Instrumentos de Laboratório Clínico

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Instrumentos de

Laboratório Clínico

Prof. Sérgio Francisco Pichorim

Baseado no cap. 11 do Webster

Introdução: Laboratório Clínico

• Químico, Hematologia e Microbiologia

• Sangue, Urina, Fluido cérebro-espinhal

• Outros fluidos

• Altamente importante a precisão do diagnóstico ou resultado

• Resposta rápida é o ideal.

ESPECTROFOTÔMETRO

• Fotômetro e colorímetro (intensidade e l)

• Substâncias absorvem / emitem diferentes comprimento de onda l

• 200 a 400 nm – ultravioleta

• 400 a 700 nm – visível

• 700 a 800 nm – infravermelho

Varredura de l na cubeta Figure 11.1 Block diagram of a spectrophotometer (Based on R. J. Henry, D. C. Cannon, and J. W. Winkelman, eds., Clinical Chemistry, 2nd ed. Hagerstown, MD: Harper & Row, 1974.)

1) Fonte de luz

• 200 a 360 nm : lâmpada de descarga

• 360 a 800 nm : lâmpada de filamento tungstênio

• Desafio: 90% da energia está no IR (calor)

2) Seletor de l

• Sequência de filtros – vária combinações (janela de l larga)

• Monocromador (prisma ou rede de difração) (janela de l estreita = 0,5 nm)

3) Cubeta

• Deve alterar o mínimo possível a absorção

• Pode-se aplicar uma curva de compensação para correção

4) Lei de Beer-Lambert

• Pi e Po: potência (ou intensidade) incidente e de saída

• a: absortividade da substância na amostra

• L: caminho da luz ou espessura da amostra

• C: concentração

Po = Pi . 10 (- a . L . C)

• Transmitância T% = Po/Pi . 100%

• Absorbância A = a . L . C

Exemplo: Sieczka e Pichorim (2015), “DETECTION OF GASOLINE ON SEA WATER APPLYING TRANSMITTANCE CURVE WITH ARTIFICIAL NEURAL NETWORK AND 400-NM LED”

Figure 1: Transmittance curves (T%) for mixture gasoline on sea water.

Figure 2: Transmittance curve (T%) in 400 nm for gasoline thickness on sea water.

Lei de Beer-Lambert: Po = Pi . 10 (- a . L . C)

• Transmitância T% = Po/Pi . 100%

• Absorbância A = a . L . C ∴ T = 10 - A

• Se a e L são conhecidos e constantes (substância conhecida)

Cx = Cs . Ax / As

(s = sabido, x = desconhecido)

• Exemplo: A concentração de Ca++ no soro sanguíneo (sérum) de 6 mg/dl provoca uma transmitância de 50% no espectrofotômetro (em um certo l). Se uma outra amostra desconhecida de soro tiver transmitância de 15% no mesmo l, qual a concentração de Ca++ dessa outra amostra?

• Ts = 0,5 A = - log T As = 0,301

• Tx = 0,15 A = - log T Ax = 0,824

• C = 6 . 0,824 / 0,301 = 16,8 mg/dl

5) Sistema fotométrico

• Fotossensor (fotodiodo ou PMT)

• Amplificador (transimpedância)

• Digitalização

• Correção da curva de resposta do sensor

Figure 11.2 Block diagram of instruments for (a) Flame Emission (Based on R. J. Henry, D. C. Cannon, and J. W. Winkelman, eds., Clinical Chemistry, 2nd ed. Hagerstown, MD: Harper & Row, 1974.)

Emissão atômica (luz emitida não usa lâmpada!) Para concentração de metais puros: Na+, K+, Ca++ e Li+ O Li+ é usado para calibração

Figure 11.2 Block diagram of instruments for (b) Flame Absorption. (Based on R. J. Henry, D. C. Cannon, and J. W. Winkelman, eds., Clinical Chemistry, 2nd ed. Hagerstown, MD: Harper & Row, 1974.)

Absorção atômica Para concentração de metais puros: Fe, Pb, Ca, Cu, Zn e Mg

Flame Absorption

• Lâmpada de Catodo Oco:

catodo revestido com o metal sob análise

• Alta tensão gás nobre tampão plasma

• Aquecendo o catodo vaporiza o metal

• Emite com l bem definido

• Disco de rotação (chopper) para diferenciar a emissão da chama da absorção da chama

• Demodulador sincronizado com a rotação do disco

FLUORESCÊNCIA

• Absorve energia em li e emite fótons com lo

• Po menor que Pi (lo é maior que li)

• Perpendicular para evitar a direta transmissão de li

• Alta especificidade: poucos são as substâncias fluorescentes

• Vantagem: alta sensibilidade

• Desvantagem: sensível a pH e a temperatura

Figure 11.3 Block diagram of a fluorometer (Based on R. Hicks, J. R. Schenken, and M. A. Steinrauf, Laboratory Instrumentation. Hagerstown, MD: Harper & Row, 1974. Used with permission of C. A. McWhorter.)

Exemplo (Sensors 2018, 18(6), p.1953; doi.org/10.3390/s18061953, Polystyrene Oxygen Optodes Doped with Ir(III) and Pd(II) meso-Tetrakis (pentafluorophenyl) porphyrin Using an LED-Based High-Sensitivity Phosphorimeter, Alexandre F. Moraes Filho, Pedro M. Gewehr, Joaquim M. Maia and Douglas R. Jakubiak)

CROMATOGRAFIA

• Método para separar as partes de uma mistura de substâncias

• Apesar do nome, não tem relação com “cores”

• Detecção de substâncias complexas: drogas e hormônios

• Injetor: amostra (1 a 5 ml) + solvente + calor evaporação

• Gás portador inerte: N2 ou He varre a injeção para dentro da coluna

• Coluna: f 7 mm

• 1 m de comprimento

• Material poroso

• Terra diatomácea

• Temp. controlada

Figure 11.4 Block diagram of a gas-liquid chromatograph (GLC)

• Detector:

• Analisa o gás efluente

• Ionização ou condutividade térmica

• Mede a concentração e o tempo de trânsito na coluna

Figure 11.5 Example of a GLC recording for the analysis of blood levels of phenobarbital (peak a) and phenytoin (peak c). Peak b corresponds to the level of heptabarbital (the internal standard). Medicamento anticonvulsivante, hipnótico ou sedativo.

Cromatografia

• Tempo menor que 1 hora

• Geralmente 15 minutos

• Pode detectar até 1 ng de substância

ELETROFORESE

• Método para separar proteínas, enzimas, anticorpos, DNS, RNA, etc

• Separação por carga, massa e forma

• Diferente migração em um campo elétrico E

• Mobilidade do íon (molécula com carga):

m = distância percorrida / (tempo . E)

[ m / ( s . V/m) ] = [m2/(V.s)]

Figure 11.6 Cellulose acetate electrophoresis (Based on R. Hicks, J. R. Schenken, and M. A. Steinrauf, Laboratory Instrumentation. Hagerstown, MD: Harper & Row, 1974. Used with permission of C. A. McWhorter.)

Eletroforese

• Buffer: “pista” de migração

• Concentração, pH e temperatura devem ser definidas e constantes

• Tensão constante de 250 V (E constante)

• Tempo constante (15 a 20 minutos)

• Corrente constante (4 a 6 mA) evitar aquecer o buffer por efeito Joule

• Materiais: papel, acetato de celulose, gel de amido, gel de agarose, poliacrilamida, etc

Eletroforese

• Várias pistas em paralelo mesmas condições

• Análise por comparação entre elas

• Visualização das faixas:

fixador e corantes

• Aplica-se luz

fotodiodo ou

câmera CCD

Figure 11.7 Examples of patterns of serum protein electrophoresis The left-hand pattern is normal; the right-hand pattern is seen when there is an over production of a single type of gamma globulin.

Exemplo de Eletroforese:

• Mestrado PPGEB: M. C. Estrela (2017) “AVALIAÇÃO DE UMA ANÁLISE AUTOMATIZADA PARA DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA”

• Atividade da enzima Taq DNA Polimerase

• Gel de Agarose, 100 V, 250 mA por 65 min.

• Luz UV e câmera CCD imagem JGP

• Proc. Imagem programa MatLab®

HEMATOLOGIA

• Hematócrito : Percentagem do volume sanguíneo ocupado pelas células.

• Centrifugação: 3000 rpm, 1.500∙g , 15 min.

• Valores:

40 a 54% nos homens

35 a 47% nas mulheres

Hematologia

• Contagem Eritrocitária (glóbulos vermelhos):

– 4,6 a 6,2 milhões por mm3 (=ml) nos homens e

– 4,2 a 5,4 milhões por mm3 nas mulheres.

• Contagem Leucocitária (600 vezes menor):

– 4,5 a 11 mil por mm3.

• Os principais leucócitos:

– transporte de anticorpos (monócitos),

– coagulação sanguínea (basófilos) e

– fagocitose (neutrófilos e monócitos).

Hematologia

• Plaquetas : Cerca de 1/20 dos eritrócitos:

– 250 a 500 mil por mm3.

• Plasma : 90% de água, 7% proteínas, 1% substâncias orgânicas, 1% substâncias inorgânicas e 0,9% de cloreto de sódio.

• Concentração de Hemoglobina (Hb):

– 13,5 a 18 gramas por decilitro.

Hematologia

• Volume Globular Médio (V.G.M.) : Volume médio do glóbulo vermelho (RBC).

– Valores entre 82 a 98 µm3 (µm3 = fl).

• Hemoglobina Globular Média (Hb.G.M.) : Quantidade média de hemoglobina por RBC.

– Valores entre 27 a 31 pg.

• Concentração de Hemoglobina Globular Média (C.Hb.G.M.): Concentração média de hemoglobina por RBC.

– Valores entre 32 a 36 %.

Hematologia: Exemplo 11.3 Para um número de glóbulos vermelhos (N.G.) de 5 milhões por mm3 , hematócrito (H) de 45% e concentração de hemoglobina (Hb) de 15 g/dl, calcular: V.G.M. , Hb.G.M. e C.Hb.G.M.

Hematologia • RDW: Red Cell Distribution Width ou

Amplitude de Distribuição dos Glóbulos Vermelhos.

• Curva gaussiana

• Pode indicar Anemia

• RDW = desvio padrão VGM / média VGM

– Valores entre 11,5 a 15,5 %.

Figure 11.9 Coulter STKS aperture bath. CONTADOR DE CÉLULAS POR VARIAÇÃO DE IMPEDÂNCIA (R)

Internal electrode

Blood cell suspension

Aperture tube

Detail of aperture (WBC)

Aperture

Sample beaker

External electrode

Vacuum (6"Hg)

Aperture current

100 mm

• Diluidor 1: 1/224 vezes

• Agente de lise celular (lysing) rompe RBC

• Diluição final de 1/250

• Hb + solução Drabkin Ciano.Meta.Hb espectrofotômetro para conc. Hb

• Contagem Leucócitos (WBC) em triplicata

Equipamento para Hematologia

• Diluidor 2: para contagem de plaquetas e de Eritrócitos (RBC)

• Contagem em triplicata

– De 2 a 20 fl plaqueta

– Se maior 36 fl eritrócito

• Volume celular é medido em função da variação de Impedância elétrica (DR)

Figure 11.8 A block diagram of a Coulter Model STKS. (Modified from J. Davidsohn and J. B. Henry, Todd Sanford Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 15 ed. Philadelphia: W. B. Saunders Co.) Analyzer computer

RBC bath

WBC bath

Data management system

Laboratory computer system

Printer

Lysing agent

WBC stabilizing agent

Triple transducer module

Diluter I Diluting fluid

Diluter II

Hemoglobin- ometer

C C C C C C

Lysing and mixing

• Estabilizador preservar os WBC

• Agente de lise celular (lysing) rompe RBC

• Módulo Triplo Transdutor: movimento dos WBC em um fluxo fila de células

– Condutividade em alta freq.

– Impedância em baixa freq. VOLUME (y)

– Laser: Luz dispersada (x)

Figure 11.10 Two-dimensional scatterplot.

Monocytes

Lymphocytes

Neutrophils

Light scatter

Eosinophils

Figure 14 Block diagram of HEMATRAK (From M. Levine, "Automated differentials: Geometric Data's HEMATRAK," Amer, J. Med. Tech., 40: 464, 1974.)

Stage and focus motor drives

Cytoplasm morphology

Nucleus morphology

Granularity

Nuclear/cytoplasm ratio

Chromatin pattern

Vacuolization

Neutrophils

Eosinophils

Monocytes

Basophils

Lymphocytes

Atypical lymphocytes

Blast-like cells

Nucleated erythrocytes

Other immature cells

Image memory

Video scanner Color

analyzer

Morphological analyzer

Recognition computer

Reference memory

Normal cell counters

"Suspect“ cell counters

Keyboard

Video display

Printer

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