EXTRACCIÓN DE DNA

MITOCONDRIAL

EQUIPO 1:

Cuenca Pérez Emir Moisés

Estrada Aguilar Flor Ivonn

Flores Pimentel Felipe Antonio

Marcelino Ayala Manuel

Sánchez Arrieta Yesssenia

Las mitocondrias son orgánulos que se encuentran en las células eucariotas

Contienen las enzimas para la mayoría de las reacciones oxidativas que generan energía para las funciones

celulares.

• Poseen varias características importantes que las hace un poco diferentes del resto de los orgánulos de las células eucariotas.

Por ejemplo, son orgánulos de doble membrana, poseen una envoltura exterior y una envoltura interior. la característica más sorprendente y diferencial es que poseen su propio ADN (ADNmt).

ADN

• Se trata de una molécula circular de ADN, helicoidal, con doble hebra, y supercondensada.

• En los seres humanos tiene un tamaño aproximado de 16569 pares de bases mientras que en levaduras contiene cerca de 80000 pares de bases y en plantas varía entre 100 y 2000 kb.

ADN Mitocondrial

El ADN MITOCONDRIAL se hereda en todas las personas ,es procedente de la madre.

Nos permite ver las relaciones hermano-hermano de madre.

• TIPOS DE MUESTRA

(Sangre, pelos, saliva, semen, etc...).

• ESTADO DE LA MUESTRA

(Buen estado ó degradada).

• CANTIDAD DE MUESTRA

(Indicios mínimos, o cantidad suficiente).

Pretratamineto

• Limpieza superficial de los RO o dientes, para la

eliminación de los posibles contaminantes

(material exógeno y/o bacterias).

• Se realizan lavados con agua destilada o

eliminación de la capa superficial mediante

abrasión mecánica o lijado.

• Irradiación de las piezas a analizar con luz

ultravioleta.

• Pulverización.

• Descalcificación del polvo de hueso

mediante lavados con EDTA, que es un

quelante iónico que actúa secuestrando

las sales iónicas contenidas en la

muestra, incluyendo el calcio de los

huesos.

EXTRACCIÓN

PROTOCOLO: “Extracción de

ADN por fenol:cloroformo” • Las muestras son digeridas con proteinasa K

y un detergente como Triton X-100 o SDS, que rompe las membranas celulares.

• El digerido es mezclado con una solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:25:1), paso que es repetido hasta eliminar la coloración.

•Para eliminar las trazas de fenol, se puede anadir una solución de cloroformo:alcohol isoamílico .

•La fase acuosa, que contiene el ADN se trasvasa a un tubo limpio.

• A partir de este punto, se incluye una fase de precipitación con acetato amónico y etanol absoluto frío, introduciendo la concentración en pequeños volúmenes ,usando sistemas de filtración por centrifugación.

• Dicha concentración se realiza mediante dispositivos de ultrafiltración 80,81, que permiten la retención selectiva del ADN extraído.

Protocolo

«Desmineralización-silica» • Presenta 2 claves fundamentales: la

digestión completa, aumentando la proporción de tampón de digestión y polvo de hueso; y la eliminación de inhibidores, mediante la purificación con resina.

• Digestión inicial de toda la matriz ósea, lo que supone una desmineralización total.

• El tampón de desmineralización consiste en EDTA (0,5 M), laurilsacnosinato sódico (1%) y proteinasa K.

• Una vez digerido, el sobrenadante es filtrado en dispositivos de ultrafiltración92, y el volumen recuperado

• Pasa a ser procesado siguiendo las especificaciones de la casa comercial del kit QIAquick®.

Silica-sal • Se añade polvo de hueso/diente de una

solución de extracción, consistente en EDTA y proteinasa K.

• Dejar incubar toda la noche

• Al sobrenadante obtenido se le añade una solución de unión de base de tiocianato de guanidinio (GuSCN) concentrado y cloruro o acetato sódico (NaCl/Ac), y la suspensión de silica

• Incubar en obscuridad

• Una vez descartado o almacenado el sobrenadante al precipitado de silica someter a lavados con solución de lavado de base etanólica (EtOH 50%, NaCl yEDTA)

• Finalmente se añade la cantidad requerida de tampón TE para eluir el ADN retenido en la silica.

• NOTA:

Para muestras que no contienen inhibidores de la PCR, se pueden usar otras sales diferentes, como el cloruro sódico. Estas sales no caotrópicas son mucho más baratas y actúan igual de bien o incluso mejor en términos de recuperación de ADN. Pero, tienden a copurificar inhibidores de la PCR y, por tanto, no deben ser usadas con muestras que probablemente contengan inhibidores.

Bibliografía

• Barrio-Caballero PA. Revisión de métodos

de extracción de ADN a partir de restos

óseos en el laboratorio forense. Rev Esp

Med Legal. 2012.

http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.00

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