Purification et propriétés de la β-galactosidase (lactase) d'escherichia coli

transcript

VOL. ~ (x95x) BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA I53

PURIFICATION ET

PROPRI]~T]~S DE LA fl-GALACTOSIDASE (LACTASE)

D ' E S C H E R I C H I A COLI*

MELVIN COHN** ET JACQUES MONOD

Institut Pasteur, Paris (Frame)

Nous pr~sentons dans ce m~moire quelques observations sur les propri~t~s chimiques d'une preparation de fl-galactosidase obtenue ~ partir de la souche "ML" d'E. coli m ~ b i b . L'isolement, la purification partieUe et certaines propri~t~s de cet enzyme d&ign~ alors sous le nom de"lactase" ont ~t6 d~crits ou mentionn~s dans des publications ant~rieures 14,is,xS. On verra pourquoi il nous a paru n~cessaire d'abandonner cette d~signation. C'est en raison de ses propri~t~s adaptatives clue nous nous sommes attach6s

l'6tude de cet enzyme, mais nous n'abordons pas ici la question du d~terminisme adaptatif ou g6n~tique de sa formation. Les donnt~s r6unies dans ce m~moire concement uniquement la pr6paration d'une galactosidase purifi~e, les propri~t~s chimiques de cette pr6paration (hydrolyse du lactose et de l'o-nitroph6nyl-fl-D-galactoside, effets des ions et du Pn, inactivation thermique), ses propri~t~s antig~niques et certaines de ses propri6t6s physiques (61ectrophor~se).

Ces observations concernent surtout l'hydrolyse du l~aose, alors qu'il eut ~t~ souhaitable de comparer, dans chaque type d'exp6rience, l'activit6 en presence de plusieurs jS-galactosides diff~rents. Quelques essais comparatifs ont pu cependant ~tre faits avec le lactose et l'o-nitroph6nyl-~-D-galactoside (niph~gal). Toujours est-il que les observations faites r~v~lent quelques propri~t~s remarquables de cet enzyme, en particulier les effets complexes des ions alcalins. On voudra bien consid6rer que ce travail apporte ~ l'~tude de cet enzyme une contribution partielle dont nous esp~rons que les lacunes seront peu ~ peu combines.

PARTIE EXP]~RIMENTALE

I. MATERIEL ET TECHNIQUES

I. R~aaqs

Les sels min~raux ~taient des produits Merck, type "C.P.". La tri~thanolamine et l'acide cacodylique 6taient de marque "Rh6ne Poulenc". Le lactose ~tait un produit Pfanstiehl "C.P.". L'eau ~tait distill~e sur pyrex apr~s d~min~ralisation sur colonnes

* Ce travail a b6n6fici~ d'une subvention du "National Inst i tute of Health", Public Health Service, Bethesda, Maryland, Etats-Unis.

** Fellow du "National Research Council" des Eta ts Unis (Fondation Merck).

Bibliographie p. x74.

154 M. COttN, J. MONOD VOL. ? (I951)

de r~sine. Les tampons au phosphate et au cacodylate de triethanolamine ~taient prepares par neutralisation de l'acide jusqu'au Pn voulu. Les concentrations sont exprim~es en molarit6 de l'anion. L'o-nitrophenyl-fl-D-galactoside ~ - - q u e d~sormais nous appellerons en abr~g~ "n iph~gal" - -nous a 6t6 obligeamment envoy$ par Mr S. SPIEGELMAN. La notatine 6tait preparee par la methode de COULTHARD e~ al 5. La souche de Penicillium productrice de notatine nous a 6t6 envoyee par Mr SHORT de la "Boots pure Drugs Co".

2. Mesures d' aaivit~

L'hydrolyse du lactose a 6t6 suivie par titrage du glucose ~t l'aide de la glucose- oxydase de P. notatum (Mias notatine). On sait que cet enzyme constitue un reactif specifique du glucose se t permet de le doser avec une excellente precision, ell presence d'autres glucides 9, x~, par d6termination manometrique de l'oxyg~ne consomme.

Deux techniques ont 6t6, suivant les circonstances, employees pour les mesures d'activite.

a. Technique d deux temps. L'enzyme est ajoute, ~ dilution convenable, ~ une solution contenant du lactose M/Io, ainsi que le tampon et les sels appropries, variables suivant les experiences. Le tube ~t essai contenant le melange est maintenu ~ 28°C pendant un temps donne (n'excedant pas, en principe, 20 minutes) apr~s quoi fl est plong6 dans l'eau bouillante pendant 3 minutes, puis refroidi. Les temps et les concentrations d'enzyme sont calcules approximativement de fagon que moins de lO% du lactose soit hydrolys6 au cours de l'essai. Le melange est additionn6 de nitrure de sodium (concentration finale M/5 o) dont le r61e est d'inhiber toute activit6 peroxydasique ou catalasique. I1 est additionn6 enfin de tampon ~ l'acetate de sodium (concentration finale M/IO) ~ pi~ 5.3, optimum pour l'activit~ de la notatine, et port6 k volume constant. Une fraction donn~e de ce volume (I ~ 2 ml) est portee dans une fiole de WARBtlRG dont le diverticule contient une solution de notatine. On dgtermine ainsi la quantit6 d'O~ correspondant k l 'oxydation du glucose libre. Une molecule d'O 2 gquivaut, dans ce cas, ~ une molgcule de glucose, soit & l'hydrolyse d'une moMcule de lactose. La notatine oxyde Sgalement tr&s lentement le galactose, mais son affinit6 pour ce glucide est faible de sorte que cette reaction parasite est pratiquement inoperante dans ces conditions, off la concentration d'hexose fiber6 n'exc~de gu&re 0.oo5 M environ. L'activit~ mesur~e par cette methode est independante de la dilution de la ~-galactosidase. Les r~sultats sont d'une pr$cision et d'une fidelit6 tout ~ fait remarquables (voir par exemple les chiffres donnes par le Tableau I I I premiere ligne).

b. Technique d u n temps. L'enzyme, ~t dilution convenable, est introduit dans le diverticule d'une fiole de WARBURG. Le compartiment principal de la fiole contient une solution M/Io de lactose, dans un tampon approprie, variable suivant les expgriences. Cette solution est additionnge de notatine et de catalase. Si l'on fait en sorte que la notatine et la catalase soient en grand exc~s par rapport ~ la galactosidase, la vitesse de consommation de l'oxyg&ne est proportionnelle ~ la concentration de celle-ci. En pratique, l'absorption d'oxygene ne doit pas depasser 400/A/h par fiole et les quantit~s de notatine et de catalase employees dans chaque fiole correspondent au moins ~ dix lois cette activit& Dans ces conditions (presence de catalase) un atom, d'oxyg~ne con- somm6 correspond ~ une mol2cule de lactose hydrolys& La reaction est d'ordre zero, comme par la premiere technique, mais les r~sultats sont moins precis (4- 5 %) tout en restant satisfaisants.

VOL. 7 (1951) LACTASE D'EschericMa coli I~5

L'hydrolyse enzymatique de l'o-nitroph6nyl-~-D-galactoside (niph6gal) a 6t6 suivie par mesure de la densit6 optique k 42o m~ dans le spectrophotom~tre BECKMAN. Une solution de niph6gal M/6oo 6tait employ6e, ~ une temp6rature malheureusement assez mal contr616e (environ 27 ° C). Cette solution 6tait additionn6e d'une dilution convenable d'enzyme. L'accroissement d'absorption r6sultant de la lib6ration de l'o-nitroph6nol 6tait mesur6 de minute en minute pendant 5 minutes. Un 6talonnage pr~alable avait 6t6 fait ~ l'aide d'une solution titr6e d'o-nitroph6nol dans des conditions identiques. La r6action est encore d'ordre z6ro, mais la pr6cision des r6sult~ts souffre du mauvais r~glage de la temperature. Les ~carts atteignent 8 ~ io%.

Toutes les activit6s sont exprim6es en/~M de substrat hydrolys6, par heure et par mg d'azote de la pr6paration.

L'azote prot6ique 6tait d6termin6 par la m6thode de KJELDAHL apr~s pr6cipitation et lavage par l'acide trichlorac6tique ~ 5 %-

3. Souche, Mil ieux

Nous avons employ6 la forme lactose-positive et maltose-positive de la souche "ML" d'E. coli le. Le milieu 6tait le suivant:

PO4KH2 27.2 g; SO4(NH4)~ 4.o g; SO4Mg.7H~O 0.4 g; C12Ca o.oI g; SO4Fe.7H~O o.ooo 5 g; Lactose (st6rilis6 ~ part par filtration) 8.o g; NaOH q.s.p. Pa 7.oo; Eau distill6e q.s. p. I.ooo.

Le milieu est r6parti par 25o ml dans des fioles coniques de 2 1. On ensemence tr~s largement et on agite k 34 ° C. La culture est arr~t~e par addition de glace quand la densit6 bact6rienne atteint 1.5 mg de poids sec par ml environ.

II. R~SULTATS

I. Extraction et purification de la l a n c e

Les op6rations d'extraction et de purification sont r6sum6es par le Tableau I qui indique les r6sultats obtenus k ehaque stade. La technique d'extraction par traitement au toluene dans l'eau distill6e a 6t6 adopt6e apr~s divers essais effectu6s en pr6sence d'61ectrolytes, qui se montr~rent peu favorables ~ l'extraction par le toluene. Apr~s la premiere centrifugation (~limination des corps microbiens) le liquide surnageant contenait de 4 ° ~ 7o% de l'activit6 initiale totale. Nous avons obtenu 6galement de bonnes extractions par une solution satur6e de thymol, en pr6sence d'assez fortes concentrations de sels de sodium.

La m6thode de purification diff~re peu du proc6d6 d6crit dans des publications ant6rieures 14,~. On volt qu'eUe repose exclusivement sur le fractionnement par le sulfate d'ammoniaque. Les essais de purification poursuivis, par le m6me proc~d6, all delk du stade V n'ont donn6 aucun r6sultat. La fraction d6sign6e " V " par le Tableau I a 6t6 employ6e pour toutes les exp6riences d6crites ici. Conserv6e avec un cristal de thymol comme antiseptique, elle est demeur6e parfaitement stable pendant plus de huit mois, sans baisse mesurable d'activit~. L'enzyme est tr~s stable ~galement ~ la tem- p6rature du laboratoire, et peut ~tre conserv6 ainsi pendant de nombreux jours sans perte d'activit6. II est inactiv6 irr6versiblement par dialyse prolong~e contre de l'eau distill6e.

I 5 6 M. COHN, J. MONOD VOL. 7 (1951)

Tra i t ements

T A B L E A U I

PURIFICATION DE LA ~-GALACTOSIDASE

0 ~ ' ~ ,

I. I65 g de bactSries (poids humide) obte- nues /~ pa r t i r de 30 1 de culture, lav6es deux Iois ~ l 'eau distill6e, raises en sus- pens ion darts 600 ml d ' H t O avec IO ml de toluene. Suspension agit6e I h ~ 37 °, puis abandonn~e 2 h ~ o °. Centr i fugat ion

II . Surnageant addi t ionn~ de SOI(NHI)~ sa tura t ion dans du PO4KH $ M/IO,

PH 7), jusqu'A 5O~/o de saturat ion. Aban- donn6 I2 h ~ o% Centtifug~. Pr~cipitd dissous dans ioo ml HzO, dialys6 contre du t a m p o n phospha te M/io, PH 7 .°.

I I I . Frac t ion II amen~e ~t 4O~/o de sa tura t ion dans les m~mes condi t ions que ci-dessus. Pr~cipit~ trai t~ de la m~me fa~on.

IV. Frac t ion I I I amen~e ~ 33~/o de sa tura t ion par le sulfate d ' ammoniaque . Pr~cipit~ repris dans 20 ml de t a m p o n PH 7 .~.

V. R~p6tit ion du t r a i t emen t pr6c~dent

I 600 461 ooo

II IOO 456 ooo

I I I i o o 3 4 2 o o o

IV 20 29 ° 0o0

V 20 235 0o0

~ ~ o • ~ . ~ ~ o ~

512 IO0 I

I79O 99 3. x

3750 74 6.5

7020 63 i2.2

7960 51 14

* Les act ivi t6s sont suppos6es mesur6es en presence de K + et en l ' absence de Na +. Dans les cas off les mesures r6elles ava ien t 6t~ fai tes en pr6sence de Na, le fac teur de correct ion appropri6 a ~t6 appl iqu6 (cf p lus loin, page 157 ).

** L"azo te pro t6 ique" est calcul6 indirectement ~ par t i r des valeurs de l ' absorp t ion A 280 m/~, d~termin6e sur la fract ion pr~cipi table par l 'ac ide tr ichlorac~tique.

2. Hydrolyse du lactose

En pr6sence de la pr6paration F V, le lactose est quantitativement hydrolys6 en glucose et galactose, ainsi que le montrent les bilans r~sum~s par le Tableau II. Le cours de la r6action, suivi par la technique k la notatine, dans l'appareil de WARBURG, avec diff6rentes quantit6s initiales de lactose, est exprim6 par les courbes de la Fig. x. On observera que, d'apr~s chacune des trois courbes de r6action figurant sur ce graphique, de l'oxyg~ne continue d'6tre lentement consomm6 au-del~t des valeurs th6oriques (figur6es par un trait interrompu horizontal). Ceci est dr, sans nul doute, h la lente oxydation du galactose par la notatine 8. On volt d'ailleurs que l'intersection des tangentes men6es ~ la premiere et ~ la derni~re portion respectivement de la courbe figurative, se trouve sensiblement sur l'asymptote th6orique.

La r6action est pratiquement insensible ~ la pr6sence ou k l'absence d'ions PO4 (comparez Tableaux III, V, VII). Cela permet d'61iminer l'hypoth~se d'une phosphoro- lyse interm6diaire. L'enzyme pr~sen~e donc les propri6t6s d'une hydrolase. L'activit~ de 1'enzyme n'est pas affect6e par la cyst~ine M/5o, le cyanure M/5o, le glutathion M/Ioo oxyd6 ou r6duit.

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VOL. ? (t951) LACTASE D'Esckerichia coli I57

La prdparation F V s'est montrde ddpourvue de toute activitd mesurable en prdsence des disaccharides suivants: maltose, mdlibiose, cellobiose, saccharose, trdhalose.

TABLEAU II

BILAN DE L'HYDROLYSE DU LACTOSE PAR LA •-GALACTOSIDASE

Lactose initial

5 I0 15

Glucose libdrd en fin de rdaction

4.97 9.99

Galactose libdrd en fin de rdaction

4,95 9.97

R&actions effectudes en t ampon PO4KH t M[Io, PH 7. Volume total 2 ml. Enzyme utilisd: 394 / ,M/h par tube. Durde de l 'expdrience 3 h. Tempdrature 28 ° C. En fin d'expdrience, lea tubes dtaient port6s ~t ioo ° pendan t 3 rain. Le glucose dtai t dosd par la nota t ine sur un dchantillon. Apr~s oxydat ion du glucose, on dosait lea sucres rdducteurs restant, par Is mdthode de SOMOGYX-NELSO~ dtalonnde par des solutions titrdes de galactose contenant des quanti tds analogues des m~mes prot6ines. Le sucre rdducteur demeurant apr~s oxydation du glucose donnai t l 'osazone typique du galactose.

FM de Olucose I/b~r;

4 ~ m ~

Y _ut~,..x ~

~~_._o-------.-o~

~ x ~ . x x tO

• i a_ e 5

50 fO0 150 200 250 rnin~c.s

Fig. I. Lib6ration du glucose g par t i r du lactose, en pr6sence de fl-galactosidase. R6action suivie par la technique ~ la notatine-catalase, dana l 'apparei l de WARBORG. Tampon PO4KH t M/xo, PH 7 .o. Enzyme ajoutd: 394/*M/h par fiole. Lea chiffres en regard de chaque courbe indiquent le nombre

de /*M de lactose ajoutd ini t ialement.

3. Activations et inhibitions par lea ions alcalins

Le Tableau I I I exprime les rdsultats de plusieurs s6ries de mesures d'activitd effectu6es avec du lactose comme substrat, et en prdsence de diffdrents ions alcalins en concentrations croissantes. Lea mdtaux 6taient ajoutds, sous forme de chlorures, k une solution tampon de base (phosphate de tridthanolamine M/2o) 12. Lea rdsultats consignds clans la 7~me colonne du Tableau I I I montrent que l'activitd enzymatique eat pratiquement insensible aux variations de concentration de ce tampon qui peut done ~tre consider6 comme "inerte". On observe cependant un 16ger effet de concentration du

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tampon en pr6sence de KC1 (voir Tableau III , colonnes 8 et 9 et Fig. 2). Cet effet doit sans doute 6tre rapport6 aux variations de l'activit6 thermodynamique de l'ion K + en fonction de la force ionique de la solution. Nous appellerons "activit6 de base", l 'activit6 mesur6e en pr6- sence du tampon seul. On voit (I6re colonne horizontale, 7~me colonne verticale) que cette activit6 est re- marquablement stable. Les chiffres donn6s dans les 5 premieres colonnes du tableau montrent que les ions alcalins exercent tous une action, parfois tr~s marqu6e. Le potassium est un puissant activateur. Le rubidium et l 'ammonium activent $galement, le sodium et le caesium activent 16g~rement. En pr6sence de lithium, au contraire, l 'activit6 enzymatique est fortement d6prim6e. I1 s'agit bien l~t d'inhibition et non d'inactivation puisque: i. l'effet est r6versible (il disparalt en pr6sence de fortes concentrations de potassium) ; 2. en pr6sence de lithium M/Io, l'activit6 de la lactase demeure constante pendant plus de 2 h ~ 28 °.

L'inspection des graphiques ex- primant l'activit6 en fonction de la concentration des divers ions (Fig. 2) r6v6le imm6diatement que ceux- ci se distinguent non seulement par leurs propri6t6s d'activation, mais aussi par leur a~init£ pour l'enzyrne. I1 y aurait int6r~t ~ pr6ciser quantitativement cette notion. Cela est rnalheureusement difficile, car la variable ~ consid6rer n'est pas la

gt.Vheure/m¢" Azofe

4 3 2 f log de Io ¢oncentrotion mol~culoire

Fig. 2. Ac t i on des ions monova lents sur l ' ac t i v i t d en lactose de la/~-galactosidase.

K potassium O tri~thanolamine R rubidium L lithium A ammonium • phosphate de tri~thanolamine C caesium en prdsence de K + M/2o N sodium × phosphate de tri6thanolamine

en pr6sence de K + M]5o Conditions: voir Tableau III

concentration mol6culaire, mais l'activit6 thermodynamique de chaque ion. Or, nous ne savons pas comment calculer, dans un tel syst~me, l'activit6 thermodynamique. On peut cependant, cornme premiere approximation, utiliser directement la concentration mol~culaire et appliquer une 6quation du type MICHAELIS, en 61iminant 'Tactivit6 de base" par soustraction. Ces artifices, arbitraires, il faut en convenir, permettent de calculer des constantes ayant une certaine valeur de comparaison. On trouve ainsi une "constante de dissociation" (apparente) de l'ordre de 3" zo-8 M pour le potassium, 2. I0 -2 M pour le rubidium, 4" zo-~ M pour l 'ammonium. Le calcul est ~videmment impossible pour le sodium et le caesium qui n 'activent que trEs faiblement. L'inspection de la Fig. 2 sugg~re cependant que l'affmit~ du sodium pour l 'enzyme est tr~s

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T A B L E A U I I I

]~FFETS DES CATIONS MONOVALENTS SUR L'ACTIVIT]~ EN LACTOSE DE LA ~-GALACTOSIDASE

Concentrat ions mol6culaires

0 I2OO

IO -4 1310

1o -s 2730 2 .1o -a 371o

i o - s 611o 2 .1o -2 672o 5"IO -2 707 ° io -I 7o9 o

I250 I36O 139o 142o 143o 144o 149o

Activit6s en ,M/h/mg N en pr6sence de:

116o 1170

125o 129o 148o 149o 156o 155o

118o 129o I42o I59O 299o 35Io 413 ° 438o

NH4 + Li + TEAPO 4 TEAPO 4 TEA POd KC1 M/5o] K.C1 M/2c

I2OO 12IO --

I2IO II60 --

1 3 9 0 1070 I I 8 0 156o 866 119o I890 585 I180 251o 45 ° - - 318o 398 12oo 392o 386 12oo

6 6 9 o 6980 71oo 7320 707 ° 7400

672o 7o70 649o 695o

Mesures faites A 28 ° par la technique ~ deux t emps en presence de t a m p o n au phospha te de t r i6thanol- amine PH 7 .o. Les ions 6taient ajout6s sous forme de chlorures. Les t rois derni~res colonnes donnent les activit6s en pr6sence de diff6rentes concentra t ions du t a m p o n seul (76me colonne) ou addit ionn6 de KCI M/5 o ou M/2o (8~me et 9~me colonnes).

61evA, plus forte que celle du potassium. En d6finitive, les ions alcalins pourraient &re rang6s en ordre d'affmit6 d&roissante pour l'enzyme, de la fa~on suivante:

Na > K > Cs > Li > Rb > NH 4

non sans quelque incertitude sur l 'ordre exact en ce qui concerne Cs et Li. L'emploi de l'6quation de MICHAELIS permet aussi de d6finir le pouvoir activateur,

par une constante que nous appellerons l'"activance". Ce sera le rapport de l'activit6 saturation par l'ion k l'activit6 de base. On trouve les valeurs suivantes qui imposent,

on le voit, un classement bien diff6rent de celui que donnait l'affinit6:

K >Rb >NH 4 > Cs >Na >Li 6.z 4.7 4.3 1.3 1.2 0. 3

Ces chiffres n 'ont qu'une valeur relative. L'essentiel, c'est que cette br~ve analyse des r&ultats met en 6vidence l'ind~pendance entre l'a~init~ et l'activance des ions alcalins. C'est lk une notion int6ressante qui permet d'interpr&er les effets d'antagonisme rap- port6s dans la section suivante.

4. Competitions et antagonismes ioniques

Nous venons de voir que l'ion sodium doit &re consider6 comme un activateur de la lactase. Des exp6riences pr61iminaires nous avaient cependant conduit k le classer comme un inhibiteur. Dans ces exp&iences, nous utilisions une solution tampon de base au phosphate d'ammoniaque M/Ioo. Nous observions alors une activation par le potassium, mais une inhibition par le sodium (Fig. 3). Cette contradiction apparente s'explique ais6ment par la haute affinit6 et la faible activance du sodium, oppos6e k la faible ai~nit6 et ~ la forte activance de l 'ammonium. Cette interpr&ation est pleinement confirm6e par l '6tude de 'Tantagonisme" entre le sodium et le potassium (Tableau IV et Fig. 4). On volt qu'en #r~sence de potassium, le sodium agit comme un puissant inhibiteur: avec du potassium M/Ioo, et du sodium ~ concentration 6gale, l'inhibition est de 86 % ; k concentration vingt lois plus faible de sodium, l'inhibition atteint encore

r 6 0 M. COHN, J. MONOD VOL. 7 ( I 9 5 I )

36%. I1 est clair cependant qu'entre les deux ions il n'y a pas ~ proprement parler antagonisrne puisque leurs effets individuels sont qualitativement les m~mes. I1 y a, en r~alit6, competition entre deux activateurs d'affinitE et d'activance di ffErentes.

I °°°_o 7~ j

I to 9 de la concentration mol$culalre

Fig. 3. Ac t ion du p o t a s s i u m et du s o d i u m s u r l ' hyd ro l y se du lactose pa r la ga lac tos idase en p m ~ n e e d ' a m m o n i u m . P o t a s s i u m et s o d i u m a jou t~s sous fo rme de chlorure~ A une so lu t ion t a m p o n pr6par6e p a r neu t r a l i s a t ion ~t Plt 7.0 d ' ac ide phosphor ique M / I o o pa r de l ' a m m o n i a q u e . Cet te so lu t ion 6fair

done env i ron M[5o e n N H t +. Mesures des ae t iv i t6s A 28 ° pa r l a m 6 t h o d e g d e u x t emps .

Les r6sultats dans leur ensemble sont en bon accord avec cette interpr6tation: on voit (Tableau IV) que l'activit6 d6pend du rapport des concentrations plut6t que des concentrations absolues; un calcul approximatif indique que l'affinit6 du sodium pour l'enzyme est environ vingt fois plus 61ev6e que celle du potassium. On ne saumit pourtant passer sous silence le fait qu'~ forte concentration de potassium (M. IO-X), l'addition

T A B L E A U EI~FETS COMPI~TITIFS DU SODIUM ET DU POTASSIUM

Act iv i t6s (ttM/h/mg 1%) en pr6senee

Cone. N a + m o l K + o l O - 4 2 • IO -& 2 - 5 " I ° - 4 5 " l O - 4

I25o O i O - 4

1 0 - 8

2 • IO - $

iO-3 2 • IO - 3

4" lO-2 5" I ° -2

I O - 1

131o 273o 371o 611o 6720 7000

7o7 ° 7o9 o

i 2440 i 223o 318o 2730 564 ° 507 ° 655 ° 6400

721o 71oo 728o 718o

2 1 2 0 188o 2 2 I O

* Act iv i t6s mesur6es pa r la t e chn i que A d e u x t e m p s A 28 ° en p h o s p h a t e de t r i 6 thano l amine M/2o, PH 7 .oo.

Bibliograpkie p. z74.

de traces de sodium (M. Io -4) provoque une tr~s faible ac t iva t ion (2.5%). Ce 16ger effet

mont re que la s i tua t ion est plus complexe que notre in terpr6ta t ion VM/heure/mgAzo*e

, oo I

5 000 i t0-2~ i 4x,~ -~

.oo . i _ " \

3 000 fO -~ ' x o

¢000~ o o

ne le suppose. Mais il ne s 'agit en tous c a s q u e d 'une approximat ion. I1 est ext r~mement t e n t a n t de g6n6ra- liser cette in te rpr&at ion en suppo- sant que tousles cations monovalents sont en r6alit6 des activateurs de la lactase et se diff6rencient unique- men t par leur affinit6 et leur activance. L 'act ivi t6 "de base" serait alors due aux ions H ÷ de l 'eau. L'effet inhib i teur du l i th ium serait dfi k ce que son act ivance serait plus faible que celle des ions H + avec lesquels il ent rera i t en comp6tition.

5. A clion des ions bivalents

Le Tableau V r6sume quelques donn6es sur l 'ac t ion des ions bivalents. On voit que tous, ~ l 'except ion du magn6sium, agissent comme des inhibiteurs. I1 convient d 'ai l leurs de faire des r6serves en ce qui concerne le cuivre et le zinc dont l'effet n 'es t pas r6versible par addi t ion de potassium et ne peut donc ~tre con- sid6r6 comme une inhibi t ion mais const i tue plut6t une inact ivat ion. Le Tableau VI mont re qu ' i l y a "an ta -

log de Io concentrotion mol~cQlaire en #loCI

Fig. 4. Effets comp6titifs du sodium et du potassium sur l'hydrolyse du lactose par la ~-galactosidase. Les chiffres en regard de chaque courbe indiquent la concentration

mol$culaire en potassium -o - o- activit6 de base (sans H + ni Na +)

N acrivit~ en sodium seul Conditions: voir Tableau IV.

V UR L'ACTIVIT~ EN LACTOSE DE LA fl-GALACTOSIDASE*

e diff6rents m61anges des deux ions

i o - 3 2 . i o -3 2 . 5 . i o -8 5 - i o - 3 i 0 - 2 2 . 1 o - 2 4 . i o - Z

1410 143o 136o

i81o 19oo

139 °

324 ° 234 ° 199o

253 ° I87O 2OlO 2470

19oo 199o 188o

L s~dium et potassium ajout6s sous forme de chlorures.

I62 M. COHN, J. MONOD VOL. 7 ( I95I )

TABLEAU V E F F E T S DES CATIONS BIVALENTS SUE L'ACTIVIT]~ EN LACTOSE

DE LA ~-GALACTOSIDASE*

Ion Concentrations[ Activitd moldculaires (/~M/h/mg N)

][0 w3 i0--3 i0--I

2.i0--2 I0--3

2.10--2 2.i0--2 2-10--2

Cu ++ (SO4) Zn ++ (S04) Ca ++ (el)

Mn ++ (CI) Co ++ (Ac) Fe ++ (SOt) Sr ++ (CI) Mg ++ (SO4)

Sans addition J

95 I 452 498 762 2 0 2

13oo 12OO

Inhibit ion %

IOO IOO

87.5 62 58 36 83

Activation %

* Activitds mesurdes par la technique ~ deux temps ~ 28 ° en t ampon au cacodylate de tridthanolamine M/2o, PH 7 .o. D'apr~s des tests effectuds a v e c l a protdase de GORINI 7, ce corps ne complexe pas le calcium. Des contrCles avaient dtd insti tuds pour vdrifier que le t i trage du glucose par la notat ine restai t correct en prdsence des ions bivalents.

T A B L E A U VI KFFETS COMP]~TITIFS DU POTASSIUM ET DU CALCIUM SUR L'ACTIVIT]~

EN LACTOSE DE LA f l -GALACTOSIDASE

Activitds (l~M/h/mg N) en prdsence de diffdrents mdlanges des deux ions*

Concentrations K + moldculaires

0 ][0-8

I0--$ 2 " ][0 -2

IO-- I

124o I2OO II90 117 °

99--108

2 . 1 0 - - 2

6620 6580 335 ° I 9 5 0 270

6600 364 ° 175o lO7O ][84

* Activit~s mesurdes par la technique ~ deux temps, ~ 28 °, en prdsence de cacodylate de tridthanolamine, PH 7 .o. Les ions dtaient ajoutds sous forme de chlorures. La solution de CaCl s dtait prdparde par dissolution dans HC1 d 'une quanti td exacte de CO3Ca pur.

TABLEAU VII

EFFI~TS DE QUELQUES ANIONS SUR L'ACTIVIT]~ EN LACTOSE DE LA f l -GALACTOSIDASE

Anion (M/xo)

CI- Br - I-

Activitd (~M /h/mg N)

713 ° 7200 619o 4200

Anion (M/io)

NO s- NO s- SO C-

Cacodylate

Activitd (~Mih/mgN)

6460 4280 69IO 718o

Mesures effectudes en t ampon au phosphate de tr idthanolamine M/2o, PH 7.0. Anions a jout& sous forme de sel de potass ium (M/Io). "Cacodylate" = essai effectud en t ampon au Cacodylate de tr i~thanolamine M/Io, PH 7 .o, additionnd de KCI M/io . Technique/L deux temps.

Bibliographie p. z74.

gonisme" entre le calcium et le potassium. Les donn6es ne sont pas assez nombreuses pour clue l'on puisse conclure qu'tl s 'agit exclusivement d 'un effet de coml~tition. Les r6sultats sugg~rent pour tant que cet antagonisme pourrait ~tre au moins en partie l 'expression d 'un ph~iom~ne de comp6tition entre un activateur puissant (K +) et un activateur faible ou tr~s faible (Ca ++) en presence d 'un activateur moyen {H + ?).

L 'act ion l~g~rement activante du magn6sium n'est probablement pas due ~ une impuret~ et semble authentique. Le Tableau VII montre clue les anions utilis~s dans les exp6riences pr6c~dentes sont sans effet sp6cifique sur 1'activit~ de la galactosidase. On notera ~L ce propos, sans surprise, les effets inhibiteurs ou inactivants des anions NO8-, NO~-, I-, lOs-.

6. Aaivit~ en /onction du Pu

La Fig. 5 donne les r6sultats de plusieurs s6ries de mesures d'activit6 effectu6es entre p~ 4 et PH 10, ell pr6sence de diff6rents cations monovalents (M/Io) et de tampon au phosphate de tri6thanolamine (M/eo). On voit que le maximum, k PH 7, est particuli~rement marqu6 en pr6sence de potassium, tr~s net encore avec le rubidium et l 'ammonium, k peine indiqu6 pour les ions faiblement activants.

pl~fh~re/mg Azofe

7000 I t

. o o o //';" 5 000

J 000 -.

5 6 7 8 Q 10 p,

Fig. 5. Activit6 de la/~-galactosidase en fonction du PH en pr6sence de lactose et de ditt6rents cations monovalents

K phosphate de tri6thanolamine M/zo + KC1 M/Io R phosphate de tri6thanolamine M/2o + RbCI M/to A phosphate de tri6thanolamine M/2o + NH4C1 M/Io N phosphate de tri6thanolamine M/2o + NaC1 M/Io C phosphate de tri6thanolamine M/2o + CsC1 M/xo L phosphate de tri6thanolamine M/2o + LiCI M/xo O phosphate de tri6thanolamine M/2o sans addition X phosphate de potassium M/xo

Bibliographie p. ~74.

164 M. COHN, J. MONOD VOL. 7 (I95I)

On a port6 6galement sur cette figure une s6rie d'activit6s mesur6es dans un tampon au phosphate de potassium. On voit que dans ce cas la courbe d'activit6 se creuse k pi~ 7.3 et se relive $ Pn 7.8- Nous ne savons comment interprfter cet effet, ii6 k la nature du tampon, et qui ne semble pas pouvoir ~tre attribu6 k la pr6sence de deux enzymes distincts (voir plus loin). Souliguons que la galactosidase est stable entre les limites des PH employ6s (4 a IO) et retrouve sa pleine activit6 lorsque le Pi~ est ramen6 l'optimum.

7. Hydrolyse du niph~gat

LEDERBERG (communication personnelle) a d6montr6 l'existence dans des extraits d'E. coli (souche K 12) adapt6 au lactose, d'une "fl-galactosidase" tr~s active, notam- ment envers le niph6gal. La question de l'identit6 de cet enzyme et de la "lactase" de la souche "ML" se posait donc. La pr6paration F IV s'est montr6e excessivement active en pr6sence de niph6gal. Ce corps est hydrolys6 quantitativement en o-nitroph6nol et galactose. C'est du moins ce que montrent les bilans de r6action, compte tenu du fait que la pr6paration de niph6gal utilis6e contenait une forte proportion (12%) d'impuret6s, probablement du galactose libre.

LEDERBERG avait sigual6 que sa fl-galactosidase 6tait activ6e par le sodium. Les chiffres port6s dans les trois premieres colonnes du-Tableau IX permettent d'appr6cier l'effet du sodium et du potassium respectivement sur l'hydrolyse du niph6gal par notre pr6paration. En moyenne, l'activit6 de base est multipli6e par 3 en pr6sence de KC1 M]Io et par 5 en pr6sence de NaC1 M/Io. Le sodium est donc en presence de niph~gal un activateur plus puissant que le potassium. Cette diff6rence remarquable, cette "inversion" de l'activance du potassium et du sodium (par rapport aux r6sultats obtenus avec le lactose) sugg6rait que deux enzymes distincts 6taient en cause. Cette hypoth~se sera consid6r6e dans les paragraphes qui suivent. Le mgme tableau (colonne 1-4) montre que l'activit6 de la pr6paration, exprim6e en gM de substrat hydrolys6 par unit6 de temps est trois fois plus forte environ avec le niph6gal qu'avec le lactose comme substrat.

8. Analyse ~lectrophor~tique

Deux essais de s6paration 61ectrophor6tique ont 6t6 conduits avec la pr6paration F IV. Les conditions de ces exp6riences sont donn6es dans les 16gendes des figures cor- respondantes. Deux constituants (ou groupes de constituants) bien distincts apparaissent darts le diagramme de l'exp6rience I (Fig. 6). L'un et l 'autre avaient tendance ~t s'6taler et k devenir asym6triques. D'apr~s l'analyse des diagrammes, 91% des prot6ines totales se trouvaient dans le constituant principal. Une fraction, correspondant au constituant mineur le plus rapide (A) fut isol6e dans la moiti6 sup6rieure de la branche ascendante de la cellule, tandis qu'une autre fraction, correspondant au constituant principal, le plus lent, (fraction D) 6tait pr61ev6e dans la moiti6 sup6rieure de la branche descendante.

L'activit6 sur le lactose de ces deux fractions fur d6termin6e (aussit6t apr~s la s6paration) en pr6sence de potassium (Tableau viii). On volt que ces deux #actions, pourtant bien distinctes sur les diagrammes, poss~dent de ractivit6, encore que l'une (fraction A I) soit pros de trois lois plus active que l'autre (fraction D I).

Devant ce r6sultat assez surprenant un second essai de s6paration rut tent6, darts des conditions plus s6v~res, c'est k dire permettant l'application d'un potentiel plus 6lev6, afin d'obtenir une r6solution maximum. On notera d'ailleurs l'6talement marqu6 et l'aspect fortement dissym6trique des diagrammes. Seuls les bords ant6rieurs et pos-

Bibliographie p. I74.

t&ieurs des fronti~res furent isol*s, dans les branches ascendante et descendante res- pect ivement . Tou te possibilit6 de con tamina t ion d 'une fraction par l ' au t re semble avoir 6t6 exclue. Ici encore, cependant , les deux fractions se m o n t r e n t actives (Tableau VIII) et le rappor t de leurs activit6s 6gal ~t 2. 9 est du m~me ordre que dans l 'exp6rience pr6c6dente oh il est 6gal ~ 2.45.

~XPER/ENCE 1 De~cendont

XPER/EN£E 2

Fig. 6. Electrophor~se de la pr6paration FV.

Exp. z Prot~ine % 1.3

f phosphate-K o.o2 M Tampon NaC1 (o.I8 M)

PH 7-4 force ionique o.2

DurOc 83 minutes Potentiel 4.85 V/cm

Exp. 2 Prot6ine % I. 4

~ cacodylate-K o.oI M Tampon ~PFI 7.2

L force ionique o.oz

Dur6e 135 minutes Potentiel I9 V/cm

S6paration des fractions effectu6es dans une cellule ~ 4 616ments apr~s compensation adequate de la progression des fronti~res

TABLEAU VIII FRACTIONNEMENT ]~LECTROPHOI~TI~UE DE LA PI~PARATION F V

Activit6s en lactose des fractions ascendantes et descendantes isol6es au cours des exp6.ziences

Fractions

h i DI A2 D2 FV

z et 2 (Fig. 6).

Activit6 (/~M/h/mgN) en pr6sence de

K + M/zo

13 890 5 960

I8 500 62IO 7 090

Na + M/io

3 i I 2 I 2 i o

3 8zo z 360 I 49 o

Rapports des aetivit6s

K+/Na ÷

4-45 4.92 4.85 4.55 4.75

Moyenne 4-7 + 5%

Mesures effeetu6es ~ 28 ° par la technique ~ deux temps, en tampon phosphate (de potassium ou de sodium) M/Io, PH 7 .0. AI et A2 = fractions "ascendantes"; Dr et D2 = fractions "descendantes", isol6es an cours des exp6riences I e t 2 respectivement.

166 M. COHN, J. MONOD VOL. 7 (1951)

La comparaison des activit~s en presence de sodium et de potassium respectivement offrait un moyen suppl6mentaire d'identification. On volt (Tableau VIII ) que le rapport de ces activit~s est sensiblement le m~me pour les deux fractions, et pour la pr6paration originale.

L'activit6 de ces diverses fractions en prSsence de niph6gal rut d6termin6e plusieurs mois plus tard. Entre temps ces solutions, tr~s dilutes, avaient perdu une partie de leur activitY. Ce fait ne semble rien enlever (au contraire) ~t la valeur probante des r~sultats, donn~s par le Tableau IX. II est clair que les rapports des activit~s mesur~es dans diff~rentes conditions (presence d'ions K ou Na) avec le niph~gal et surtout le rapport particuli~rement caract~ristique de l 'activit$ en niph~gal ~ l 'activit6 en lactose, ne different pas de faTon significative, pour aucune des fractions, des valeurs trouv~es pour la preparation non fractionn~e.

TABLEAU IX FRACTIONNEMENT ~LECTROPHOR~TIQUE DE LA PREPARATION F V

Act iv i t6s compar6es des f rac t ions a s c e n d a n t e s et de scendan t e s en lac tose e t en n iph6gal

Fractions

AI DI A2 D2

Non f rac t ionn6

Activit& (/~M/h/ml) en

niph6gal en pr6sence de

PO4TEA (1)

33.9 7.05

23.9 ?

K + Mlxo (2)

116 17.4 68.0

IO 800

N a + M/IO

(3) (4)

I77 28.0

118.o 1.56

15 ioo

Lactose en presence de

K + M/IO

51.3 9.3

42.1 ?

R a p p o r t s des activitdm

3 94 °

(3)/(4) (3)/(2)

3.44 1.5 2 3.Ol 1.6o 2.80 1.7 2 -- 1.55

3.83 1.4 ° Moyenne Moyenne

3.34-Io% ~.56+ 5%

(3)/(0

5.2 3.9 5.x

4.4 Moyenne

4.75+ ,2%

Mesures effectu6es d e u x mois apr~s l '~lectrophor~se. T a m p o n au p h o s p h a t e de t r i 6 t h a n o l a m i n e (PO4TEA) M/xo, pi t 7.o. P o t a s s i u m et s o d i u m a jou t6s sous fo rme de chlorures . Pou r le n iph6gal , mesu re s au spee t ropho tom~t r e B e c k m a n ~. 26 ° envi ron . P ou r le lactose, t e c h n i q u e ~ deux t e m p s A 28 °. AI , A2, DI , D2 = f rac t ions a s c e n d a n t e s (A) e t d e s c e u d a n t e s (D) isol6es au cours des ex l~ r i ences I e t 2 r e spee t i vemen t . On no t e r a que les ac t iv i t6s son t donn6es e n IzM/h pa r m l e t non pa r m g d 'N.

L'analyse ~lectrophor~tique met donc en ~vidence au moins deux constituants distincts dans notre pr6paration. Mais les tests, assez s~v~res cependant, dont nous disposons, ne permettent pas de diff~rencier ces constituants principaux par leurs propri~t~s enzymatiques caract~ristiques.

9. Inactivation thermique

Les r6sultats donn~s par le Tableau X permet tent de comparer les vitesses d'inactivation thermique de la "lactase" et de la "niph6galase" ~ 50.6 ° C. Des essais pr61i- minaires avaient montr6 qu 'k 55 ° C l ' inactivation 6taft totale en moins d 'une minute, tandis qu'k 47.3 ° C elle 6taft de moins de 5 % en IO minutes. La r6action d' inactivation est sensiblement du Ier ordre (Fig. 7). Les r6sultats obtenus pour les deux s6ries de mesures ("lactase" et "niph6galase") sont prat iquement 6quivalents.

V~L. 7 (1951) LACTASE D'Escherichia coli 167

TABLEAU X INACTIVATION THERMIQUE DE LA ~-GALACTOSIDASE

Comparaison des activit6s en lactose et en niph6gal au cours de la d6uaturation A 5o.6 ° C

Temps en minutes

Activit6 en niph6gal (/~M/h)

Activit6 en lactose (/~M/h)

Rapport niph6gal/lactose

3 0 0 0

1 0 2 0

Exp6riences effectu4es par la technique suivante21: des tubes en verre g parois minces ~taient plac6s dans un thermostat g 5o.6 ° C. On mesurait dans chaque tube o. 3 ml d'une solution concentr6e d'enzyme, en phosphate de tri6thanolamine M/xo, PH %o. Une minute plus tard (temps n6cessaire pour que l'6quilibre de temp6rature fur atteint) on pr61evait dans chaque tube un 4chantillon qui 6tait imm6diatement dilu6 dans du tampon ~, o ° C. Ce moment 6tait arbitrairement consider6 comme le temps o. Les 4chantillons suivants 6taient pr61ev~s de la m6me mani~re au moment voulu, et dilu6s de fa~on ~ tenir compte approximativement de la perte d'activit6. Ils 6taient ensuite additionn& de NaCI (M/io) pour les mesures d'activit6 en niph6gal et de KC1 (M/Io) pour les mesures d'activit6 en lactose. Les premieres 6talent effectu6es g 26 ° C par la technique d4crite (p. 154), les secondes

28 ° C par la technique g 2 temps.

log -~ '/.5

J O=LOCtO*O x=Niphigala*G

4 6 8 t0 miaut~s

Fig. 7. Inactivation thermique de la/~-galactosidase. Activit6s mesur6es en lactose ("lactase") et en niph6gal ("niph6galase"). Co = activit6 au temps O. Cx ----- activit6 au temps considerS. Technique

des mesures, voir 16gende du Tableau X

IO. Propri~t~s immunochimiqu,s

Une pr6paration de pseudo-globuline anti-gahactosidase obtenue k partir du s6rum de lapins immunis~s par injection de la preparation d'enzyme (v. Tableau XI) poss6dait un titre 61ev6 en anticorps pr6cipitant. Cette pr6paration d'anti-gahactosidase pr6cipitait 6galement ha "hactase" d'autres esp~ces ou souches de bact6ries coliformes (Aerobact, r aerog~ae,, E. coli souche K-x2). EUe ne r6agissait pas avec ha lactase de Saccharomyces /ragilis. Bibliographie p. z74.

I 68 M. COHN, J. MONOD VOL. 7 (r95})

TABLEAU

A N A L Y S E I M M U N O C H I M I ~ U ~

R6action de pr6cipitation

Antig6ne ajout6 en pg d 'N

5.5 I I . I

16.6 27.7 33.2 38.8 44.3 55.4 66.5

Lactase ajout~e en unit~s d 'act ivi t~

(uM/h)

39.3 78.6

118 196 236 275 314 393 472

Niph6galase ajout6e en unit6s

d 'act ivi t6 (pM/h)

124 248 372 6 2 o

744 868 992

124o 149o

r6moin: antigone + tampon i i . i ] 78.6 248

r6moin: antigone + pseudoglobuline "normale" 11.1 78.6 ~48

Pr6cipit6 form6 pg N

73.I 95.2 93.2 87.6 85.3 74.1 6o.4 43.2 18.9

Analyse de

par la r6action de pr6cipitation

Pr6sence d 'ant icorps

+ + + Tr Tr 0

Prdsence d'antig~nes

Tr + + + + + + +

Technique quantitative pour la rdaaion de precipitation s Anticorps: 0.2 ml de la pr6paration de pseudoglobuline. Tampon phosphate de potassium M]io,

PH 7 .o. Volume tota l 2 ml. La pr0zipitation est compl~te apr~s 7-8 jours & la glaci~re. Mesures d 'activit6 dans les liquides surnageants effeetu6es s imultan6ment sur tous les 6chantillons. Lactose: technique & 2 temps, 28 °. Niph~gal: mesures au spectrophotom~tre Beckman, 27 °.

P r ~ ¢ i p i f ~ t ~g IV)

f O 0 _

fo 20 30 40

Fraction d'enzyme pr&ipit~

• = Pr&ipit~ 1 0 = L o ( t o s e

x = N i p h ~ g a l o s e

\ 50 60 70

AntigOne ojout6 ([lg N)

Fig. 8. R6action de pr6cipitafion entre la prdparation FV et le sdrum homologue. Les points noirs donnent les poids (en dquivalent-N) de prdcipitd formd, en fonction de la quanti td d'antig~ne ajoutA. La "fract ion d 'enzyme prdcipitd" est calcul6e pour la " lactase" comme pour la "niphdgalase", d'apr~s les valeurs de l%ctivitd enzymatique du liquide surnageant apr~s dlimination du prdcipitd. Conditions:

voir ldgende du Tableau XI.

VOL. 7 ( I 9 5 I )

DE LA PREPARATION VV

LACTASE D' Escherichia coli x69

l iquides surnageants

par l 'act ivi t$ enzymatique Rapport niph~galase

lactase niph~galase lactase

Activit6 °/o en solution Activit~ ~o en solution

5.14 9.26

5 1 . O

23 ° 320 465

2.6 3.9

I8.5 73 82 99

Tr 18.4 39.2

25o 73 8

3.o 5.2

29.0 84 99

3.58 3.65 4.42 3.20 3.82 3.22

Moyenne 3.54 4- 1 0 %

Preparation de pseudoglobuline anti-galaxtosidase Six lapins re~oivent chacun 125 #g de prot6ine de la pr6paration FV, inject6s pax la tech-

nique de FREUND ET BONANTO s. T6moin "normal" , m6mes s6rums avant immunisat ion. Isolement de la fraction pseudoglobulinique par 3 pr6cipitations au sulfate d 'ammoniaque g 33~/o et dialyse contre de l 'eau distill6e.

Le pr$cipit~ sp~cifique, lav~ par centrifugation, conservait int~gralement l'activit~ enzymatique. I I en ~tait de m~me des complexes solubles antig~ne-anticorps, form6s en pr6sence d'un exc~s d'antig~ne. C'est grace ~ ces propri~t~s que nous avons pu mettre au point une technique de titrage (Tableau XI) dont le principe consiste ~ utiliser l'activit6 enzymatique non pr~cipit6e pour d~terminer le point d'~quivalence. Ce titrage ~tant bas~ sur une propri6t~ sp~cifique de l'antig~ne, les r~sultats sont ind~pendants de toutes autres r~actions dues k des anticorps 6trangers. C'est ainsi que le titrage de l'anticorps, soit par la preparation de galactosidase purifi6e, soit p a r des extraits bruts, donnait sensiblement les m~mes r~sultats. (I1 semble cependant qu'un anticorps sp~cifique d'une prot~ine ~trang~re k l'enzyme ~tait present, mais ne constituait qu'une petite fraction de l'anticorps total. Nous y reviendrons dans un instant).

Des extraits bruts de bact~ries non adapt~es, extraits qui ne poss~daient que des traces ~ peine mesurables d'activit~ pr$cipitaient sp~cifiquement l'anti-lactase. Une prot6ine dou6e de propri~t~s immunologiques tr~s semblables, sinon identiques k celles de la lactase, est donc pr~sente dans les bact6ries non adapt~es. Nous laisserons de c6t~, ici, le probl~me des rapports structuraux et ontog~niques de ces deux prot~ines, probl~me dont nous poursuivons l'6tude.

Une analyse quantitative de la r~action entre lactase purifi~e et pseudoglobuline

Bibliographie p. I74.

I70 M. COHN, J. MONOD VOL. 7 (1951)

alxti-lactase est donn6e par le Tableau XI. L'activit6 enzymatique des liquides surnageants a 6t6 d6termin6e el1 pr6sence de lactose et de niph~gal. On voit que jusqu'~ 16.62/~g d'antig~ne ajout6, le liquide surnageant est d6nu6 de toute activit6. Au-del~ commence la zone d'exc~s d'antig~ne. Le pourcentage d'activit6 demeurant ell solution s'accrolt; les deux s6ries de mesures d'activit6 ("lactase" et "niph6galase") donnent des rSsultats 6quivalents aux erreurs pr~s. Aucune tendance ~ une dissociation des deux activit6s lie se manifeste. Elles sont donc associ6es toutes deux ~ un m~me antigone, homog~ne quant ~ la sp6cificit6 immunologique. La m~me exp6rience a 6t6 r6p~t6e avec des extraits non purifi6s. Les r6sultats en ont 6t6 essentiellement semblables.

Notons qu'au del~ de 55/*g d'6quivalents-N d'antig~ne ajout6, tout l'enzyme demeure en solution. Cependant, il y a encore pr6cipitation jusqu'~ 66.5 V4~ d'~quivalents N ajout6s. Cette pr6cipitation est 6videmment due ~ une impuret6 de la pr6pa- ration, et k l'anticorps correspondant. Nous avons lk un exemple de plus de la valeur de la r6action de pr6cipitation dans la zone d'exc~s d'antig~ne pour la d6tection immunologique de certaines impuret6s 3, 4.

DISCUSSION

I. La "lactase" purifi~e que nous avons ~tudi~e hydrolyse le lactose et le niph~,gal. Ces corps n'ont en commun que le radical fl-galactoside. Nous pouvons ajouter ici (quoique nous u'ayons pas ~tudi~ quantitativement cette r~action) que le fi-m~thyl- galactoside est ~galement hydrolys~. En revanche, la preparation est totalement inactive envers tous ceux des glucides essay,s qui ne contiennent pas la liaison ~-galactosidique.

Auculi des tests ou essais de s6parations effectu~s (~lectrophor~se, pr6cipitation par le s~rum sp6cifique, inactivation thermique) ne permet de dissocier, m~me partieUement, les activit~s mesur6es en pr6sence soit de lactose, soit de niph~gal. Tous ces r~sultats indiquent donc qu'un m~me enzyme est responsable de l'hydrolyse des deux substrats. I1 est plus que probable que cet enzyme sp~cifique de la configuration ~ogalactosidique est, au moins partieUement, indiff6rent ~ la structure de la fraction aglycone. Ce serait donc une flogalact0sidase et il est pr~f6rable de renoncer ~ rappeUation de "lactase" employee dans des publications pr~c~dentes (loc. tit.). Cet enzyme paralt identique par son activit6 enzymatique aussi bien que par sa sp~cificit~ antig~nique ~ celui que J. LEDERBERG (communication personnelle) a extrait de la souche K-I2 d'E. coli et dont il a observ6 l'activation par le sodium en pr6sence de niph~gal. Notre enzyme est distinct au point de vue immunologique de la "lactase" de levure, mais il se pourrait qu'il en fut assez proche au point de rue chimique, car la lactase de levure est 6galement activ~e par le sodium et le potassium (DAVIES, communication personneUe). Les donn6es publi~es sur des "lactases" et des "~-galactosidases" d'autres sources ne nous permettent pas de faire de comparaisons ou de rapprochements utiles. Nous n'aborderons pas ici le probl~me de la sp~cificit6 des galactosidases. On doit pourtant remarquer que la fl-galactosidase de l'~mulsine n'a pu jusqu'~ pr6sent ~tre s~par~e ou distinguee nettement de la fl-glucosidase 19. Notre pr6paration semble au contraire d6pourvue de toute activit6 sur les fl-glucosides.

2. En 6tudiant avec quelque soin l'effet des ions sur l'activit6 de cet enzyme, nous avions simplement pour but de pr6ciser des propri6t6s caract6ristiques. Les effets

VOL. 7 (1951) LACTASE D'Escherichia coli 17I

a'activation par les ions alcalins, et surtout les ph6nom~nes de "pseudoantagonisme" observ6s all cours de cette 6tude m6ritent pourtant de retenir l 'attention. La galactosidase purifi6e constitue un mat6riel de choix pour l'6tude de ce type d'effets dont il est inutile de souligner l 'importance. On salt que le potassium est indispensable k la croissance de plusieurs bact6ries n, 1~, is. SNELL et ses coUaborateurs ont pu mettre en 6vidence des rapports comp~titils entre Na +, NH + et K + pour la croissance des streptocoques e.t lactobacilles. Ils ont montr6 que ces effets comp6titifs pouvaient rendre compte de certains antagonismes. De tr~s nombreux effets d'activation et d'inhibition de syst~mes enzymatiques plus ou moins complexes par des cations monovalents ont 6t6 sign- al~s x, 2,10, ~0, 24.

On poss~de beaucoup moins de donn6es se rapportant k des enzymes isol~s ou cristaUis6s. Les plus completes concernent la myosine ~.

Deux indications principales se d6gagent des observations que nous avons expos6es ici. D'abord, que la notion assez obscure d'antagonisme ionique pourrait, dans beaucoup de cas peut-~tre, se ramener ~ l'id6e plus claire de competition. Nous avons vu comment le sodium, activateur de la galactosidase exerce cependant une action inhibitrice ell presence d'un autre ion, le potassium, activateur puissant, mais dou6 de moins d'afflnit~ pour l'enzyme. Nous avons vu 6galement que les r6sultats concernant les cations monovalents y compris les effets inhibiteurs du lithium pourraient s'expliquer de fa~on analogue, k la condition d'admettre que, comme les autres cations, ceux de l'eau (ions H +) sont dou6s d'aflinit6 pour l 'enzyme et de pouvoir activant.

L'affinit6 et l"activance" de chaque ion suffiraient dans cette hypoth~se k d6fmir ses propri~t6s, et la connaissance de ces valeurs permettrait de calculer l'activit6 enzymatique ell pr6sence de n' importe quel m61ange d'ions.

La v6rification de ces hypotheses assez simples, satisfaisantes en ce qu'elles r~- duiraient ~ des diff6rences quantitatives (affinit6, activance) les differences qualitatives qu'implique la notion d'antagonisme ne paralt pas impossible ell principe, mais exigera des recherches approfondies.

La comparaison des r6sultats obtenus soit avec le lactose, soit avec le niph6gal, accrolt encore l'int6r~t de ces ph6nom~nes captivants. Elle sugg&re que l 'activance d'un ion est une propri6t6 qui d6pen'd non seulement de l 'enzyme et de l'ion, mais encore du substrat. Nous avons vu en effet qu'en pr6sence de lactose le potassium est un meilleur activatenr que le sodium, alors que c'est l'inverse en pr6sence de niph6gal. On ne connaissait pas jusqu'~ pr6sent, croyons-nous, d'exemple d'une telle situation. Les observations expos6es ici sont malheureusement tr~s incompl~tes en ce qui concerne l 'hydrolyse du niph6gal. Nous comptons reprendre ce probl~me en comparant syst6- matiquement l 'activance des divers ions el1 pr6sence d'une s6rie assez vari6e de ~- galactosides employ6s comme substrat.

3- I1 est difficile d'interpr6ter les r6sultats de l'analyse 61ectrophor6tique montrant que l'activit6 enzymatique est associ6e avec des prot6ines de propri6t6s 61ectriques diff6rentes. Les deux fractions isol6es par 61ectrophor~se ne se diff6rencient en r i en par leurs propri6t6s enzymatiques si ce n'est l'activit6 absolue. Or cela est d 'autant plus significatif que les propri6t6s tr~s caract6ristiques de cet enzyme constituent d'exceUents crit~res d'identification. De plus, l 'analyse immunologique indique que l'activit6 enzymatique est associ6e k une seule esp~ce antig6nique.

I1 est possible que les t6sultats de l'61ectrophor~se soient dfis ~ un artefact de pr6paration. L'analyse d'autres pr6parations, effectu6es 6ventueUement par d'autres

Bibl~ographie p. 174.

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m~thodes, permettrait de v~rifier cette possibilitY*. Peut-~tre aussi ces observations doivent-elles ~tre rapproch~es de la d~couverte, dans les extraits de bact~ries non adapt~es (extraits d~pourvus de galactosidase) d'une prot~ine (Pz) precipitant sp~cifiquement avec l'anti-galactosidase. L'hypoth~se selon quoi cette prot~ine serait le pr~curseur de la galactosidase se pr~sente d'elle-m~me, et fait l'objet de recherches que nous poursuivons actuellement. Toutefois, on peut dire d~s maintenant que, d'apr~s des dosages immunologiques, la preparation utilis~e pour ce travail contenait environ 40% de prot~ine Pz. Si d'autre part on suppose que la fraction rapide ("A", p. x55) repr~sente la galactosidase "pure", on doit en d~duire que la preparation contenait 39% d'enzyme actif, et 2x% d'une (ou plusieurs) prot~ines antig~niquement diff~rentes des deux premieres. Ce calcul approximatif repose sur plusieurs hypotheses qui demanderont ~tre justifi~es et discut~es d'une fagon beaucoup plus approfondie.

R~SUM~-

i. Une technique de purification de la fi-galactosidase (lactase) adaptive de E. coli est d6crite. 2. Le lactose et l'o-nitroph6nyl-fi-D-galactopyranoside (niph6gal) sont quanti tat ivement hydro-

lys6s en pr6sence de cette pr6paration, qui, en revanche, est inactive sur les glucides ne pr&entant pas la configuration/~-galactosidique.

3. Les activit~s en lactose et en niph~gal sont le fait d 'un m~me enzyme, ainsi que le d6montrent les r6sultats suivants:

4. La vitesse d'inactivation thermique est la m~me qu'on estime l 'activit6 en pr6sence de lactose ou de niph6gal.

5. L'6lectrophor~se r6v~le la pr6sence dans la pr6paration de deux constituants au moins. Chacune de ces deux fractions est active sur le lactose et sur le niph6gal. Le rapport des activit6s est le m~me pour les deux fractions.

6. Un s~rum pr6cipitant anti-lactase a ~t6 obtenu par immunisation de lapins ~ l 'aide de la preparation purifi6e. L'6tude quantitative de la r6action de pr6cipitation indique que l 'activit$ enzymatique estim6e soit sur le lactose, soit sur le niph~gal, est associ6e A un antigone unique. L'existence d 'une prot6ine donnant une r6action crois~e tr~s marqu6e avec la galactosidase, mais d6pourvue d'activit$ enzymatique a 6t6 d6montr6e.

7- L'action des ions sur l 'hydrolyse enzymatique du lactose est 6tudiSe. Les effets des cations monovalents sont particuli~rement marqu6s et complexes, et tels que le m~me ion (sodium) peut, suivant les conditions (prSsence de certains autres cations) paraitre exercer une action inhibitrice ou activatrice.

8. Ces effets r~sultent des relations comp6titives existant entre les cations monovalen~. Une interpretation est envisag6e qui rendrait compte de ces ph6nom&nes ainsi que des effets inhibiteurs de certains ions, en faisant intervenir seulement deux constantes caract6ristiques, ~ savoir l'affinit~ (inverse de la constante de dissociation apparente du complexe ion-enzyme) et l 'activance (activit~ de l 'enzyme ~ saturation par l'ion).

9. Dans l 'hydrolyse du lactose, l ' ion pr6sentant l 'activance maximum est le potassium, tandis que le sodium n'active que faiblement. Au ccnvraire, avec le niph6gal comme substrat, l 'activance du sodium est plus $1ev6e que celle du potassium. Cette remarquable inversion des effets des ions d6montre que l 'activance est liSe ~ la structure chimique du substrat.

SUMMARY

i. A method for the purification of the adaptive enzyme of E. toll, fl-galactosidase (lactase) has been described.

* Le Dr Louis SIMINOVITCH, travaillant dans le laboratoire du Professeur TIS•LIUS, a tout r6cemment r6pdt~ cette sdparation sur une pr6paration d 'enzyme obtenue dans des conditions tr~s diff6rentes. Ici encore les fractions ascendante et descendante pr6sentaient les m6mes caract6ristiques d'activi't&

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2. Lactose and o-nitrophenyl-~-D-galactopyranoside are quantitatively hydrolysed by this enzyme preparation which, however, is inactive on sugars not possessing the /~-galactosidic configuration.

3- The following results (4, 5, and 5) indicate that the hydrolysis of lactose and 0-nitrophenyl- fl-D-galactopyranoside is catalyzed by the same enzyme.

4. The speed of thermal inactivation is the same whether one determines the activity with lactose or o-nitrophenyl-/~-D-galactopyranoside as substrate.

5- The electrophoretic analysis of this purified preparation reveals the presence of at least two constituents. Each of these electrophoretically distinct constituents is active on lactose and on o-nitrophenyl-~-D-galactopyranoside, and the ratio of these activities is the same for both fractions.

6. A precipitating anti-lactase serum has been obtained by immunization of rabbits with the purified enzyme preparation. A quantitative study of the precipitin reaction indicates that the enzymatic activity, whether it be determined on lactose or o-nitrophenyl-fl-D-galactopyranoside, is associated with a single antigenic species. There has also been demonstrated the existence of a protein which possesses no enzymatic activity but which markedly crossreacts with the fl-galactosidase.

7. The action of various ions on the enzymatic hydrolysis of lactose has been investigated. The effects of monovalent cations are particularly marked and complex. Depending upon the conditions (the presence of certain other cations), a given ion (sodium) is able to behave as either an inhibitor or an activator.

8. These effects are the result of the competitive relationship between the monovalent cations. In order to account for the above phenomena, a hypothesis is presented, bringing into play only two characteristic constants: the affinity (inverse of the apparent dissociation-constant of ion-enzyme complex) and the "activance" (activity of the enzyme when saturated by the ion).

9. For the hydrolysis of lactose, potassium shows the maximum "activance", while the sodium is only weakly active. On the other hand, with o-nitrophenol-15-D-galactopyranoside as substrate, the "activance" of sodium is higher than that of the potassium. This remarkable inversion of the effects of ions demonstrates that the activance is linked to the chemical structure of the substrate.

ZUSAMMENFASSUNG

I. Eine Methode zur Reinigung der adapt iven ~-Galaktosidase (Laktase) von E. coli wurde beschrieben.

2. Laktose und o-Nitrophenyl-~/-D-galaktopyranosid ("Niph6gal") werden in Gegenwart dieses Enzympr~parates quant i t a t iv hydrolysiert, w~hrend Zucker, die keine ~-Galaktosid-Konfiguration aufweisen, n lcht angegriffen werden.

3. Die folgenden Ergebnisse (siehe 4, 5 und 6) zeigen, dass die Hydrolyse yon Laktose und o-Nitrophenyl-~-n-galaktopyranosid durch dasselbe Enzym katalysier t wird,

4. Die W~rme-Inakt ivierung ist dieselbe, ob man nun die Aktivit~.t mi t Laktose oder mi t o-Nitrophenyl-fl-D-galaktopyranosid als Substra t best immt.

5. Die Elektrophorese dieses gereinigten Pr~parates l~sst die Gegenwart mindestens zweier Bestandteile erkennen. Jede dieser beiden Frakt ionen is t sowohl gegen0ber Laktose als gegen o-Nitrophenyl-~-D-galaktopyranosid aktiv. Das Verh~iltnis der Aktivit~iten is t fiir die beiden Frak- t ionen dasselbe.

6. E in pr~zipitierendes ant i -Laktaseserum wurde durch Immunisierung vop Kaninchen mi t dem gereinigten Enzympr/~parat hergestellt. Dic quant i ta t ive Untersuchung der Pr~zipitations~eaktion ha t gezeigt, dass die Enzymaktivi t~t , ob sie nun in Bezug auf Laktose oder o-Nitrophenyl-fl-D- galaktopyranosid bes t immt wird, einem einzigen Antigen entspricht. Das Vorhandensein eines Eiweisstoffes, der starke Kreuzreaktionen mi t der Galaktosidase zeigt, aber als Enzym inakt iv ist, wurde bewiesen.

7. Die Wirkung verschiedener Ionen auf die enzymatische Hydrolyse der Laktose wurde unter- sucht. Der Effekt der einwertigen Kat ionen is t besonders deutl ich und komplex. Je nach den Um- st~nden (Gegenwart gewisser anderer Kationen) scheint ein und dasselbe Kat ion (Natrium) hemmend oder akt ivierend zu wirken.

8. Diese Effekte sind das Ergebnls der "Konkurrenz" zwischen den einwertigen Kationen. Eine Hypothese, welche die oben erw~hnten Erscheinungen und die Hemmwirkung gewisser Ionen erkl~ren kSnnte, wurde aufgestellt. Sie verwendet nur zwei charakterist ische Konstanten, n~mlich die Affinit~t (der umgekehrte Wer t der scheinbaren Dissoziationskonstante des Komplexes Ion-Enzym) und die "ac t ivance" (Aktivit~it des Enzyms bei S~ttigung durch das Ion),

9. Bei der Hydrolyse der Laktose zeigt Kal ium die gr6sste "act ivance", w~hrend Natr ium nur schwach akt iv ist. Mit o-Nitrophenyl-/~-D-galaktopyranosid als Substra t is t dagegen die "ac t ivance" von Natr ium gr6sser als die yon Kalium. Diese merkwiirdige Umkehrung in der Wirkung der Ionen beweist, dass die "ac t ivance" mi t der chemischen Struktur des Substrates zusammenh~ngt.

Bibliogvaphie p. x74.

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B I B L I O G R A P H I E

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Re~u le 2 d6cembre I95O

N O T E

Au m o m e n t d ' e n v o y e r ce t r ava i l ~ l ' impres s ion nous a v o n s eu conna i s sance d ' u n mdmoire de J . LEDEmSERG (3*. B a a . , Vol. 6o, oc tobre I95O) su r la ga lac tos idase p rodu i t e pa r l a souche " K I2" d ' E . coll. Les in td res san tes obse rva t ions de LEDSR~ER~ sur les effets des ions a lca l ins pour ra ien t , au p remie r abord, appa ra i t r e assez d ive rgen te s des nStres, m a i s le caractAre pr61iminaire de ce t te pub l i ca t i on e t le fa i t que LEDER~ER~ a employ6 e x c l u s i v e m e n t le n iphdga l c o m m e s u b s t r a t t a n d i s que nous a e o n s s u r t o u t u t i l i sd le lac tose n ' a u t o r i s e n t pa s de c o m p a r a i s o n d6tai l lde en t r e ces rdsu l ta t s e t les nStres. I l y a t o u t l ieu de croire qu ' i l s ' ag i t du m ~ m e enzyme.

Purification et propriétés de la β-galactosidase (lactase) d'escherichia coli

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