4a. a Leucemie Acute Mieloidi - LAM

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HEMATOPOIESIS

WHO Integrated Classifications

Morphology:Cytology

Histopathology

Molecular GeneticsCytogenetics

Immunology:Immuno-cyto-histochemistry

Leucemia Acuta Mieloblastica

• De Novo• Secondaria

Età > 18 anni

LEUCOSI ACUTELEUCOSI ACUTE

•LEUCOSI ACUTE “LEUCOSI ACUTE “DE NOVODE NOVO”: NON RICONOSCONO ”: NON RICONOSCONO UNA CAUSA EZIOPATOGENETICA CERTA.UNA CAUSA EZIOPATOGENETICA CERTA.

•LEUCOSI ACUTE LEUCOSI ACUTE SECONDARIESECONDARIE: PATOLOGIE : PATOLOGIE CONGENITE. (Sindrome di Down, Anemia di Fanconi, CONGENITE. (Sindrome di Down, Anemia di Fanconi, Atassia Telangectasia, etc..)Atassia Telangectasia, etc..)

•LEUCOSI ACUTE LEUCOSI ACUTE SECONDARIESECONDARIE: IATROGENE O DA : IATROGENE O DA ESPOSIZIONE A TOSSICI AMBIENTALIESPOSIZIONE A TOSSICI AMBIENTALI

•LEUCOSI ACUTE LEUCOSI ACUTE SECONDARIESECONDARIE: A DISORDINI : A DISORDINI MIELOPROLIFERATIVI E SINDROMI MIELOPROLIFERATIVI E SINDROMI MIELODISPLASTICHEMIELODISPLASTICHE

“Leukemia is a genetic disease”

- point mutations/deletions- chromosome gain / loss-chromosomal translocationschromosomal translocations-amplification

Citogenetica e Analisi Molecolare delle Leucemie

Diagnosi e Prognosi

Follow-up

Malattia Residua Minima

Gruppi di rischio in relazione alla valutazione citogenetica

Favorevole Intermedio Sfavorevole

t(8;21) Normale del(5q)/-5Inv16 +8 del(7q)/-7del(16q) +6 t(9;22)t(15,17) 11q23 3q,9q,11q,20q,21q,17p

+21 t(6;9) +22 Cariotipo complesso (≥3 anomalie non

correlate) del(12p) -Y

Leucemie Acute Mieloidi: Anomalie citogenetiche e molecolari

LEUCEMIA ACUTA PROMIELOCITICA ( M 3 ) AML con t (15;17) (q 22;q 12) ; (PML/RAR)

Nella LAM M3, che rappresenta 5-8% delle LAM, la popolazione dominante a livello midollare è costituita da promielociti atipici, il citoplasma è repleto di granuli di dimensioni rilevanti, di colore rosso porpora al Romanowsky. Talora il loro numero è così elevato da oscurare il nucleo. In una variabile percentuale di cellule sono presenti numerosi corpi di Auer, sovente raccolti in fasci. I bastoncelli di Auer sono spesso più larghi che nelle altre forme di LAM. Le reazioni al Sudan nero e alla Perossidasi sono particolarmente intense

I bastoncelli di Auer hanno in microscopia elettronica una

morfologia caratteristica con una disposizione esagonale di

strutture tubulari a periodicità specifica di 250m in contrasto con la periodicità 6-20 di altre

Leucemia Acuta Promielocitica

t(15;17)(q15;q21)

AML-M3favorable prognosisfusion gene: PML RAR

One of the rare leukaemia where treatment is an emergency for intra vascular coagulationtreatment with retinoic acid

A partial G-banded karyotype of two cells from a patient with APL showing t(15;17)(q22;q21) /(top panel, while insert). The bottom panel shows PML-RAR fusion (yellow)

in three interphase cells from the same patient

t(8;21)(q22;q21)

AML-M2favorable prognosisfusion gene: AML1-ETO

t(8;21) / AML1-ETOinv(16) / MYH11-CBFB

Geni target

MPO, IL-3, GM-CSF, CSF-1R

Attivatore Trascrizionale

CBF LEUKEMIAS

inv (16)(p13q22)

/ CBFB-MYH11

Geni target

CBF LEUKEMIAS

OS of 1091 patients with de novo AML according to cytogenetic risk groups. Leukemia 2004;18,120-125

OS of 93 patients with t-AML according to cytogenetic risk groups. Leukemia 2004; 18,120-125

de novo AML t-AML

Percent

MUTAZIONEMUTAZIONE

ALCUNE MUTAZIONI SONO RESPONSABILI DELLO ALCUNE MUTAZIONI SONO RESPONSABILI DELLO SVILUPPO DI EMOPATIE MALIGNESVILUPPO DI EMOPATIE MALIGNE

L’ESPOSIZIONE AD AGENTI FISICI (RADIAZIONI L’ESPOSIZIONE AD AGENTI FISICI (RADIAZIONI IONIZZANTI), CHIMICI (BENZENE) O AMBIENTALI IONIZZANTI), CHIMICI (BENZENE) O AMBIENTALI

(VIRUS) PUO’ AUMENTARE LA FREQUENZA DI TALI (VIRUS) PUO’ AUMENTARE LA FREQUENZA DI TALI MUTAZIONIMUTAZIONI

E’ UNA VARIAZIONE NELLA NORMALE SEQUENZA DEL DNAE’ UNA VARIAZIONE NELLA NORMALE SEQUENZA DEL DNA

NucleusNucleus

Plasma membranePlasma membrane

NucleolusNucleolus

FOSFOPROTEINFOSFOPROTEINA NUCLEOLAREA NUCLEOLARECON FUNZIONI CON FUNZIONI DI TRASPORTO DI TRASPORTO DI RNA E DI RNA E PROTEINE FRA PROTEINE FRA NUCLEO E NUCLEO E CITOPLASMACITOPLASMA

CytoplasmCytoplasm

NPMCRM1

Mutazione AMutazione A

RIPRODUCIBILITA’RIPRODUCIBILITA’

WT GATCT CT G GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAGA GATCT CT G TCTG GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAG

Schnittger, S. et al. Blood 2005;106:3733-3739

Figure 5. Kaplan-Meier analysis of AML with normal karyotype and different NPM1 and FLT3-LM status

NPM1 mutated AML

Age: Adults

Sex: Female

Karyotype: Normal ( > 90%)

Immunophenotype: CD34-

Associated genetic events: FLT3-ITD ( 40%)

Prognosis Low Risk

Leucemia

Trattamento(Chemio-TMO-Altri Agenti)

Refrattaria Remissione

Malattia Minima Residua(Recidiva)

100000

1000000

Post-inductionDiagnosis

Gorello P. et. al Leukemia. 2006 Jun;20(6):1103-8

Diagnostic WORK-UP for SPECIFIC SUBSET

Genomic Identity Card

Individualized Therapy

Malattia minima residua:Con questa espressione si intende il tentativo di identificare, con sofisticate tecniche di biologia molecolare, cellule leucemiche residue, anche quando a livello del sangue periferico e del midollo osseo la malattia appare in remissione. Questo approccio però può essere utilizzato quando la cellula leucemica possiede una anormalità molecolare (marcatore). Ciò permette un follow-up più sensibile dei pazienti in remissione e, di sapere precocemente se c’è necessità di terapie aggiuntive.

Malattia Residua Minima

Metodi Sensibilità Vantaggi Principali

Immunofenotipo 10-3 – 10-4 Rapido; Accurata quantificazione; Distinzione delle cellule vive

PCR di trascritti di fusione

10-4 – 10-6 Alta sensitibilità; Relativamente rapida;

FISH 10-2 – 10-3 Rapida; Altamente specifica

NPM1FLT3KITRAS

Mutazioni Geniche

nucleoporina (trasporto nucleo/citoplasma)

tirosinchinasirecettori per fattori di crescita

transduzione del segnale

RECEPTOR FAMILY

Tyr Kinase domains

Cell Membrane

Extra Cellular

Intra Cellular

Phosphorilation - Dimerisation - Signal Transduction ( RAS; STAT; MAPK…)

Science 20 October 2006. Vol.314 no.5798, pp.433-434

LEUCEMIA ACUTA MIELOIDELEUCEMIA ACUTA MIELOIDE

MLLMLL

MDRMDR

P53P53

Loss RbLoss Rb

JAK2JAK2

NPM1NPM1

FLT3FLT3

CEBP-CEBP-

RASRAS

AML1AML1

C-KITC-KIT

PU.1PU.1

PTPN11PTPN11

NF1NF1

AML1AML1

GATAGATA

DE NOVODE NOVO CONGENITECONGENITE SECONDARIESECONDARIE

RASRAS

Complex Karyotype, del (5q); -5; del(7q);-7Complex Karyotype, del (5q); -5; del(7q);-7

Citogenetica e Analisi Molecolare delle leucemie

Diagnosi e prognosiFollow-upMalattia residua minima

LIMITI della citogenetica convenzionale

Assenza di mitosiCariotipo normaleRiarrangiamenti cripticiAmplificazione genica

Citogenetica molecolare: FISH

ANALISI MOLECOLARE: RT-PCR e sequenziamenti

J Mol Med (2007) 85:227-235

Krivtsov AV. Nat Rev Cancer. 2007 Nov;7(11):823-33

Geni target

CBF LEUKEMIAS

Profilo wild type

Profilo mutato

Tempo di eluizione

DHPLCDHPLC

Profilo wild typeProfilo wild type

NPM1FLT3KITRAS

Mutazioni Geniche

nucleoporina (trasporto nucleo/citoplasma)

tirosinchinasirecettori per fattori di crescita

transduzione del segnale

WT ctattcaagatctctg gcagtggaggaagtctctttaagaaaatag -DLWQWRKSL. (NM_002520)

Mut.A tctgTCTGgcagtggaggaagtctctttaagaaaatag -DLCLAVEEVSLRK.

Nt. 959

WT ctattcaagatctctggcagt ggaggaagtctctttaagaaaatag -DLWQWRKSL.

Mut.E cagtCTCTTGCCCaagtct -DLWQSLAQVSLRK.

(insertion 9 nt.)

(Deletion 5 nt.)Nt. 964 A.A

288A.A 290

A.A 288

A.A 290

(NM_002520)

Differenziazione: interazione tra fattori di crescita e fasi del ciclo cellulare

FLT3-L, SCF

Class II alterations target transcriptionalregulators of hematopoiesis.

Fusion genes involving:- Core binding factor (CBF)Core binding factor (CBF)- Retinoic acid receptor (RAR)- Homeobox factors (HOX)- Co-activators: CBP/p300

Point mutations involving:- Core binding factor (CBF)Core binding factor (CBF) - CCAAT/enhancer binding protein (CEBP/

- PU.1- NPM1

Impaired transcriptional activity

Block in cellular differentiation & maturation

“LOSS OF FUNCTION MUTATIONS”

Classificazione FAB delle LAM

M0 minima differenziazione CD34, CD13 e/o CD33HLA-DR, anti-MPO

M1 senza maturazione CD11, CD13, CD33, MLA-DR (CD19)

M2 segni di maturazione CD11, CD13, CD33, MLA-DR (CD19)

M3 promielociti leucemici CD19, CD33 (CD2) (CD34)

M4 maturazione granulocitaria CD11, CD13, CD33, CD14e blasti monocitari HLA-DR, CD68

M5 monoblasti e monociti CD11, CD13, CD33, CD14HLA-DR, CD68

M6 eritroblasti e mieloblasti Glicoforina, HLA-DRAntigeni ABH

M7 blasti megacariocitari CD41, CD42a, CD42b, CD61

FAB Anticorpi monoclonali

Bain BJ. Clin Lab Haematol 2002 Feb;24(1):1-13

Myeloid

Second line:

First line:

Panel of antibodies for the diagnosis of acute leukaemias

PML/RARA blocca la differenziazione mediata da fattori di

crescita (es. PU.1)

A very simplified model of action of transcription factor fusions associated with acute leukemia.

Co-Act.

Co-Act.TF

Co-Rep.

Co-Repr.TF-fusion

Co-Rep.

Co-Rep.TF

Co-Act.

Co-Act.TF-fusion

Deregulation of target gene expression

[e.g. CBF, X-RAR] [e.g. MOZ, CBP]

Geni coinvolti

ETO8q22localizzazione nucleare fattore di trascrizione

AML121q22localizzazione nuclearefattore di trascrizione per vari geni che regolano l’ematopoiesi

4a. a Leucemie Acute Mieloidi - LAM

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