1

よ -

573& スゝ 573& )3&

よ

73&

0 ^ < I ⒢

57*894 /89 .(475 /89

* 2F %H F F FH

ゝ ㈻

┘

よ

㈻

㈻ スゝ

73& 73& 73&

73& )3&

よ

よ

さ

)3&

↓

73&

2

F F IF

)3& ぜ / <F 0F^

4[ G 5 F

┘

⒢ 73& ⒢

よ さ

よ

835

┞ 835 ┞

チ ⒢ ⒢

⒢ ┘

⒢

㈻

㈻ 73& ⒢ 73&

)3& ㌹ ⒢

ッ よ

よ

㈻ ┘ 々 ㌹

ゼ

┘

よ )3& 73&

73&

73F - ㈻ ㈻

┞ ┘ ↓

ぜ

3

53&

3 3 5 I

3 H H &H I 53& 53& ┞ )3& 73& <F ( H

53& )3& よ 9

)3& )3& Υ

53& )3& 9 Υ

53& ├

よ

　また、二重らせんを形成している )3&・)3& 錯体に 53& を添加すると、その塩基配列に応じて多彩な

三重鎖錯体が形成されることが報告された 。例えば )3&（ホモプリン配列）・)3&（ホモピリミジン）

錯体に、チミン塩基がリッチなホモピリミジン配列を有する一本鎖 53& を添加すると、ホモピリミジン

)3&鎖が 53&の添加により解離し、添加した 53&が相補的な )3&鎖と <F ( H 型塩基対（・で表す、

図 ）形成により鎖交換反応の起こった F I [F 型とよばれる 53&・)3&錯体を形成すると共に、

もう一本の 53&鎖が - 型水素結合により 53&・)3&二重らせん錯体と相互作用し、53&・)3&＊53&

型三重鎖錯体が形成される。

53& の代表的な優れた特性は、１）アミド骨格を有するためヌクレアーゼに対してはもちろん、プロテ

アーゼなどに対しても耐性を示し、高い酵素耐性ならびに化学的安定性、２）53&・)3&、53&・73& 錯体

共に天然核酸錯体に比較して非常に高い安定性、３）ミスマッチ塩基導入により大きく低下する錯体安

定性、すなわち高い塩基配列選択性、である。

　このように優れた特性・機能を示す 53& であるが、ポリアミド主鎖に複素環である核酸塩基をグラフ

トしたオリゴマーであると考えると当然ではあるが、水に対する溶解性が比較的低く、現実に用いられ

るのは 量体程度までで、自己会合性も強く疎水性に基づくタンパク質や酵素類との非特異的吸着も

無視できず、疎水性に起因すると考えられている膜透過性の欠如など深刻な問題も併せ持つ。またター

ゲット )3& 73& との錯体形成においても、53& の 3 末端、( 末端と )3& 73& 鎖の ’末端、 ’末端の方向

O B

OPO

–O

O

DNA PNA

NH

NO

OB

)

)

O B

O

P O–O

O

RNA

OH

Figure 1 DNA, PNA, and PNA. ↓

4

性に対する選択性が甘いことも報告され、アンチセンス分子として用いる場合に大きな問題点として指

摘されている。また、先に述べたがミスマッチ塩基の存在により 53&・)3& 錯体の安定性は大きく低下

し 9 は ~ ℃も低下するが、それでも )3&・)3& 錯体の 9 より高く、ミスマッチを有する 53&・)3&

錯体が、フルマッチ )3&・)3& 錯体より優先して生成してしまうという問題も抱えている。また、現実

的なアンチセンス 73&分子としての適応を考えると、53&・73&錯体が 73F -の基質となり錯体中の 73&

のみが 73F - により選択的に切断されることにより、触媒量のアンチセンス分子により効果的な抑制

効果を発現することが求められるが、53&・73& 錯体は 73F - の基質とはならないため触媒的には機能

できず、 73& と最低化学量論量の 53& の投与が必要なことが既に報告されている。このような 53& の有

する水溶性、核酸認識方向性の問題解決、低い細胞膜透過性の向上、高すぎる安定性の低減、73& との

錯体が 73F -の基質となることなどを実現するため、図１に示した種々の修飾 53&が報告されている 。

　53& のモノマ－は一時市販もされ、固相合成や自動合成機を用いて比較的簡便にオリゴマー合成が可

能で、さらに依頼合成でも目的オリゴマーを入手することも可能にもなり、細胞膜透過性や各位構成シ

グナルペプチドとのハイブリット合成などの盛んに研究されている。このため、化学者だけではなく、

生化学、バイオテクノロジーそして分子生物学を専門とする研究者でも、カスタム合成の )3& 73& と同

様に 53& を用いた研究に取り組める環境となり、53& を用いた遺伝情報発現制御に関する多数の報告も

なされている。

5

　このように 53& は数々の特性を有し、欠点を克服する 53& 誘導体の研究も精力的に行われている。と

ころが、従来報告されている 53&も含めたほとんどすべての核酸モデル・人工核酸は、ターゲット )3&・

73&といかに強く結合するか、9 の高い錯体を形成するかを目標として設計・合成に力が注がれてきた。

しかし、単純な一方向の錯体形成だけではなく、ターゲット )3&・73& との錯体形成・解離の可逆的制

御、すなわち認識・錯体形成能の外部因子・外部刺激による自在で、可逆的制御を実現する人工核酸が

開発されれば、アンチセンス治療においても抑制的制御のみならず、遺伝情報の発現・抑制の自在でよ

り積極的な制御が可能となり、アンチセンス分子の適用範囲の飛躍的拡大が期待される。また、核酸の

分子認識に基づく様々な機能材料への適用においても、材料機能の外部刺激・外部因子による

スイッチング制御が実現でき、人工核酸の材料展開も大幅に加速されることが期待される（図２）。

　このコンセプトを実現するためには、外部からの刺激や外部因子による核酸認識の可逆的制御、ター

ゲットとの錯体形成と解離制御が必要となる。最近、小宮山・浅沼によってリン酸ジエステル部位に、

NN

O

O

OOHHO

H

OP

O

O

HNHN

O

O

NN

N

NNHH

OO

OH

N

HN

O

O

NHN

O

O

OH

O B OHO OH

OP

O

O

NN

N

NNHH

OO

OH

Borate

pH / Temp./ Saccharide

U A

PRNA

U A

RNAPRNA-RNA Complex

anti syn

O

N

N

X

O

O OB

HO OH

OH3NN

N

X

HOOH

OH2N H

External Orientation Control

5'-NH-Proton

Free 2', 3'-OHanti syn

2', 3'-Cyclic Borate

H-bonding

NegativeCharge

+ Borax

– Borax

5'-NH2-Pyrimidine Ribonucleosides

4 4

73&

チ)3& ゝ

々 よよ

Figure 2 The schematic drawing of reversible control of recognition and complexation behavior of PRNA by borax.

（外部因子により可逆的に相補的核酸と錯体形成・解離制御可能な人工核酸に期待される機能）

6

アゾベンゼン誘導体を導入した修飾 )3& を用いて、紫外光・可視光照射による塩基配列特異的な二重鎖

および三重鎖錯体形成・解離制御ならびに、光によるポリメラーゼや 73F - 活性を制御する興味深い

論文が報告 されたが、これ以外には外部因子・外部刺激による可逆的な核酸認識機能を有する核酸モ

デルに関する報告、ならびにその方法論に関する報告さえほとんど見あたらない。

　このような背景を踏まえ、我々は次世代のアンチセンス分子としてターゲット核酸と安定な錯体を形

成するとともに、細胞内環境などの外部因子・外部刺激による可逆的な錯体形成・解離制御可能な人工

核酸開発に取り組んでいる。先にも述べたが可逆的な塩基部認識制御に関しては、これまでその方法論

さえ提案されていなかった。我々は、核酸の認識過程において塩基部の配向が重要であり、効果的な塩

基認識にはピリミジン塩基では 位カルボニル基が、プリン塩基の場合はピリミジン部が糖部の反対側

に存在する F 配向を優先する必要があり、逆の ^ 配向は塩基認識にとって不利で有ること、F

^ 塩基部配向は、糖部コンホメーションにより影響を受けることに注目した。すなわち、糖部 ’ ’

水酸基を有する核酸認識分子において、外部因子により糖部コンホメーション変化を誘起できれば、塩

基部の配向制御が可能となり、その結果として認識制御が期待できる（図２）。この観点から、外部因

子による塩基部配向制御、核酸認識制御に取り組んだ。そして 73& を核酸認識部位として導入したペプ

チドリボ核酸（ I G H H FH I 573&）と名付けた新しいカテゴリーの人工核酸を設計・合

成した 。先にも述べたように 73&は、)3&に比較して 73&、 73&、 73&などに代表されるように様々

な高次構造と多彩で高度な機能を発現することが知られ、その機能応用に注目が集まっている。しかし、

73& は ’ 水酸基に基づく骨格構造不安定性を示し、容易に加水分解を受け失活してしまうなどの本質的

で深刻な問題も抱えている。このため、73& を構成単位とする人工核酸は興味が持たれているが、これ

まで 73& を有する核酸モデル化合物はほとんど報告されていない。この点からも 573& はユニークな人

工核酸で、高度な機能を発現し、様々な応用研究が期待される。

　一般にピリミジンヌクレオシドの塩基部は溶液中で、塩基部 位カルボニル基と糖部アキシアル位水

素間の立体反発に基づき塩基認識に有利な F 配向を優先する。リボヌクレオシド糖部 水酸基

に架橋構造を有する H:25（ I ’ ’ H^H H F ）や .5:（ 4

^ I I ）などの誘導体では、塩基部 位カルボニル基と、糖部の立体障害が低減した

結果 ^ F 比が増加していることが報告されている。しかし、このようなヌクレオシド誘導体の場

合、共有結合により ^ 配向が優先されるため、外部因子により F ^ 配向の可逆的な変化を誘起

することは不可能である。

　我々はこの G H^H H 構造を有するフラノース構造が ^ F 比を増加させることに注目し、外部因

子により可逆的な G H^H H 構造形成・解離を制御出来れば、 ^ F の配向制御も可能になると考え

た。そして外部因子による ^ 配向の誘起を達成するため１）塩基部 位カルボニル酸素とフラノース

部 位水素間の水素結合形成、２）フラノース部 H ジオールとホウ酸類との G H^H H 架橋構

造形成の協同効果の利用を考案した（図２）。ホウ酸類は H ジオールと水中で可逆的にエステル

を形成することが知られている。リボヌクレオシドにおいても 位に H ジオールを有し、ホウ酸

エステル形成による糖部コンフォメーション変化に伴う塩基部の配向変化が期待される。さらにリボヌ

7

クレオシドの 位水酸基をアミノ基に変換した アミノ デオキシリボヌクレオシドを認識部位と

して用いる事により、効率よい糖部_核酸塩基間水素結合形成も期待される。この観点から 位水酸基

をアミノ基に変換した アミノ デオキシウリジン（ 3- : I）を合成し、塩基部配向を - 327 34*

スペクトルならびに円二色 () スペクトルにより検討した（図３）。

　リン酸緩衝液中での 3- : I のピリミジン塩基部 位水素の照射により、塩基部 位・糖部 位

水素に加えて糖部 そして 位水素にも核オー

バーハウザー効果（34*）に基づくピークが観測さ

れ、塩基部カルボニル部位が糖部の反対を向く F

配向を優先することが示唆された。一方、糖部

’ ’ H ジオールが、架橋構造を有する環状ホウ

酸エステルを形成するホウ酸存在下では、同じく塩

基部 位水素照射により塩基部 位水素・糖部

位水素にのみ 34* ピークが観測され、他の糖部水素

との 34* ピークは全て消失した。以上の事実は、ホ

ウ酸の添加により核酸塩基部が F から ^ 配向

優先に変化したことを明確に示唆している。すなわ

ち、 ’ アミノピリミジンリボヌクレオシドはホウ

酸類を外部因子として F ^ 塩基部配向制御可

能な分子であることが明らかとなった。

　さらに 3- : I の () スペクトルをホウ酸緩衝

液中で測定すると@θB F] 値は F 配向を示す

から、 ^ 配向に基づく にまで減少した（図 ）。すなわち、() スペクトルからもホウ酸類による

間の架橋構造形成、ならびに分子内水素結合形成の協同効果により、ホウ酸を外部因子とする効

果的な ^ 配向の誘起が実現出来ることが明らかになった。また、同じくピリミジン塩基を有し 水

酸基をアミノ基に変換した アミノ デオキシシチジンにおいても、同様にホウ酸類を外部因子と

して塩基部配向を F → ^ へと配向制御可能であることが示された。一方、 位水酸基が存在しない

アミノチミジンや、 位カルボニル基が存在しない アミノリボアデノシンや アミノイノシン

では、ホウ酸添加に伴う塩基部配向は全く観測されず、非常に構造特異性の高い配向制御法であること

が明らかとなった。表 に様々なヌクレオシド誘導体に対してホウ酸類添加による、可逆的塩基部配向

制御について検討した結果を示した。

0.0

[θ ]

x 10

-3/d

eg c

m2 d

mol

-1

10.0

- 5.0

5.0

Wavelength/nm350210 300250

Urd in phosphate buffer

Urd in borate buffer

5'-NH2-Urd in borate buffer

5'-NH2-Urd in borate buffer

Fig. 3 CD spectra of Urd and 5’-NH2-Urd in phosphate andborate buffer.（円二色スペクトルを用いた塩基部配向の観察。Anti 配向優先するウリジンでは大きな CD ピークを、syn 配向を優先 5’NH2-Urdでは小さな CDピークを示す。）

8

573& スゝ

573& スゝ

F с ^ さ

さ H

さ

さ ↓ )3& 73& ↓ 53&

↓

573& スゝ ]

573& スゝ

　 -PRNA -PRNA anti

Table 1 Anti-syn orientation of nucleosides and nucleoside derivatives anti syn

HO

HN

N O

O

O

HO NH2

2'-NH2-Urd

H2N O

HO

N

N

NH2

N

N

OH5'-NH2-Ado

HN

N O

OH3C

O

HO

HO

Thd

O

HO

HOO

N

N

NH2

HO O

HO

N

N

NH2

N

N

OHAdodCyd

O

O OB

HO OH

HN

N

NO

R

HO

HO

HOO

N

N

NH2

CydOH

HO

HN

N O

O

O

HO OH

Urd

5'-NH2-Urd (R = OH)5'-NH2-Cyd (R = NH2)

H2N

HN

N O

O

O

HO OH

5'-NH2-Urd

O

HO

H2NO

N

N

NH2

5'-NH2-CydOH

phosphate buffer (a)

borate buffer (b)

b/a (%)

[θ]ext5100 8400 9700 14200

1600 4900 7400 12200

31 58 75 86

phosphate buffer (a)

borate buffer (b)

b/a (%)

[θ]ext3400 700 -2100 -2100

3200 7100 -2500 -2200

94 101 119 105

7700

7200

94

NN

O

HO

HO OH

HN

N O

O

HN

O

N

O

HO

HO OH

HN

N O

O

HN

O

O

HNO

N O

HO OH

H

HN

N O

O

γ-PRNAα-PRNA

Figure 4 Structures of PRNAs.　（外部刺激応答性人工核酸 PRNAの構造）

9

syn 5’-1H-NMR NOE, CD

よ

┘ ぞ -

- ()

-

() F ^

-

() ’ ’ anti syn

pH

( ) pH 7.2 5.5 mM [θ]ext

anti syn pH 6.2 [θ]ext

syn anti pH 8.0 6.3

[θ]ext pH

573&

PRNA

RNA DNA ┞

さ Boc N

❻ ┞ PRNA

Boc

PRNA

㈻ Ⅴ 9-

(fluorenyl)methyloxycarbonyl (Fmoc) N ❻

┞ α-

Fmoc 20-30% (PPD) Fmoc

PRNA

PRNA

2’,3’-

+HCl

+NaOH

+HCl

5

0

100

50

% a

nti

Borax5.5mM

pH 7.2

pH 7.2

pH 6.2

pH 8.0

pH 6.3

0

[θ ]

x 10

-3/d

eg c

m2 d

mol

-1

pH Change

10

Figure 5. pH dependence of [θ]ext of PRNA monomercontaining uracil base in the presence of borax.（pH7.2- 6.2 の変化に伴う塩基部配向の可逆的制御）

10

α- Fmoc ┞ PRNA

┞ 24 PRNA

PRNA anti-syn CD,1NMR-NOE -PRNA 8

CD 260nm 6000 [θ] anti

PRNA 5'-

syn1H-NMR NOE PRNA

573& )3& よ

さ )3& 73& よ

┞ よ

573& + H ┞

573& よ 9 ┞

)3& :;

/ G 53& ┞

)3& ┞ 9

ふ 573& )3&

573& I & 9 )3&

9 Υ 573& ↓

573& ❻

↓ ❻ F F F F F

)3& 53&

)3&

573&

573& ┘ よ

NN

NN O

OPO O

HN

O

OHOH

N NN

O

O

NH

H

HH

O

O

HN

ON

HN

N

O

O

OH

O OBHO OH

ON

N

NN O

OPOO

NHH

Complexation Decomplexation

O

O

Borax +

Figure 6 Schematic drawing of complexation and decomplexation process of PRNA – DNA complex by borax.

（ホウ酸添加に伴う PRNA—DNA錯体の形成と解離の可逆的な制御）

11

573& )3&

573& )3& 9 ふ 573& )3&

よ )3& )3& 573& )3&

よ 573&

よ

よ 573& ^ )3&

)3&

573& ┞ )3&

よ

573& -

F с ^ 573& )3& -

よ :; 9

573& )3& 573& )3&

よ -

9 ふ ^ F

573& )3& 573& -

)3&

573& ㈻ - - )3& 73&

с ㈻ -

㈻ -

573& ^

㈻ 573& よ

573&

ぜ

ゝ

3 ㈻ 53&

573&

ッ ⒢

)3& チ

12

1) Lander, E. S.　et al., Nature 2001, 409, 860-921. (b) Venter, J. C., et al, SCIENCE 2001, 291,1304-1351.

2) For reviews, see: E. Uhlmann, A. Peyman, Chem. Rev. 1990, 90, 543. (c) M. Egholm, O. Buchardt, P. E>

Nielsen, R. H. Berg, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 9677.

3) Nucleic Acid Analogs (Syntheses and Properties), T. Wada, Y. Inaki, and K. Takemoto, The Polymeric

Materials Encyclopedia: Synthesis, Properties and Applications, J. C. Salamone and M. Lowell Eds., CRC

Press Inc., Boca Raton, FL, USA, 94-108 (1996).

4) (a) J. C. Venter, et al., Science 2001, 291, 1304; (b) E. S. Lander, et al., Nature 2001, 409, 860.

5) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 1991, 254, 1497.

6) (a) P. E. Nielsen, Acc. Chem. Res. 1999, 32, 624. (b) ℡♡ 60, 1179 (2002) (c)

63, No.1 (2005)

7) a) H. Asanuma, M. Komiyama, Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 2393; b) H. Asanuma, M. Komiyama,

Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2671; c) H. Asanuma, M. Komiyama, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1977. d)

H. Asanuma, M. Komiyama, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 11452.

T. Wada, N. Minamimoto, Y. Inaki, Y. Inoue, Chem Lett, 1998, 1025.

a) T. Wada, N. Minamimoto, Y. Inaki, Y. Inoue, Nucleic Acids Res. Symp. Ser, 1998, 39, 29;. b) T. Wada, N.

Minamimoto, H. Sato, Y. Inoue, Y. Nucleic Acids Res. Symp. Ser, 1999, 42, 145; c) T. Wada, N. Minamimoto,

Y. Inaki, Y. Inoue, Y. J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 6900; d) T. Wada, H. Sato, Y. Inoue, Nucleic Acids Res.

Suppl., 2001, 1, 45; e) H. Sato, Y. Hashimoto, T. Wada, Y. Inoue, Tetrahedron, 2003, 59, 7871.