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Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
Neurobiología
Neurobiology
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Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
MICROTUBULOS MICROTUBULES
Jefe de Línea / Group Leader: Jesús Avila de GradoPersonal Científico Scientific Personnel: Rosario Armas Portela, Javier Díaz Nido, Filip Lim,
Juan José Lucas Lozano, Esteban Montejo de Garcini, Almudena Ramón Cueto, Marina Sánchez García
Becarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Mar Pérez Martínez, Carlos Sánchez MartínBecarios Predoctorales Graduate Students: Montserrat Arrasate Iragui, Christian González
Billault, Gretchen Lorio García, Laura Sayas Casanova, Mª Auxiliadora Parrales Mena
Técnico de Investigación Technical Assistance: Raquel Cuadros CataláEstudiantes / Undergraduate Students: Evariste DemandeCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Julia García Pérez (CIGB, La Habana. Cuba)
Resumen de Investigación
En el bienio indicado se ha comenzado el análisis de la función de la primera pro-teína asociada a los microtubulos que se expresa in situ en una neurona, la MAP1B,mediante el uso de mutantes en los que esta proteína se expresa deficientemente. Porotra parte, se ha continuado con el estudio de la fosforilación de esta proteína, MAP1B,habiéndose indicado que la proteína quinasa dependiente de prolina que la puedemodificar es fundamentalmente la GSK3, y en determinadas circunstancias la proteínaquinasa cdk5. Estos estudios han sido complementados analizando la localización delas diferentes isoformas fosforiladas de MAP1B en diversas partes del sistema nervioso(central y periférico) de una rata adulta. Simultáneamente a los estudios anteriores seha estudiado la fosforilación de la proteína mayoritaria asociada a los microtubulosdendríticos, la proteína MAP2 habiéndose encontrado que dicha fosforilación puede serregulada por glutamato a través de los receptores NMDA.
Adicionalmente a los estudios de la estructura y función de la proteína microtu-
bular, fundamentalmente en lo que respecta a su implicación en el desarrollo de la mor-
fología de una neurona, se han analizado los cambios que se producen en las proteínas
microtubulares en procesos neurodegenerativos, como por ejemplo la enfermedad de
Alzheimer. En la enfermedad de Alzheimer, la proteína asociada a los microtubulos
conocida como tau se ensambla en unas estructuras aberrantes, los filamentos aparea-
dos helicoidales y en este periodo de tiempo hemos analizado qué factores favorecen
dicho ensamblaje y cuál es la región de la proteína tau a través de la cual se produce la
interacción proteína-protein que da lugar al polímero aberrante. Nuestros resultados
han indicado que los glicosaminoglicanos en forma sulfatada, y otros polianiones, favo-
recen la polimerización de tau, y que la región de interacción tau-tau coincide con la
región de tau que interacciona con los microtubulos. Además hemos observado la
implicación de la proteína kinasa GSK3 en la fosforilación aberrante que se produce en
la proteína tau que se encuentra en los cerebros de pacientes con la enfermedad de
Alzheimer, implicación que ha sido estudiada mediante el uso de sales de litio como
inhibidores específicos de la kinasa.
Por otra parte se ha iniciado, con buenos resultados, un estudio sobre la utiliza-
ción de células de glia envolvente en procesos de regeneración de la médula espinal. En
un primer trabajo se ha demostrado que las células de glia envolvente transplantadas
en el sitio donde se ha producido la lesión medular son capaces de migrar junto con el
axon(es) dañado(s), sugiriendo la regeneración del axon(es), en la distancia analizada
en la médula espinal.
Research Summary
During the last two years we have started the analysis of the function of microtu-
bule associated protein, MAP1B. The interest of this study is to determine the function
of the first MAP that is expressed �in situ� in a neuron. To test that we are doing the
analysis in mutant mice lacking that protein. Also, we have continued the study of
MAP1B phosphorylation. Our results have indicated that the proline directed phosp-
horylation that occurs in MAP1B is mainly achieved by protein kinase GSK3, and in
some conditions, by protein kinase cdk5. These studies have been complemented with
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the analysis of cell localization, in central and peripheral neurons system of an adult rat,
of the different types of MAP1B phosphoisoforms. Simultaneously to the previous stu-
dies we have also analyzed the phosphorylation of the main microtubule associated
protein associated to dendritic microtubules, MAP2. Our studies have indicated that the
phosphorylation of that protein could be regulated by glutamate through NMDA receptors.
Additionally to the structure-function analysis in microtubule proteins, mainly
focused on the involvement of these proteins in regulating neuron morphology, it has
been studied the changes occurring in microtubule proteins during neurogeneration
disorders, for example Alzheimer�s disease. In Alzheimer�s disease, microtubule asso-
ciated protein tau can assemble into aberrant structures known as paired helical fila-
ments. Our analysis has been focused in looking for factors that could favour the abe-
rrant aggregation of tau and in determining the tau region involved in its self aggrega-
tion. Our results have indicated that the presence of sulfated glycosaminoglycans, or
other polyanions, favour tau polymerization and that the tau region involved in pro-
tein-protein interaction essentially coincides with that tau region that binds to microtu-
bules. Also, we have found that tau protein present in the brain of Alzheimer�s disease
patients in hyperphosphorylated form, could be modified by GSK3 protein kinase.
These analyses have been mainly carried out by using a specific inhibitor for that pro-
tein kinase, lithium salts.
On the other hand, we have started with good results an analysis regarding the
use of olfactory ensheating glial cells in processes of neural regeneration in spinal cord.
Our studies have demonstrated that olfactory ensheating glial cells transplanted to the
lesion site are able to migrate together with the damaged axons, and appear to overco-
me any inhibitory influence from the environment, in the central nervous system. Thus,
the olfactory ensheating cells support the regrowth of axons over long distances within
the spinal cord.
Publicaciones / Publications
� García Rocha, M., Avila, J. and Lozano, J. The ζ isozyme of protein kinase C binds
to β tubulin through the pseudo substrate domain. Exp. Cell Res. 230, 1-8 (1997).
� Ramón-Cueto, A. and Avila, J. Differential expression of microtubule-associated
protein IB phosphorylated isoforms in the adult rat nervous system. Neuroscience
77, 485-501 (1997).
� Pigino, G., Paglini, G., Ulloa, L., Avila, J. and Caceres, A. Analysis of the expres-
sion, distribution and function of cyclin dependent kinase (cdk5) in developing
cerebellar macroneurons. J. Cell Sci. 110, 257-270 (1997).
� Avila, J. Modification in proteins related with the onset of Alzheimer�s disease:
Tau phosphorylation, glycation and oxidation Alzheimer�s disease. Current Drugs
2, 141-143 (1997).
� Avila, J. and Colaço, A.L.S. The role of sulfated glycosaminoglycans in
Alzheimer�s disease: a hypothesis. Alzheimer�s Research 3, 77-81 (1997).
� Muñoz Montaño, J.R., Moreno, F.J., Avila, J. and Díaz Nido, J. Lithium inhibits
Alzheimer�s disease-like tau protein phosphorylation in neurons. FEBS Letters
411, 183-188 (1997).
� Avila, J. The use of microtubule poisons on tumor cells. The Cancer J. 10, 315-318 (1997).
� Sánchez, C., Ulloa, L., Montoro, R., López-Barneo, J. and Avila, J. NMDA-gluta-
mate receptors regulate phosphorylation of dendritic cytoskeletal proteins in the
hippocampus. Brain Res. 765, 141-148 (1997).
� Avila, J. and Díaz Nido, J. Phosphorylation of microtubule protein. Encyclop.
Human. Biol. 6, 791-800 (1997).
� Pérez, M., Aloria, K., Zabala, J.C. and Avila, J. A putative β tubulin phosphate-
binding motif is involved in lateral protofilament interactions. Eur. J. Biochem. 248,
840-847 (1997).
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� Arrasate, M., Pérez, M., Valpuesta, J.M. and Avila, J. Role of glycosaminoglycans in
determining the helicity of paired helical filaments. Am. J. Pathol. 151, 1115-1122 (1997).
� Sánchez, C., Díaz Nido, J. and Avila, J. Regulation of a site-specific phosphoryla-
tion of the microtubule associated protein 2 during the development of cultured
neurons. Neuroscience 87, 861-870 (1998).
� Moreno, F.J. and Avila J. Phosphorylation of stathmin modulates its function as a
microtubule depolymerizing factor. Mol. Cell Biochem. 183, 201-209 (1998).
� Vecino, E., Ulloa, L. and Avila, J. The phosphorylated isoform of microtubule
associated protein 1B (MA1B) is expressed in the visual system of the tench (Tinca
tinca, L) during optic nerve regeneration. Neuros. Lett. 245, 93-96 (1998).
� García Pérez, J., Avila, J. and Díaz Nido, J. Implication of cyclin-dependent kina-
ses and glycogen synthase kinase 3 in the phosphorylation of microtubule asso-
ciated protein 1B in developing neuronal cells. J. Neuros. Res. 52, 445-452 (1998).
� Heredia, M., Gascuel, J., Ramón-Cueto, A., Santacano, M., Avila, J., Masson, C.
and Valverde, F. 1.9 E and 4.11.C, two novel monoclonal antibodies against the
olfactory bulb ensheathing glia. Glia 24, 352-364 (1998).
� Ramón-Cueto, A., Plant, G.W., Avila, J. and Bunge, M.B. Olfactory ensheathing
glia promote long distance axonal regeneration in the transfected adult spinal
cord. J. Neurosc. 18, 3803-3815 (1998).
� Ramón-Cueto, A. and Avila, J. Olfactory ensheathing glia: properties and func-
tion. Brain Res. Bull. 46, 175-187 (1998).
� Pérez, M., Valpuesta, J.M., Montejo de Garcini, E., Quintana, C., Arrasate, M.,
López Carrascosa, J.L., Rabano, R., García de Yébenes, J. and Avila, J. Ferritin is
associated to the aberrant tau filaments present in progressive supranuclear
palsy. Am. J. Pathol. 152, 1531-1539 (1998).
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� Pérez, M., Wandosell, F., Colaço, C., Avila, J. Sulphated glycosaminoglycans prevent
the neurotoxicity of a human prion protein fragment. Biochem. J. 335, 369-374 (1998).
� Ledesma, M.D., Pérez, M., Colaço, C. and Avila, J. Tau glycation is involved in
aggregation of the protein but not in the formation of filaments. Cell. Mol. Biol. 44,
1111-1116 (1998).
� Fanarraga, M., Aloria, K., Avila, J. and Zabala, J.C. Characterization of tubulin
isotype-specific antibodies by electrophoretic mobility shift assay. BioTechniques
25, 940-942 (1998).
� Franco, P., Massa, O., García-Rocha, M., Chiaradonna, F., Iaccarino, C., Correas,
I., Mendez, E., Avila, J., Blasi, F. and Stopelli, P. Protein kinase C-dependent
phosphorylation of prourokinase leads to the formation of a receptor competitive
antagonist. J. Biol. Chem. 237, 27734-27740 (1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Carlos Sánchez Martín: �Caracterización de la fosforilación de la proteína asociada a
los microtubulos 2 (MAP2) en su región rica en prolina�. Universidad Autónoma de
Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.
Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry
Proyecto colaboración con Synthelabo y Pharma Mar
Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions
Jesús Avila:
� Premio Carmen y Severo Ochoa, 1998
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MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN; MODULACIÓN PORNEUROPEPTIDOS E IMPLICACIONES FARMACOLÓGICAS TRANSDUCTION MECHANISMS; MODULATION BY NEUROPEPTIDES AND PHARMACOLOGICAL IMPLICATIONS
Jefe de Línea / Group Leader: Edgardo CatalánPersonal Científico Scientific Personnel: Félix Hernández, Antonio LirasBecario Predoctoral Graduate Student: María José Pérez-AlvarezTécnico de Investigación Technical Assistance: María Victoria Mora-Gil
Resumen de Investigación
El objetivo principal del proyecto de investigación lo constituye el estudio de los
mecanismos de transducción implicados en la acción de la endotelina, así como la
implicación de agentes farmacológicos específicos. Los objetivos particulares de este
proyecto han sido:
Estudio del efecto de la endotelina en sistemas de transducción, especialmente
metabolismo de lípidos y fenómeno de fosforilación-defosforilación.
Los datos obtenidos han confirmado el mecanismo de acción de la endotelina a
través del ciclo PI-PA. Cabe señalar que dentro de esta aproximación al mecanismo de
acción del neuropéptido, se ha iniciado un análisis de los esfingolípidos como otro posi-
ble mecanismo de transducción afectado por la endotelina; datos obtenidos en cerebro
en esfingosina, ceramida y glicoesfingolípidos cerebrales indican la participación direc-
ta de diversos sistemas enzimáticos como la esfingomielinasa y soportan la implicación
de este sistema de esfingolípidos en la acción de la endotelina. Por otra parte, teniendo
en cuenta que ciertos metabolitos de este sistema lipídico (como la esfingosina y cerami-
da) han sido propuestos como segundos mensajeros, se ha iniciado un estudio particu-
lar de estos mediadores bioquímicos.
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Respecto a la fosforilación-defosforilación, un aspecto particular lo ha constituido
la demostración de la participación de la tirosina quinasa y la tirosina fosfatasa en la
acción de la endotelina. De manera específica, estudios de la proteína tirosina fosfatasa
-1C han demostrado que la modulación y regulación por el neuropéptido pueden estar
relacionadas de manera fundamental a los sistemas defosforilantes con la posible par-
ticipación de nucleótidos cíclicos. En orden a establecer una relación entre este fenó-
meno descrito y el fenómeno de adhesión, se han estudiado dos proteínas (p125FAK y
p130Cas) habiéndose establecido que la fosforilación de estas proteínas por acción de la
endotelina tiene lugar mediante receptores tipo B. Estos estudios indican que la
endotelina modularía la fosforilación en tirosina de proteínas específicas, las cuales
pueden estar implicadas en los procesos de adhesión en el sistema nervioso.
Estudio de la funcionalidad de la barrera hematoencefálica principalmente a nivel
de sistemas de transducción.
Se ha continuado el estudio de la barrera hematoencefálica, habiéndose obtenido
nuevos datos acerca del turnover de fosfoinosítidos y su afectación por proteínas fosfo-
rilables y diversos agentes farmacológicos.
Estudios de la participación de mediadores en la acción de la endotelina.
Se ha establecido el papel de ciertos mediadores como PAF y NO en el mecanis-
mo de acción de las endotelinas. De manera particular, se ha analizado el mecanismo
de acción del PAF en el sistema nervioso fundamentalmente a nivel de proteínas especí-
ficas y metabolismo de esfingolípidos.
Estudio de la modulación de los sistemas de transducción mediante agentes
farmacológicos.
Se ha continuado la investigación acerca del modo de acción de nuevas drogas
capaces de afectar sistemas de transducción en el sistema nervioso. Otros sustratos
biológicos (plaquetas) han sido utilizados con fines comparativos. En particular, se ha
estudiado el modo de acción de nuevas moléculas con actividad antitrombótica en sis-
temas enzimáticos como la fosfodiesterasa dependiente de GMP cíclico.
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Research Summary
The main goal of this project is to study the biochemical mechanisms at the trans-
duction level involved in the action of neuropeptides, in particular endothelin, and the
involvement of new pharmacological agents. In this regard, the particular objectives are:
Effect of endothelin on transduction systems, specifically on lipid metabolism and
the phosphorylation-dephosphorylation phenomenon.
Our data have confirmed that the mechanism of action of endothelin involves, at
least in part, the PI-PA cycle. The involvement of sphingolipids in the endothelin signal
transduction mechanism has also been studied. In brain, endothelin evoked variations
on sphingomyelin, ceramide and glycosphingolipids, a phenomenon that is probably
related to sphingomyelinase activity and to glycosphingolipid synthesis. These data
support the idea that the neuropeptide is able to evoke ceramide production in nervous
system, which might account, at least in part, a number of biochemical responses
evoked or mediated by endothelin. Taking into account that other sphingolipid metabo-
lites (as sphingosine and ceramide) have been proposed as second messengers in signal
transduction pathways, we have initiated a particular study on these mediators.
In regard to protein phosphorylation, the involvement of tyrosine kinases as well
as tyrosine phosphatases in the mode of action of endothelin has been confirmed; in
particular, the role of tyrosine phosphatase-1C (related to cyclic nucleotide action) has
been established. Furthermore, we have demonstrated that endothelin regulates the
tyrosine phosphorylation of two proteins, the focal adhesion kinase p125FAK and crk-
associated substrate p130, a fact that indicate that endothelin modulates the tyrosine
phosphorylation of specific proteins, which may be involved in adhesion processes in
the nervous system.
Functioning of the blood-brain barrier mainly at the transduction level.
We have continued the study of the blood-brain barrier; new data have been
obtained on phosphoinositide turnover and on the role of phosphorylated proteins and
several pharmacological agents.
Involvement of mediators in the mechanism of action of endothelin.
The role of mediators such as PAF and NO in the actions of endothelin has been
established. In particular, the mechanism of action of PAF on the nervous system (at
specific proteins and sphingolipid metabolism level) has been analyzed.
d) Modulation of the transduction systems by pharmacological agents.
We have continued the research on the mode of action of new drugs able to affect
transduction systems at the nervous system. Other experimental designs included the
utilization of platelets for comparative purposes. The mode of action of new molecules
with antithrombotic activity has been studied, mainly on enzyme systems such as cyclic
GMP-dependent phosphodiesterase.
Publicaciones/Publications
� Catalán R.E., Gargiulo, L., Martínez, A.M., Calcerrada, M.C. and Liras, A. Protein
tyrosine phosphatase activity modulation by endothelin-1 in rabbit platelets.
FEBS Lett. 400, 280-284 (1997).
� Catalán, R.E., Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Ruiz, S. and Martínez, A.M.
Sphingolipids increase calcium concentration in isolated rat liver nuclei. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 238, 347-350 (1997).
� Catalán, R.E., Calcerrada, M.C., Miguel, B.G. and Martínez, A.M. Mechanism of
arachidonic acid-induced Ca2+ mobilization in liver nuclei. J. Lipid Med. Cell
Signal. 17, 167-174 (1997).
� Catalán, R.E., Martínez, A.M., Aragonés, M.D., Lombardía, M., Calcerrada, M.C.
and Garde, E. Regulation of PAF-induced platelet responses by cyclic nucleotides.
Platelets 8, 147-154 (1997).
� Catalán, R.E., Martínez, A.M., Aragonés, M.D. and Lombardía, M. Involvement of
cyclic GMP in the mode of action of a new antithrombotic agent PCA-4230; inhi-
bition of the platelet cyclic GMP dependent phosphodiesterase. Thromb. Res. 87,
547-557 (1997).
� Catalán, R.E. Phosphatidylinositol pathways. In �Introduction to the Blood-Brain
Barrier�. W.M. Pardridge (ed), Cambridge University Press, pp. 330-337 (1998).
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BASES MOLECULARES DE LA NEUROTRANSMISIÓN MEDIADA POR AMINOÁCIDOS MOLECULAR BASIS OF THE AMINO ACID MEDIATED NEUROTRANSMISSION
Jefes de Línea / Group Leaders: Cecilio Giménez, Carmen Aragón Personal Científico Scientific Personnel: Beatriz López-Corcuera, Francisco ZafraBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: Arjan Geerlings Becarios Predoctorales Graduate Students: Rodrigo Martinez, Luis Olivares, Julia Ponce, Irene
Poyatos, Enrique SaleroTécnico de Investigación Technical Assistance: Enrique NúñezCientífico Visitante Visiting Scientific: Raquel Pérez Sen (Universidad Complutense de
Madrid)Estudiantes de Programas InternacionalesUndergraduate Students from international programs: Thomas Dickmeis (Albert-Ludwigs-Universitat of
Freiburg); Damien Thompson (Michigan State University).
Resumen de Investigación (C. Aragón)
La glicina es un neurotransmisor inhibidor en médula espinal y tallo cerebral. En
estas dos regiones actúa sobre el receptor postsináptico de glicina sensible a estricnina.
El segundo papel de la glicina es potenciar la acción del glutamato, el más importante
neurotransmisor excitador en corteza e hipocampo, sobre receptores del tipo NMDA.
Para llevar a cabo cualquiera de estas funciones, es necesario que los niveles de glicina
extracelulares se mantengan bajo límites muy estrechos de concentración. Esto se lleva
a cabo mediante la actuación de los transportadores de glicina de alta afinidad, depen-
dientes de sodio y cloruro y localizados en la membrana plasmática de las neuronas o
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los procesos gliales adyacentes. Alteraciones en cualquiera de las dos funciones de la
glicina antes mencionadas dan como consecuencia desórdenes en la actividad neuro-
muscular, o bien alteraciones en la función cognitiva.
Los objetivos del grupo están centrados en el estudio, a nivel molecular, de los
transportadores de glicina GLYT1 y GLYT2; concretamente el estudio de la relación
estructura/función y la regulación de estas proteínas en el SNC.
Con respecto a la relación estructura/función, hemos generado clones de líneas
celulares de mamífero que sobreexpresan de forma estable GLYT1 y GLYT2 con objeto
de estudiar, de forma comparativa, sus características bioquímicas y electrofisiológicas
utilizando técnicas de patch-clamp. Hemos podido demostrar diferencias funcionales
entre GLYT1 y GLYT2. Este último es estrictamente dependiente de cloruro, y presenta
una mayor cooperatividad respecto al sodio que GLYT1. Esta mayor dependencia de sodio
en GLYT2 también se manifiesta por la mayor dependencia de voltaje que presentan las
corrientes de entrada generadas por el funcionamiento de GLYT2 respecto a GLYT1.
Por otra parte, hemos estudiado la distribución subcelular de las isoformas
GLYT1a y GLYT1b mediante transfección de cultivos de neuronas de hipocampo y pos-
terior microscopía de inmunofluorescencia, observándose una localización exclusiva-
mente dendrítica de estas proteínas. Mediante mutaciones puntuales y delecciones rea-
lizadas en dominios intracelulares de los transportadores, hemos identificado dos moti-
vos di-leucina en el carboxilo terminal, y el extremo amino terminal, como determinan-
tes estructurales responsables de la distribución polarizada de GLYT1. La funcionalidad
de estos motivos se ha analizado igualmente en células epiteliales polarizadas MDCK.
Mediante técnicas de microscopía electrónica, se ha determinado con precisión la
expresión subcelular de GLYT2 que aparece concentrado en agregados a lo largo de la
membrana axonal. Además, se ha demostrado que GLYT2 es un marcador de neuronas
glicinérgicas, y que la alta concentración de glicina que se encuentra en estas neuronas
se debe al trabajo del transportador GLYT2.
En cuanto a la regulación de los transportadores hemos demostrado que la expre-
sión glial de GLYT1 depende de factores procedentes de la neurona.
En la actualidad, el interés del grupo está centrado en la identificación y localiza-
ción de dominios y residuos de GLYT1 y GLYT2 implicados en su función (sitios de
unión a glicina, sodio y cloruro), que a su vez expliquen las propiedades diferenciales
de ambos transportadores. Para abordar este objetivo estamos generando transporta-
dores quiméricos entre GLYT1 y GLYT2, y mutantes puntuales en residuos localizados
en dominios susceptibles de estar implicados en estas funciones.
Todo ello permitirá desarrollar compuestos que interactuando con sitios concre-
tos de la proteína, modifiquen su actividad y, por tanto, modulando la neurotransmi-
sión mediada por glicina, puedan actuar como agentes terapéuticos anticonvulsivantes,
antiepilépticos, antiespásticos o sedantes.
Resumen de Investigación (C. Giménez)
La Apolipoproteína E (apoE) es una proteína bien caracterizada, de 299 aminoá-
cidos que está involucrada en el transporte y la regulación del colesterol en plasma, y
en el metabolismo de los lípidos. En humanos, apoE presenta tres isoformas: E2 (cys112,
cys158); E3 (cys112, arg158); y E4 (arg112, arg158), codificadas por un mismo gen localizado
en el cromosoma 19. Estudios genéticos han demostrado que apoE es un factor de ries-
go en enfermedades cardiovasculares y en enfermedades neurodegenerativas, especial-
mente la enfermedad de Alzheimer. Estos datos genéticos, junto con otros clínicos y
bioquímicos han demostrado la implicación de apoE en procesos de regeneración y
reparación celular, especialmente en el SNC. Los niveles de expresión de la apoE pare-
cen estar asociados a las situaciones clínicas citadas anteriormente.
El gen APOE esta sometido a una regulación compleja por factores hormonales,
nutricionales, específicos de tejido y del desarrollo ontogénico. En el sistema nervioso,
la proteína se sintetiza en células de glía. En gran medida, los niveles de expresión pare-
cen estar regulados transcripcionalmente por la actividad de diversos elementos de la
región promotora del gen APOE. Experimentos previos de nuestro laboratorio han per-
mitido la identificación de dos sitios de unión del factor de transcripción AP2 en la
región proximal del promotor que estarían implicados en la regulación de la expresión
de APOE por cAMP. En la actualidad, hemos iniciado la búsqueda de otros sitios den-
tro de esta región promotora que pudieran ser importantes para la regulación de la
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expresión del gen. La identificación de factores de transcripción con capacidad de unión
al promotor se está realizando mediante la técnica del híbrido simple en células de leva-
dura. De esta manera hemos identificado un sitio de unión para el factor de transcrip-
ción USF (región -80), de la familia HLH, y otro para las proteínas con �dedos de zinc�
ZIC1 y ZIC2. Estos sitios de unión se han confirmado mediante la técnica de retardo en
gel de electroforesis (EMSA). Además, estos experimentos nos han permitido identifi-
car otros sitios adicionales para unión de las proteínas ZIC. Experimentos funcionales
en los que se utilizan diversas construcciones del promotor unido al gen reporter luci-
ferasa nos indican que mientras USF tiene un efecto modesto sobre la actividad del
promotor, ZIC1 y, especialmente, ZIC2 son fuertes estimuladores del mismo. Las proteí-
nas de la familia ZIC desempeñan un papel importante en durante el desarrollo tempra-
no del sistema nervioso. En el adulto se concentran en el cerebelo, pero también parecen
inducirse en las células de glía en respuesta a ciertas señales. En la actualidad investiga-
mos si algunos de los procesos fisiológicos atribuidos a ZIC están mediados por APOE.
Research Summary (C. Aragón)
Glycine is an inhibitory neurotransmitter in the spinal cord and the brain stem. In
these regions glycine acts on the postsynaptic glycine receptors sensitive to strychnine.
Glycine is also able to potentate the action of glutamate, the main excitatory neuro-
transmitter in the cortex and the hippocampus, on the postsynaptic NMDA glutamate
receptors. For both glycine functions, the extracellular levels of glycine must be finely
regulated. The uptake of glycine through sodium and chloride dependent, high-affinity
specific transporters located both in the plasma membrane of neurons and the fine glial
processes, provides a way of clearing the extracellular space of neuroactive substances.
Dysfunction in any of the mentioned glycine roles in neurotransmission would lead to
neurological disorders associated with excessive musculoskeletical activity, or in cog-
nitive functions.
The aim of the group is to study, at the molecular level, the structure/function
relationship and the regulation of the GLYT1 and GLYT2 glycine transporters from CNS.
We have generated clonal cell lines stably expressing GLYT1 and GLYT2 in order
to comparatively examine their biochemical and electrophysiological features. By using
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patch-clamp techniques, we have demonstrated functional differential properties bet-
ween GLYT1 and GLYT2. A sigmoidal sodium dependence of the glycine uptake indi-
cates the involvement of more than one sodium in the transport cycle. We suggest a
more cooperative behavior for sodium in GLYT2 than in GLYT1.
The subcellular distribution of the glycine transporters isoforms GLYT1a and
GLYT1b has been also studied in cultures of fully polarized hippocampal neurons. By
immunofluorescent microscopy we show that both GLYT1 isoforms are targeted to
dendrites but not to axons. Site directed mutagenesis experiments allowed the identifi-
cation of two di-leucine motifs in the carboxyl terminus of the protein involved in the
polarization of GLYT1 to dendrites. Deletion experiments in the very amino terminal
region of the protein give additional sorting information for this glycine transporter.
The functionality of these motifs has been also analyzed in polarized MDCK cells.
By electronic microscopy techniques we have shown the subcellular expession of
GLYT2 which appears as clausters through the axonal membrane. On the other hand, it
has been demonstrated that GLYT2 is a reliable marker for glycinergic neurons, and
that the high content of glycine observed in some neurons is indeed achieved by the
concentrative task performed by GLYT2.
As far as the regulation properties of the transporters is concern, we have
demonstrated a neuronal dependency of the GLYT1 expression in glial cells.
Currently, the interest of the group is focused in the identification of structural
domains of GLYT1 and GLYT2 involved in its differential functionality (binding sites
for glycine, sodium and chloride). For this purpose, we are generating chimeric trans-
porters between GLYT1 and GLYT2 and site-directed mutants in residues located in
structural domains putatively involved in the transport process. Besides, it will provi-
de a way to develop new selective glycine transporter inhibitors that can act as specific
drugs with potential anticonvulsant, sedative, antiepileptic, and antispastic effects.
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Research Summary (C. Giménez)
Apolipoprotein E (apoE) is a well characterized 299 amino acid protein that par-
ticipates in the regulation of plasma cholesterol and lipid metabolism. In humans, apoE
has three major protein isoforms: E2 (cys112, cys158); E3 (cys112, arg158); and E4 (arg112,
arg158), that are encoded by a single gene on chromosome 19. Genetic studies have
shown that apoE is a risk factor for cardivascular and neurodegenerative diseases, spe-
cially Alzheimer disease. These genetic data, together with additional clinical and bio-
chemical data, have demonstrated the involvement of apoE in repair and regeneration
cellular processes, specially in the CNS. The levels of expression of apoE seem to be
associated with the risk to develop the former mentioned clinical conditions, specially
Alzheimer disease.
The APOE gene is under a complex regulation of developmental, hormonal, die-
tary and tissue specific factors. In brain, the synthesis take place in astrocytic cells. The
expression levels seem to be transcriptionally regulated by an array of regulatory ele-
ments in the promoter region of the APOE gene. Previous experiments from our labo-
ratory allowed the identification of two binding sites for the transcription factor AP2
located in the proximal region of the promoter. These sites could be involved in the
regulation by cAMP of the apoE expression. Currently, we have initiated a search of
additionally regulatory elements in this region of the promoter that would be important
for the regulation of expression of this gene. Search of transcription factors with binding
ability to this region of the promoter is being performed by the one-hybrid technique in
yeast cells. We have identified a binding site for the HLH transcription factor USF (-80
region) and another one for the zinc finger proteins ZIC1 and ZIC2. These sites have
been confirmed by electrophoretic mobility shift assays (EMSA). In addition EMSA stu-
dies reveal additional binding sites for ZIC proteins. Functional assays with a variety of
promoter-luciferase constructs indicate that whereas USF has a moderate effect on the
promoter activity, ZIC1 and specially ZIC2 are strong stimulators of the promoter. ZIC
proteins are known to play an important role in the early development of the nervous
system. In the adults life they are mainly expressed in the cerebellum, but are also regu-
lated in glial cells in response to some signals. Whether any of the physiological pro-
cesses attributed to ZIC proteins are mediated by apoE is currently under investigation.
191
Publicaciones / Publications
� Poyatos., I., Ponce, J., Aragón, C., Giménez, C. and Zafra, F. The glycine trans-
porter GLYT2 is a reliable marker for glycinergic neurons. Mol. Brain. Res. 49, 63-
70 (1997).
� Spike, R.C., Watt, C., Zafra, F. and Tood, A.J. An ultrastructural study of the gly-
cine transporter GLYT2 and its association with glycine in the superficial laminae
of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience 77, 543-551 (1997).
� Zafra, F., Poyatos,I. and Giménez, C. Neuronal dependency of the glycine trans-
porter GLYT1 expression in glial cells. Glia 20, 155-162 (1997).
� Zafra, F., Aragón, C. and Giménez, C. �Molecular Biology of Glycinergic
Neurotransmission. Molecular Neurobiol. 14, 117-142 (1997).
� Olivares, L., Aragón, C., Giménez, C. and Zafra, F. Analysis of the transmembra-
ne topology of the glycine transporter GLYT1. J. Biol. Chem. 272, 1211-1217 (1997).
� Cristie, G.R., Walker, D., Aragón, C. and Hirst, B.H.. A novel GLYT1 glycine
transporter in human small intestine. J. Physiol. (London) 504, 147-148 (1997).
� Ponce, J., Poyatos, I., Aragón, C., Giménez, C. and Zafra, F. Characterization of the
5´region of the rat brain glycine transporter GLYT2 gene: Identification of a novel
isoform. Neurosci. Letters 242, 25-28 (1998).
� Giménez, C. Composición y estructura de la membrana neuronal. Bases molecu-
lares de su fisiología y su patología. Rev. Neurol. 26, 232-239 (1998).
� Aragón, C. y Giménez, C. Mecanismos que regulan la disponibilidad de neuro-
transmisores en el espacio sináptico. Rev. R. Acad. Cienc. Exact. Fis. Nat. 91, 259-267
(1998).
� Zafra, F. Neurotrofinas: supervivencia, diferenciación, regeneración y plasticidad
de las neuronas. Rev. R. Acad. Cienc. Exact. Fis. Nat. 91, 285-2296 (1998).
192
� C. Aragón and B. López-Corcuera. Purification, Hydrodynamic Properties and
Glycosylation Analysis of a Glycine Transporter. Methods Enzymol. 296, 3-17
(1998).
� López-Corcuera, B., Martínez-Maza, R., Núñez, E., Roux, M., Supplisson, S. and
Aragón, C. Differential properties of two stably expressed brain-specific glycine
transporters. J. Neurochem. 71, 2211-2219 (1998).
� Murga, C., Zafra, F. and Mayor, F. Jr. The subcellular distribution of b-adrenergic
receptor kinase 1 (GRK2) in rat brain. Neuroscience 87, 631-637 (1998).
Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry
Synthelabo Recherche (L.E.R.S.). Francia
193
BASES MOLECULARES DE LA ADAPTACIÓN AL EJERCICIO MOLECULAR BASES OF THE ADAPTATION TO EXERCISE
Jefe de Línea / Group Leader: Rafael Manso MartínezBecarios Predoctorales Graduate Students: Beatriz González Alonso, Raquel Hernando
Sebastián
Resumen de Investigación.
El interés investigador del laboratorio se centra en la caracterización de los facto-
res y mecanismos moleculares implicados en la inducción de cambios adaptativos por
el entrenamiento. Aunque el músculo esquelético constituye el principal objeto de
interés investigador, también se han desarrollado algunos estudios en miocardio e
hígado. Uno de los objetivos del laboratorio es explicar el fundamento molecular de la
selectividad y especificidad de las respuestas adaptativas musculares al entrenamien-
to. Mientras que la actividad contráctil muscular puede aportar los elementos necesa-
rios para proporcionar selectividad, una aproximación al fundamento molecular de la
especificidad implica caracterizar los estímulos inductores, su relación con la actividad
contráctil muscular y los cambios neuroendocrinos que desencadena la actividad física,
que conducen a la activación de los sistemas respiratorio y cardiovascular, así como los
mecanismos de recepción y transducción mediante los que la fibra muscular modifica
finalmente su fenotipo.
La caracterización de la respuesta celular de estrés como fundamento universal
de los mecanismos de preservación de las células de las agresiones del entorno y de la
tolerancia a nuevas agresiones, junto con las evidencias de que el ejercicio físico desen-
cadena una respuesta celular de estrés en fibras musculares y en otros tejidos, propor-
cionan verosimilitud a la hipótesis de que las proteínas de choque térmico o de estrés
(HSPs) pudieran jugar un importante papel como mediadoras de las respuestas adap-
tativas al entrenamiento. El trabajo de nuestro laboratorio en los últimos años se ha diri-
Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
gido a comprobar esta hipótesis tratando de definir la forma de participación de las
HSPs en los procesos adaptativos tisulares. Para ello, se han estudiado las cinéticas de
inducción de la síntesis y la acumulación de HSPs tras ejercicio agudo en dos tipos de
músculo con diferente grado de implicación en la actividad locomotriz, en miocardio y
en hígado, y se ha analizado la forma en que el entrenamiento modifica la respuesta de
estrés al ejercicio y los niveles de expresión de HSPs. Las evidencias de que el ejercicio
físico puede modular la expresión de HSPs, actuando de forma específica de tipo de
músculo, han abierto una serie de interrogantes relativas a la relación entre las carac-
terísticas del ejercicio agudo y el tipo de entrenamiento y la especificidad de los cam-
bios inducidos en la respuesta celular de estrés y en los niveles de expresión de HSPs,
respectivamente, que están siendo objeto de estudio en el laboratorio considerando por
separado el papel del patrón de impulsos nerviosos que activan el músculo y del entor-
no endocrino como elementos determinantes de cambios adaptativos al entrenamiento.
Además de su potencial interés para comprender las bases moleculares de la adaptabi-
lidad muscular, el estudio de la regulación de los niveles de expresión de HSPs por el
ejercicio físico, la actividad neural y el sistema endocrino puede aportar una valiosa
información para caracterizar el fundamento molecular de la relación existente entre el
ejercicio físico y la salud y establecer sus posibles límites.
Research Summary
The research interest of the laboratory is directed towards an understanding of
the molecular mechanisms involved in the adaptive changes induced by physical exer-
cise. Although skeletal muscle was the main object of study, some of the investigations
were performed in myocardium and liver. One of our research aims is to characterize
the factors and processes involved in defining the selectivity and specificity of skeletal
muscle adaptations to exercise training. While contractile activity itself can provide the
necessary elements to understand selectivity, an approximation to the molecular foun-
dations of specificity implies characterizing the adaptive stimuli, their relationship with
the contractile activity of muscle or with the neuroendocrine changes induced by phy-
sical exercise that trigger the activation of the respiratory and cardiovascular systems,
as well as the mechanisms of reception and transduction that enable muscle fibers to
transform adaptive stimuli into changes in their phenotype.
194
195
The characterization of the cellular stress response as a universal mechanism of
cellular protection from environmental aggressions, and heat-shock or stress proteins
(HSPs) as the molecules responsible for preserving cells from stress and preparing them
to survive new environmental challenges, together with experimental evidence that
physical exercise induces a cellular stress response in skeletal muscle and other tissues,
provides a reasonable basis to the notion that HSPs might have a fundamental role in
mediating the adaptive responses to exercise training. The work of our laboratory in the
last few years has been directed to test this hypothesis, trying to define the way in
which HSPs are involved in the adaptive processes. We have analyzed the kinetics of
induction of stress protein synthesis and accumulation following exercise in different
muscle types variously involved in the locomotive process, in myocardium and in liver.
We have investigated the way in which exercise training modulates the stress response
to exercise and the expression levels of stress proteins. The experimental evidence accu-
mulated, indicating that exercise training may modulate the expression of stress pro-
teins, acting in an individual, muscle type-specific fashion, opened a number of ques-
tions concerning the possible relationship between the characteristics of acute exercise
and exercise training regimes and the specificity of the stress response and stress pro-
tein expression levels, respectively, that are being the object of recent studies, conside-
ring the pattern of nerve impulses that activate the muscle and the endocrine environ-
ment as separate factors that contribute to define the adaptive process. In addition to its
potential interest in getting a deeper understanding of the mechanisms of adaptation to
exercise, studying the regulation of the stress response and of HSP expression levels by
physical exercise, the pattern of neural activity and the hormonal status could be useful
to unravel the molecular bases of the relationship between physical exercise and health,
and of its possible limitations.
196
Publicaciones / Publications
� Hernando, R. and Manso, R. Muscle fibre stress in response to exercise: Synthesis,
accumulation and isoform transitions of 70 kDa heat-shock proteins. Eur. J.
Biochem. 243, 460-467 (1997).
� Hernando, R., González, B., Delicado, M.L. y Manso, R. Inducción de la síntesis
de proteínas de estrés en fibras musculares y en células hepáticas tras ejercicio
agudo. Serie Icd, Investigación en Ciencias del Deporte 18, 11-37 (1998).
� Hernando, R., Ferrández, M. D., de la Fuente, M., Díaz, A.E y R. Manso. Efecto de
los esteroides anabólico androgénicos nandrolona y estanozolol sobre la actividad
del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal y la función linfocitaria. Serie Icd,
Investigación en Ciencias del Deporte 18, 43-60 (1998)
� Hernando, R y Manso, R. La respuesta de estrés de las fibras del músculo esquelé-
tico tras el ejercicio. Ibérica: Actualidad tecnológica 413, 517-521 (1998)
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Raquel Hernando Sebastián: �Respuesta de estrés de las fibras musculares por el ejer-
cicio agudo y su adaptación por el entrenamiento: Control neural y hormonal�.
Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Apto cum laude.
197
SEÑALIZACIÓN CELULAR MEDIADA POR RECEPTORES DESIETE DOMINIOS TRANSMEMBRANA Y PAPEL FISIO-PATOLÓGICO DE SUS MECANISMOS DE REGULACIÓN SIGNAL TRANSDUCTION MEDIATED BY SEVEN TRANSMEMBRANE DOMAIN RECEPTORS AND PHYSIOLOGI-CAL ROLES OF RECEPTOR REGULATORY MECHANISMS
Jefe de Línea / Group Leader: Federico Mayor, jr.Personal Científico Scientific Personnel: Anna M. Aragay, Ana Ruiz-GómezBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Esperanza Morato, Cristina Murga, Petronila
Penela, Catalina Ribas Becarios Predoctorales Graduate Students: Ana Elorza, M. Carmen Jiménez, Susana SarnagoEstudiantes Undergraduate Students: Sandra Peregrín, Antonio SobradoTécnico de investigación Technical Assistance: Ramón Campos
Resumen de Investigación
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) median las acciones de una granvariedad de mensajeros que controlan la diferenciación, proliferación y función celular.Una característica general de estos receptores es que su acción está controlada median-te complejos mecanismos de regulación que modulan la eficacia de la transducción dela señal, y que son la base de los procesos de desensibilización o tolerancia. Las quina-sas de receptores acoplados a proteínas G (GRKs) y las proteínas moduladoras deno-minadas arrestinas desempeñan un papel esencial en los procesos de rápida fosforila-ción, desacoplamiento, internalización y reciclaje de GPCR activados. Por otra parte,datos recientes sugieren la participación directa de GRKs y arrestinas en procesos deseñalización desde GPCR a las cascadas de quinasas mitogénicas, por lo que estas pro-teínas reguladoras emergen, además, como componentes esenciales de la transducciónde señales mediada por estos receptores.
Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
Este papel esencial sugiere que cambios en la expresión y/o actividad de GRKs y
arrestinas afectarán a la eficacia de la señalización mediada por GPCR y podrían tener
transcendencia fisiopatológica. El desarrollo de esta hipótesis requiere profundizar en
los mecanismos moleculares de regulación de la funcionalidad y de los niveles de estas
proteínas, así como en sus principales cometidos fisiológicos. En este contexto, los prin-
cipales objetivos de nuestro laboratorio son:
1) Un mejor conocimiento de las funciones celulares de GRKs y arrestinas. En este
sentido, nuestro laboratorio ha descrito el papel clave de la quinasa GRK2 en la
internalización de receptores β-adrenérgicos y otros GPCR, así como identificado
nuevos sustratos celulares de GRK2 que no son GPCR activados, como las fosduci-
nas. Por otra parte, estamos estudiando la participación de GRKs y arrestinas en la
activación de MAPK por GPCR.
2) Identificar los principales mecanismos y señales que regulan la actividad y gobier-
nan la expresión de estas proteínas. Este estudio se está abordando a varios nive-
les, que incluyen la interacción de GRK2 con proteínas de anclaje a diversas locali-
zaciones subcelulares, la fosforilación de GRKs por otras proteínas quinasas, la
modulación de la actividad transcripcional del promotor del gen GRK2 humano y
el complejo y activo control de los niveles intracelulares de GRKs y arrestinas por
diversas vías proteolíticas.
3) Estudiar el posible papel y relevancia de GRKs y arrestinas en la función y disfun-
ción de dos sistemas fisiológicos concretos de gran importancia clínica: el sistema
cardiovascular y la regulación de la respuesta inflamatoria. En lo que respecta al
sistema cardiovascular, el laboratorio lidera un proyecto europeo Biomed que
investiga el papel de GRKs y arrestinas en la función y disfunción del sistema car-
diovascular, dado que alteraciones en los niveles de GRK2 son un factor importan-
te en pacientes con fallo cardiaco congestivo, hipertensión y otras patologías. Por
otra parte, la alta expresión de GRKs en leucocitos y los recientes datos de diversos
laboratorios, incluido el nuestro, que indican la participación de GRKs y arrestinas
en la modulación de receptores de quimioquinas, sugieren que estas proteínas
reguladoras desempeñan un importante papel en la respuesta celular y migratoria
de diversos tipos celulares a las quimioquinas. El desarrollo de estos objetivos es de
gran interés para identificar nuevas dianas farmacológicas y métodos diagnósticos,
así como para proponer nuevas estrategias terapéuticas.
198
199
Además de este tema principal, nuestro laboratorio colabora con otras líneas del
CBMSO en el estudio de la relación entre sistemas de transducción y la expresión y fun-
ción de proteínas implicadas en la enfermedad de Alzheimer, como las presenilinas y
la apolipoproteína E.
Research Summary
G protein-coupled receptors (GPCR) mediate the actions of a wide variety of mes-
sengers which modulate cell differentiation, proliferation and function. A general fea-
ture of GPCR is the existence of complex mechanisms which regulate signal transduc-
tion efficacy, and which underlie key physiological processes such as desensitization or
tolerance. G protein-coupled receptor kinases (GRKs) and a family of proteins termed
arrestins play an essential role in the rapid phosphorylation, uncoupling, internaliza-
tion and recycling of GPCR that takes place upon activation by agonists. On the other
hand, recent data suggest a direct participation of GRKs and arrestins in GPCR-media-
ted MAPK activation, thus emerging as key components of the GPCR signal transduc-
tion machinery. Such central role suggests that changes in the expression levels and/or
activity of GRKs and arrestins may affect the efficacy of GPCR signalling and be of pat-
hophysiological relevance. The testing of this hypothesis requires a better knowledge of
the molecular mechanisms of regulation of the levels and functionality of GRKs and
arrestins, as well as about their main physiological roles. In this context, the main objec-
tives of our laboratory are:
1) To better understand the cellular functions of GRKs and arrestins. In this regard,
our laboratory has reported a key role for GRK2 in the internalization of β-adre-
nergic and other GPCR, as well as identified new cellular substrates for GRK2, dif-
ferent from activated GPCR, such as the phosducins. On the other hand, we are currently
investigating the participation of GRKs and arrestins in the GPCR-MAPK pathway.
2) To identify the main mechanisms and signals governing the activity and expression
levels of these proteins. This issue is being addressed along a variety of lines of
research, including the interaction of GRK2 with anchoring proteins in several sub-
cellular locations, the phosphorylation of GRKs by other protein kinases, the
modulation of the transcriptional activity of the human GRK2 promoter and the
complex and active regulation of the cellular levels of GRKs and arrestins by diffe-
rent proteolytic pathways.
3) To investigate the role of GRKs and arrestins in the function and disfunction of two
main physiological models: the cardiovascular system and the regulation of the
inflammatory response. Our laboratory leads a Biomed project on the role of GRKs
and arrestins in cardiovascular function and disease, given the fact that changes in
GRK2 levels appear to be a key factor in conditions such as congestive heart failu-
re, hypertension, and other vascular pathologies. On the other hand, the high
expression levels of GRKs and arrestins in leukocytes and recent data from our
laboratory indicating the participation of these proteins in chemokine receptor
regulation, suggest that GRKs and arrestins play an important role in the cellular
and migratory response of several cell types to chemokines. A better understan-
ding of the role of GRKs and arrestins in these physiological conditions would help
to identify new potential drug targets and diagnostic methods and to suggest novel
therapeutic strategies.
In addition to this main theme, our laboratory collaborates with other groups of
our Institute in the study of relationships between signal transduction pathways and
the expression and function of proteins involved in Alzheimer�s disease, such as prese-
nilins and apolipoprotein E.
Publicaciones / Publications
� Ruiz-Gómez, A. and Mayor, F. Jr. β-adrenergic receptor kinase (GRK2) colocali-
zes with β-adrenergic receptors during agonist-induced receptor internalization.
J. Biol. Chem. 272, 9601-9604 (1997).
� Murga, C., Esteban, N., Ruiz-Gómez, A. and Mayor, F. Jr. The basal subcellular
distribution of β-adrenergic receptor kinase is independent of G-protein βγ subu-
nits. FEBS Letters 409, 24-28 (1997).
� Murga, C., Penela, P., Zafra, F. and Mayor, F. Jr. The subcellular and cellular dis-
tribution of G protein-coupled receptor kinase 2 in rat brain. Neuroscience 87, 631-
637 (1998).
200
201
� Mayor, F. Jr., Penela, P. and Ruiz-Gómez, A. Role of G protein-coupled receptor
kinase 2 and arrestins in β-adrenergic receptor internalization. Trends in
Cardiovascular Medicine 8, 1050-1738 (1998)
� Aragay, A. M., Ruiz-Gómez, A., Penela, P., Sarnago, S., Elorza, A., Jiménez-Sainz,
M.C. and Mayor, F. Jr. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2): mechanims
of regulation and physiological functions. FEBS Letters 430, 37-40 (1998).
� Mellado, M., Rodríguez-Frade, J.M., Aragay, A., del Real, G., Martín, A.M., Vila-
Coro, A.J., Serrano, A., Mayor, F. Jr. and Martínez-A, C. The chemokine monocy-
te chemotactic protein 1 triggers janus kinase 2 activation and tyrosine phosp-
horylation of the CCR2B receptor. J. of Immunology 161, 805-813 (1998).
� Ozaita, A., Escribá, P.V., Ventayol, P., Murga, C., Mayor, F. Jr. and. García-Sevilla,
J. A. Regulation of G protein-coupled receptor kinase 2 in brains of opiate-treated
rats and human opiate addicts. J. Neurochem. 70, 1249-1257 (1998).
� Aragay, A.M., Mellado, M., Frade, J.M.R., Martín, A.M., Jiméndez-Sainz, M.C.,
Martínez-A., C. and Mayor, F. Jr. Monocyte chemoattractant protein-1-induced
CCR2B receptor desensitization mediated by the G protein-coupled receptor
kinase 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2985-2990 (1998).
� Penela, P., Ruiz-Gómez, A., Castaño, J.G. and Mayor, F. Jr. Degradation of the G
protein-coupled receptor kinase 2 by the proteasome pathway. J. Biol. Chem. 272,
35238-35244 (1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Petronila Penela: �Expresión de las proteínas reguladoras βARK-1 (GRK2) y β-arresti-
na-1 en distintos estadíos de desarrollo. Modulación a nivel transcripcional y de degra-
dación proteolítica�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación:
Sobresaliente cum laude.
202
Premios y Distinciones/Prizes and Distinctions
Federico Mayor, Jr.:
� Premio anual de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales
(Octubre 1997).
203
NEUROTRANSMISION Y DESARROLLO NEUROTRANSMISSION AND DEVELOPMENT
Jefe de Línea / Group Leader: Galo RamírezPersonal Científico Scientific Personnel: Ana BaratBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: Milagros Ramos Becario Predoctoral Predoctoral Fellow: Javier S. BurgosTécnico de InvestigaciónTechnical Assistance: José Luis García-MiraCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Diogo Gomes de Souza, Carla I. Tasca (Universidad
Federal de Rio Grande do Sul. Brasil)
Resumen de Investigación
Durante estos dos años nuestro grupo ha trabajado en el análisis de las interac-
ciones de los nucleótidos de guanina (GNs) con los receptores ionotrópicos de gluta-
mato. Se sabe que las diversas subunidades de dicha familia de receptores, clonadas
hasta la fecha, contienen una breve secuencia de aminoácidos, en uno de los dominios
extracelulares, que reconoce a los nucleótidos de guanina. Esta secuencia (que ha sido
relacionada con el llamado p-loop, zona de reconocimiento típica de proteínas que unen
nucleótidos -como las GTPasas-, aunque esta relación es cuando menos dudosa) forma
además parte del propio sitio de reconocimiento de los agonistas de glutamato por lo
que los GNs son capaces de desplazar e impedir el acceso de dichos agonistas al recep-
tor. Los GNs constituyen así una familia de antagonistas potenciales del glutamato.
En este contexto hemos demostrado por primera vez el efecto protector del GMP
frente a las lesiones causadas por las excitotoxinas quinolinato y kainato in vivo y ex vivo y,
en contraste, el efecto agonista parcial de algunos análogos del GTP en estos mismos modelos.
Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
Los objetivos de este proyecto de investigación, a medio y largo plazo son:
a) Profundizar en el conocimiento de los mecanismos de interacción entre los GNs
y los receptores de glutamato y las condiciones estructurales para definir el carácter
agonista/antagonista de dichos nucleótidos.
b) Estudiar la capacidad neuroprotectora de los GNs antagonistas de glutamato
en diversos paradigmas experimentales de excitotoxicidad in vivo, ex vivo y en cultivo.
c) Utilizar el GMP, un GN no activo en señalización (en contraste con el GTP y el
GDP), para modelización molecular de compuestos heterocíclicos antagonistas del glu-
tamato, de baja toxicidad, para su posible uso terapéutico como neuroprotectores.
Research Summary
We are working on the analysis of the interactions of guanine nucleotides (GNs)
with ionotropic glutamate receptors. It is already known that the different ionotropic
glutamate receptor subunits cloned so far contain a short amino acid sequence respon-
sible for the recognition of GNs, as shown by directed mutagenesis. This sequence,
which has been tentatively related to the p-loop nucleotide-recognition motif, is also part
of the glutamate recognition site so that GNs block the access of agonists to the recep-
tor, thus behaving as potential antagonists of glutamate.
In this context we have recently demostrated the ability of GMP to act as a neu-
roprotector against quinolinate- and kainate-induced neuronal lesions, both in vivo and
ex vivo, and the partial agonistic behavior of some GTP analogs in these same models.
The medium- and long-term objectives of this project are:
a) To improve our understanding of the interaction of GNs with glutamate recep-tors, specially of the structural properties underlying the agonistic/antagonistic beha-vior of GNs.
b) To further analyze the neuroprotective capacity of several GN derivatives indifferent experimental paradigms involving neurotoxicity.
c) Using GMP as a model molecule, to design heterocyclic compounds with anta-
gonistic activity towards glutamate and low intrinsic toxicity.
204
205
Publicaciones / Publications
� Rubin, M.A., Medeiros, A.C., Rocha, P.C.B., Livi, C.B., Ramírez, G. and Souza,
D.O. Effect of guanine nucleotides on [3H]glutamate binding and on adenylate
cyclase activity in rat brain membranes. Neurochem. Res. 22, 181-187 (1997).
� López, R., López-Gallardo, M., Medina, J.I., Ramos, M., Ramírez, G. and Prada, C.
A Streptomyces fradiae protease dissociates structurally preserved neurons and
glial cells from the embryonic and adult central nervous system of vertebrates. J.
Neurosci. Meth. 73, 9-16 (1997).
� Ramos, M., Souza, D.O. and Ramírez, G. Specific binding of [3H]GppNHp to
extracellular membrane receptors in chick cerebellum: possible involvement of
kainic acid receptors. FEBS Lett. 406, 114-118 (1997).
� Malcon, C., Achaval, M., Komlos, F., Partata, W., Sauressig, M., Ramírez, G. and
Souza, D.O. GMP protects against quinolinic acid-induced loss of NADPH-diap-
horase-positive cells in the rat striatum. Neurosci. Lett. 225, 145-148 (1997).
� Alcalde, E., Roca, T., Barat, A., Ramírez, G., Goya, P. and Martínez, A. Molecular
modeling of (E)-1-Alkyl-4(3)-[2-(1H-azolyl)vinyl]-pyridinium salts and evalua-
tion of their behavior towards choline acetyltransferase. Bioorg. Med. Chem. 5, 949-
954 (1997).
� Tasca, C.I., Cardoso, L.F., Martini, L.H., Ramírez, G. and Souza, D.O. Guanine
nucleotides inhibit cGMP accumulation induced by metabotropic glutamate
receptor activation. Neurochem. Res. 23, 183-188 (1998).
� Regner, A., Ramírez, G., Belló-Klein, A. and Souza, D. Effects of guanine nucleo-
tides on glutamate-induced chemiluminiscence in rat hippocampal slices submit-
ted to hypoxia. Neurochem. Res. 23, 523-528 (1998).
� Burgos, J.S., Barat, A., Souza, D.O. and Ramírez, G. Guanine nucleotides protect
against kainate toxicity in an ex-vivo chick retinal preparation. FEBS Lett. 430,
176-180 (1998).
206
Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions
Galo Ramírez:
� Miembro del Bureau de la Asamblea Europea de la Ciencia y la Tecnología
(ESTA) / Member of the Bureau of the European Science and Technology
Assembly (ESTA). 1997.
207
MECANISMOS DE ENVEJECIMIENTO YNEURODEGENERACIÓN MECHANISMS OF AGEING AND NEURODEGENERATION
Jefe de Línea / Group Leader: Jorgina SatrústeguiPersonal Científico Scientific Personnel: Elena Bogónez, Jose M. Carrascosa, Alberto
Martinez-SerranoBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Araceli del Arco, Ana Villa Becarios Predoctorales Graduate Students: Gema Alvarez, Santiago Cavero, Yasmin Fermín,
Maria Isabel García-Simón, Juan Carlos Molero, Francisco Javier Rubio, Francisca Ruiz
Técnicos de Investigación Technical Assistance: Belen Huesa, Bárbara Sesé Científico VisitanteVisiting Scientist: Miguel Hernández-Carrasquilla (Conserjería de
Salud, Comunidad Autónoma de Madrid)
Resumen de Investigación
Nuestro laboratorio está interesado en le estudio de los mecanismos moleculares
del envejecimiento y la neurodegeneración en el sistema nervioso central y en el estu-
dio de la resistencia a la insulina durante la vejez.
Respecto del primero de estos estudios, trabajos previos de nuestro laboratorio
mostraron que la capacidad de regulación de los niveles intracelulares de calcio se dete-
riora en las neuronas durante el envejecimiento. Como la función neuronal está deter-
minada por los niveles de calcio celular, un deterioro en la regulación de la concentra-
ción de este segundo mensajero puede tener consecuencias fisiopatológicas en la función
cerebral a edades avanzadas y también puede constituir un factor de riesgo dependien-
te de la edad para la neurodegeneración. Por ello, estamos intentando averiguar cuales
son los mecanismos moleculares responsables del deterioro en la regulación del calcio
Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
208
celular durante el envejecimiento y sus posibles consecuencias en neurodegeneración.
Como encontramos que el envejecimiento afecta severamente a la regulación mitocon-
drial de calcio, estamos centrándonos en el papel de la mitocondria en estos procesos.
Uno de los aspectos que más nos interesa es identificar las proteínas responsables
del transporte o de la regulación de calcio in mitocondrias. La(s) proteína(s) responsa-
bles de la captura y eflujo de calcio en mitocondrias se desconocen. En los últimos años
hemos purificado un transportador de calcio de mitocondrias de hígado de rata que
tenía actividad de intercambio Ca2+/H+ tras su reconstitución en proteoliposomas.
Además, hemos identificado una nueva subfamilia de transportadores mitocondriales
caracterizada por tener dominios de unión de calcio. Hemos clonado al primer miem-
bro de esta subfamilia, que hemos llamado Aralar, de corazón humano. Aralar es una
proteína mitocondrial que une calcio y está presente sólo en tejidos excitables (corazón,
músculo y cerebro). De acuerdo con la distribución de cargas en sus dominios trans-
membrana, Aralar puede funcionar como un transportador de aniones dependiente de
Ca2+ Estamos empleando distintos abordajes (expresión de Aralar entera o de formas
truncadas en levaduras y células de vertebrados, ver también mas abajo) para estudiar
la actividad transportadora de esta proteína así como su papel en la función y supervi-
vencia neuronales.
Se sabe ahora que la mitocondria participa activamente en apoptosis y posible-
mente en otros procesos de muerte celular mediante la liperación de citocromo c y otros
factores apoptogénicos al citosol. Así, en los últimos años, hemos estudiado el papel de
la mitocondria en dos procesos que conducen a la muerte neuronal: la excitotoxicidad
del glutamato y la exposición al beta-amiloide, el péptido que se acumula en las placas
seniles características de la enfermedad de Alzheimer. Estos estudios se realizan usan-
do cultivos neuronales primarios como modelo y bajo la dirección de la Doctora E.
Bogónez. Estamos estudiando los sucesos tempranos que desencadenan la muerte neu-
ronal en estos paradigmas, la activación de caspasas, el papel de la provisión de sus-
tratos respiratorios a la mitocondria como medio de modulación de la muerte neuronal
por necrosis o apoptosis y la posible implicación de un megacanal mitocondrial res-
ponsable de la llamada �transición de permeabilidad�.
Desde el descubrimiento de la existencia de células neurales madre multipotentes
en el cerebro embrionario y adulto en roedores, estas células, por sus propiedades, han
sido utilizadas en el diseño de estrategias de terapia génica en modelos de neurode-
genración del sistema nervioso, así como también para estudiar el desarrollo del siste-
ma nervioso de mamíferos. Desde el punto de vista biotecnológico, ha habido también
un gran esfuerzo orientado a la generación controlada de neuronas, astrocitos y oligo-
dendrocitos plenamente diferenciados en cultivo. En nuestro laboratorio, bajo la di-
rección del Dr. A. Martínez-Serrano, hemos comenzado a desarrollar procedimientos
que utilizan células de origen humano, con el objetivo de acercar estas estrategias al
escenario de la clínica. Como primer paso, hemos desarrollado la metodología necesa-
ria para expandir células madre de cerebro humano, así como para inmortalizarlas y
generar líneas celulares con las mismas propiedades que las células primarias, de gran
utilidad para estudios bioquímicos y de biología molecular, así como para llevar a cabo
transplantes en el cerebro. En el momento presente, hemos generado y aislado una
colección de líneas celulares con estas propiedades de multipotencialidad, que están
siendo objeto de estudio y de nuevas modificaciones genéticas encaminadas a su uso
futuro para terapia génica. Por otra parte, dado que estas líneas son capaces de generar
células humanas maduras pertenecientes a los tres linajes celulares del SNC (neuronas,
astrocitos, oligodendrocitos), estamos explorando cómo instruir a estas células para
controlar y dirigir su programa de diferenciación en un sentido u otro, según las nece-
sidades. Finalmente, estamos desarrollando modelos en cultivo para el estudio de pro-
cesos de muerte neuronal, así como la participación de la proteína Aralar en homeos-
tasia de calcio, funcionalidad y supervivencia neuronal.
En relación al estudio de la resistencia a insulina asociada al proceso de envejeci-
miento, dirigido por el Dr. J.M. Carrascosa, durante los últimos años se han analizado
diversas modificaciones en la cascada de transmisión de la señal insulínica en adipoci-
tos de rata. Después de demostrar que el receptor de insulina de los adipocitos proce-
dentes de ratas viejas posee una menor actividad quinasa in vitro, se ha orientado el tra-
bajo hacia el análisis de procesos moleculares posteriores a la estimulación del receptor
que pudieran estar a su vez alterados, contribuyendo a la marcada insensibilidad a la
hormona característica de estas células en los animales envejecidos. Para ello se empleó
209
210
el vanadato, un compuesto que ejerce efectos similares a la insulina tales como la esti-
mulación del transporte de glucosa, la translocación del transportador GLUT 4, o la
activación de las MAP quinasas, sin inducir la autofosforilación y subsiguiente activa-
ción del receptor insulínico. Nuestros datos indican la existencia de alguna alteración
en la vía de transducción de la señal insulínica a un nivel posterior a la estimulación de
PI-3 quinasa, que impide una completa activación del transporte de glucosa durante el
envejecimiento. Sin embargo, de los datos relativos a la estimulación de las MAP qui-
nasas puede concluirse que la mayoría de los procesos moleculares involucrados en la
señal hormonal permanecen perfectamente activos en las células de los animales viejos.
Durante el último año hemos comenzado a analizar los efectos lipogénicos y anti-
lipolíticos de la insulina utilizando un abordaje experimental similar al descrito.
Igualmente, hemos comenzado una línea de investigación sobre la posible implicación
de las MAP quinasas en la estimulación de dichos procesos utilizando la línea celular
adipocitaria 3T3-L1 como modelo experimental.
Research Summary
Our laboratory is interested in the study of the molecular mechanisms of ageing
and neurodegeneration in the central nervous system, and in the study of insulin resis-
tance in ageing.
With regards to the first of those studies, previous work from our laboratory has
shown that the ability to regulate intracellular calcium levels in neurons becomes
impaired during ageing. Since neuronal function is finely tuned to intracellular calcium
levels, an impaired calcium regulation may have pathophysiological consequences in
brain function in old age and it may also become an age-dependent risk factor for neu-
rodegeneration. Thus, we are currently trying to understand what are the molecular
mechanisms whereby calcium regulation is altered during ageing and its possible con-
sequences in neurodegeneration. Since we found that calcium handling by neuronal
mitochondria was severely affected by ageing, we are focusing on the role of mito-
chondria in these processes.
One of our main interests is to identify the proteins responsible for calcium trans-
port and/or calcium regulation in mitochondria. The protein(s) responsible for uptake
and efflux of calcium in mitochondria are yet unknown. In the last years we have puri-
fied a calcium transporter from rat liver mitochondria that was shown to have Ca2+/H+
exchange activity after reconstitution in proteoliposomes. In addition, we have also
identified a new subfamily of mitochondrial metabolite carriers characterized by the
presence of calcium binding domains. The first member of this subfamily, that we
named Aralar, was cloned from human heart. Aralar is a mitochondrial protein that
binds calcium and is present only in excitable tissues (heart, muscle and brain).
According to the charge distribution within its putative transmembrane domains,
Aralar may function as a Ca2+-dependent anion carrier. We are employing different
approaches (expression of wild type and truncated Aralar in yeast and in cells from ver-
terbrates) to study the carrier activity of this protein and its role in neuronal function
and survival.
It is now known that mitochondria participates actively in apoptosis and possibly
other cell death processes by releasing cytochrome c and other apoptogenic factors to
the cytosol. Thus, in the past few years, we have also studied the role of mitochondria
in two processes that lead to neuronal death: glutamate excitotoxicity and the exposu-
re to beta-amyloid, the peptide that accumulates in senile plaques characteristic of
Alzheimer�s disease. These studies are carried out using primary neuronal cultures as
model systems and under the direction of Dr. E. Bogonez. We are currently studying
the early events that trigger cell death in these paradigms, the activation of caspases, the
role of metabolite supply to mitochondria as means of regulation of cell death by necro-
sis or apoptosis and the possible involvement of a mitochondrial megachannel respon-
sible for the so called �permeability transition�.
Since the discovery and identification of multipotent neural stem cells in the
embryonic and adult rodent brain, these cells, and their inherent properties, have been
exploited for the design of ex vivo gene therapy strategies in models of CNS degenera-
tion, and also for the study of CNS development. On the more biotechnological side,
there has been also a major effort oriented to develop procedures for the tailored in
vitro generation of mature neurons, astrocytes and oligodendrocytes. In our laboratory
211
212
and under the direction of Dr. A. Martinez-Serrano, we have set up the methodology
needed to expand human derived neural stem cells in culture, and also immortalize
them, to generate cell lines useful for biochemistry and molecular biology studies, while
retaining optimal properties for their transplantation to the brain. At present we have
isolated a collection of cell lines of multipotential characteristics, that are being the sub-
ject of further genetic manipulations aimed at their future use for gene therapy. On the
other hand, since these multipotential stem cells can generate human neurons, astrocy-
tes and oligodendrocytes, we are exploring how to instruct these cells to follow specific
developmental programs. Finally, we are setting up in culture models where to study
aspects related to neuronal cell death, and the participation of Aralar protein in calcium
homeostasis, neuronal function and health.
With regards to the study of insulin resistance during ageing, in the last years we
have studied the modifications of the insulin signal transduction cascade in adipocytes
under the direction of Dr. J.M. Carrascosa. After having shown that adipocytes from old
rats have a decreased insulin receptor kinase activity in vitro, we focused our research
in the identification of possible postreceptor alterations that could in turn contribute to
the dramatically depressed insulin sensitivity of these cells. In order to do that we used
vanadate, an agent that elicits an insulin-like stimulation of glucose transport activity,
GLUT 4 carrier translocation, and MAP kinase function, without inducing insulin
receptor autophosphorylation and activation. Our data indicate the presence of an alte-
ration of insulin signal transduction downstream of PI-3 kinase in the pathway leading
to the stimulation of glucose transport during ageing. However, it appears that most
molecular events involved in the hormonal signal transduction are fully active in the
cells from aged rats.
During the last year we have focused our research interest in the lipogenic and
antilipolytic actions of insulin in adipocytes using a similar approach to that previously
mentioned. Equally, we are exploring the possible role of MAP kinase on those path-
ways using the adipocyte cell line 3T3-L1 as experimental model.
213
Publicaciones / Publications
� Rosenblad, C., Martinez-Serrano, A. and Björklund, A. GDNF promotes sprou-
ting of spared nigrostriatal dopaminergic afferents and induces recovery of func-
tion in a rat model of Parkinson´s disease. Neuroscience 82, 129-137 (1997).
� Martinez-Serrano, A, Bjorklund, A. Immortalized neural progenitor cells for CNS
gene transfer and repair. Trends Neurosci 20, 530-538 (1997).
� Lundberg, C., Martinez-Serrano, A., Cattaneo, E., McKay, R.D., Bjorklund, A.
Survival, integration, and differentiation of neural stem cell lines after transplan-
tation to the adult rat striatum. Exp. Neurol. 145, 342-360 (1997).
� Escriva, F., Agote, M., Rubio, E., Molero, J.C., Pascual-Leone, A.M., Andres, A.,
Satrustegui, J. and Carrascosa, J.M. In vivo insulin-dependent glucose uptake of
specific tissues is decreased during aging of mature Wistar rats Endocrinology 138,
49-54 (1997).
� Martínez-Serrano, A. and Snyder, E.Y. Immortalized neural stem-like cells for
CNS repair..In �CNS Regeneration: Basic science and clinical applications�.
Tuszynski M, Kordower J y Bankiewicz J, eds. Academic Press, San Diego, CA
(1998).
� Martínez-Serrano, A. and Björklund, A. Progress Towards Gene Therapy for
Nervous System Diseases. In The Development of Human Gene Therapy Ed. by
T Friedmann. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998).
� Andsberg, G., Kokaia, Z., Björklund, A., Lindvall, O. and Martínez-Serrano, A.
Amelioration of ischemia-induced neuronal death in the rat striatum by NGF-
secreting neural stem cells Eur. J. Neurosci. 10, 2026-36 (1998).
� Martínez-Serrano, A., Olsson, M., Gates, M. and Björklund, A. In utero gene trans-
fer reveals survival effects of Nerve Growth factor on brain cholinergic neurons
during development. Eur. J. Neurosci. 10, 263-271 (1998).
� Martínez-Serrano, A. and Björklund, A. Ex-vivo NGF gene transfer to the basal
forebrain in presymptomatic middle-aged rats prevents the development of cho-
linergic neuron atrophy and cognitive impairment during aging. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95, 1858-1863 (1998).
� Kokaia, Z., Andsberg, G., Martínez-Serrano, A. and Lindvall, O. Focal cerebral
ischemia in rats induces expression of p75 neurotrophin receptor in resistant stria-
tal cholinergic neurons. Neuroscience 84, 1113-1125 (1998).
� Di Jeso, B., Pereira, R., Consiglio, E., Formisano, S., Satrustegui, J. and Sandoval,
I.V. Demonstration of a Ca2+ requirement for thyroglobulin dimerization and
export to the Golgi complex. Eur. J. Biochemistry 252, 583-590 (1998).
� Batuecas, A., Pereira, R., Centeno, C., Pulido, J.A., Hernandez, M., Bollati, A.,
Bogónez, E., and Satrustegui, J. Effects of chronic nimodipine on working
memory of old rats in relation to defects in synaptosomal calcium homeostasis
Eur. J. Pharmacology 350, 141-150 (1998).
� Ruiz, F., Alvarez, G., Pereira, R., Hernandez, M., Villalba, M., Cruz, F., Cerdan, S.,
Bogónez, E., and Satrustegui, J. Protection by pyruvate and malate against gluta-
mate-mediated neurotoxicity. Neuroreport 9, 1277-1282 (1998).
� Molero, J.C., Martinez, C., Andres, A., Satrustegui, J. and Carrascosa, J.M.
Vanadate fully stimulates Insulin Receptor Substrate-1 associated Phosphatidyl
Inositol 3-Kinase activity in adipocytes from young and old rats. FEBS Letters 425,
298-304 (1998).
� Del Arco, A. and Satrústegui, J. Molecular cloning of Aralar, a new member of the
mitochondrial carrier superfamily that binds calcium and is present in human
muscle and brain. J Biol Chem. 273, 23327-23334 (1998).
� Villa, A., García-Simón, M.I., Blanco, P., Sesé, B., Bogónez, E., and Satrústegui, J.
Affinity chromatography purification of mitochondrial inner membrane proteins
with calcium transport activity. Biochim Biophys Acta 1373, 347-359 (1998).
214
215
� Carrascosa, J.M., Ramos, P. Molero, J.C. and Herrera, E. Changes in the kinase
activity of the insulin receptor account for an increased insulin sensitivity of
mammary gland in late pregnancy. Endocrinology 139, 520-526 (1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Juan Carlos Molero Navajas: �Bases moleculares de la resistencia a la isulina con el
envejecimiento. Alteraciones en la estimulación del transporte de glucosa y de la acti-
vidad MAP-quinasa en el adipocito de rata�. Universidad Autonoma de Madrid. 1997.
Calificación: Apto cum laude.
216
NEUROPATOLOGÍA MOLECULAR DE LA ENFERMEDAD DEALZHEIMERMOLECULAR NEUROPATHOLOGY OF ALZHEIMER�S DISEASE
Jefe de Línea / Group Leader: Fernando Valdivieso Personal Científico Scientific Personnel: Jesús Vázquez Becarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Mª Jesús Bullido, María RecueroBecarios Predoctorales Graduate Students: Jesús Aldudo, Mª Jesús Artiga, Pilar Cazorla, Miguel
Angel García, Elena SerranoTécnicos de Investigación Technical Assistance: Ester Romero, Isabel Sastre
Resumen de Investigación
La enfermedad de Alzheimer, causa más frecuente de demencia senil, se presen-
ta de forma tanto familiar como esporádica. Estudios genéticos han permitido identifi-
car tres genes, los de la proteína precursora del amiloide (APP), la presenilina-1 (PS-1)
y la presenilina-2 (PS-2), mutaciones en los cuales causan enfermedad de Alzheimer
presenil transmitida de forma autosómica dominante. Sin embargo, la mayoría de los
casos de enfermedad de Alzheimer son de tipo senil y no se ajustan a un patrón de
herencia mendeliano. El alelo ε4 de la apolipoproteína E (APOE, gen; ApoE, proteína)
está asociado con un incremento en el riesgo de desarrollar la enfermedad de
Alzheimer. A pesar de la amplia evidencia de que éste constituye el principal factor
genético de riesgo para la enfermedad de Alzheimer senil, tanto familiar como esporá-
dica, es también claro que el alelo ApoE4 no es necesario ni suficiente para causar la
enfermedad, por lo que deben existir otros factores, genéticos o ambientales, implica-
dos en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.
Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
Nuestro grupo ha realizado una búsqueda de variantes genéticas en la región pro-
motora del gen APOE (nucleótidos -1019 a +407), encontrando tres sitios polimórficos
nuevos (-491, -427 y -219) y uno descrito anteriormente (+113). La comparación de los
distintos alelos polimórficos en ensayos de transfección transitoria de células de hepa-
toma y astrocitoma humano mostró diferencias en su actividad transcripcional.
Además, el estudio de las proteínas nucleares que se unen a estas zonas polimórficas
del promotor APOE mostró diferencias en la afinidad de la unión debido a las diferen-
cias alélicas.
Hemos determinado que una de estas variantes (-491A) está asociada con un
incremento en el riesgo de enfermedad de Alzheimer, y que dicha asociación es inde-
pendiente del alelo ApoE4. Asimismo, el estudio del riesgo asociado a los haplotipos (-
491/-427) y de su actividad transcripcional mostró que el riesgo de padecer la enfer-
medad de Alzheimer correlaciona con la actividad transcripcional del promotor. Estos
trabajos sugieren que los polimorfismos en el promotor APOE pueden incrementar el
riesgo para la enfermedad de Alzheimer alterando los niveles de ApoE en el cerebro.
Se han descrito numerosas mutaciones causantes de enfermedad de Alzheimer en
el gen PS-1; dichas mutaciones producen las formas más agresivas de la enfermedad.
Las mutaciones patogénicas en PS-1 son muy heterogéneas y son responsables de la
mayoría de los casos de enfermedad de Alzheimer autosómica dominante. Nuestro
grupo ha desarrollado un método basado en la electroforesis en geles de gradiente des-
naturalizante, que permite el análisis mutacional de todos los exones codificantes y de
la región promotora del gen PS-1. El análisis por este método de una colección de
pacientes con enfermedad de Alzheimer presenil nos ha permitido identificar tres nue-
vas mutaciones en la región codificante (Met233Leu, Leu282Arg y Ala409Thr); además
hemos identificado una nueva mutación en el promotor proximal (-280C/G) que pro-
duce cambios significativos en la actividad transcripcional del gen en líneas celulares de
origen neuronal o astrocítico, pero no en células de origen hepático, sugiriendo que la
región -280 del promotor PS-1 contiene elementos que regulan la transcripción del gen
específicamente en células del tejido nervioso.
217
Research Summary
Alzheimer�s disease, the most common cause of dementia in the elderly, exists in
both familial and sporadic forms. Genetic studies have led to the identification of three
genes, amyloid precursor protein (APP), presenilin-1 (PS-1), and presenilin-2 (PS-2),
which, when mutated, can cause autosomal dominant forms of familial Alzheimer�s
disease. However, these three genes are responsible for only a small fraction of
Alzheimer�s disease cases, while the vast majority of patients with Alzheimer�s disease
present with a late age at onset and shows non-Mendelian inheritance pattern. The ε4
allele of apolipoprotein E (APOE, gene; ApoE, protein) has been associated with an
increased risk of developing Alzheimer�s disease. Despite the evidence implicating
ApoE4 as the single most important genetic determinant of susceptibility to sporadic
and late-onset familial Alzheimer�s disease so far identified, it is apparent that the
ApoE4 allele alone is neither necessary nor sufficient to cause the disease. This implies
the existence of other genetic or environmental factors in the pathogenesis of
Alzheimer�s disease.
We have screened for genetic variability in the proximal promoter region of
APOE (nucleotides -1017 to +406) and found three new polymorphic sites (-491, -427
and -219) and a previously described one (+113) within this region. Comparison of the
polymorphic alleles linked to a luciferase reporter gene and transfected into human
hepatoma and astrocitoma cells demonstrated different transcriptional efficiencies.
Furthermore, analysis of nuclear proteins that specifically bind to the upstream regula-
tory region of the APOE gene revealed differences in affinity for DNA binding proteins
due to nucleotide variations.
We found that one of these variants (-491A) is associated with risk for dementia
of the Alzheimer type and that this association is independent of ApoE4 status. In vitro
studies suggested that the APOE regulatory region polymorphism may increase risk for
Alzheimer�s disease by altering the level of ApoE expression. Study of the transcriptio-
nal activity of the haplotypes defined by combination of the -491 and -427 alleles indi-
cates that the risk for late-onset Alzheimer´s disease correlates with the transcriptional
activity of the APOE gene.
218
219
Many different mutations causative of Alzheimer�s disease have been found in
the PS-1 and are associated with the most aggressive forms of the disease. The patho-
genic mutations of PS-1 are very heterogeneous and are responsible for most cases of
autosomal dominant early-onset Alzheimer disease. We have developed a method
based on denaturing gradient gel electrophoresis, which allows the mutational analysis
of all the coding exons and the proximal promoter of PS-1. The analysis by this metho-
dology of early-onset Alzheimer�s disease patients has resulted in the finding of three
new mutations (Met233Leu, Leu282Arg and Ala409Thr) within PS-1 coding region and
a mutation in the PS-1 proximal promoter (-280C to G) that, interestingly, provokes sig-
nificant changes in the transcriptional activity of the gene in cell lines of neuronal and
astrocytic, but not hepatic origin, strongly suggesting that the region around -280 of
PS-1 promoter contains a regulatory element which control its transcription specifically
in neural cells.
Publicaciones / Publications
� Haas, C., Aldudo, J., Bullido, M.J., de Miguel, C., Vázquez, J. and Valdivieso, F.
Proteolysis of Alzheimer´s disease amyloid protein precursor by activated Factor
Xa. Biochim.Biophys.Acta 1443, 85-94 (1997).
� Haas, C., Cazorla, P., de Miguel, C., Valdivieso, F. and Vázquez, J. Apolipoprotein
E forms stable complexes with full-length, recombinant Alzheimer´s disease β-
amyloid precursor protein. Biochem. J. 325, 169-175 (1997).
� Aldudo, J., Bullido, M.J., Frank, A. and Valdivieso, F. Presenilin-1 genotype [2/2]
is associated with late-onset Alzheimer�s disease in Spanish patients. Alzheimer�s
Res. 3, 141-144 (1997).
� Fernández-Shaw, C., Marina, A., Cazorla, P., Valdivieso, F. and Vázquez, J. Anti-
brain spectrin immunoreactivity in Alzhemier´s disease: Degradation of spectrin
in an animal model of cholinergic degeneration. J. Neuroimmunol. 77, 91-98 ( 1997).
� Artiga, M.J., Bullido, M.J., Sastre, I., Recuero, M., García, M.A., Aldudo, J.,
Vázquez, J. and Valdivieso, F. Allelic polymorphisms in the transcriptional regu-
latory region of apolipoprotein E gene. FEBS Letters 421, 105-108 (1998).
� Bullido, M.J., Artiga, M.J., Recuero, M., Sastre, I., García, M.A., Aldudo, J.,
Lendon, C., Han, S.W., Morris, J.C., Frank, A., Vázquez,, J., Goate, A. and
Valdivieso, F. A polymorphism in the transcriptional regulatory region of apoli-
poprotein E gene associated with risk for Alzheimer´s dementia. Nature Genetics
18, 69-71 (1998).
� Aldudo, J., Bullido, M.J., Arbizu, T., Oliva, R. and Valdivieso, F. Identification of
a novel mutation (Leu282Arg) of the human presenilin-1 gene in Alzheimer´s
disease. Neurosci. Lett. 240, 174-176 (1998).
� Artiga, M.J., Bullido, M.J., Frank, A., Sastre, I., Recuero, M., García, M.A.,
Lendon, C., Han, S.W., Morris, J.C., Vázquez, J., Goate, A. and Valdivieso, F. Risk
for Alzheimer´s disease correlates with transcriptional activity of the APOE gene.
Hum. Mol. Genet. 7, 1887-1892 (1998).
� Roks, G., Cruts, M., Bullido, M.J., Backhovens, H., Artiga, M.J., Hofman, A.,
Valdivieso, F., Van Broeckhoven, C. and Van Duijn, C.M. The -491 A/T poly-
morphism in the regulatory region of APOE and early-onset Alzheimer�s disease.
Neurosci. Lett. 258, 65-68 (1998).
� Aldudo, J. , Bullido, M.J., Frank, A. and Valdivieso, F. Missense mutation E318G
of the Presenilin-1 gene appears to be a non-pathogenic polymorphism. Ann.
Neurol. 44, 985-986 (1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Pilar Cazorla: �Estudio de las interacciones moleculares entre proteínas implicadas en
la enfermedad de Alzheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación:
Apto cum laude.
220
221
Ana Isabel Marina: �La espectrina en la enfermedad de Alzheimer�. Universidad
Autónoma de Madrid. 1997.Calificación: Apto cum laude.
María Jesús Artiga: �Polimorfismos en la región reguladora del gen APOE y su asocia-
ción con la enfermedad de Alzheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.
Calificación: Apto cum laude.
Miguel Angel García: �Mecanismos de regulación transcripcional del gen APOE y su
relación con la enfermedad de Alzheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.
Calificación: Sobresaliente cum laude.
Jesús Aldudo: �Análisis mutacional del gen de la presenilina-1 y su asociación con la
enfermedad de Azlheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación:
Sobresaliente cum laude.
Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions
Fernando Valdivieso:
� Premio Nacional de Investigación sobre la Enfermedad de Alzheimer �Ciudad de
Zamora� 1998.
222
BASES MOLECULARES DE LA PLASTICIDAD NEURONALMOLECULAR BASIS OF NEURONAL PLASTICITY
Jefe de Línea / Group Leader: F. Javier Díez GuerraBecarios Predoctorales Graduate Students: Noa Martín Cófreces, Paloma Rodríguez Sánchez,
Pedro Tejero Díez, Eva Yus NájeraTécnico de Investigación Technical Assistance: Pedro Torrico Pardo
Resumen de Investigación
El correcto funcionamiento del sistema nervioso depende de la capacidad neuro-
nal para adaptarse a distintas situaciones de su entorno. Esta capacidad se manifiesta
durante el desarrollo -en la generación y especificación de los circuitos neuronales bási-
cos-, durante la regeneración que sigue al daño neuronal -promoviendo la formación de
nuevos contactos sinápticos- y durante el aprendizaje y la función memorística -con-
trolando el remodelamiento y la eficacia de los contactos sinápticos en redes neurona-
les. La comprensión de los mecanismos moleculares en los que se fundamenta la plas-
ticidad neuronal es un objetivo básico para la neurobiología. Su consecución abriría
enormes expectativas en la investigación clínica relacionada con la regeneración fun-
cional después de lesiones medulares, y con el desarrollo de tratamientos preventivos
y paliativos de mayor eficacia para neuropatías que, como las epilepsias, se caracterizan
por neurodegeneración masiva asociada a hiperexcitabilidad.
En la actualidad, el esfuerzo de nuestra línea de investigación se centra, por un
lado, en el desarrollo de modelos experimentales �in vitro� que permitan el análisis
molecular de los mecanismos responsables de la plasticidad neuronal y, por otro, en el
estudio de la fisiología molecular de dos proteínas específicas de tejido nervioso -GAP-
43 y Neurogranina-, cuya implicación en fenómenos de plasticidad neuronal está
ampliamente documentada.
Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report
Los modelos experimentales se desarrollan a partir de cultivos de neuronas de
hipocampo de rata -cultivos primarios- y de rodajas de hipocampo procedentes de rata
neonatal -cultivos organotípicos. Los cultivos primarios se mantienen a baja densidad
durante periodos prolongados -3-4 semanas- gracias a su co-cultivo con astrocitos en
soportes independientes. Los cultivos organotípicos se establecen sobre membranas de
celulosa. Ambos sistemas permiten estudios a medio-largo plazo, imprescindibles para
analizar los fenómenos de plasticidad neuronal, hasta ahora inabordables en otras pre-
paraciones. Asimismo, permiten alterar farmacológicamente la actividad neuronal y
realizar un seguimiento mediante sondas fluorescentes.
El estudio bioquímico de GAP-43 y Neurogranina se concreta en el análisis de su
modificación post-traduccional (fosforilación, palmitoilación, etc), distribución subce-
lular e interacción con otras proteínas, como pasos previos para situar su actividad en
un contexto más amplio de transducción intracelular de señales. Paralelamente, se estu-
dia el efecto de la expresión de GAP-43 y Neurogranina sobre la morfología celular, la
adhesión y motilidad celular sobre diferentes sustratos, el dinamismo de microtúbulos
y microfilamentos y el tráfico intracelular de membranas. Estos aspectos se analizan
tanto en cultivos primarios de neuronas como en líneas celulares que expresan GAP-
43 o Neurogranina de forma inducible.
Research Summary
The nervous system normal operation depends on the ability of neurones to adapt
to changing environment conditions. This ability shows up during development -in the
generation and specification of basic neural circuits -, during regeneration following
injury -promoting sprouting and development of new synaptic contacts- and during
learning and memory function -modifying synaptic efficiency and remodelling.
Understanding the molecular mechanisms underlying neuronal plasticity is a major
goal in the area of neurobiology. Its achievement would open great hopes in clinic rese-
arch related to functional regeneration after spinal cord damage, and the development
of better preventive and palliative treatments of several brain diseases, such as epilep-
sies, which feature massive hyperactivity-linked neurodegeneration.
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At the moment, our research effort is directed, on one side, to the development of
experimental �in vitro� models which allow the molecular analysis of the mechanisms
responsible of neuronal plasticity and, on the other side, to the study of the molecular
physiology of two neural-specific proteins -GAP-43 and Neurogranin-, whose involve-
ment in neuronal plasticity phenomena has been widely documented.
The experimental models developed are cultures of rat hippocampal neurones -
primary cultures- and cultures of slices obtained from neonatal rat hippocampi -orga-
notypic cultures. Primary cultures are seeded at very low density and maintained
during prolonged periods �3 to 4 weeks- by means of a co-culture technique with
astrocytes. Organotypic cultures are set up and maintained on cellulose membranes.
Both systems allow to conduct medium and long-term studies, which are indispensable
to analyse neuronal plasticity phenomena, till now out of reach for other preparations.
Moreover, they allow pharmacological manipulation of neuronal activity and its moni-
toring using fluorescent probes.
The biochemical study of GAP-43 and Neurogranin is focused on the analysis of
their post-translational modifications (phosphorylation, acylation, etc), their subcellular
distribution and interaction with other proteins, as obligated steps before these proteins
could be mapped in intracellular signalling cascades. At the same time, we are studying
the effect of GAP-43 and Neurogranin expression on cellular morphology, on cellular
adhesion and motility on several substrates, on the dynamics of microtubule and micro-
filament cytoskeleton and on intracellular membrane traffic. These studies are now
being carried out on primary neuronal cultures and on GAP-43 or Neurogranin expres-
sing cell lines under the control of inducible promoters.
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Publicaciones / Publications
� Rodríguez-Sánchez, P., Tejero-Díez, P. and Díez-Guerra, F.J. Glutamate stimula-
tes Neurogranin Phosphorylation in Cultured Hippocampal Neurones.
Neuroscience Letters 221, 137-140 (1997).
� Tejero-Díez, P., Rodríguez-Sánchez, P. and Díez-Guerra, F.J. NGF Y bFGF alteran
la fosforilación y localización subcelular de GAP-43. Revista de Neurología 25 (147),
1715 (1997).
� Rodríguez-Sánchez, P., Lorenzo, P.I., Tejero-Díez, P., Bernal, J. and Díez-Guerra,
F.J. La expresión de Neurogranina en células PC12 produce alteraciones morfolo-
gicas similares a las inducidas por NGF. Revista de Neurología 25 (147), 1767 (1997).
� Díez Guerra, F.J. Proteínas implicadas en la liberación de neurotransmisores por
exocitosis. Revista de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales
(España) 91, 239-253 (1998).
Tesis Doctorales / Doctoral Theses
Pedro Tejero Díez: �Implicación de GAP-43 en la orientación y avance del cono de cre-
cimiento en neuronas de hipocampo en cultivo. Análisis de su fosforilación y localiza-
ción subcelular�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calficación: Apto cum laude.