Pertuzumab increases epidermal growth factor receptordown-regulation by counteracting epidermal growthfactor receptor-ErbB2 heterodimerization

Mol Cancer Ther 2009;8(7). July 2009

Juliana Bentes Hughes, Christian Berger,Marianne Skeie Rødland, Max Hasmann,Espen Stang and Inger Helene Madshus.

Daniel F. Zegarra Ruiz

AbstractEGFR(erbB1) y erbB2 forman heterodímeros

por unión de un ligando a EGFR. Formación de heterodímeros

independientes a ligando => X Sobreexpresión (En células PAE)

Incubación con Pertuzumab:◦ Disolución de heterodímeros.◦ Incrementó la homodimerización inducida por

EGF => + Endocitosis de EGF◦ Análisis de microscopía confocal => + EGF en

endosomas◦ Immunoblotting => + Degradación de EGFR

Introducción

IntroducciónFamilia hEGFR:

EGFR/erbB1, erbB2, erbB3, erbB4.

EGFR/erbB2 => Sobreexpresados en cáncer

ErbB2 => Endocitosis deficiente => Al heterodimerizarse => Endocitosis deficiente de EGFR

Introducción

Tráfico del EGFR

Resultados

Neutralización de la heterodimerización EGFR-erbB2Para investigar el efecto de EGF y

Pertuzumab en la heterodimerización, se usaron células que expresaban EGF o EGF/erbB2.

Tras la dimerización en presencia o ausencia de EGF o Pertuzumab, se procedió a la inmunoprecipitación, SDS-PAGE y al immunoblotting.

MaterialesPAE.EGFR cellsPAE.EGFR.ErbB2 cellsPertuzumab (IgG) (25ug/ml)EGF (60ng/ml)Crosslinker: bis(sulfosuccinimidyl)

suberate (2mM)Anticuerpo Anti-EGFR unido a cuentas

(Inmunoprecipitación)Gel al 6% (SDS-PAGE)Anticuerpo Anti-EGFR/Anti-ErbB2

(Inmunoblot)

Pertuzumab Vs EGF como neutralizantes de los heterodímerosPara investigar si el Pertuzumab

por si solo era capaz de disolver los heterodímeros o si el EGF facilitaba esto al favorecer la homodimerización, se incubaron células que expresaban EGFR y erbB2 sólo con Pertuzumab (IgG) durante 1 hora en hielo, luego se realizo la inmunoprecipitación, el SDS-PAGE e immunoblotting.

MaterialesPAE.EGFR.ErbB2 cellsPertuzumab (IgG) (25ug/ml)Crosslinker: bis(sulfosuccinimidyl)

suberate (2mM)Anticuerpo Anti-EGFR unido a

cuentas (Inmunoprecipitación)Gel al 6% (SDS-PAGE)Anticuerpo Anti-EGFR/Anti-ErbB2

(Inmunoblot)

Internalización del EGFR por Pertuzumab y EGF en células que expresan EGF y ErbB2Para investigar el efecto de Pertuzumab

en la endocitosis del EGFR, se usaron células que expresaban EGF o EGF/erbB2.

Las células se incubaron en presencia o ausencia de Pertuzumab (1 hora a 37°C), luego se evaluó la internalización de EGF incubando las células con 125I-EGF.

Se usaron también células SKBr3 que sobreexpresan ErbB2, y se siguió el mismo procedimiento.

MaterialesPAE.EGFR cellsPAE.EGFR.ErbB2 cellsSKBr3 cells (Sobreexpresan

ErbB2)Pertuzumab (IgG) (25ug/ml)125I-EGF (1ng/ml)

Efecto del Pertuzumab en la endocitosis de EGF (Microscopia Confocal)Se evaluó el efecto de

Pertuzumab en la endocitosis de EGF en células que expresaban EGFR y EGFR/ErbB2, fueron incubadas con o sin Pertuzumab por 1 hora a 37°C y luego con Alexa 555-EGF por 15 minutos a 37°C, posteriormente las células se fijaron e inmunomarcaron para EEA1.

MaterialesPAE.EGFR cellsPAE.EGFR.ErbB2 cellsPertuzumab (IgG) (25ug/ml)Alexa 555-EGF (60ng/ml) (Yellow-

green fluorescent dye)Anticuerpo anti-EEA1 de conejo/

Conjugado Alexa 647-Anticuerpo anti-conejo (Fijación e inmunomarcado)

Aumento en la degradación de EGFR por Pertuzumab en células que expresan EGFR y erbB2

Se evaluó si los homodímeros de EGFR, formados en células que expresan EGFR y erbB2, eran degradados tras la endocitosis por la incubación con Pertuzumab y EGF.

MaterialesPAE.EGFR cellsPAE.EGFR.ErbB2 cellsPertuzumab (IgG) (25ug/ml)EGF (60ng/ml)Cicloheximida (CHX; 25ug/ml)Gel al 6% (SDS-PAGE)Anticuerpo Anti-EGFR

(Inmunoblot)Tubulina (Control de descarga)

Disminución de la degradación de EGFR en células que expresan EGFR y erbB2 Vs células que expresan EGFR

Para analizar si la reducción el a degradación era debido a una menor endocitosis o un mayor reciclaje de complejos EGF-EGFR, se siguió el tráfico de el 125I-EGF.

MaterialesPAE.EGFR cellsPAE.EGFR.ErbB2 cellsPertuzumab (IgG) (25ug/ml)125I-EGF (5ng/ml)EGF (45ng/ml)

CIMAvax-EGF®Vacuna terapéutica anticancerígenaNSCLC IIIB/IV => +EGFR/erbB2Inmunoterapia activa: Ab anti-EGFEGF/P64k/Montanide ISA 51EGF humana recombinanteProteína recombinante de membrana

de Neisseria meningitidis: P64K inmunopotenciador (Proteína transportadora).

Montanide ISA 51: Adjuvant

Mecanismo de acción

Ligando (EGF)

AnticuerpoAnti-EGF(Suero)X

EGFREGFR erbB2

Respuestas

X

CIMAvax®

ProyectoSuero de pacientes tratados con

CIMAvax® (Exp)Suero de pacientes tratados con ChT

(Control)Cultivo celular PAE.EGFR + ControlCultivo celular PAE.EGFR.ErbB2 +

ControlCultivo celular PAE.EGFR + ExpCultivo celular PAE.EGFR.ErbB2 + ExpCultivo celular SKBr3 ¿?

ConclusionesEl Cimavax® es una vacuna

terapéutica anticancerígena