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fisica24ore Biofisica
Il file PDB
HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3
Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)
[…]
http://www.rcsb.org/pdb
fisica24ore Biofisica
ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N
ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C
ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C
ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O
ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C
ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C
ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C
ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N
ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C
ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C
ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O
ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C
ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C
ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C
ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C
ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N
ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C
ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C
ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O
ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C
ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O
…
X Y Z
coordinatetipo diatomo
tipo diamminoacido
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1a3ncatena A
C
O
N
S
EME
Fe
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http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm
RASMOL v 2.7
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Tecniche computazionali
L’utilizzo complementare di tecniche di tipo sperimentale e di tipo
computazionale è l’approccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi
biologici.
Questa considerazione riguarda in particolare gli aspetti strutturali del problema, ovvero la
conoscenza della conformazione, o variazione di conformazione, di una molecola biologica in
relazione alla sua attività.
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Limiti delle tecniche sperimentali
risoluzione spaziale misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi
risoluzione energetica analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa
risoluzione temporale i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione
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Limiti delle tecniche computazionali
Sistemi biomolecolari troppo complessi meccanica classica con funzioni di interazione semi-empiriche per descrivere le interazioni tra gli atomi di un sistema molecolare
Campionatura limitata dello spazio delle conformazioni di una macromolecola utilizzo dei dati sperimentali per restringerlo
Simulazione del comportamento di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (<NA) atomi o di gradi di libertà (di solito 102-105 atomi), per un limitato periodo di tempo (102-104 picosecondi) può essere simulato piccoli sistemi, con tempi di rilassamento brevi
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importanza della COMPLEMENTARITA’
DELL’APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE
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Alcune Applicazioni
In primis: conoscere la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola per comprendere, spiegare, e a volte anche modificare ed utilizzare, la sua attività biologica.
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Monitorare i cambiamenti strutturali indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili.
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Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione.
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Studiare le variazioni conformazionali provocate dall’interazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce l’attivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).
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Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva.
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Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio d’azione.
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Modellizzazione molecolare
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Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)
L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa
Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina
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Diagramma di flussodella modellizzazioneproteica
Sequenza proteica
Allineamento multiplodi sequenza
Dati sperimentali
Ricerca nelle banchedati
Assegnazionedei domini
Proteinaomologa
nella banca datiPDB?
E’ statopredettoun fold?
Predizionedel fold
Predizione dellastruttura secondaria
Analisi della famiglia del fold
Allineamento dellestrutture secondarie
Allineamento dellasequenza alla struttura
Predizione dellastruttura terziaria
Modellizzazionecomparativa
Modello tridimensionaledella proteina
No
SìSì
No
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che viene usata come STAMPO.
Permette di costruire la struttura tridimensionale di
una proteina
sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con un’altra proteina
di struttura NOTA
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1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e “stampo”
Passi fondamentali
4mdh.aa 1 SEPIRVLVTG AAGQIAYSLL YSIGNGSVFG KDQPIILVLL DITPMMGVLD 11BMD 1 KAPVRVAVTG AAGQIGYSLL FRIAAGEMLG KDQPVILQLL EIPQAMKALE *.** *** *****.**** . *. * ..* ****.** ** .* * *. 4mdh.aa 51 GVLMELQDCA LPLLKDVIAT DKEEIAFKDL DVAILVGSMP RRDGMERKDL 11BMD 51 GVVMELEDCA FPLLAGLEAT DDPDVAFKDA DYALLVGAAP RKAGMERRDL **.***.*** .*** . ** * ..**** * *.***. * *. ****.** 4mdh.aa 101 LKANVKIFKC QGAALDKYAK KSVKVIVVGN PANTNCLTAS KSAPSIPKEN 11BMD 101 LQVNGKIFTE QGRALAEVAK KDVKVLVVGN PANTNALIAY KNAPGLNPRN * * *** ** ** ** * ***.**** ***** * * *.**.. * 4mdh.aa 151 FSCLTRLDHN RAKAQIALKL GVTSDDVKNV IIWGNHSSTQ YPDVNHAKVK 11BMD 151 FTAMTRLDHN RAKAQLAKKT GTGVDRIRRM TVWGNHSSTM FPDLFHAEVD *. .****** *****.* * * * .. . .******* .**. ** * 4mdh.aa 201 LQAKEVGVYE AVKDDSWLKG EFITTVQQRG AAVIKARKLS SAMSAAKAIC 11BMD 201 GRP----ALE LVDME-WYEK VFIPTVAQRG AAIIQARGAS SAASAANAAI .. * * . * ** ** *** **.* ** * ** ***.* 4mdh.aa 251 DHVRDIWFGT PEGEFVSMGI ISDGNSYGVP DDLLYSFPVT IKDKTWKIVE 11BMD 246 EHIRDWALGT PEGDWVSMAV PSQGE-YGIP EGIVYSFPVT AKDGAYRVVE .*.** .** ***. ***.. *.*. **.* . ..****** ** . ..** 4mdh.aa 301 GLPINDFSRE KMDLTAKELA EEKETAFEFL SSA 11BMD 295 GLEINEFARK RMEITAQELL DEMEQVKALG LI ** **.*.* .*..** ** .*.* .
* aa identici. aa simili
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2. Costruzione dello scheletro
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3. Inserimento delle catene laterali
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4. Inserimento dei loop corrispondenti a “buchi”
nell’allineamento
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5. Ottimizzazione del modello
Minimizzazione energetica
Regolarizzazione di legami, angoli
e torsioni
Eliminazioni di clash strutturali
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6. Controllo della qualità del modello
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Meccanica molecolare
e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING).
Comprende la DINAMICA MOLECOLARE,
la RICERCA DELL’ENERGIA CONFORMAZIONALE,
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Ad ogni conformazione molecolare è associata un’ENERGIA
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La forma più semplice dell’energia potenziale di una molecola è :
ENERGIA pot =
Energia di ALLUNGAMENTO dei legami
+ Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame
+ Energia di TORSIONE degli angoli diedri
+ Energia delle interazioni di NON-LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche
La meccanica molecolare considera gli atomi come sfere e i legami come molle.
Forma equazione + parametri = force field
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Ricerca dell’energia conformazionale
ii rVF
Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)
L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa
Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina
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La superficie dell'energia libera configurazionale di una proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono
molti stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto vicina al minimo globale (problema
della ricerca del minimo assoluto)
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Conformazione energeticamente preferita
minimo globale dell'energia potenziale
equilibrio
stato più popolato
risultante delle forze nulla ii rVF
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Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà
intramolecolari) che conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia più vicina (MINIMO LOCALE), usando
il minor numero di calcoli possibile.
Minimizzazione dell’energia
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Campionamento energetico sistematico:
L’energia viene campionata ad intervalli regolari sull’intera estensione di ciascun grado di libertà (tipicamente rotazioni dei legami).
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Annealing simulato: riscaldamento ad alta temperatura che modifica la struttura superando le barriere energetiche, seguito da un raffreddamento lento.
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Dinamica molecolare: superamento delle barriere energetiche conformazionali (più basse dell'annealing) e analisi della stabilità strutturale.
Ricerca casuale: campionamento che genera strutture in maniera casuale, le quali vengono poi minimizzate
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Dinamica molecolare
Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni
conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio:
stabilità delle proteine
variazioni conformazionali
folding proteico
trasporto ionico
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Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare
= la configurazione molecolare in funzione del
tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni,
le velocità e le accelerazioni degli atomi della
molecola.
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La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell’ equazione del moto di Newton
Fi = mi ai
per tutti gli atomi del sistema molecolare
Tenendo presente che la forza si può esprimere come gradiente dell'energia potenziale:Fi = - dV/dri
si combinano le due equazioni e si ottiene: - dV/dri = mi d
2ri/dt2
che collega la derivata dell'energia potenziale alle variazioni di posizione in funzione del tempo ed è quella che viene integrata.
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3. le accelerazioni sono determinate dal gradiente dell'energia potenziale.
Perciò per calcolare una traiettoria c'è bisogno: 1. delle posizioni iniziali degli atomi (coordinate
atomiche) 2. delle velocità iniziali 3. delle accelerazioni
1. le posizioni inziali ri si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling;
2. le velocità iniziali vi si ottengono dalla distribuzione delle velocità ad una data temperatura;
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In pratica si considerano intervalli di integrazione finiti t. t tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi molecolari una simulazione di 100 ps coinvolge 105-106 intervalli di integrazione.
Le posizioni e le velocità iniziali (t = 0) determinano le posizioni e le velocità a tutti gli
altri tempi t.
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Sistema allo zero assoluto
Temperatura di simulazione desiderata
Riscaldamento lento alla temperatura di simulazione
Riequilibrazione dell’energia tra gli atomi
Distribuzione iniziale di velocità vi
Energia cinetica totale del sistema
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Struttura iniziale
rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali
nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole d’acqua
per equilibrarlo con la struttura
la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia
Fase di simulazione vera e propria
Minimizzazione dell’ energia
Solvatazione della proteina
Minimizzazione dell’ energia in presenza
del solvente
Fase di riscaldamento
Fase di equilibrazione
si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata.
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Analisi dei risultati
Campionamento periodico di coordinate (e velocità)
Calcolo dell’energia potenziale media in funzione del tempo
Calcolo della differenza con la struttura di partenza in
funzione del tempo
Calcolo della superficie accessibile al solvente e del
raggio di girazione, in funzione del tempo
Calcolo della struttura media
Residue number10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
100ps
200ps
300ps
400ps
500ps
600ps
700ps
800ps
900ps
1000ps
1100ps
1200ps
1300ps
1400ps
1500ps
1600ps
1700ps
media
-helix
-strand
S1 H1 H2 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
0 500 1000 1500 2000-900
-800
-700
-600
-500
-400
-300
-200
-100
0
100
200
Ene
rgia
pot
enzi
ale
(Kca
l/mol
)
tempo (ps)
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Riconoscimento molecolare
E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch)
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La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici.
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Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi
Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la
bioattività
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1. Ricerca del composto guida (1-2 anni)2. Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni)3. Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni)4. Test tossicologici (1-3 anni)5. Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno)6. Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni)
tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco
è di grande importanza l’identificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità
Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni
Costo totale: circa $ 500 000 000
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Screening sperimentale:
test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le
proprietà strutturali del recettore
Metodi computazionali
detti Rational Design:si basano su informazioni strutturali del
recettore e/o del ligando
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Metodi computazionali
Struttura 3D del recettore NON nota Struttura 3D del recettore nota
Structure Based Drug DesignQSAR (Quantitaive Structure-Activity
Relationship)Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e l’attività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall’analisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore.
De Novo DesignI nuovi composti vengono generati
nel sito di legame a partire da atomi o
frammenti preposizionati nel
sito e che successivamente
vengono trasformati in
molecole intere da softwares specifici.
Screening VirtualeLibrerie di molecole
(esistenti o ipotetiche) vengono analizzate
cercando ligandi con caratteristiche in
accordo con i requisiti del sito di legame
Docking
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Predice la struttura 3D di complessi proteina-ligando.
Tali funzioni valutano:
•Complementarità fra superficie
•Energia libera di solvatazione
•Interazioni elettrostatiche e idrofobiche
Trova il corretto modo di legame di un composto, tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni combinazione confomazionale ligando-recettore.
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Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per:•la modellazione di sistemi proteici•la comprensione dei processi biologici•la comprensione della relazione struttura-attività•la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici
Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e
indirizzando le conoscenze sperimentali