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Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of very low-density lipoproteins
Hua Huang*, Fang Sun*, David M. Owen ₣, Weiping Li‡, Yan Chen*, Michael Gale Jr. ₣, and Jin Ye*§
Departments of *Molecular Genetics, ₣Microbiology, and ‡Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390-9046
IntroductionIntroduction
Le virus HCVLe virus HCV Virus à ssRNA (+)Virus à ssRNA (+) Sécrété en abondance uniquement par hépatocytesSécrété en abondance uniquement par hépatocytes
Facteurs de spécificité tissulaire ?Facteurs de spécificité tissulaire ? Une partie du virus circule lié aux VLDLUne partie du virus circule lié aux VLDL
Complexe de réplicationComplexe de réplication
Réplication virale a lieu Réplication virale a lieu dans une ultrastructure dans une ultrastructure associée à la membrane : associée à la membrane : « « membranous webmembranous web » »
Visualisé sur HuH7 Visualisé sur HuH7 contenant un réplicon de contenant un réplicon de HCV 1bHCV 1b
Uniquement protéine NSUniquement protéine NS Réplication sans Réplication sans
production de particules production de particules infectieusesinfectieuses
Nature et composition des «membranous web» non étudiée
Synthèse des VLDLSynthèse des VLDL
Particules sphérique de 30 à 80nmParticules sphérique de 30 à 80nmRôle d’export tissulaire des TGRôle d’export tissulaire des TGComposition des VLDLComposition des VLDL
Protéine de structure : apoB-100 et apoEProtéine de structure : apoB-100 et apoE Chargement de TG via MTP dans ER + GolgiChargement de TG via MTP dans ER + Golgi
56% TG56% TG19% PL19% PL12% EC12% EC
Purification des « membranous web »Purification des « membranous web »
Ligné HuH7 – 5A-GFP-6Ligné HuH7 – 5A-GFP-6 NS5A taggé GFP en COOH NS5A taggé GFP en COOH
terminalterminal
Isolation immunomagnétique Isolation immunomagnétique des vésicules par des billes des vésicules par des billes Dynabeads coatées par anti-Dynabeads coatées par anti-GFPGFP
Homogénéisation des cultures Homogénéisation des cultures cellulairescellulaires
Séparation et récupération des Séparation et récupération des vésicules liées et non liéesvésicules liées et non liées
Contenu en protéines viralesContenu en protéines viralesdes « membranous web »des « membranous web »
SDS/PAGE + ImmunoblotEnv 50% NS5A dans
vésicules liées
50% des autres NSP
Pas de contamination
10%
Contenu en HCV RNAContenu en HCV RNAdes « membranous web »des « membranous web »
Signal uniquement dans vésicules extraites par
billes taggés
qRT-PCR
Vésicules purifiées enrichies en RNA viral et en protéines NS
= COMPLEXE de REPLICATION
Caractérisation des protéines associées Caractérisation des protéines associées aux CdR des « membranous web »aux CdR des « membranous web »
Vésicules attachées solubilisées
Extrait analysé par SDS/PAGE
Excision des bandes
Digestion trypsine
Tandem MS
> 30% des protéines identifiées impliquées dans métabolisme
lipidique
Dont MTP et ApoE
Données bibliographiquesDonnées bibliographiques Cliniquement : association dans le plasma VLDL - HCVCliniquement : association dans le plasma VLDL - HCV
ApoB-100 non retrouvéApoB-100 non retrouvé Masse moléculaire élevée (540 kDa)Masse moléculaire élevée (540 kDa) Hydrophobicité globaleHydrophobicité globale
Confirmation de la présence Confirmation de la présence d’ApoB, ApoE et MTP dans d’ApoB, ApoE et MTP dans
les vésiculesles vésicules
50% de MTP30% d’ApoE50% d’ApoB
Colocalisation par Colocalisation par immunofluorescenceimmunofluorescence
Colocalisation ponctiforme de NS5A et ApoB
Vésicules contenant NS5A
et ApoB
Origine des vésicules : ER ou Golgi ?Origine des vésicules : ER ou Golgi ?
Vésicules obtenues après immuno-isolation magnétique solubilisées puis Vésicules obtenues après immuno-isolation magnétique solubilisées puis traitées :traitées :
Endoglycosidase H : hydrolyse liaison N-sucres des protéines de l’ER Peptide N-glycosidase F : hydrolyses toutes les liaison N-sucres
Sensible à Endo H
ApoB sécrétée insensibles à Endo HVésicules contenant le
CdR dérivent de l’ER
Sécrétion des VLDL et réplicationSécrétion des VLDL et réplication
HuH7 – 5A-GFP-6 traitées par inhibiteur de MTP (BMS-2101038)HuH7 – 5A-GFP-6 traitées par inhibiteur de MTP (BMS-2101038) Inhibition chargement VLDL provoque ubiquitinilation ApoB Cellules lavées avant incubation avec inhibiteur : éviter contamination de ApoB
sécrétée
Sécrétion des VLDL non nécessaire à la réplication virale
Sécrétion des VLDL et libération de Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieusesparticules infectieuses
Souche HuH7 – GL avec cDNA de HCV 2a intégré dans le génome, Souche HuH7 – GL avec cDNA de HCV 2a intégré dans le génome, produisant constitutivement du virus infectieuxproduisant constitutivement du virus infectieux
Incubation +/- MTP
Diminution HCV dans le milieu n’est pas du à une diminution de synthèse
Sécrétion des VLDL et libération de Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieusesparticules infectieuses
Souche HuH7 – GL transfectée avec siRNA dirigé contreSouche HuH7 – GL transfectée avec siRNA dirigé contre ApoB GFP
Immunoblot sur le surnageant de culture
Diminution de 50%
Diminution de 70%
Inhibition importante mais moins efficace que MTP
Purification vésicules caractéristiques de complexe de Purification vésicules caractéristiques de complexe de réplication du HCVréplication du HCV
Ces données + données cliniques suggères que les particules Ces données + données cliniques suggères que les particules de HCV sont incorporées aux VLDL durant l’assemblage des de HCV sont incorporées aux VLDL durant l’assemblage des lipoparticuleslipoparticules
Test d’inhibition au MTPTest d’inhibition au MTP : sécrétion résiduelle de virus (20%) : sécrétion résiduelle de virus (20%) Voie VLDL-indépendante ?Voie VLDL-indépendante ? Faibles quantités de VLDL sous le seuil de détection de Faibles quantités de VLDL sous le seuil de détection de
l’immunoblot suffisantes à la sécrétion ?l’immunoblot suffisantes à la sécrétion ?
Dans intestin ApoB48 participe à formation des chylomicronsDans intestin ApoB48 participe à formation des chylomicrons Pas de sécrétion de HCV par l’intestionPas de sécrétion de HCV par l’intestion Protéines impliquées dans l’assemblage des VLDL responsables Protéines impliquées dans l’assemblage des VLDL responsables
de la spécifité tissulaire ?de la spécifité tissulaire ?
DiscussionDiscussion
Production virale continuelle nécessaire à maintient du virusProduction virale continuelle nécessaire à maintient du virus
Thérapeutique ciblant l’assemblage ou la sécrétion des VLDL Thérapeutique ciblant l’assemblage ou la sécrétion des VLDL pourrait être efficacepourrait être efficace
siRNA dirigé contre ApoB inhibe sécrétion VLDL chez la souris et siRNA dirigé contre ApoB inhibe sécrétion VLDL chez la souris et le primatele primate
RNA antisens dirigé contre ApoB et inhibiteur de la MTP utilisés en RNA antisens dirigé contre ApoB et inhibiteur de la MTP utilisés en essais clinique chez l’homme dans les dyslipidémiesessais clinique chez l’homme dans les dyslipidémies
Traitement à court terme entraîne peut d’effets secondaires, Traitement à court terme entraîne peut d’effets secondaires, avec accumulation de graisse hépatique faible et réversibleavec accumulation de graisse hépatique faible et réversible
DiscussionDiscussion
Test des inhibiteurs de la MTP en traitement à court terme de l’infection à HCV