Скоблов Михаил Юрьевич

Молекулярная биология

Лекция 1. Введение в курс.

Часть 1. Что изучает молекулярная биология?….

Что изучает молекулярная биология?

Молекулярная биология изучает связь между генетической информацией и признаками организма, которые реализуются с помощью белков.

Что изучает молекулярная биология?

Объект – живые организмы: многоклеточные - одноклеточные эукариотические - прокариотические вирусы

Клетка Что и как в ней работает?

Состав клетки Вещества в клетке

Неорганические • Вода – 75-85% • Неорганические соли,

кислоты – 1-1,5%

Органические

Малые молекулы • Моносахариды • Аминокислоты • Нуклеотиды • Другие • Липиды (жиры) – 1-5%

Биополимеры (макромолекулы)

• Полисахариды (углеводы) - 0,2-2% • Белки - 10-20% • Нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) - 1-2%

0,5%

Методы исследования состава клетки

• Неорганические вещества

• Малые органические молекулы

• Липиды

• Полисахариды

• Белки

• Нуклеиновые кислоты

• Хроматография • Спектрометрия • Масс-спектрометрия • Рентгеноструктурный анализ

• Хроматография • Спектрометрия

• Хроматография • Масс-

спектрометрия • Иммунологические • Секвенирование • Рентгеноструктурн

ый анализ • Электрофорез • Ультрацентрифугир

ование

• Полимеразно-цепная реакция

• Секвенирование • Гибридизация • Электрофорез • Ультрацентрифуги

рование

Белки – классический (любимый) объект молекулярной биологии… Оказалось, что их очень много и они очень разные

Они определяют миллионы взаимодействий,

образуя генные сети…

Кто сделал белки главными?

Francis Crick

1957 г. Центральная догма молекулярной биологии.

Самые часто используемые методы исследования природных биомолекул

• ДНК – секвенирование

• РНК – секвенирование

• Белок – секвенирование, масспектрометрия

А где гены?

У каждого живого организма есть наследственный материал

Есть свои гены

Вильгельм Людвиг Иогансен

Уильям Бэтсон

Грегор Иоганн Мендель

1865 г: «наследственные признаки» содержащиеся в половых клетках

1906 г: термин «генетика»

1909 г: термин «ген»

Историческая справка

• Определение 1860 – 1900х: «Ген – это дискретная единица наследственности» (Wilhelm Johannsen)

• Определение 1910х: «Ген – это отдельный локус» (Thomas Hunt Morgan)

• Определение 1940х: «Ген – это чертеж белка» (Beadle and Tatum)

• Определение 1950х: «Ген – это физическая молекула» (Griffith)

• Определение 1960х: «Ген – это транскрибируемый код» (Watson and Crick)

• Определение 1970х-1980х: «Ген – это открытая рамка считывания (open reading frame – ORF) части последовательности» (Doolittle)

История определения гена

А где гены?

Гены находятся на хромосоме

Ген — это структурная и функциональная единица наследственности, контролирующая образование какого-либо признака, представляющая собой отрезок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты

или Ген - участок молекулы ДНК (в некоторых случаях РНК), в котором закодирована информация о биосинтезе одной полипептидной цепи с определенной аминокислотной последовательностью

Определения понятия ген

Гены находятся на хромосоме

Найти ген – значит картировать РНК на ДНК, проаннотировать эту последовательность.

Биоинформатика

РНК

Геном

+

Картирование РНК на ДНК

Ген

Определение гена 2000х: «Аннотированная структурная единица генома, зарегистрированная в одной из баз данных»

B-cell neoplasia associated gene with multiple splicing (BCMS): the candidate B-CLL gene on 13q14 comprises more than 560 kb covering all critical regions.

Wolf S. et al., Human Molecular Genetics, 2001

p53

Структура гена р53 и кодирующие изоформы

p53

Современное определение гена формулируется так:

«Ген – это совокупность геномных последовательностей, кодирующих сцепленный набор потенциально перекрывающихся функциональных продуктов».

В нем не упоминаются сложные аспекты регуляции и транскрипции и утверждается, что с одним геном могут быть ассоциированы группы функциональных продуктов гена (а не промежуточные транскрипты).

Программы и алгоритмы для аннотации генов

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

Количество генов человека в базе данных Gene

1957 г. Центральная догма молекулярной биологии.

Francis Crick

Далеко не всегда всё доходит до белка, и это не есть несовершенство, наоборот!

Транскриптом

Белок-кодирующие РНК

Белок-некодирующие РНК

совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и некодирующие РНК

1,5% генома человека 80% генома человека

9277 вручную аннотированных генов

Кодирует или не кодирует – вот в чем вопрос!

1 gtggacgggg cgggcccagc tgtgtttgag tgctccgcgg tcctgggagc cagagacctg

61 gaggaagcga gctgggtaga cggctttctc cgctcgcgga agggtgtgag aggagtgtgt

121 gggggtcggc agctagaggt gtgtgcagtc agccaccggc gaggagctga gacagtcgcc

181 gcagctttcc gagccgcatc cgcttcccgc ccggggcagc tccggctgga ggggtgaagc

241 ggcggctgga gtggccgtgc ttttgtgtcc tggatccggg taccctccct cccctggtgc

301 agcccgaggc aagtccatcg aggtgatcac tcctcgacgc cgctcggaaa tcctgggcat

361 cccccctgcg ccccgagcgg ctgataccca ggtgaggcac ctgaggtgtc aggacctgcc

421 cggggcgcgg ggtgtccgga agccaggcgg gagccccggc tgctttttgg caatcgattc

481 tcatctgtga ccctccccga gctgttttct atcgaatctc atctgtgatc ctcccccggc

541 tgctcttccc aggacaactc cggtgcaaag gcttggctca tgctcgacgg cgaggggaga

601 aaaaaagctg agggacaatg gatgcaaagg cccgaaattg tttgcttcaa cataaagaag

661 ctctggaaaa ggacatcaaa acatcctaca tcatggatca catgatcagt aatggcgtct

721 taacagtagt agaggaggaa aaggtcaaaa gtcaggccac tcaatatcaa cgagcagctg

781 ctttaattaa aatgatactt aataaagaca attatgccta catttcattc tacaacgctc

841 tactacacga gggctataaa gaccttgctg gacttctgca tagcggcctt cctcttgtgt

901 cttcttccag cggcaaggac acagacggtg gaaacacttc atttgtaagg acagtgctgt

961 gtgaaggtgg agtgccacag aggccagtca tctttgtcac taggaagaag ctggtcagtg

1021 cgattcagca gaagctctgg aaactgaatg gggagccagg gtgggtcacc atctatggaa

1081 tggcaggctg tggcaagtct gtattagctg cggaagctgt tcgcgaccat gccctcctag

1141 aaggttgttt ttcagggggc

Критерии трансляции: 1. Кодирующая рамка более 300

нуклеотидов 2. Консервативность

аминокислотной последовательности

3. Удовлетворять условию NMD.

Определение кодирующего потенциала РНК происходит с помощью биоинформатического анализа.

Экспериментальная проверка – очень долгий путь….

5’ UTR CDS 3’UTR polyA

CAP

Цель проекта Протеом: инвентаризация всех белков человека и выяснение взаимодействий между ними. Российская часть проекта – определение протеома 18-й хромосомы человека.

Результат: из 300 белок кодирующих генов с помощью масспектрометрических подходов идентифицировано 80% белков.

Парадокс количества и сложности:

“Эволюционное качество” достигается не количеством генов, а их регуляцией.”

Типы регуляции экспрессии генов эукариот

Часть 2. Интересные примеры реализации молекулярной биологии….

Молекулярная биология – фундаментальная наука

Она дала мощный толчок к появлению и развитию таких прикладных направлений как: биотехнология генная инженерия диагностикя и т.д. …

Журнал "Молекулярная биология" освещает проблемы молекулярной, клеточной и компьютерной биологии, включая структурную и функциональную геномику, транскриптомику, протеомику, биоинформатику, биомедицину, молекулярную энзимологию, молекулярную вирусологию и иммунологию, теоретические основы биотехнологии, физику и физическую химию белков и нуклеиновых кислот, касается проблем молекулярной эволюции.

1988 3 млрд $

2013 1’000 $

2005 1’000’000 $

Стоимость секвенирования генома человека

Sanger

NGS 2008 100’000 $

2004 20’000’000 $

2001 200’000’000 $

Все начиналось с них…

Nature

24 september 2009

Не только люди, но и дьяволы…

Заболевание приводит к появлению на морде дьяволов больших опухолей, которые мешают животным нормально пить и питаться. Впервые рак тасманийских дьяволов был идентифицирован в 1996 году, а к настоящему моменту им заражено около 60 процентов популяции животных. Заболевание переносится непосредственно раковыми клетками, когда животные кусают друг друга или спариваются. Так как дьяволы весьма агрессивны, болезнь распространяется с высокой скоростью.

Авторы новой работы расшифровали геномы двух животных - дьявола по кличке Седрик, отловленного на северо-западе Тасмании, и самку сумчатого млекопитающего Спирит, которая была найдена на юго-востоке острова. Седрик долгое время считался устойчивым к раку - инъекции двух линий опухолевых клеток не приводили к развитию болезни, однако после инъекции третьей линии он заболел. Животное умертвили в сентябре 2010 года. Когда специалисты обнаружили Спирит, она была при смерти из-за рака, и скончалась вскоре после того, как ее доставили в лабораторию.

Ученые сравнили ДНК Спирит, Седрика и ДНК клеток раковой опухоли Спирит. Исследователи обнаружили в геноме Седрика три мутации в генах, контролирующих деление клеток. Специалисты полагают, что эти гены могут хотя бы отчасти влиять на устойчивость животных к раку.

В настоящее время ученые пытаются спасти популяцию дьяволов, выращивая здоровых животных в лаборатории. Авторы новой работы показали, что генетическое разнообразие дьяволов чрезвычайно низко - оно составляет около 20 процентов от уровня генетического разнообразия людей. Резкое сокращение числа генетических вариаций стало следствием массового истребления дьяволов фермерами, которые опасались за свой скот.

Колоссальный научно-технический прогресс!

Как оно было Как оно стало

Продолжительность >3650 дней 3 дня

Стоимость 3 000 000 000 $ 2 000 $

Участники Сотни

лабораторий 1 человек

Качество 1 прочтение 100 прочтений

The Beijing Genomics Institute (BGI)

The next generation sequencing technology platform currently has 137 Illumina HiSeq 2000, and

27 AB SOLiDTM 4.0 Systems. Of each system already has internationally recognized sequencing for DNA, small RNA, transcriptome, digital expression profiling, ChIP-Seq, DNA methylation, target region capture, metagenomics sequencing, etc.. These techniques put scientific research, practice, service and other applications as a whole, and cover most of the important area in the genome science.

Нынешняя реальность

Its sequencing output is expected to soon surpass the equivalent

of more than 15,000 human genomes per year.

Применение метода массивного параллельного секвенирования

Геномное

• Секвенирование de novo • Ресеквенирование • Секвенирование экзома • Таргетное

секвенирование • Метагеномное

Транскриптомное

• Исследование разнообразия (нормализованная РНК)

• Исследование профиля экспрессии (количественное)

• Секвенирование малых РНК (miRNA)

Эпигеномное

• Chip-seq (транскрипционные факторы, модифицированные гистоны)

• Анализ метилирования

Технологии NGS существуют всего лишь несколько лет, и активно развиваются

Что будет лет через 10?

Клонирование - «получение идентичных копий»…

Копий – чего?

Клонирование генов, фрагментов ДНК…

Генетическая инженерия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

ПЦР

Как результат: «Технология включения генов»

1. Фундаментальные исследования – исследования экспрессии генов in vivo и in vitro

2. Прикладные исследования – триумфальное шествие генно- модифицированных организмов, разработка подходов генной терапии

Биотехнология – гено-модифицированные организмы

• Golden rice - ГМО рис с большим содержанием бета-каротина (витамин А), отсюда золотисто-жёлтый цвет

• Гены ответственные за продукцию бета-каротина были помещены под управление промотора, специфического для эндосперма.

• 100—150 г золотого риса удовлетворяло 60 % суточной потребности бета-каротина.

Ликвидация недостатка витамина А может привезти к ежегодному спасению 250’000-500’000 детей от слепоты и смерти.

Биотехнология – гено-модифицированные организмы

Патрик Мур один из основателей Greenpeace

Согласно его убеждениям, в какой-то момент Гринпис потерял свои цели защиты человечества и теперь это монстр с античеловеческим лицом. Пути Мура и Гринписа не просто разошлись, теперь Мур борется с Гринписом. По его словам, Гринпис это организация по торговле приятными ощущениями.

Клонирование организмов

Долли. 1996г.

Клонирование организмов

Клонирование организмов

Сиси (СС - english) от слова “copycat”…

Отличия в результате: соматических мутаций, эпигенетических изменений в ДНК, влияния окружающей среды и случайных отклонений, возникающих в ходе онтогенеза

Лилу, сверхсущество 200 тысяч хромосом

«Технология выключения генов»

Andrew Z. Fire & Craig C. Mello

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006:

"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

Nature 382, 713 - 716 (22 August 1996);

Repression of gene expression in the embryonic germ lineage of C. elegans Geraldine Seydoux*†, Craig C. Mello‡§, Jonathan Pettitt§ , William B. Wood , James R. Priess‡ & Andrew Fire* The distinction between soma and germline was recognized more than a century ago: somatic cells form the body of an organism, whereas germ cells serve to produce future generations1. In Caenorhabditis elegans, the separation of soma and germline occurs through a series of asymmetrical divisions, in which embryonic germline blastomeres divide unequally to produce one somatic daughter and one germline daughter2. Here we show that after each asymmetrical division, embryonically transcribed RNAs are detected in somatic, but not germline, blastomeres. This asymmetry depends on the activity of the germline-specific factor, PIE-1. In the absence of PIE-1, embryonically transcribed RNAs are detected in both somatic and germline blastomeres. Furthermore, ectopic expression of PIE-1 in somatic blastomeres can significantly reduce the accumulation of new transcripts in these cells. Taken together, these results suggest that germ-cell fate depends on an inhibitory mechanism that blocks new gene expression in the early embryonic germ lineage.

Как результат:

1. Фундаментальные исследования – возможность подавления экспрессии изучаемых генов, исследования их функции как in vivo и in vitro

2. Прикладные исследования – разработка подходов генной терапии

Очень успешно! - Более 50 тысяч публикаций!

Офтальмологические заболевания Инфекционные заболевания (гепатит, грипп, СПИД) Генетические заболевания Метаболические заболевания (Диабет II типа, ожирение) Респираторные заболевания (астма) Рак

Возрастная макулярная дегенерация – первый удачный опыт.

Индуцированные стволовые клетки

Индуцированные стволовые клетки

for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent

Рекомендованная литература:

Старые лекции здесь: http://bio.fizteh.ru/student/files/mol_biology/

• Любой учебник в котором рассматриваются процессы репликации, транскрипции, трансляции.

• Молекулярная биология клетки. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Издательство Мир.

• http://www.biology.org.ua/files/lib/Alberts_et_al_vol1.pdf