Биофизические основы патологии...

transcript

Свободные радикалы и болезни человека

Ю.А. Владимиров, А.Н. Осипов

Биофизические основы

патологии клетки

•O2- H2O2

•OH H2O

Взаимосвязь активных форм кислорода

+e- +e- +e-+e-

+2H+ +H+

+ Cl- HOCl/OCl-+MPO

+ NO• ONOO-

оксид азота пероксинитрит

гипохлорит

синглетный

кислород

супероксидный

анион-радикал

пероксид

водорода

гидроксильный

радикал

Какие частицы относят к активным

формам кислорода?

1. ●O2─ супероксидный радикал

2. H2O2 пероксид водорода

3. ●OH гидроксильный радикал

4. 1O2 синглетный кислород

5. ClO─ гипохлорит

6. ONOO─ пероксинитрит

7. NO● оксид азота

8. Радикалы липидов: LO● (алкоксильный),

LOO● (пероксильный)

а—схематическое изображение клетки фагоцита;1 — захват клеткой чужеродной частицы (фагоцитоз);2 — активация клетки химическим веществом, например хематтрактантом;

Активация фагоцита внешним стимулом

б—участок клеточной мембраны; НАДФН, образующийся при окислении глюкозы (гексозомонофосфатный шунт), окисляется ферментным комплексом цитоплазматической мембраны (НАДФН-оксидазой) с образованием супероксидных радикалов. В присутствии люминола наблюдается интенсивная хемилюминесценция.

О2➔НО2⚫➔Н2О2➔ОН⚫

III III

NAD+ + H+

C(Fe+3)

4H+ 2H2O

O2C(Fe+2)

О2➔НО2⚫➔Н2О2➔ОН⚫

+О2+О2

Образование супероксидных

радикалов в митохондриях

Дыхательные комплексы митохондрий при реоксигенации

Препараты, используемые для фотодинамической терапии:

Аласенс, Аминолевулиновая кислота, Гелеофор, Димегин, Радахлорин,

Фотосенс, Хлорин Е6, Фотолон, Фотогем

Гипохлорит

Образуется миелопероксидазой нейтрофилов из H2O2 и Cl-

H2O2 + Cl- ➔ OCl-/HOCl

pK (OCl-/HOCl) = 7.5

Это означает, что при нормальном рН концентрации

OCl- и HOCl почти равны

Обладает хлорирующим действием и таким образом

разрушает бактерии и вирусы в очаге воспаления

Может образовывать ОН ⚫ радикалы в реакции с ионами железа:

HOCl + Fe2+➔ Cl- + OH⚫ + Fe3+

Пероксинитрит: химические свойства

Образуется в реакции оксида азота и супероксидного радикала:

NO⚫ + ⚫O2-➔ ONOO-/ONOOH

Является сильным окислителем, может

взаимодействовать с липидами, белками и нуклеиновыми

кислотами.

ONOOH ➔ OH⚫ + ⚫NO2

ONOOH ➔ HNO3/NO3-

Оксид азота

•участвует в процессе внутриклеточной передачи сигналов у

млекопитающих, включая человека. Он играет ключевую роль в

неврологии, физиологии и иммунологии.

•как свободный радикал - обладает высокой химической активностью. Он

легко взаимодействует с кислородом и озоном, превращаясь в двуокись

азота (•NO2) или с супероксидом, превращаясь в пероксинитрит (ONOO-).

В 1992 году Американское химическое общество присвоило

оксиду азота титул – «молекула года»

Химические свойства NO

1. Реакция с кислородом:

2NO• + O2 2NO2•

2. Реакция с супероксидным радикалом:

NO• + O2 •- ОNOО-

3. Реакция с тиолами:

NO• + RSH RSNO

4. Реакция с металлопротеинами:

NO• + Hb(Fe3+) Hb(Fe2+)NO

В каких формах NO существует в организме?

Нитрозотиолы (RSNO):

нитрозоцистеин (CysNO), нитрозоглутатион (GSNO), нитрозоальбумин (AlbNO) и др.

Нитрозометаллопротеины (Hb(Fe2+)NO):

нитрозогемоглобин (HbNO), нитрозомиоглобин (MbNO), нитрозоцитохром (CytNO) и др.

Оксид азота синтезируется в организме из L-аргинина

ферментом NO-синтазой.

В организме есть 3 типа NO-синтаз (NOS):

1. eNOS – эндотелиальная (эндотелий),

2. nNOS – нейрональная (глиальные клетки) и

3. iNOS – индуцибельная (тканевые макрофаги)

eNOS и nNOS активируются ионами Ca2+, в то время как

активация iNOS происходит в макрофагах в присутствии

ФНО или интерферона-g.

Образование NO в организме

Физиологические функции NO

NO важен для

передачи

сигнала между

нервными

клетками в мозге

NO участвует в защите

от бактериальной

инфекции и паразитов

Макрофаг

Нейроны в мозге

NО регулирует

тонус сосудов

Сосуды в организме

•тормозит агрегацию тромбоцитов и адгезию лейкоцитов к

эндотелию.

•может вызывать повреждения при гипокии-реперфузии: при

гипоксии синтезируется много оксида азота, а при

реперфузии появляется супероксид, который реагируя с

оксидом азота, образует токсичный пероксинитрит

Физиологические функции NO

Кроме того:

Схема образования NO в сосудах и тканях

Нитроглицерин, взрывчатка 100 летней

давности, и сердечное лекарство

При атеросклерозе бляшки уменьшают кровоток в артериях. Это уменьшает доставку

кислорода к сердечной мышце и вызывает боль в груди (стенокардию), а иногда - даже

инфаркт миокарда. Лечение нитроглицерином приводит к выделению NO, который

расширяет сосуды и увеличивает кровоток. Благодаря Нобелевским лауреатам 1998 года

мы теперь понимаем, как работает нитроглицерин, это важное сердечное лекарство. Он

действует как донор NO, вызывая расширение кровеносных сосудов, увеличивая их

снабжение кислородом и тем самым защищая клетки сердца от повреждения.

Роберт Фуршготт, Родился в 1916. Работает в Отд.

Фармакологии,

SUNY Health Science Center

New York

Луис Иньяро, Родился

в 1941.

Работает в Отд. Молекулярной

фармакологии, UCLA School of

Medicine, Los Angeles

Ферид Мурад, Родился в 1936. Работает в

Отд. Интегративной биологии,

фармакологии и физиологии,

University of Texas Medical

School, Houston

Нобелевская Премия по Физиологии и

Медицине 1998

"за открытие касающееся окиси азота как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе"

Бутерброд ФуршготтаРоберт Ф Фурчготт показал, что вызванное ацетилхолином расслабление

кровеносных сосудов зависит от эндотелия. Его эксперимент "бутерброда" было

важным этапом в последующем развитии науки. Он использовал две

различных части аорты; одна имела неповрежденный слой эндотелия, в другой

этот слой был удален.

Эндотелий удален –

ацетилхолин вызывает

сокращение стенки сосуда

Эндотелий сохранен –

ацетилхолин вызывает

расслабление сосуда

Так был открыт EDRF –

эндотелиальный фактор

расслабления

Спектральный анализ Иньярро

Луи Иньярро сообщил, что EDRF расслабляет кровеносные сосуды. Он также

идентифицировал EDRF как молекулу, используя спектральный анализ

гемоглобина. Когда гемоглобин был подвергнут действию EDRF, максимум

поглощения света сдвигался; такое же изменение спектра наблюдали при

действии на гемоглобин окиси азота. Так был открыт новый принцип

передачи сигналов между клетками человеческого организма.

Спектрофотометр

Гемоглобин (желтый) при

взаимодействии с клетками

эндотелия давал сдвиг спектра,

точно такой же, как при действии на

гемоглобин окиси азота (зеленый).

Активация гуанилат-циклазы

(по данным Мюрада)

Ферид Мюрад знал, что нитроглицерин вызывает расслабление клеток гладкой

мышцы. Фермент, гуанилатциклаза, был активирован, и это вызвало рост концентрации

циклического ГМФ, что привело к расслаблению мышцы. Нитроглицерин действовал

через образование оксида азота? Мюрад барботировал NO-газ через ткань,

содержащую фермент; циклический GMP увеличивался. Так был обнаружен новый

способ действия лекарственного средства!

Расслабление стенок сосудов благодаря

передаче сигнала между клетками

NO индуцирует синтез ц-ГМФ путем активации гуанилат-циклазы. Это

приводит к релаксации миозина гладких мышц

Ацетилхолин стимулирует синтез

оксида азота, в клетках эндотелия.

Затем NO проникает в

гладкомышечные клетки и вызывает их

расслабление.

Расслабление стенок сосудов благодаря передаче

сигнала между клетками

Ацетилхолин стимулирует синтез оксида

азота, в клетках эндотелия. Затем NO

проникает в гладкомышечные клетки и

вызывает их расслабление.

NO индуцирует синтез цГМФ путем

регуляция пероксидазнойактивности цитохрома С с

помощью оксида азота

Влияние АФК на развитие процессов в клетке

Апоптоз НекрозАутофагия/

Митофагия

Выживание клетки Гибель клетки

Ингибиторы

апоптоза

Деполяризация

Истощение

резерва АТФ

Разрыв внешней мембраны

Необратимые

морфологические изменения

АФК

Цитохром с

Количество Активных Форм Кислорода

контакт

ымитохондрии

ядро

повреждающее воздействиеНекроз

Клетки и органеллы

набухают. Начало

конденсации хроматина

Растворение клеточных

органелл

Лизис клеток. Внедрение

фагоцитов. Воспаление.

Этапы развития некроза

контакт

ымитохондрии

ядро

Повреждение межклеточных контактов

Начало конденсации хроматина

Клетки сжимаются

Хроматин конденсируется у периферии ядра

Клетки фрагментируются.

Продолжается конденсация хроматина

Клетки превращаются в

апоптотические тельца

Апоптотические тельца подвергаются

фагоцитозу

Апоптоз

Этапы развития апоптоза

Общая схема апоптотических реакций

Кинетика процессов при апоптозе

Окисление

кардиолипина

митохондриальных

мембран (пмоль/нмоль

общего кардиолипина)

Активность

каспаз 3/7 (ЕА/мг

белка)

Окисление

кардиолипина

митохондриальных

мембран (пмоль/нмоль

общего кардиолипина)

Активность

каспаз 3/7 (ЕА/мг

белка)

Цитохром С

(пмоль/мг белка)

Аннексин V (+)

клетки (% от

общего

количества)

Фагоцит

Апоптотическая

клетка

DOCK 180

Перестройка цитоскелетадля формирования фагосомы

C1q рецептор

лиганд C1q

МестосвязыванияC1q

Рецепторы PS

Рецепторы

Фагоциты распознают на поверхности апоптотической клетки сигнал «съешь меня», формируемый фосфатидилсерином (PS) на внешней мембране клетки. Этот сигнал запускает процесс фагоцитоза апоптотической клетки

Механизм фагоцитоза при апоптозе

Met80Lys72

Wavelength, nm

320 360 400 440 480

Native state

NO, H2O2

Кардиолипин

640 690 740Wavelength, nm

Met-80

His-18

В пероксидазе H2O2 имеет

свободный доступ к атому

железа в активном центре

В цитохроме c H2O2 не имеет

доступа к атому железа в

активном центре т.к. 6

координационную связь

занимает Met80

Строение активного центра пероксидазыи цитохрома с

Met-80

His-18

Met-80

His-18

H2O2 CL

Кардиолипин смещает Met80 в

активном центре и облегчает

доступ H2O2 к атому железа в

активном центре

Изменения в активном центре в присутствии кардиолипина

Met-80

His-18

Не только H2O2 но и NO может

взаимодействовать с железом

гема, когда активный центр

модифицирован кардиолипином

H2O2Met-80

His-18

Когда NO связался с

железом, H2O2 не может

прореагировать с железом

Связывание NO в активном центре

цитохрома С в

присутствии кардиолипина

Нитрозильный комплекс

цитохрома с чувствителен к

действию видимого света и

может быть разрушен при

облучении видимым светом

Met-80

His-18

Если NO удалено

облучением, то H2O2 легко

реагирует с гемом.

Met-80

His-18

Лазерный фотолиз нитрозильного

комплекса в активном центре в

присутствии кардиолипина

His-18

Met-80

+ cardiolipin

Met-80

His-18

CLH2O2

His-18

H2O2 CL

Met-80

Суммарная схема

регуляция тонуса сосудов с помощью оксида азота

Гуанилат-циклаза гладких мышц

Расслабление

сосудов

NO-гемоглобин

Перенос Оксида азота с Гемоглобина на

Гуанилат-циклазу под действием Лазерного

излучения

GTP cGMP

гемоглобин

Индукция cGMP при лазерном облучении NO-Hb

Контроль Облучение NO-HbОблучение

]-NOHb +NOHb

Допплерография сосудов

Аппарат для Допплерографии

Принцип Допплерографии

Допплерограмма

Аппарат для Допплерографии

Принцип Допплерографии

Операция

Выделение A. carotis Выделение A. femoralis

Облучение A. epigastrica

Подготовительные хирургические процедуры

Контроль

Введение

Облучение

После

облучения

Результаты Допплерографии

HbNO + облучение

Hb+облучение

Изменение кровотока в A. epigastrica

(по данным допплерографии)

узи

Контроль Введение Облучение После обл.

ПерекисноеОкисление Липидов

Общая схема реакций перекисного окисления липидов

???€????‚‡??? €???

LOO •LH

L• L • LOO •

LO •

LOO •

инициирование цепи

продолжение цепи

разветвление цепиL •

Вопросы к зачету:

1. Кому и за что была присуждена Нобелевская

премия по физиологии в 1998 г.?

2. Расскажите об исследованиях Фуршготта.

3. Расскажите об исследованиях Иньяро.

4. Расскажите об исследованиях Мурада.

5. Расскажите о роли оксида азота в апоптозе.

6. Расскажите о роли оксида азота в регуляции тонуса

сосудов.

7. Дайте определение процессу перекисного

окисления липидов.

8. Каковы основные стадии процесса перекисного

окисления липидов?

Биофизические основы патологии...

Documents