FUNDAMENTOS DE LA MANIPULACION GENETICA

Benjamín Paz Aliaga M.D.; MSci. DMS

Profesor Emérito de la UNSA

Profesor Principal de la UCSM

2009

DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DEL ADN

REPLICACION DEL ADN BACTERIANO

DNA RNA

PROTEINA

EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

FUNCIONAMIENTO DE LOS GENES

EXPRESION GENICA

RIBOSOMA

SUBUNIDAD MENOR

SUBUNIDAD MAYOR

PARTICIPACION DEL RIBOSOMA EN LA SINTESIS PROTEICA

REGULACION DE LA EXPRESION GENICA ( OPERON LAC)

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y LOS LUGARES DE CORTE DEL DNA

ENZIMAS DE RESTRICCION

ACCION DE LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ECO R1 SOBRE UN PLASMIDO

ACCION DE LA DNA LIGASA

ACCION DE LA ENZIMA DE RESTRICCION Eco R 1

ELECTROFORESIS DE UN FRAGMENTO DE DNA CORTADO Y SIN CORTAR CON UNA ENZIMA DE RESTRICCIÓN

SEPARACION ELECTROFO-RETICA DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION

PLASMIDO

MICROGRAFIA ELECTRONICA DE UN PLASMIDO BACTERIANO

PLASMIDO pBR322

FORMACION DE LA MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE

DNA RECOMBINANTE

VECTORES DE DNA

VEHICULOS DE CLONAJE

• TIPOS:

1. Plásmidos

2. Fagos

3. Cósmidos

4. Cromosoma artificial de bacteria (BAC)

5. Cromosoma artificial de levadura (YAC)

VEHICULOS DE CLONAJE

• TIPOS:

– Plásmidos, que son moléculas extracromo-

somales de DNA circular que se replican autónomamente en el interior de la célula bacteriana. Tamaño del inserto a clonar: de 100 a 10,000 bp ( 0.1kb -10kb)

VEHICULOS DE CLONAJE

• TIPOS:

- Fagos, que son derivados del bacteriófago λ. Moléculas de DNA lineal que tienen un sector que no es útil para la replicación y que puede ser reemplazado por el DNA extraño.

Util para clonar fragmentos de 8 a 20 kb

VEHICULOS DE CLONAJE

• Cósmidos,son moléculas de DNA circular extracromosomal que combinan las carácterísticas de los plásmidos y de los fagos.

El tamaño del fragmento a clonar en estos vectores oscila entre 35 a 40 kb

TAMAÑO DEL INSERTO EN DIFERENTES VEHICULOS

CLONADORES

YAC (Cromosoma artificial de levadura)100- 1000 kb

• BAC (Cromosoma artificial bacteriano)

75- 300 kb

• Cosmido 35 - 50 kb• Fago λ 8 - 20 kb• Plásmido 0.1- 10 kb

MARCADORES DE PESO MOLECULAR

DNA RECOMBINANTE

Construcción de una molécula de ADN recombinante

FORMACION DE LA MOLECULA DE ADN RECOMBINANTE

PLASMIDO CON INSERTO CRECIENDO Y MULTIPLICANDOSE EN UN CULTIVO BACTERIANO

CONSTRUCCION DE MOLECULAS DE ADN RECOMBINANTE

CLONAJE DE FRAGMENTODE ADN EN UN PLASMIDO

CLONAJE DE FRAGMENTOS DE ADN USANDO EL FAGO COMO VRECTOR

DETECCION DE GENES RELACIONADOS CON LA EXPOSICIÓN DE NUTRIENTES

INGENIERIA GENETICA

CONSTRUCCION DE UNA BIBLIOTECA GENOMICA

IDENTIFICACION DE LAS CLONAS QUE CONTIENEN LOS PLASMIDOS CON LOS FRAGMENTOS BUSCADOS

TECNICA DEL SOUTHERN BLOTT

IDENTIFICACION DE LOS FRAGMENTOS BUSCADOS MEDIANTE AUTORRADIOGRAFIA

CLONAJE DE GENES DE DROSOPHILA

COSMIDO RECOMBINANTE

BIBLIOTECA GENOMICA

OBTENCION DE UNA CLONA GENOMICA Y UNA CLONA cDNA

FORMACION DE LA MOLECULA DE cDNA

AISLAMIENTO DEL mRNA

METODO PARA CONVERTIR EL mRNA en cDNA DE DOBLE HEBRA

CONSTRUCCION DE UNA BIBLIOTECA GENOMICA Y UNA BIBLIOTECA cDNA

CLONAJE DE UN cDNA DE DOBLE HEBRA EN UN FAGO VECTOR

SELECCIÓN DE UNA LIBRERÍA CON UNA SONDA DE ACIDO NUCLEICO PARA DETECTAR UN GEN

EXPRESION DE UN GEN INSERTO EN UN PLASMIDO

EXPRESION DE UN GEN NORMAL Y MUTADO

EXPRESION DE LAS BIBLIOTECAS

BIOLOGIA MOLECULAR: HACE POSIBLE EL DESPLAZAMIENTO DE LA PROTEÍNA AL GEN Y VICEVERSA PARA UN MEJOR ESTUDIO

USO DE LA HIBRIDIZACION IN SITU PARA LA LOCALIZACION DE LOS GENES EN LOS CROMOSOMAS

(Cromosoma humano 5)

MARCACION DE LAS CELULAS QUE EXPRESAN UN TIPO PARTICULAR DE RNA MENSAJERO

( Mensajero de la proteína ciclina)

PCR

PCR

USO DE PCR PARA LA DETECCION DEL HIV EN EL SUERO DE UN PACIENTE

USO DE LA PCR EN MEDICINA FORENSE

KNOCKOUT DE UN GEN

PRODUCCION DE UN ANIMAL TRANSGENICO

SECUENCIACION DEL ADN POR EL METODO DE SANGER