HIGH PERFORMA LIQUID

CHROMATOGRAPH

Indriyanti Widya

Department of Pharmacy, Health Faculty

University of Darussalam Gontor

2016

HISTORICAL

Historically, high-performance liquid chromatography (HPLC) can be traced back to the amino acid analyzers of the early 1960s. By 1975, liquid chromatographic instrumentation was described in the United States Pharmacopeia.

Since that time, HPLC has become the most popular chromatographic technique in the pharmaceutical laboratory

DEFINITION

Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase) dengan menggunakan fase gerak (mobile phase) mengaliri semua ini

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-wa dengan fase diam dan fase gerak

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

Kedua hal ini berguna untuk : analisis kualitatif digunakan informasi tR, analisis kuantitatif digunakan informasi luas area/tinggi puncak kromatogram

QUANTITATIVE AND QUALITATIF ANALYSIS

USABILITY HPLC

Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis

Analisis ketidakmurnian (impurities)

Analisis senyawa tidak mudah menguap (non volatile)

Penentuan molekul-moleku netral, ionik, maupun zwitter ion

Isolasi dan pemurnian senyawa

Pemisahan senyawa-senyawa yg strukturnya hampir sama

Pemisahan senyawa-senyawa dlm jml sekelumit (trace elements)

Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu

EXCESS HPLC

KCKT dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan senyawa berbobot molekul tinggi.

KCKT dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian besar non volatile.

KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan panas

Pada KCKT kemungkinan intaraksi antara fase gerak dan fase diam besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen dan reaksi ion) proses pemisahan lebih optimal

Fase gerak pada KCKT dapat diubah dengan mencampur pelarut dalam berbagai gradient

Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)

SHORTAGE OF HPLC

Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dg spektrometer massa

Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit diperoleh

RESOLUTION

Tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan

Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak tumpang tindih

RESOLUTION Resolution is a measure of the effective separation of

adjacent analyte peaks.

Resolution of two peaks is aided by thermodynamic factors, which give rise to partitioning and separation (ie-K), and it is countered by kinetics, which can give rise to additional dispersion of a peak, making otherwise well separated peaks merge with each other.

COMPONENTS OF HPLC INSTRUMENTS

1.Wadah fase gerak

2.Sistem penghantaran fase gerak = Pompa

3.Alat utk memasukkan sampel

4.Kolom

5.Detektor

6.Wadah penampung buangan fase gerak

7.Tabung penghubung

8.Suatu komputer atau integrator atau perekam

CAUTION

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas)

Pelarut yang digunakan harus dengan kemurnian tinggi (HPLC grade)

SYUKRON