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transcript

EXPRESSION OF HETEROLOGOUSEXPRESSION OF HETEROLOGOUS

GENE CLUSTERS: GENE CLUSTERS:

ACTIVATION BYACTIVATION BY

PROMOTER-GENERATING PROMOTER-GENERATING

MUTATIONSMUTATIONS

ProfProf. Renato Fani. Renato Fani

APPROCCIO DI TIPO SPERIMENTALEAPPROCCIO DI TIPO SPERIMENTALE

Studio in vivo di acquisizione di nuove abilità metaboliche

Popolazione microbica sottoposta a pressione selettiva

Esperimenti di Esperimenti di EVOLUZIONE GUIDATAEVOLUZIONE GUIDATA

Selective pressure: request of functions X and Y

y ?ProfProf. Renato Fani. Renato Fani

Modification of pre-existinggenetic information

activation of cryptic or silent genes

selection of mutations in regulatory or structural genesSurviving of XY cells

Horizontal gene transfer(XENOLOGY) Surviving of XY cells

In principle, the gene flow might be limited by the barriersto heterologus gene expression

In In principleprinciple, , the the gene gene flow flow might be limited might be limited by by the barriersthe barriersto heterologus to heterologus gene gene expressionexpression

This persistence is dependent on the expression of transferred genes

ThisThis persistencepersistence isis dependent on dependent on the expressionthe expression of transferred genesof transferred genes

For horizontal transfer to be successful, donated genes mustpersist in the recipient organism

ForFor horizontalhorizontal transfer transfer toto bebe successfulsuccessful,, donated genes mustdonated genes mustpersistpersist in in the recipient organismthe recipient organism

The introgression of foreign genes into a heterologous recipient

does not per se imply their expression in the host cell.

The introgression of foreign The introgression of foreign genes intogenes into a a heterologous recipientheterologous recipient

does not does not per se per se imply imply their expression their expression in in the host cellthe host cell..

On the other hand, the finding that HGT is pervasiveamong microial lineages indicates that these barriers

may somehow be overcome

On the other hand, the finding that HGT is pervasiveamong microial lineages indicates that these barriers

may somehow be overcome

Can this issue be analyzed under laboratory conditions ?Can this issue be analyzed under laboratory conditions ?

??Thus, how can a heterologous gene (cluster)

be expressed in a host cell whose RNA polymerase

is not able to (efficiently) recognize

the transcriptional signal of the introgressed gene(s)?

………by transferring genes for a given metabolic route from a donor

organism into a heterologous recipient lacking that metabolic ability, and whose transcriptional apparatus does not recognize the regulatory signal of the donor DNA.

………by transferring genes for a given metabolic route from a donor

organism into a heterologous recipient lacking that metabolic ability, and whose transcriptional apparatus does not recognize the regulatory signal of the donor DNA.

This idea relies on the so-called "directed evolution" experiments that demonstrated the occurrence of regulatory mutations in bacterial populations incubated under selective conditions and

allowing the appearance of cells able to thrive in alternative environments.

This idea relies on the so-called "directed evolution" experiments that demonstrated the occurrence of regulatory mutations in bacterial populations incubated under selective conditions and

allowing the appearance of cells able to thrive in alternative environments.

FENOTIPOFENOTIPO

XX -- Cromosoma

PLASMIDE

TRASFERIMENTOTRASFERIMENTOGENICOGENICO

ORIZZONTALEORIZZONTALE

PRESSIONE SELETTIVAPRESSIONE SELETTIVA(Richiesta della Funzione X)(Richiesta della Funzione X)

PLASMIDE

Cromosoma

Plasmide Cromosoma

X geneX gene

Bacterial cellBacterial cell

Acquisition Acquisition of a of a potentiallypotentiallyfunctioning functioning X gene by HGTX gene by HGT

XX phenotypephenotype

Selective pressureSelective pressure::request of functionrequest of function X X

Model for the expression of newly acquired metabolic genes by promoter-creating mutations in a host celllacking the function encoded by a gene X and which has an X- phenotype. This cell may acquire (by

xenology or sinology) a heterologous gene X whose regulatory signals are not recognized by thetranscriptional apparatus of the host cell; therefore the cell phenotype is still X-. The appearance of cell

with X+ phenotype is possible if under starvation conditions requiring the function X, mutations fallingupstream of the gene X create a promoter sequence, and render the gene X expressable.

Overall experimentalstrategy

Escherichia coli G D C B H A F IE

Azospirillum brasilense Bd H Orf 168 A F Orf

pRK290pRK290

TetTetrr

EcoRIEcoRI

Bd H Orf 168 A F Orf

pAF58pAF58

TetTetrr

EcoRIEcoRI

E. coli E. coli FB251FB251

hisBhisB recArecA

hisAhisA

hisFhisF

His PhenotypeHis Phenotype

XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++

hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++

hisBhisB++hisAhisA++hisFhisF--

hisBhisB recArecA

hisAhisA

hisFhisF

A. A. brasilense his brasilense his biosynthetic genesbiosynthetic genes

XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++ BAF

pAF58pAF58

hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++ BAF

pAF58pAF58

hisBhisB++hisAhisA++hisFhisF-- BAF

pAF58pAF58

Selective pressureSelective pressure::request of histidinerequest of histidine

Acquisition of Acquisition of A. A. brasilense hisbrasilense hisgene cluster by HGTgene cluster by HGT

E. coli E. coli HisHis-- mutantmutant

HisHis phenotypephenotype

E. coli E. coli HisHis++ revertantrevertant

pAF58pAF58

pAF5803pAF5803

Working hypothesisWorking hypothesis

hisBhisB recArecA

hisAhisA

hisFhisF

A. A. brasilense his brasilense his biosynthetic genesbiosynthetic genes

XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++

hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++

hisBhisB++hisAhisA++hisFhisF--

pAF5803pAF5803

++ProfProf. Renato Fani. Renato Fani

RESULTS

Transformation ofhisB E.coli with plasmid pAF58

Transformation ofTransformation ofhisBhisB E.coli E.coli with plasmid with plasmid pAF58pAF58

Ability of plasmid pAF58 to complement the hisB mutation(crescita in ASSENZA di istidina)

Ability of plasmid Ability of plasmid pAF58 pAF58 to complement the to complement the hisB hisB mutationmutation(crescita in ASSENZA di (crescita in ASSENZA di istidinaistidina))

hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++ BAF

pAF58pAF58

XXE. coli E. coli FB251FB251

hisBhisB recArecA

TUTTI i trasformanti crescono in ASSENZA di istidina

Ability of plasmid pAF58 to complement the hisB mutation(crescita in ASSENZA di istidina)

Ability of plasmid Ability of plasmid pAF58 pAF58 to complement the to complement the hisB hisB mutationmutation(crescita in ASSENZA di (crescita in ASSENZA di istidinaistidina))

Il PROMOTORE dell’operone his di A. brasilense è riconosciuto dalla

RNA polimerasi di E. coli

Il PROMOTORE dell’operone his di A. brasilense è riconosciuto dalla

FINEFINEFINE

TUTTI i trasformanti NON crescono in ASSENZA di istidina

Il PROMOTORE dell’operone his di A. brasilense NON è riconosciuto dalla

MA, dopo alcunigiorni compaiono dei revertanti His+

MA, dopo alcunigiorni, compaiono dei revertanti His+

I revertanti sono capaci di sintetizzare l’istidina

(COMPLEMENTAZIONE)

I revertanti sono capaci di sintetizzare l’istidina

(COMPLEMENTAZIONE)

RICOMBINAZIONEintermolecolare

RICOMBINAZIONERICOMBINAZIONEintermolecolareintermolecolare MUTAZIONE MUTAZIONE

MUTAZIONE MUTAZIONE

PLASMIDICA PLASMIDICA CROMOSOMICA(reversione del gene hisB mutato)

CROMOSOMICA(reversione del gene hisB mutato)

Aumento del numerodi copie

Creazione di un PROMOTORECreazione di un PROMOTORE

TRASFORMAZIONETRASFORMAZIONEIncorporaziome di molecole di DNA

(ricombinanti o non)da parte di

cellule ospiti “competenti”

Miscela di cellule competenti del ceppoMiscela di cellule competenti del ceppoFB251 FB251 hisBhisB e di e di

molecole di DNA molecole di DNA plasmidico plasmidico pAF58pAF58

Una frazione delle cellule competentiUna frazione delle cellule competentiincorpora molecole di DNAincorpora molecole di DNA

Come riconoscere, tra tuttele cellule (qualche miliardo)

potenzialmente trasformabili, icloni positivi,

cioè quelli che hanno incorporatoil plasmide ricombinante pAF58?

QuesitoQuesitoQuesito

Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidinaistidina

Lamoltiplicazione

diqueste celluleporterà allacomparsa di

colonieresistenti allatetraciclina

LaLamoltiplicazionemoltiplicazione

didiqueste cellulequeste celluleporterà allaporterà allacomparsa dicomparsa di

coloniecolonieresistenti allaresistenti allatetraciclinatetraciclina

Come verificare se il plasmide pAF58 è capace di complemetare

la mutazione his del ceppoFB251?

Come verificare se il Come verificare se il plasmide plasmide pAF58 è capace di pAF58 è capace di complemetarecomplemetare

la mutazione la mutazione hishis del ceppo del ceppoFB251?FB251?

Piastra di terreno selettivo contenentePiastra di terreno selettivo contenentetetraciclina ma NON ISTIDINAtetraciclina ma NON ISTIDINA

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

E ISTIDINAE ISTIDINATerreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA

Replica-Replica-platingplating

Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF58 pAF58 è riconosciutoè riconosciuto dalla RNA- dalla RNA-

polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli ... ...

E ISTIDINAE ISTIDINA

CRESCITA di TUTTE le COLONIECRESCITA di TUTTE le COLONIE su su

terreno contenente tetraciclina terreno contenente tetraciclina

Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF58 pAF58 NONNON è riconosciutoè riconosciuto dalla dalla

RNA-RNA-polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli ... ...

ASSENZA di CRESCITAASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE di TUTTE le COLONIE

su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina

RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 24 24 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)

IL IL promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dal portati dal plasmideplasmidepAF58 pAF58 NONNON è riconosciutoè riconosciuto dalla RNA- dalla RNA-

polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli

RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 4848 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)

CRESCITACRESCITA di ALCUNE MICRO-COLONIE di ALCUNE MICRO-COLONIE

Il NUMERO delleIl NUMERO delle MICRO-COLONIE MICRO-COLONIE

MA NON ISTIDINA MA NON ISTIDINA AUMENTAAUMENTA

MA NON ISTIDINA MA NON ISTIDINA continua ad AUMENTAREcontinua ad AUMENTARE

MA NON ISTIDINA MA NON ISTIDINA NON AUMENTA PIU’NON AUMENTA PIU’

Che cosa sono le microcolonie?Che cosa sono le Che cosa sono le microcoloniemicrocolonie??

Revertanti HisB+Revertanti HisBRevertanti HisB++

RispostaRispostaRisposta

Revertanti HisB+Revertanti HisBRevertanti HisB++

Revertanti CROMOSOMICI

Revertanti Revertanti CROMOSOMICICROMOSOMICI

Mutanti plasmidiciMutanti Mutanti plasmidiciplasmidici

Come discernere trale due possibilità?

Come discernere traCome discernere trale due possibilità?le due possibilità?

“Curing” del plasmide““CuringCuring” del ” del plasmideplasmide

CRESCITA di REVERTANTI CRESCITA di REVERTANTI HisBHisB+ + ininpresenza di arancio di presenza di arancio di acridinaacridina

Terreno contenente Terreno contenente

arancio di arancio di acridina acridina

Terreno massimo NON Terreno massimo NON

contenente tetraciclinacontenente tetraciclina

Semina della colturaSemina della coltura

Verificare il Fenotipo delle colonie cresciuteVerificare il Fenotipo delle colonie cresciute

Scenario 1Se la mutazione responsabile del fenotipo Se la mutazione responsabile del fenotipo HisHis+ dei+ dei

revertantirevertanti è a carico del è a carico del plasmideplasmide::

Le cellule potranno essere Le cellule potranno essere TetTetrr o o TetTetss

••Tutte le cellule Tutte le cellule TetTetrr devono essere anche devono essere anche HisHis++

••Tutte le cellule Tutte le cellule TetTetss devono essere anche devono essere anche HisHis--

Scenario 2Se la mutazione responsabile del fenotipo Se la mutazione responsabile del fenotipo HisHis+ dei+ dei

revertantirevertanti è a carico del è a carico del cromosoma:cromosoma:

••Tutte le cellule sarannoTutte le cellule saranno HisHis+ + indipendentemente dalindipendentemente dal fenotipo fenotipo TetTet

Terreno MM -Terreno MM -Tet Tet --HisHis

Terreno MM +Terreno MM +TetTet - -HisHis

Terreno MM +Terreno MM +TetTet + +HisHis

Terreno MM -Terreno MM -TetTet + +HisHis

???Estrazione DNA plasmidico dai revertanti HisB+

Estrazione DNA Estrazione DNA plasmidico plasmidico dai dai revertanti HisBrevertanti HisB++

Come discernere trale due possibilità?

Come discernere traCome discernere trale due possibilità?le due possibilità?

“Curing” del plasmide““CuringCuring” del ” del plasmideplasmide

ESTRAZIONE del DNA PLASMIDICOESTRAZIONE del DNA PLASMIDICO

dai REVERTANTI dai REVERTANTI HisBHisB++

pAF5803pAF5803(milioni di copie)(milioni di copie)

Miscela di cellule competenti del ceppoMiscela di cellule competenti del ceppoFB251 FB251 hisBhisB e di e di

molecole di DNA molecole di DNA plasmidico plasmidico pAF5803pAF5803

Una frazione delle cellule competentiUna frazione delle cellule competentiincorpora ilincorpora il plasmide plasmide pAF5803pAF5803

Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidinaistidina

Lamoltiplicazione

diqueste celluleporterà allacomparsa di

colonieresistenti allatetraciclina

LaLamoltiplicazionemoltiplicazione

didiqueste cellulequeste celluleporterà allaporterà allacomparsa dicomparsa di

coloniecolonieresistenti allaresistenti allatetraciclinatetraciclina

Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF5803pAF5803 NONNON è riconosciutoè riconosciuto dalla dalla

RNA-RNA-polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli

Revertante cromosomicoRevertante cromosomico

Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF5803pAF5803 è riconosciutoè riconosciuto dalla RNA- dalla RNA-

polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli

Mutante Mutante plasmidicoplasmidico

Mutante Mutante plasmidicoplasmidicoProfProf. Renato Fani. Renato Fani

Genetic andmolecular

characterization ofplasmid DNA from

twenty HisB+

revertantsProfProf. Renato Fani. Renato Fani

Extraction of mutant (?) plasmid DNAfrom 20 HisA+ revertants

Extraction Extraction ofof mutant mutant (?)(?) plasmid plasmid DNA DNAfromfrom 20 20 HisAHisA++ revertantsrevertants

Transformation ofhisA, hisF, hisB E.coli cells

Transformation ofTransformation ofhisAhisA, , hisFhisF, , hisBhisB E.coli E.coli cellscells

Ability of mutant plasmids to complement hisA, hisB and/or hisF

Ability of mutant plasmids to Ability of mutant plasmids to complement complement hisAhisA, , hisBhisB and and/or /or hisFhisF

ComplementationComplementation**

FB251 FB251 hisBhisB FB184 FB184 hisAhisA FB182 FB182 hisF hisF

0 0.1 10 0.1 1 0 0.1 10 0.1 10 0.1 10 0.1 1

OriginOrigin

PlasmidPlasmid StrainStrainSelective conditionsSelective conditions

HisHis TimeTimeN N cellscells

platedplated

pAF58 FB184 - - - - pAF58 FB184 - - - - - - - - - - - - - -

pDS1-3 “ 0 5x10pDS1-3 “ 0 5x1066 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +

pDS4-5 pDS4-5 “ 0 5x10 “ 0 5x1077 3 + + + + 3 + + + + + + + + + + + + + +

pDS6-7 “ 0 5x10pDS6-7 “ 0 5x1077 4 + + + + 4 + + + + + + + + + + + + + +

pDS8 pDS8 “ 0.1 5x10 “ 0.1 5x1066 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +

pDS9-11 “ 0.1 5x10pDS9-11 “ 0.1 5x1077 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +

pDS12 “ 0.1 5x10pDS12 “ 0.1 5x1077 3 + + + + 3 + + + + + + + + + + + + + +

pDS13 “ 0.1 5x10pDS13 “ 0.1 5x1077 5 + + + + 5 + + + + + + + + + + + + + +

pDS14-15 “ 1.0 5x10pDS14-15 “ 1.0 5x1066 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +

pDS16 “ 1.0 5x10pDS16 “ 1.0 5x1066 3 + + + + 3 + + + + + + - - + + + - - +pDS17-18 “ 1.0 5x10pDS17-18 “ 1.0 5x1066 3 + + + + 3 + + + + + + + + + + + + + +pDS19-20 “ 1.0 5x10pDS19-20 “ 1.0 5x1077 4 + + + + 4 + + + + + + + + + + + + + +

* * Growth on selective Growth on selective medium medium after after 24 h 24 h incubation at incubation at 37°C37°CProfProf. Renato Fani. Renato Fani

These results suggest thatThese results suggest thatThese results suggest that

This mutation might have generated a promoter-like sequence rendering the A. brasilense his operon

(efficiently) transcriptable by the E. coli RNA-polymerase

This mutation might have generatedThis mutation might have generated a a promoterpromoter--like sequencelike sequence rendering the rendering the A. A. brasilensebrasilense hishis operon operon

((efficientlyefficiently)) transcriptable transcriptable by by the the E. coliE. coli RNA- RNA-polymerasepolymerase

The appearance of HisB+ revertants was due to a mutation occurring in plasmid pAF58 and NOT to a retromutation

The appearanceThe appearance ofof HisBHisB++ revertants was revertants was due due to to a a mutation mutation occurringoccurring in in plasmid plasmid pAF58 pAF58 and and NOT NOT to to a a retromutation retromutation

At least two different mutations should have occurredAt At leastleast two two differentdifferent mutationsmutations should should havehave occurredoccurred

These mutations should have fallen upstream of the first gene ofA. brasilense his operon, hisB

These mutations should have fallenThese mutations should have fallen upstream upstream ofof the first the first gene gene ofofA. A. brasilense his operonbrasilense his operon, , hisBhisB

- - -- - -

+ + ++ + +

EcoRIEcoRI BamHIBamHI

PhenotypePhenotypeHisB HisB HisA HisA HisFHisF

- - -- - -

+ + ++ + +

pAF58pAF58

MutantMutant

plasmidplasmid

The mutation is localized on the 479 bp fragment including the 5’ end of hisBd

and its upstream region

The mutation is localizedThe mutation is localized on theon the 479 479 bp fragment bp fragment includingincluding thethe 5’ 5’ endend ofof hisBdhisBd

andand itsits upstreamupstream regionregion

EcoRIEcoRI BamHIBamHI

pAF58pAF58

MutantMutant

plasmidsplasmids

PCRPCRPCR

Nucleotide sequenceNucleotide sequenceNucleotide sequenceProfProf. Renato Fani. Renato Fani

pDS1-15 + + + + + + + + + -------------pDS1-15 + + + + + + + + + -------------T-----------T-----------

pDS17-20pDS17-20

ComplementationComplementation

FB251 FB251 hisBhisB FB184 FB184 hisAhisA FB182 FB182 hisFhisF

0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1

pDS16 + + + + + + - - pDS16 + + + + + + - - + + ----A------------------------A--------------------

pAF58 - - - - - - pAF58 - - - - - - - - - - - - cttcctgacttcctgaTAAAACTAAAACccggactcccggactcatgatg

TatAaTTatAaT

Nucleotide sequenceNucleotide sequence

hisBhisBE.coliE.coli -10 -10 consensusconsensus

FB251(pDS44)

FB251(pAF58)

0 1 2 3 4 5 6 7

Time (h)

FB251(pDS49)O.D

FB184 (pAF58)FB184 (pAF58)

FB184 (pDS1)FB184 (pDS1)

FB184 (pDS16)FB184 (pDS16)

Time (h)Time (h)

ODOD550550

Promoter probe vectorPromoter probe vector

pKK232-8Ampr

Vettori per il clonaggio e l’analisi di sequenze regolative

Codoni di stop-traduzione leggibili in tutti e tre i moduli di lettura

Shine e Dalgarno (gaagg)

E. coliE. coli

CamCam phenotypephenotype

pKK232-8pKK232-8

pKK0001pKK0001

Working hypothesisWorking hypothesis

SSE. coliE. coli

(pKK232-8)(pKK232-8)

E. coliE. coli

(PKK001)(PKK001) RR

14C14CCam + Cam + AcetilAcetil--CoACoACATCAT

14C14CCam-Cam-Acetilato Acetilato + + CoACoA

E.coliE.coli EE.coli.coli(pKK232-8)(pKK232-8)

E.coliE.coli(pKK0001)(pKK0001)

Non Non acetilatoacetilato

MonoMono--acetilatoacetilato

Di-Di-acetilatoacetilato

CromatografiaCromatografia

SAGGIO CATSAGGIO CAT

E.coliE.coli(pKK0002)(pKK0002)

CAT ASSAY

CAT ASSAYCAT ASSAY

CLONING of the REGULATORY REGION upstream ofthe cam promoterless gene of the

PROMOTER-PROBE vector

CLONING CLONING of the of the REGULATORY REGION REGULATORY REGION upstream ofupstream ofthethe camcam promoterlesspromoterless gene gene of the of the

PROMOTER-PROBE PROMOTER-PROBE vectorvector

Strain Strain Plasmid Plasmid CAT CAT activityactivity**

E.coliE.coli hisBhisB -- 1.21.2

“ pKK232-8 “ pKK232-8 1.4 1.4

“ “ PKK0001 PKK0001 99.799.7

“ “ pKK0002pKK0002 1.5 1.5

**percentage of percentage of 1414CC--acetylated Camacetylated Cam; 0.01 ; 0.01 µµg g of total proteinsof total proteinsProfProf. Renato Fani. Renato Fani

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