Post on 06-Nov-2023
transcript
NovaUniversidad Colegio Mayor de Cundinamarcarevistanova@unicolmayor.edu.co ISSN (Versión impresa): 1794-2370COLOMBIA
2006 Martha N. Calderon / Carlos Parra López / Rosalba Alfonso / Paola Barato / Diana
Giraldo / Martha L. Pinto / Manuel A. Patarroyo MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ESAT-6 ANTIGEN IMMUNOGENICITY IN
OWL MONKEYS Nova, enero-junio, año/vol. 4, número 005
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca Bogotá, Colombia
pp. 14-26
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Universidad Autónoma del Estado de México
http://redalyc.uaemex.mx
14 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116ARTÍCULO ORIGINAL
Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 antigenimmunogenicity in Owl Monkeys
Martha N. Calderon, Carlos Parra-López, Rosalba Alfonso, Paola Barato,Diana Giraldo, Martha L. Pinto, Manuel A. Patarroyo.
Molecular Biology Department, Fundación Instituto de Inmunología de ColombiaUniversidad Nacional de Colombia
Corresponding author: mapatarr@fidic.org.co
Abstract������� ������ �� ������� ���� ���� ������ ������ �� ��������� ������ ����� � ��� ������ ������
������� �� ������ ���� �������� ��� ������� �� ��� � � � ���� � � ����������������� ������������� ��������
�� �������� �� ������ ������ �� ��� � �� � �������� ������� ����� �� ���� ���������� �� ������������
�� ����������� ���� ������ �� ����� ������� ���!�� �� �������� � ����� �������� �� ��� �� ���
"� � �� ������ ��� �� � �� ��� ������ ������� ��� ��� �� ��� ������� �� ��������� ������� �������� �������
��� ���� � #$%&��������� ������������� �� ���������� ������������� � �� � %��� ������� �� ��� � �� �� �
�� ������ ������ �������� ����� �� '(')�*++ �������� ������ ������ �� �������, ������������ ������
�� ������� ����� ������ ���� ������ ������� �-����� ���� ����������� ���������� �� ���� �������� ���
������� ������ �� ���� �������������� �� ������ � ���� � ��� ���������� ���� ���������������� �� ��� ������
������ � ��� �� ��������� ������ ��� ��� ��������� �� ����� � ����� ������� � ������ ����� ���
������� �� �� ��������� ���������. �������� ��� �� ��� ������ �� �������������� ��������� �� �� ��� � ��
������������ ��� ����� �� � �� ����������
/������ ( 0�� ���!��� ������ ������ ��� ������� �� ��������� ����� ������ �� ��� ��
Resumen1� 2���� ������ �� ������� ������ �� ��������� � � �� ���� ��� ������� ���� 345� -�� ������ ���
�������� ���������� �������� �+6*+6 � ����� ������� �� ����� ������ ������7������ �� ��� �������� �����
� ��������� � ������ ������ � �� ���8����� �� �� ������ ������� �� �9�����������8� �������������
�������� ������� ����"� � ������:��� � ���������8� �7 ��� ���� �� ������ �� �� ������ �� �� ����� ���������
������ � �� ���� �������� �� � ; ���� �����:� �� �������8� � ��������8� �� �� �������;� �� �� ������� �
���� 8����� ������. ����7 �� �� � ����� ����������� ��� �� �� ��� �� ������ ����� �� ��� �������
�� ���������� 1� ������� �� ������ ������ �����"� ���� �� ������ ������������� �� �� ��������8� ��
������ � �� ����� � �� ���������� �� �������������� �� ������ �����:����� �� ������ �� ��: �� �����
��� ������ �� ��������� ���������� �� : �� �� ���� ��� ��������� � ��������� 1� ������� �� � �����
�� �� �� �������8� ��� ������������ �� �� ��������� � � �� ��� � � �� ���7��� � -�� � �� �������
��������� �� �������8� �� �� � ���� ����;����� ��� ������ � �� ��������� � ������ ����� �� <+6 �� ��
�������8� ��������� �������� �� �������8� �� �� � ���� �������� =��� -�� �� ������ ������ ���� ���"�� ��
15
Introduction�� ���� ��������� ������������� � ������� � �� ��
�� ��� ��� ������� ���� 345 ����� ������ ��
������ ���������� �������� �+6*+6 � ��!���
���������� � ��� ������������ ����� �� ������ ��������
�'$ � 5���� ������� ���� ���� ���� �� !��������
��������� ��� ������� �� ���������� ���������
����������� ��� ������, �-����� �> � �������������
����� � �� ������� ��������� ����� �������� ������
�������������� ��� ����������� ������������� �������
�������� ��� �������������� �?* � ���
�������������, ���� ���� �������� ��� ����������
�<�'+ � ���� � ��� ���� �� ��� ���� ��������
���������� � ����!��� ��� �����!��� �������� ��
��� ������� �� ��������� ��������� �''�') �
@� ���� ������� ��������� ����� � ��� ��������
���� ���� ��������� ������ ����� � ���������� ���
��� � ����������� ������� � ��9������ ������� ���
=A� ������� �'$'< � 0��� B� ��� �� ���� ��������
���� ����� ?+6 �� ��� 'C+ ��������� �� �����������
�� ��������� ����� ���� ���� �� ��� ���� ���� ���
D ������ ������� ��������E� ���������� ������ ���
!�������� ��������� ������� ��!��� �� ��� �������
��� ������ �� ���� �� ������-�� ������� ��������
����������� ������� �)+ � �� � ��������� �������
���� ���� � �������� ��������� �� ��� �� ���������
��� ������ ����� ����� ���� �������� �� ��
����������� ����� ��� �������, ������ �� ���������
���� ��������� ��������� ��������� ��� �������� ��
���������� ��������� �� ��� ���� ��� ����� ������
����� � ���� � ��� � ���� ������� �� ��� ������
�� ��� � �� ��� ������� �� ��������� �)')? �
A������� ������� ������ �� ���� ����������
��������� ���� ������������ ���������� ������ ��
���� �� ��������� ��������� ��������� � ��� ����� �
�� ������� ���������� �)� � �� � ������ �� �����
���� � ������� �� ���!�� ��� ���������� ���������
����������� ����� �� ���� �������� ���� ����������
��� � ���� , ��������� �� ����� �)C�)* � A�������
������� ����� ���� ����� ������ ���� ��� � ������
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ESAT-6 ANTIGEN IMMUNOGENICITY IN OWL MONKEYS: 14 - 26
�������������� �� �� �����;�� � ������� �� �� �� ������� �� ���� ����� ����� ����� ����� �����"� ��
�� ���� ������8� �� ��������� � ��� �� �� ������� ��� ����9���������� �� <+6 �� �������� �� ������ ��
������ � �� ���:���� ��� � ���� ������ � ������� �� �� ���� 1� �����;�� ���� �� ������ ��������
��������� ������ � != �� ��� ������� �� ��������� � �� ���������� ����������� ��� �������� �� �������
�� ����� ������ �4F@ � �� ��� ���:���� � -�;��������� ������������� � ������ ��� ������� �� ��� ��
�������:���� ��� ���� %'� � �� ���;���� � �������� ������� �� �� � ������� �� ����������� ����� ������
����� ���������� ��� ������� � ������ ��������� ��� ��� ������� �� ���������� � �� ����� ����
-�� � ����� �8� �� ��� ������ ������ ������������� � ��� ��������� � �� ������ �� �����������8 �����
�� � �� �����"� � � ����8 �� �� ��� �� ������ ��� ���� ����� ������ �� ���;���� �������������� ���� ��
����� ������������ ������ � �� ���;���� ��� ���������� "���� ��� �� ��������� G�������� C)+ ���������
�� ��� ������ �� ��� �� ������� � �������� �� ��� ����� ����� ��� �����:� ����� �� �����;�� ������ ���
���� �� �� �������� �� ����� �� ������� �� ��� ������� �� ���������� 1� �� ��� �� ������� ��� ������
��� �� �����������8� �� #$%&�������� �� �� ��� �� ����������������8�� 1� �� ��� �� ������� � ������8 ���
�� ��� �� �1B�� � ����������� ������:��� � ���� �;���� �� ���������� ��� �� �� '(')�*++ �������� ����
�� �� ���� ��8 �� ���������� ������������ �� � �� ���;���� �� -�� �� ������� �:����� -�� ������ �� �����;��
������ � ���;��������� ���������� ����� � ����� ������� ���� �������� �� �� ���8 ����7 �������8� �� ��
�� ��� �� � �� ��������8� ����� ������ � ������� ����� ��� �� �����"� ���� �� ������ �� �9�����������8�
�� ������ � �� ��������8� �� �� �� ��� ��� � �� � ����� � ��� ������ �� �� ������ �� � �� ��������8� ���
���� ����� ���� ������ ������ �� ��������� � �
�������� ����� G��� ������ ������ ������� ��� ������� �� ��������� ����� �� ��� �� �������
16 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116
Figure 1. rESAT-6 characterizing. (A) Clonation, expression and purification of rESAT-6: gel electrophoresis, immunoblot, HPLC chromatographyand circular dichroism. (B) Maldi-Tof mass spectrometry.
��
3�
17
��� � �������� �� ��������� � ���� ����������
�)<�$+ �
��������� �� ������ � � ���������� ���������� ��
������ ����������� ���������� ���!��
���������� ���� ��� �� �� ��������� �� � ���� ����
�� �������� ��� ��������� �� � ���������� ����� ����
������ �� ����� ��������� � ����� <+6 �� ���
�������� ���������� ���� ������ ���������� 0���� �����
���� ���� ���� �������� ������� ��� �� ���������
��������� �� ����������� ���� 345 ��� �� ���� �
����������� ����� �� ������� �=% �� ����� �������
���� ������������� ������� �)C�$'$) � �� �� �����
����� ������� �������� ������� �4F@ �������������� ���
����� �� ��� � ��� ������ ���!�� ���� ����
���� �������. �� ��� ����� � ��������� ��������
�� ���� ������� ��� �������� �� ��� � � ���� ��� BFA�
���������� ����� �$$�$> �
���� ������ �������� ��������� ������ � != �
� �������� ������� �������� ���������. �� � � �������
��� ���������� ������������� ������� �������� ������
%' �� ��� � �$?>' � �� ������� � ������� ������
������������� ������� ������ ��� �� ����� �������
���������� �� ��������� ����� �������� ���� �� ���
��������� ������ � ������ ��� ���� . ��� ����
���� �� ����� ��� �� � ������ ������������� � ������
������� ��� �� ������� ������������ ��� �� � �
����������� �$<�>)>> �
�� ����� ��� ���!��, ������ �� ��� � ��
����� � ������ �� ��� ���!� B����������� ����
��� ����������� ������� �������� ���� G�������� C)+
��"����� ������� ���� ���� ������� ��� ���� �������
�� ��� � � ���� ��� � ���� ������ �� ����� B� ��
�� ����� �� ������� ������ �� ��� � ���� ����
������� ��� ��� �� ��� ������� �� ��������� 4F@
�� ���������� �� ����� ��� ��������� ���� ����
�� ��������� �� ����� ���������� �� ���������� ����
���� ����������� ������� ��� 4F@ �� ���������� ��
������������� � �� � ���������� ���� � ������������
������ �� ��� � �� ����� ����������
Materials and Methods��������� �� �������
����� �� �9��� �� �� =%?� �H�$+
���!������ � ��� �HB�5�A � �� �������� ��
�������� �������������� � ��� � G���� 4������
��������A�)I �� �� ��� �������� ��������� �����
�� ������������� �� ����������� %@14 ������ �
��� � ��� ��� �9��� ��� �������������� � G������
�� ����������� ��� �������� ������� �� F����� '�
�� ��� ������� ���� 345 ���� �������
�1����������� B���� J�9� 4����� �� �� � � �� �
���������� ������� ��� �� ���� �9�������� �
4������� ������� �� ��������� %$CK� �������
�������� ������� �4F@ �������� �� ��� A�������
B� ������ �� %������ A������� B� ������ �� ������� ���
B�������� =� �� � �4������� A+'�BC?$)+� !�����
������� �� =�� L� 3��� �� �� 4������� ����� M����� ���
�� � �� �� ��� �� ����� ������������� � �� � ���
Table I. ESAT-6 synthetic peptide sequences
*FIDIC peptide number
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ESAT-6 ANTIGEN IMMUNOGENICITY IN OWL MONKEYS: 14 - 26
18 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116
� ������� )+��������� ���� ������� ���� ����� ����
�� ���� ��� � ����������� �?$ � �������� �� %@14
��� ������������� �� �� ������������ @������
������ ��� �-����� ��� ���� �� ���� B�
�� �����
� ����� �� '? ������� ����� ������� ���
���!�� ������� ���� ������� �� ������ ������ ������
���� B��������� ���� ������� �� �� �� ����������
�� ��� ��� �������� ������ ������� �� ����
������������� ����������� ���� ������� �� �����
����� %$CK� �� ��� � G��!�� ���� !��� �� ���
�� ������, �9���������� ������� ������ �� 1������
������� �� ���������� ���� 44�4 �4�������� ��
4��� ��� M � �� 1��������� ������ � M� ���������
��� 4�������� A������� B� ������ �� %����� ���������
��� ��� � � �� ���������� ������ � ������ �� �� ���
4�������� N������� 4���������� �4������������ �
�� ��� ���� �� ������������ �� ���!�� ��� ��
�� ��� ������ �� ��������� �� �������� ��!��
����� � 0�� ������� ����� ���� ��������� ����� �
�� ���� ������� ������ ��������� ���� ���� ��� ����!���
����� ���� ��� ��������� ��������� �� ��!�� ��
��� ���� ��� �� �$?��O!� ������ !������� +�'��O/�
�������� ��� ' ��O/� ��������� ������� �����
�� ������� ��-����� ��� ��� ��������� ������� ���
�� ��� $+ ����� ��� �� � ���������� �� ���� ������ � ���
� ��� � 1���� ����� �?> � �� ����� ����
�������������� �� @������, ������-�� �?? � P����Q
A��� �� �PA �������� ��� ��������� �� 3�����
GB5<�+ � ��� ��� ���� ������ �G���������!
C%'+ ���� � ���! �� $CR4 ���� ���� ������� ����
�� ���������� �� � �� ���� �� ��� ������ �� '? �����
������� �� �� ����� ��� ������ � ������� ��F3 ���O��
��"����� ���� ��� ���� ������ ��� �������� �����
��� �� ������ ��� ���� �� ������� �������������
������� ������������ � '++�� ���������� �� � �@@=
K)$ ��B� ������� ����� B� ������� 4��������� ��
������������� ������ ������
�����������
F��� ���!�� ���� ������� ��� ���� ���������
����� BB � '++�� ����� �� @3� �'$C �G A�4��
)�C �G /4�� >�$ �G A�)%@0
>��� '�> �G /%
)@+
>
��� ���!���� � ���� ������� �� ��� ��� � ������ ��
����� ����� �������� ���� ��� ������� ����
345. ��� �� ����� ������� �� @3�� ������� �� ?+��
��� �� �� �� ����� ����� ����� ������ �� ��� �������
�@3� ��� ��"����� � B�������� ���� ���� �����
���� G�������� B�� C)+ ��"����� ���@@B4F�����
�� � C+($+ ����� �� ��������� ���� ����� ��������
����� ���� ��������� ���������� �� ���� )++��
���� ��� �� ��� ������� ����� ���� �� $+ ��� ��������
���� +� $+ ��� �+ � 3���� �� ��������� �����������
����� �� ��� ��� � ��"������� �� ��� $+ ��� ����� �����
�� ����� ���� ��� � G��!�� ���� ��� ������
��������� ��� '*+ ��� ��� ���������� ����� ���
� ����� �������� �
Table II. Immunized Aotus monkey groups
Immunogens were dissolved in PBS (I, II, and III) and emulsified 30:70 with Montanide ISA720adjuvant (I and III).M. bovis BCG was not emulsified in Montanide ISA720 adjuvant
19
������ ��������
F�� ���������!�� B����� ������ � ��
��1B�� � ��� ������� ���� ������� �� @3� �� '+��O
���� �4F@ ��� ' ��O���� ������ ��� ������� ���
� �� ��� ������� ���������� ���� . ��� ���� ����
����!�� ���� $6 3��� ����� ����� �������� ��
�� ����� ���� �� ���� �� ��� ������� ���� ����� ��
�������� �������� . ��� ����� � ����9��� � �%K@
���"������ ���� ��������� B�5 ��������� �� FB=B4
�� ����� �� ���� ���� � ����� ��������� ��
�������� �� ��������� � ��� G3 G��������
@���9��� � ��� ����� �� ���� ��)+��
�� ���� �� �
1�� � ��� G���� !�� GL �1B�� ������ �?� �
F�� N� ���� 3��� ����� � � 4F@ ���� ��������
�� ����� ������� ��������������������� ���
������������ � ��=�@�5� � ����� ��������
��������� �� � '+'?6 �������� ���� ����� ��
�������� �� '>6 �=�@�5� �� �� ������ � ����
�� ��� ���� ������������������� ���� ������ ��
������������ � �������� ���� 3��� 3�� K�� �
3���!��� ������ �'6 ������ ���!3� �'+�G �� %4�
�%C�?� '?+�G A�4� +�+?6 ���� )+ �� � ��
��� ��������� ��� ������� ��� � ������ ������������ �
���� ���� ������ ?+�� 4F@ �� ' �� ����� ����
��������� ���� ���!�� ���� ������� '('++ �� ����!���
������� ����� ���� ��������� ���� ��!�����
��� ����� � ��@ �������� ���� ��������� B�5� 34B@O
A3 �@������ �� � �� ��� ��������� �?C �
�������� ������������ ��������
G��!�� ���� ������������� �� ��� '?+ �����
��� ���� �� ������ 1��������� ���� �������� ��
��������� ��������� � ��� ��� ���� ����� ���
���� �������� �� F�����%���-�� �B4A 1�����
��������� ������ �������� ��������������� 4��� ����
�� ��� ��� � ������ �� K@GB '�>+ ������
���������� %�@��� 1���������� ���������������������
��� )+6 ��������� ����� '++�� ���� � ��� ���
���������� '+� ���� ���� ������ ���� <����� ����
������ ����� � �������� ���� ������� �'$ � 4F@ �'+��O
�� � ����� �� ������� �'��O�� ���� � �� �
������� ��� ?��O�� ������������������ �@%��
=BF40 �� K@GB '�>+ � �� ����� ������� ��� ���
��������� ������� �� ���������� ���� ���������� ��
��������� �� ���������� ���� � @���� ���� ���������
�� $CR4 �� ?6 40)���C) �� #$%&��������� �'�4�O����.
���� ��� �� ����� ��� ��� ����� '�'* ����
����������� 4��� ���� ����� ��� ���� ������ �5��
F���� ����� )>+'� 4�������� ���� �� � ��� � ����
����� ���. ������ ���� ����� ��� ���� ���� �������
�� � ������������ �������� K� ��� ��� �������� �
���������� ����9 ��B ( � ������� ������ � �� �����
��� ������ ���� ��� ��������� ������� ����
��� ������ �� ����� �
Results������������ ��������
A� ��� �� ���������� ��������� ���� �� �����.
��� ��������� � ���� ������� ���� ����� �� ��� �
����������� �� ����� ��!��. ���� * �� �����
������� ���� � ������ �� ��� ���������� �������� ��
3�4�4 ������� ��� �������� �� PA( > ���� ����
�� ���� ������� ' ���� ��� ��� $ ���� ������ ����
����� =A� � ������ ���� �������� ����� �� �������
�������� �� @4K �?> � ����� �������� ��� �� �� ���
������� ������9 ������������ ����� ��� ���� � ��
���������� �� � �� ���� �� ��� ������ �� '? �����
������� �� �� ����� ��� �F3 ���O�� ��"����� ���� ���
���� ������ ��� �������� ����� ��� �� ������ ���
���� �� ������� ������������� ������� �����������. ��
���������� �� �� ����� �������� �� �������� )> �� C)
���� ��������� ������������
���� �������� �� �����������
�� ��������� ���� ��!�� ���� ������� �� ���
����� �� �������� ������ ��� ��� ����( �������
���� �� ������ ���������� �� �������� ���������� ���
������� �� ���� ��� ����������� �� �� �� ���������
%$CK� ������� �� N� ���� ���� � ��� ���� �� �������
���� �� ���� ������� ������� ������� ����������� ��
������������� ������� ����� � ��� ��� ���������
�� ���� ����� �� ��� ���������� ��� �1B��
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ESAT-6 ANTIGEN IMMUNOGENICITY IN OWL MONKEYS: 14 - 26
20 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116
����� � � G��!�� ���� ��������� �� ����� ���� �
��� ������ ��� ������� �������� ����� � � A� ��������
�� ��� �� ������ �� �������� �� ��� �����������
��� �� ������ ��������� ���� �����. ������
�� ��� ���� �������� �� ��� ������� ���!�� � �����
����� BB �������� � ����� �� � �� 345. ����������
���� �� ����� ����� ���� �������� �� ��� ����� ��
��� ����������� ��� �������� ��� !�� ���
���������� �� ��� ���� BB�
������� ������ ��������
B��������� ��� �1B�� ���� � �� ��� �����������
����� ��� 4@F �������� ����������� �� ���!��
�������� ��� �������� ���� ����� B ������ �� ������
���� ����� ��� ��� � ��� �� �-���� ������������ ����
���� �� ������� ���� ����� �� ������������ ���
�� � ������ � F����� )�� �9���� ��� G��!�� ?� �����
�� ������ ���� ��� ����������� ����� ��� ���� � ������
���� ��� ��� �� 4F@�� �� � ����������� ���� ����
��� ��� � ��������� ���� �� �� ����������� ����� ����
�������� ��� �� ��� ����� ������� ������� ����� �� 4F@
����� ���� '++ ������� � ���������� �� ��������� �
��� ���� ���� ����� ���������� ��� ��� ��� ���������
�� � ����� F����� )3�
Figure 2. Western blot analysis showing the binding of antibodies from immunized Aotus monkeys with rESAT-6. (A) Results of immunodetectionin rESAT-6. (B) Mycobacterium tuberculosis crude CFP (B). Primary antibodies 1:100 dilution sera. Assay controls: a* strip incubated withanti-polyHistidine (Sigma), then anti-mouse IgG-PA (ICN.); c* strip incubated with anti-Ag85B, then anti-rabbit IgG-PA (ICN); b* and c* reagentcontrol for A and B, respectively.
21
Figure 3. ELISA assay for IgG antibodies generated by immunization with rESAT. (A) CFP and rESAT. (B) 5 peptides mapping ESAT-6. 620nmabsorbance delta, corresponding to the value obtained in each bleeding less pre-immune sera absorbance of each monkey regarding eachantigen. Primary antibodies 1:100 dilution. Each bar represents the mean of triplicate values.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ESAT-6 ANTIGEN IMMUNOGENICITY IN OWL MONKEYS: 14 - 26
�1B�� � �� ������������ ��� ���������. �� ��
���������� ���� ��� ����� ������� ������� �����
������ ������ ����� ������ �� ����� ��������� �����
������� '(*++ ��� '(')�*++ ��� �������� BBB ������ <+
��� � �������� ����� ��� ���� �� 4F@���� ���������
��� ���� �� ��� ��������� ������������ � '('++ �����
��� ���� � ����� �F����� $� � �������� ��� ���������
������� �-����� ������� ��� ������� ����� ������
22 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116
Figure 4. Proliferative responses of spleen-derived lymphocytes from Aotus immunized with rESAT-6 (Monkeys 1 and 2) and BCG (Monkey6). [3H]thymidine incorporation in response to in vitro stimulation with rESAT-6, the pool of ESAT-6 peptides, CFP and PHA (positive control)were measured 90 days after final immunization. Data are reported as SIs (fold stimulation over that of cells incubated in just medium). Resultsshown are representative of the immunized population. Each bar represents the mean of triplicate values ± sem
����������� ��� ��� ��������� ������ � �9���� ���
G��!�� ? ������� �� ����������� �������� ����� �����
�� ��� ���������� ������� � ��� ����� ���� ���
���������� �-����� ���������� ��� ����� ��������
������������� ������� �A%)���
��� ����� ����������
�F����� $3 � A� ���������� ����� �������� �����
���� �� ����� ���� ��� ���� ������ ���������
���� 345 �� ������� ���� �� ��� ����� ��� ���� �
�������� ������ ��������
4������� ������������� �� ��� � ���� � � �� � ���
������ , ����� ���������� � F����� > ��� �������������
����� ������� �� ������ ��� ���� �� ������� �������
��� �������� 4F@ ��� @%� �� ��� ����� ��������
�9�������� �� ����� ��������� ������ �G��!�� '
��� ) ���� ������������!�� ��������� � �������������
�������� �� ��� � �� 4F@� ��������� ���!�� ���������
����345.F����� > ��� G��!�� � �������������������
�� ��� ��������� ������� ������� �������������345�
B� ��� �� � ������������� ������� �� @%� �� �������
���� ���� ����� ���� ��� ����� ������� ������������ ���
������� � ��������� ���� �� ������ �� ������� ���!��
���������� � K���������� ������� ��� ������� ����
������������ ������� �� ��� � ������ �������������
"� � ������ �� �� ��� ��� ����� ���������� ��
������� � ���� ������ ����� ��������� ��� ���� ���!���
�B ����� ������ ���� '? �� $> ��� �����. * �� )* ���
��� ������� ����. ��� '+ �� )< ��� 4F@�
�� ������������� �� ��� � �� ���� ���� �����
��������� ������ ��������� ���� ������� �������
��� ������� �� ����� ���� ���� �� ����� ����
���������� ���� ��� ����������� ������� �� �������
���� ���� BJ� 4������� �� ���� ������ ���� ����
��� �� ��� �� ������ ���!�� ���������� ��� �������,
A%)���
������� �������� ')+$$ ���������� �� ����
��� �����9��������� ������ �400%���
� � �� �����
�� G��!�� ) ��� $� �� ����� ����� ���������� ���
�400%���
������ ���� ������� ')+$� ��� ')+$C�
A��� �� ��� ������� �� ��� �� ���������� ��
G��!�� ?� 4��� ��������� ���� ������� ���� ���
23
�������, ������ ������ �')+$> ��� ')+$? ��� ���
��� ��� ��� ����������� ��������������
Discussion������� ���� ��� �� �� ���� ���� ��� ��� ��
������� ���� ������� �� � �������� � �������
���� ������ �������� %' ���������� �� ���������
�������� �� ��������� � � ������ ���� ���������� �����
�BFA� ���������� ����� �>+�?* � B� � �������
���������� ���� �� ����������������� ����� � �������
�� �� ����� ���� �� � � �� ������ ��� !�� ��������� ��
���� ���������� �� �� ������� ��� ���������� ���
��������� ��� �� �� ��������� � �>>� ?<�+ � ������
����� �� ������� ����������� ������� ��� �� ������ �
��������� ����� ������ ��� � ������ ��� ��������
������� ���� �� ������ ����� ������� ��� ��������
������������ ������� 3 ��� ������� ���� ����
���������� ���������� ��� �������� ��������� �� ���
����� �������� �>$��'�$ �
B������������� ��� ������������������ ����� ����
���� �9������ �� ����� � ����������� ��� � =A�
��� ����������� ���� ������� �'$'>�'C��>�? �
�� � ��������� ���� ���� ���� �� ������ ��������
%' �� ��� � ��� ���������� ������ �� ���� ��� �����
�� 345� ������� ������� ��� ����� ���� ���������
�� ���� ��������� ���� �� � ���� ��������.
����������� ��� ���������� ������ �� ��� ������
�� ��� � �� ��� ��"����� � �� �� ��� ������������
����� � ��������� �� ��� �������� 0�� ���� ��
���� ���� ��� ����==� ����������� ���������
����������� ��������������� ��� ��� ������ ���
����������� ������ �� ��� � �� ��� ������ ������
N��� G@1 �������� ������ ������ � ������������
���� ��� ����������� �� ��������� ����������� � �����
��"����� �������� ��� �� �� ����� ��� ���� �������� ���
������� ������ �� ��� � �>) � �� ���� ��� �����
�� ��������� ������ �������� ���� ���������� ��������
���������� ��� ��������� ���� ������� � �� ���
��� ����� � 345� � �������� �� ��� ��� � ����� ��
Table III. rESAT-6 binding antibody titers obtained by ELISA assay
Table IV. ESAT-6 peptide-stimulated splenocyte proliferation assays
Monkey 4 died before the experiment ended.Positive values were considered as having SI>2 (shown in bold and underlined).Each result represents the mean of triplicate values ± sem.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ESAT-6 ANTIGEN IMMUNOGENICITY IN OWL MONKEYS: 14 - 26
����������������������
24 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116
�� ��������� �������. ��� � �� ��� ��� ���� ����
��� ��� �������� �� ��� � ���� ����������� �������
�� ������ ����� � ��� G�������� C)+ � ��"������
G�������� C)+ � � ������������� ������� ������ ��
��� ������� ��"����� ����� �� ���� �������� ��������
��� � � �� ����� � ����� ��������� ���� �����
�� ��� ������� ��� ��� ��� ��� ������ �� �� �����
���� ������ ��������� ���� 345 �
=�������� ������ ���� ��������� ���� ����
������� ������� ������� ���������� �� � ����
���������� �� ���������� � ��������� �� ��� �� �������
�� ��� � �� � �� �?<��'��� � =�������� �������
�-����� �������� �� ������� ����������� ����
�� ����� �� ����� ���!�� � ����� ���� � ��� �����
������� ����������� �� �������� �����������
B����� ������ ���� �� ��� ��������� ������ , ���
���������� ��� ����������� ������� A%)���
��������
1�!��� �� ��� ����������� �� ���� A%)���
������
������� �� ��������� �� ���������� �������� ���
���� ��� ���������� ����-�� � ��� � ����-�� �
������� 5���� ���!�� �� ���� ��������
����� ������ �� � ���� � ��� ����������� �������
������� ��� ���� ������� �-������ ����� ��
��������� ����������� ������ ��� 400%���
�������
� �� ����� ���� ����� �� ��������� ��$ � �� ��������
�� ��� � ������ �-����� ������ ������ ��� ���
400%���
�������� ���� ������� ������������� �� ���
��������� ���!�� � ����� ��� �� ��� ���������
���!�� ��� ���� �� �� ���� ������ ��� A%)���
�� ��
������� �� ��� ���� ���� �������� �� ������� �����
� ��� ����� ���� �>'����* � 4������� ��� �������
�� ����� ������ �� ��� � ���������� ���� �����
�������� ������� ������� ���� ������� ����
� ��� ���� ���� ���� ������ �������������� �������
���� ��� ��� �� ���� ��� ������� ���� �� ��� ���
�� ��� � � �� ������������� ������� �
�� ����� ������� ���!�� �� ����
����������� �� ��� N���� %����� 0�����������
�N%0 � � ����� ��� ������� ������� ���������
���������� ��<C+ � �� �� ������� ������ � ���
�������� �� ����� ������� �� � ���� ���������� ��
�������� ���� ����� ����� ����������� K����� ����
�� ���� C*6 �� <?6 �������� ��� G%4BB
�������� ��� ��������������� 4�� BB ������9 �>?
?)�C' ����� ���� ���� �������� � ������ �����
���������� �� ��������� � ��������� �)$)> �
1��������� , ������������� �� ����� �� ��� � ��
������� �� ����� ������� �� ���� ���������
������ ���� �� ����� ���� ���!�� �� ���!��
��������� �� ��� ���������� ������� � � �� �C) .
��� �� �� � ��� �� ��� ��� ��� ���!� J����� ��������
��� ������� ����������� �� ���������� ����� �
��������� ���!�� ��� ���� �� ��������� ������� .
�������� ��� �� ��� ��� ���� �� ����� �����������
����� ��� ������� �������� ������ �� ���������
��������� ������ �� ��� ��
B� �� ���� �������� ���� ��� ������� ��� � �����
��� �� ��������� � � �������� ���������� �������
����� �9� � ����� 0�� N���� ������� ����� ��� �
��� � ���!�� ��� ���� �� ����� �� ��������� ���� �
A�� N���� ����� ��� � -������ ���!�� ������
�� �� �� � �������� �)C � ���� ���� ���� ���
������ �������� ��������� ��������� � �� A�� N����
G��!�� � ���� ���� � �� ��� ����� � ���� � �������
��� ����������� ������������ �� A�� N���� �������
���������� �� ��������� ������������ �������� �� ��
� ������� �� ��� �� ��� ��� ����� ��� �������� �?> �
F�� ���!�� ���� ����� �� �� �� ����� ���
������������ �� ��� ������� ����. ��� � ������
������������ ���� �������������� �������� ������
�������� �4������� � ��������� � ��������� �� �� �
������� ���� �C$ �
�� ���������� �� � �� ���� �� ����� ������� ��
�� ����� ��� �F3 ���O�� ������ ��� ���� ��
������������� ������� �����������. �� ���������� ��
�� ����� �������� �� ��������� �� �� ��� ���������
���� �� ����� ����������� �� ������������� �������
���� � ���� ��� ������ ���� ��� �������� ��
���������� ������������� ���� ��� �F3 ��������� ��
��� �������� ���������� �� ��� �� ����� ������ ����
�� ������� ���� ������������� ������������ ��� ����
����� ������� ��� ����������� �� ����� ����������
25
����� ������� � ����� ������ �� ��� � ���� ����
���� ��������� ���� � ������������� ������� �� �
����������� ������� ���� ������ ���� ����� ����
G�������� C)+ � ��"������ B����� �� ��� � ���
������������ ���������� ��� ��� �� ��� �� ��
��������� ����� ��� ���!�� �������� � ������
����� ����� � ��� ��� �������� � � �� ��������� ���
� �������� �9���������� ����� ����� � �� �� ��� �
��� ��� ������ ������������ � ���������� ������
������ ���� �������� ��� ��� ��� ���!�� ���� �����
�� �� �� ����� ��� ���������� ������������ �� �� �����
�������� �� ���������� �� ��
Acknowledgements�� �� ����� ���"��� �� �������� �� ���
4�������� @�� �����, 0������ ��� �� G��� ��� ��
@����� %������ N� ��� ������� �������� �� L����� K�
� � =���� ������ 5������� =������� L����� 4���� �
S������ ������ ��� L� �� 5���� ��� ����� �������������
���� ��� � ���� �� ��� ���! ��� G������ 4����
4���� ��� �� ���� ���� �
References'� 4������ 5� 3����� � 3��!�� 4� N�� �� G� 3�����! �� F������� %� G� ������
F( �������� �� 345 ������� �� ��� ���������� �� ��������� � � G�������� � �� ��� ����� ��� ����������� L��� )C'(�<*C+)� '<<>
) � F��� @�( J�������� �� ���������� �� 345( ����������� �� ������ ����������� ��������� 1����� $>�('$$<'$>?� '<<?
$ � 5�� ���� �G( N���, ��� �� ��������� � ������� T 3��� N����%����� 0���� *+(>*$>**� )++)
> � 4��� �� 3�� �� K� @��!���� L� 5������ � 4������� 4� %���� =�5����� �J� ��������� /� 5� �� 3���� 4�� $��� �!��� F� 3�����!/� 3� ��� =� 3���� =� 4������������ � 4����� K� =���� K�=����� /� F������� � 5����� �� %����� A� %������ �� %��� ��� L���� /� 3������ 35� �� ���( =���������� ��� ������� ����� ������� �� ��������� ���� ��� �������� ������ �-������ A����� $<$(?$C?>>� '<<*
? � �!��� F� 5����� �J� 5������ � 3�� �� K� 3������ 35� 4��� �(����� � �� ��� �������� �� ��� ������� �� ��������� �� ������ ���� 1��� =� C<($)<$>)� '<<<
� � L������� @K� �������� M�� G�����!��� %L� P��������� M� K������3� G����� L� %����� @� 1���� �� %���� /� /������� �%( 4������������������ ����� � �� ��� ������� �� ��������� ��� ��� ������� ���� 345 ����� ( ������ ���������� ������� �� ��������� �������� �G�� G�������� $$(''+$'''C� '<<<
C � =������� @� 3���� 4�� $��� 4��� �( ��� ������� �� ����������� ��� �� �������� ���� 4��� 0��� G�������� >()*$>� )++'
* � 4����� 3�� ������� L�� 0��� BG� 3��� �� L( �� ������������� ��������� �� �������� ��� ���� ������� �� ��� ��������� ���������� @�������� '(?C>?*�� )++'
< 3������ @L( ���������� ��������� ��� ������� � �� ��� ���� ���� ����� ������� �� ���������� �������� � ������ *$(<'<C� )++$
'+ � 3������ @L� 3� �� 5�( ���������� �������� ��� ������� � �� ���������������� ���� ����� 3������ ��� ��� )?('**'<>� '<<C
'' � 0��� BG� 4����� �G( 4���!���O�����!��� �� ���� ���������� �� ��������� � � B������ ���� )+($+C$')� '<<<
') � F���� L1� 4��� L( B��������� �� ��������� � � ���� K��
B������ '<(<$')<� )++''$ � @�� ��� 3����� @� G�"�� � 1� 3�� �� K� =������� 4� N������
�� 5������� /�� G������ 5� 1������ 4� 4��� �( K����������345 �9������� ���� ������ �������� ���������� ����� ���������� � � A�� G�� <(?$$?$<� )++$
'>� 3�� 1� 4��� N� P���� %� N��� U( J��������� ��������������� ������������� �������� �� ��� ����������� ��� ������� ���� ������� 4�������5����� ����� �9��� ��� ��� ������� ���� ������� ������� �� ���������� B����� B���� C'('�?�'��'� )++$
'? � L��! �� G� @����� �N� 1���������� G� �� ������9 =� 4�������@� G������ 5� G�G����� =A� 5��-��� 3� 5������ 4( @�� � �������� ���������� �������� �� � ��� ������� �� �����������9������ �������� B����� B���� �C()*�C)*C$� '<<<
'�� /����� �� F��� 45� G�������� G� 3�� ��� %� 3������ NL( =��������������������� �������� �� =A� ������� �9��� ��� ������� ������� ����� ������� �� ���������� B����� B���� �C('C+)'C+C� '<<<
'C � 1� P� %����� �� /����� 4� =����� 5� 4����� F� G���� �(B������������� �� =A� ������� �9��� ��� ��������� � ������� �� �� �� �� �� ��� ������� ��������� ����� �-����� �B����� B���� �C(>C*+>C*�� '<<<
'* � %����� /( 0� ��� � � �� =A� ������� ��� ��� ��������9� ��������������� �� �� � � B����� B���� C'('�'$'�)'� )++$
'< � A�� AG� G� � G( ��������� ������ ��� ����������� �� �������� ����� � ��������� � ( ����������� 345 ��� =A��������� �������� � ������ *>('+)'+<� )++>
)+ � 0��� BG� G�G����� =A� 3��� �� L( �������� � ������������������( ������ ������ � ���� G�������� <(''?''*� )++'
)' � =��������� �G L�� 4����� FG( @����� ��� ��������� ��������� � � ��� ��� �� ������ ��� ������ �� ������ ������� �� ������ � ���� ��������� ��� � ��� � ��� �� � ��������� �� � �� ��� � �� �������������������� � �������� � ������ .*'�$ ())<>)� )++'
)) � 3������ �1� =,����� 4� K����� �=� /���� 3@� F���! ��� 1��G�� M���� L3� %����� /� G�G����� =G� 0��� BG(���������� �� ��� ������� �� ��� ��� � ��� ������ ��� ������� ��������� � � B����� B���� ��()<?')<?<� '<<*
)$� ������ 4�� G���� J@� S� /� L� ��� %� ���!� /� 4��� L� F���� L1(=�������� �� 4=>�I ���� ��� � ������������ �� ������ ��� � ������������� � �� ���� ��������� �9��� ��� �� ���������� ����� ��������� �9��� ����� � )� L �9� G�� '<)($>C$?*� )+++
)> � G���� � 5������� G�� K��� 1� 1�4��� � K� A���� KL( ���������� ���������� �� ���� �� �� �� �������� ������������������ �� �������� ��� ������� �� ������������������ �� ����� L �9� G�� '<$()C')*+� )++'
)?� G�G����� =A( K����� ������ �� ��� ����������� ��� �� ���� �� ������� ����� � ����� ��������� � � B�� L @��� ���� $$(?>C??>� )++$
)�� G�G����� =A( � �������� ������� ����� ��� ����������� �� ���� �� ������������ � ������� � 4��� B����� =� $+ ����� $(�)'+)')� )+++
)C � 5��� K4( =� �� � �� A������� @������ � �� �� G������������� ���������!� /����� 5� N���� 1 ��� � A�� S��!� G�����=�!!��� B���� '<*>� �� <+$<)>
)* � J����3��� L1� N������ 3������� �( ��������� ��� ���������� �� �������� ������� � ������ ����� �� ������� �� ����� ��������9 �� �� � � L G�� @������� )�(''$''<� '<<C
)< � N�� � 5@� �� �J� ���� 4��� �4� ����� KG� J��������� � 15�S���� 1L� 4������ KJ� A������� L3� %������ G�( �� @������������������ ���!�� �G����� �� ������� ������� � ����������� ������� ����� �� ��������� � ���� �� ����� ������� �� �� A�� G�� )(>$+>$�� '<<�
$+ � 4������ �J� BBB� 4���9 =�� @���� �� P�����! �� G��� �� 1��@1� 3� �� �� F������ 4� /���� �� F���� L1( �9������������� ������� �� ��������� ��������� �� ��������� ����-�� ��� ��� �� ����� ��� ������ ������ ������ �� ����� �� �� ���������� ���������� B����� B���� C'(?*$'?*>>� )++$
$' � 1�������� L�� ����� �� @� ��� ��������� =� J������� K��F�� � @�� ��� ��� 1��� � ��� @��9����� 1�� ��� ��� %�������L� /���� �� @��!�� B� F���-��� �� ���� �N( =�������� �������� ������� 4�������5����� �345 ����������� ����� ������� �� ��������� ��������� �� ������ ������� ����-�� ����� ( ����������� ��� ������� ����� �� ��������� � ��������� ������ @��� A��� ���� ��� M � � <*(''><C''?+)� )++'
$) � 3��� LF( %� ������ ��� ������� ���������� �� ��� ��� ���!����� ���� ( �� ��� ���!�� 3��� LF� N����� K�� /�!��� B ��� �A�� S��!� �������� @�� B���� '<<>� �� '$$'�>
$$ � ������ �� K� @����� /� G�4���� %G( B������������� ��� ������� ��� ������� �� ��������� ������� �������� ������� �� �������� ������� � 4��� �9� B������ ''<(*><'� )+++
$> � @����� /� 3�� !� /G� 3����� G� ������ �� K( ��� ��������� ��������� ������� ������� ������� ( �������������� �������� � L 4��� B������ )+($+�$'�� )+++
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ESAT-6 ANTIGEN IMMUNOGENICITY IN OWL MONKEYS: 14 - 26
26 NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 5 ENERO - JUNIO DE 2006:1-116
$? � 3������ FU� K� �� �� @3� K� ��!���� B� ����� �� @� 5��-���3( � ��� ������� �� ��������� ������ �������� ���� ��� ������ �������������� ������� �������� ������� �4F@'+ �G����������� '>> � @� '' ($'<?$)+$� '<<*
$� � 5�� J�� @����� A4� 5��������� L� %��� N� 3���� 5=� ������KL� 3���� �=( �� ���� ���� ��� ��� �� ��� ��������� ��������� ��� ����� ���� 5I4 5����� ����� ��������� 5�����3��� )(K����K4%++>>� )++'
$C� ����� �� �1� A���� �� %���� 5� ����� �� @� ����� �� �3( @�������������� ���������������� �� � �������������� ���� ������� ������� ����� ������� �� ���������� B����� B���� �$('C'+'C'C� '<<?
$* � %����� G� 0�������� � N�!�� %5� K� ��!���� B� ����� �� @(�������� ��� ���������� �� ��� ���� ������� ����� ������� �� ��������� ��� �������� ��� ������� ������� ��� �� �� ���� �� ��� ������� ���� 345� B����� B�����>('�))� '<<�
$< � K�� ��� @�� @����������� @� N����� �� 5����� �J� %���� �� K5�N������ �� K�� 4��� G=( 4����� ��� �������� ���� ��� ��"�� ���� ������� �� ��� ��� ������� �� ��������� ������9 ������� 4F@'+ ���� � ������ '(' ������9 ��� ���������������� �� ��� ��������� ��������� �� ����� 4F@'+� ��� ��� ����V4F@'+������9� B���������� ��� ��������� � ��� ���������� L 3��� 4���)CC()'?<*)'�+$� )++)
>+ � �!"�� K1� 0�������� � K� ��!���� B� K��� @� 3���! B� L���� ���� ����� �� @( 4���������� ���������� �� �������������� ������� ���� ��� ������� �� ��������� ��������� ������ �� ��� ���� ������ � �������������� ���� ������� �B����� B���� �*()'>))+� )+++
>' � G� ���� ��� 0����� F� ������ %�� G��� AG� ���� �� ������F� K� �� /���� B� ����� �� @( G������� ������� ���� ������ ������� �� ��������� ���� ������� ��� ���������� ��������� ������� ����� ���� ���� � 4��� B����� =� $+ �����$(�)+')+?� )+++
>) � 3����� 1� ����� G� K� ��!���� B� 1������� �3� ����� �� @(���� ������ ����������� ����� � ��� ������� �� ����������� B����� B���� �*(C<'C<?� )+++
>$ � 0� �� �N� %�� �� @K� %��� �� ����� �� @( ��������� ��������������� � ��� ������� �� ��������� �� ����������� ���� � ����� ���������� ������� ���� ��� ���� �������� ��� LB������ $+('C)>'C$)� )+++
>> � G��� � ��!����� G� S����� �� F� �!� ���� � /����� S�A���� /� ������� �� %����� A� G������ �� 0!��� G� ����!� /�B���� S� �������� /� �� �!� S� G�����! 5%� �������� B(�������� =�������� �� �������� � B�������� ���� �� B�������������� 3� �� � �� M ��� A�� ������� � �� L K� ��� 4��� 4���G��� )++>
>? � 5������ G� @����� 4�� 4���� ���! L� @��� �1� ��������� %���� ���� L� 5������ 5� 5���� 4@( ����� � ��������������� ��������� �� @������ �� �� �� =A� �������� �������������� �� �� ��������� G�� @��������� ���� <(?*??<*� '<<*
>� � A���J� -��� LL� J���� =� K�������� K� G����� �� @��������G�� @�� ��!� 5� =����������� 4�( ��-����� ��� ����� ��� ��=K3 ���� �� ����� �������� � ������� ����� ��� ������������ ���� ��� � B������������ ?'()'<)$+� )+++
>C � =����������� 4�� ������� G� J����� N� %����� 3� ���� %�K����-�� K� @�������� G�� @�� ��!� 5( F��������� ��� ��������� ��������� �� J ����� <J ����� ) ���� �� ����� ��� ���� ���!�� � � ������� ��������� ����� ��� �������� ����������������� L B������ '�C(�>)'�>$+� )++'
>* � G������ 5�� J����� L@� @�������� G�( @������ ������������������ ��� 4=>? ��� ����� � �=A� �� ��� ��� ���!�� ���������������� � �� L @������� ?C('''� )++)
>< � 5������� L�� @������ =@� ������ 4F� G������� @� ��� ������� F�G������ 4�� @�������� G�� @�������� G�( 4������������� ���� �������� ������������� ���� �� ����� ������� ������!�� ���������� ������ � �� ������� �)(>C)>*)� )++$
?+ � N�� ��� =� %��� �J( @����� ���� ��� ������� ������� � 3���N���� %����� 0���� *'(<+)<+<� )++$
?' � � ��"� F� 3������� �� ���� �� M�-���� G� K�������� K� 1���� S�@�������� G�( ���������� ��� ��������� ��� '?'$ G�@'�������, ������������ ������ ������ ���������� ����� � ��������3������ 3����� K� 4����� $'?(>'*>)C� )++>
?) � K�������� K� G����� �� 5����� F� 4���� G� @�������� G�(������ �� ��� ���!�� ������� �� ��� ����������� �� � ��������������� ����� � ��� � �9��� ����� ���� �� �������� ������������ L ��� G�� %�� >$($$<$?>� '<<+
?$ � %������� K�( 5������ ������ ��� ��� ����� ������� � ����� � �� ����� ������ �� ������� ( ���������� �� ��������������� ����������� �� ��� ����� �� ���������� ����� ���� � @���A��� ���� ��� M � � *)(?'$'?'$?� '<*?
? > ����� � K� K����� K�� =��� �� 4������� GA� M������� 5����� L� @�������� G�� @�������� G�( B ������� ����������������� �� ������������ �� A�� N���� ������� ���������� �� ���������� J�� G�������� <*()*?)<?� )++>
?? � @������� L4� @������ F( ������ �� ��������������� ������ ��� ������� ��������� �� ��������� �� ��� ������� ���������� ��� 3�4�4 � ���� L 4��� G�������� $�(>+)>+*� '<<*
?� � � ���� � �G� ������ �S� 3������ 4�� 4����� 1�� 4����� �G�1���� 3� 5����� F� ����� �L� @�������� G�( �9��� �������������� � ����� � � ������������ ������� ��� �������������������� �� ��� �������� ����� G�@' ������� ������������������� � J������ )'('+$$'+>$� )++$
?C � 3����� =G� ���� ���� �L( B�������������� �� @������ G����� ���� � A�� S��!� L��� N���� ��� �� � B��� '<<$� �� '*')''
?* � ����� �� @� ����� �� �3� ����� �� �1� A���� �( K����� �� ��������� �������� �� ��� ������� �� ��������� ��������� �� �����L B������ '?>($$?<$$C)� '<<?
?< � M����� � G��! G�� G�����!��� %� 3���@�� � �� 4�������� K�5������ G1� /������� �%( =����������� ���� �� ��� � ����� ������� �� ��������� ���� �� ��������� � ������� ���������� ����� � ��� L B������ )*($<><$<?*� '<<*
�+ � 3���! B� N������� /� 1�������! � F������� F� ����� �� @(4������ �� �� � A�� �������� 3���� � � ��� ��� �!�� � � ���������� � 4������ � �� L K� ��� 4��� 4��� G��� )++>
�' � 3����� 1� 0�������� � %��� �� ����� �� �3� ����� �� @( /��������� �� ��� ���� ������� ���������� �� ���� ������ ��������� �� ���������� �������� �� ��� ������� �� ����������L B������ '?C($?)C$?$$� '<<�
�) � @�����! LG� ����� �� @( @���������� ����������� �� ��� ����������� �� ��� ��� � ��� � �� ���������� ���� ��� ������� ������ ������� B����� B���� �?()?*C)?<)� '<<C
�$� /����"�� 5J� G����� �� 5����� G�� ����� �� @� 5������ G1(K���������� �� ���� �-����� �� ��������� �� ��� �� ���������� �������� ������� � 4��� =���� 1�� B������ ''()))))�� )++>
� > G���� �� /����� 4� %����� �� 1� P� 4����� F( ���������������� �� ����� ��� ����������� =A� ������� ����� ���������� � � J������ '*�)+ ()'??�$� )+++
�? � G����� F4� G���� ��� G������ 55� N����������� GL( �������������� ������� ������� ����� ���������� ��� ��������������5)� �� ��� � �� � ��� ������������� ���� �-����� �� =A�������� � B����� B���� C'())$<))>$� )++$
�� � K��� @� =��� �� �� ������ � N����� �� %� 1��� =� ������%�� G� ���� ��� L�� �� �/� %��� �� K� ��!���� B� 0����� F�0���� L� ��� K��� F� ����� �� @( %���� ���� �� ��� � ����� ���� ������� ���� ��� ������� �� ���������� L B�����=� 'C<(�$C�>?� '<<<
�C� J������� =� 4������ �� =� G��� @� @������ 1@� @���� ���� A� @������� F����������� 0� B������� 5� 5������ �� ����� ���� G� 5������ =(B������������� �� ����� �������� ������� ������� ������� ��� ��������������� � �� ������ ��������� � � G�� G�� <('+?'''� )++$
�*� G� ���� ��� ������ F�� ��������� K� ���� �� ������� �G������ �� @� 0����� F( %���� �' ���� ���� ��������� ������ ������� �� ��������� ���� ������� ��� �� ������� ��� �������� ���� ���-������ �9��� �� %1� ��� BB �������� ������ L B������ ?C(')?'$>� )++$
�< � @�������� G�� K����� @� ���� G1� 4����"� @� G����� ��G������� �� K�������� K� 5����� F� 4����� �( B�������� ������������ �������� ����� � �9���������� ��������� ���� ������� � ��� �������� ������� � A����� $)*(�)<�$)� '<*C
C+ � 4����� N�� 5������ 55� �������� L�� G���� 41( ��������� ����������� ����� �� �������� ��������� ��� �� ���� ����� ���� ������� �� ����� ������ ���!�� � �� L ��� G��%�� ?'())>)$)� '<<>
C' � =��� =� A������ G� K�������� K� A���J� -��� LL� G����� ��@�������� G�� @�� ��!� 5� =����������� 4�( ��-����� �������� ��� �� G%4 =H� ��� =H3 ���� �� ��� ��� ���!������� ������� � B������������ ?'(?)*?$C� )+++
C)� @�����4����� �� J����� L@� K�������� K� @�������� G�( @�������������� ��� � �� ���������� ����� ���������� �� ������� �� ��� ��� ���!������� ������� L G�� @������� $)($'$*� )++$
C$� 4������� @�� 5���;� B� 5������� GB� 1�8� 4B( �������8� �� �� ��������� � �� 4�������� 3���:���� )++>.)>������ ('+)'>� )++)�