На правах рукописи
Огородникова Виктория Юрьевна
ИЗМЕНЕНИЯ В ПЕРЕДНЕМ ОТРЕЗКЕ ГЛАЗА
ПРИ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПОТЕНЗИВНОЙ
ТЕРАПИИ ГЛАУКОМЫ
14.01.07 - Глазные болезни
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2014
2
Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Российский национальный исследовательский медицинский университет им.
Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Егоров Алексей Евгеньевич
Официальные оппоненты:
Алексеев Игорь Борисович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО
«Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава
России, профессор кафедры офтальмологии
Ходжаев Назир Сагдуллаевич, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ
«Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад.
С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения РФ, заведующий отделом по
научно-клинической работе с филиалами
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им.
Гельмгольца» Министерства здравоохранения РФ
Защита состоится «___» _____________2014 г. в 14 - 00 часов на заседании
диссертационного совета Д 001.040.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней»
Российской академии медицинских наук по адресу: 119021, г. Москва, ул.
Россолимо, д. 11, корп. Б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИГБ» РАМН.
Автореферат разослан «____»______________________ 2014 г
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук Иванов М.Н.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время глаукому принято рассматривать
как нейродегенеративное заболевание, характеризующееся ускоренной потерей
ганглионарных клеток сетчатки (ГКС) и их аксонов вследствие нарушения
процесса апоптоза с последующим развитием глаукомной оптической нейропатии
(Алексеев В.Н., 2005; Kong G.Y.X., 2009).
Запуск программы апоптоза может инициироваться множеством факторов.
Большинство из них реализуется за счет нарушения функции митохондрий. Роль
митохондриальной дисфункции в запуске программы апоптоза многолика (Wei
Y.H., 1998; Wei Y.H., 2001). Исследование таких нарушений при глаукоме,
учитывая объективные трудности дифференциальной диагностики между
физиологическими и патологическими изменениями, а также сложности
определения причин и следствий, наступающих последовательно, требует особого
внимания.
В настоящее время единственным патогенетически доказанным способом
замедления прогрессирования глаукомного процесса является понижение уровня
внутриглазного давления (ВГД) ниже толерантного. С этой целью длительное
время применяются местные гипотензивные препараты, которые могут оказывать
воздействие на глазную поверхность и структуры переднего отрезка глаза,
вызывая их изменение. Длительная местная гипотензивная терапия глаукомы
препаратами различных фармакологических групп неоднозначно влияет на
показатели пахиметрии роговицы (Kaminski S., 1998; Lass J.H., 2001; Inoue K.,
2003; Bafa M., 2009). Имеются данные о снижении эффективности
хирургического лечения глаукомы, а также повышенном риске развития
катаракты после продолжительного использования местных гипотензивных
препаратов (Broadway D.C., 1994; Baudouin C., 2008; Chandrasekaran S., 2009).
Значительное количество работ посвящено анализу изменений дренажной
системы при глаукоме и попыткам объяснить развитие заболевания в
сопоставлении с механической блокадой передних путей оттока вследствие
закупорки фильтрационных путей гранулами пигмента (Пригожина А.Л., 1966;
4
Нестеров А.П., 1971, 1974; Симакова Р.А., 1974; Смирнов В.Б., 1975; Lutjen-
Drecoll E. 1975). А последние годы состояние дренажной зоны рассматривается в
аспекте изменения пигментации под влиянием продолжительного применения
аналогов простагландинов (Tsai J.C, 2001; Grierson I., 2002; Сracknell K.P.B.,
2006).
Актуальность вышеуказанных фундаментальных вопросов определила цель и
задачи настоящего исследования.
Цель исследования: изучение изменений переднего отрезка глаза при
длительном применении гипотензивных средств у пациентов с первичной
открытоугольной глаукомой.
Задачи исследования:
1. Изучить клинические особенности пациентов с ПОУГ, находящихся на
диспансерном наблюдении.
2. Выявить динамику изменений слезопродукции и морфологических
особенностей роговой оболочки в норме и у больных глаукомой разных стадий,
получавших гипотензивную терапию.
3. Изучить особенности изменений трабекулярной сети пациентов с ПОУГ при
длительном применении гипотензивных средств.
4. Изучить состояние внутриклеточных включений и степень выраженности
апоптоза фибробластических клеток трабекулярной сети у больных глаукомой.
Научная новизна
Определены закономерности изменения роговицы на фоне длительного
применения местной гипотензивной терапии. С развитием заболевания
происходит изменение соотношения слоев роговицы - процентное отношение
толщины стромы при прогрессировании болезни уменьшается, а общая толщина
всей роговицы не имеет явной тенденции к истончению.
Установлено достоверное увеличение содержания гранул меланина в
трабекулярной сети пациентов, длительно получавших антиглаукомную
гипотензивную терапию с применением аналогов простагландинов.
5
Определена тенденция к усилению апоптоза фибробластических клеток
трабекулярной сети с прогрессированием заболевания у пациентов с глаукомой.
На далеко зашедших стадиях преобладали клетки, содержащие необратимо
апоптозно измененные ядра, а для ранних проявлений глаукомного процесса
было характерно маргинальное расположение ядерного хроматина.
Впервые в России для объективной оценки метаболических нарушений в
клетках трабекулярной сети был проведен иммунохимический анализ с
применением методики TUNEL.
Практическая значимость
Определено негативное влияние продолжительного применения местных
антиглаукомных препаратов на глазную поверхность и структуры переднего
отрезка глаза у пациентов с ПОУГ. С увеличением количества применяемых
пациентами местных гипотензивных препаратов происходит снижение
слезопродукции и уменьшение плотности эндотелиальных клеток роговицы.
Определена взаимосвязь между степенью пигментации трабекулярной сети и
режимом антиглаукомных гипотензивных инстилляций. Длительное применение
комбинированной терапии с назначением аналогов простагландинов вызывает
усиление пигментации трабекулярной сети.
Определены вариабельность выраженности апоптоза в клетках трабекулярной
сети и его взаимосвязь со стадией болезни. С прогрессированием ПОУГ
происходит усиление апоптоза клеток и преобладание необратимых изменений
клеточных органелл.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Длительное применение местных антиглаукомных препаратов способно
неблагоприятно влиять на структуры переднего отрезка глаза, вызывая
снижение слезопродукции, уменьшение толщины стромы роговицы в
оптической части и снижение плотности эндотелиальных клеток роговицы.
2. Комбинированная антиглаукомная терапия, включающая препараты группы
простагландинов при длительном применении может приводить к усилению
пигментации дренажной зоны глаза.
6
3. Прогрессирование глаукомного процесса сопровождается необратимыми
метаболическими нарушениями и выраженным апоптозом клеток дренажной
зоны глаза.
Внедрение результатов исследования
Разработанные методики используются в практической работе ФКГУ
«Медицинский учебно-научный клинический центр им. П.В. Мандрыка» МО РФ
(г. Москва); учебном процессе на кафедрах офтальмологии лечебного факультета
ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский
университет им. Н.И. Пирогова (г. Москва) и Курского государственного
медицинского университета.
Апробация работы
Результаты работы доложены и обсуждены на следующих мероприятиях:
V, IV Всемирный глаукомный конгресс (Бостон, 2009; Париж, 2011), VII, VIII
международная конференция «Глаукома: теории, тенденции, технологии»
(Москва, 2009, 2010), круглый стол, посвященный 65-летию Победы и 65-летию
ЛДЦ ГШ 2-го ЦВКГ им. П.В. Мандрыка (Москва, 2010), IX Конгресс
Европейского глаукомного общества (Мадрид, 2010), V юбилейная конференция
Глаукома: теория и практика (Санкт-Петербург, 2012), Научно-практическая
конференция по офтальмохирургии с международным участием «Восток-Запад»
(Уфа, 2012), Межрегиональная научно-практическая конференция «Актуальные
вопросы офтальмологии», посвященная 90-летию офтальмологической службы
Омской области (Омск, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 23 работы в виде статей и тезисов
докладов, в том числе 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК; 2 – в зарубежных
изданиях.
Объем и структура диссертационной работы
Диссертационная работа изложена на 122 странице машинописи, состоит из
оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, двух глав
собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций.
7
Список литературы состоит из 52 отечественных работ и 104 зарубежных
источников. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 21 рисунком.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования
Работа выполнена на клинической базе кафедры офтальмологии им. акад.
А.П. Нестерова лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный
исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова»,
офтальмологических отделений ФКГУ «Медицинский учебно-научный
клинический центр имени П.В. Мандрыка» МО РФ и Городской клинической
больницы № 15 им. О.М. Филатова. Во временных рамках 2009-2012 гг. был
выполнен цикл работ, разделенный на хронометрически независимые
промежутки. Всего в рамках научного исследования было 4 (четыре) клинические
работы.
Всего в работу было включено 206 пациентов (266 глаз) с
диагностированной ранее «первичной открытоугольной глаукомой»,
составившими основную группу (группа 1), диагноз которых был верифицирован
в соответствии с системой дифференциальной диагностики заболеваний и
подтвержден специальными методами диагностики; и пациентов без глаукомы (с
сопутствующим диагнозом «начальная старческая катаракта» или «фоновой
ретинопатией и ретинальными сосудистыми изменениями» и остротой зрения не
ниже 0,6), составившие контрольную группу (группа 2). Детальные
характеристики пациентов приведены в таблице 1. Наибольше число
обследованных пациентов приходится на группу больных с ПОУГ (МЭС
H40.1/067.100) - 186 человек (90,3%). Число пациентов контрольной группы
(МЭС Н25.1/067.130 и Н35.0 /067.040) было 20 человек (9,7%). Очевидное
численное неравенство между группами объясняется особенностями проводимых
исследований. Общий средний возраст больных глаукомой составил 70,88±8,96
лет, пациентов контрольной группы - 71,5±7,5 лет (р>0,05). В дальнейшем, когда
анализ проводился по подгруппам, учитывая различные стадии заболевания и
8
этапы работы, статистически значимые отличия были установлены, что нашло
свое отражение в главе «Результаты исследования и их обсуждение».
Таблица 1
Характеристики обследуемых групп по возрасту и полу, n=206
Группы
пациентов Диагноз
Число
больных/
глаз
(абс.)
Мужчины Женщины
Возраст
(лет, Mσ) абс. % абс. %
Группа 1 ПОУГ 186/226 111 59,6 75 40,4 70,88±8,96
Группа 2 контроль 20/40 10 50 10 50 71,5±7,5
Всего: 206/266 121 58,7 85 41,3 70,91±8,89
M – среднее значение, σ – среднеквадратичное отклонение, n-количество пациентов.
В соответствие с целями проводимых исследований группа пациентов
ПОУГ была подразделена на 4 подгруппы (табл. 2).
Подгруппа 1.1. была набрана с целью исследования изменений глазной
поверхности при продолжительном применении местных антиглаукомных
препаратов. В подгруппе 1.2. было проведено изучение пигментации
трабекулярной сети под влиянием длительного применения антиглаукомных
препаратов. Изучение состояния митохондрий и апоптоза клеток трабекулярной
сети у пациентов с ПОУГ было выполнено в подгруппе 1.3. Для оценки степени
выраженности апоптоза клеток дренажной зоны у пациентов с продвинутыми
стадиями ПОУГ были отобраны пациенты, составившие подгруппу 1.4.
Обследование пациентов проводилось по стандартной схеме, включающей
информацию о жалобах, сбор анамнеза, рутинное офтальмологическое
обследование (рефрактометрия, определение остроты зрения с допустимой
коррекцией аметропии, биомикроскопия, тонометрия, гониоскопия,
офтальмоскопия). В соответствие с целями работы были выполнены
дополнительные методы исследования: статическая периметрия Humphrey (Zeiss
Meditec, Германия-США), конфокальная микроскопия роговицы с
использованием роговичного модуля конфокального лазерного сканирующего
офтальмоскопа HRT-III (Heidelberg Engineering, Германия), тест Ширмера. На
отдельных этапах работы применялись специальные методы обследования
9
образцов ткани трабекулярной сети пациентов с ПОУГ, полученных
интраоперационно в ходе проведения хирургического антиглаукомного
вмешательства.
Таблица 2
Общие характеристики группы пациентов с ПОУГ, n=206
Группы
пациентов
Кол-во
больных/
глаз,
абс.
Мужчины Женщины Возраст,
лет
(M±σ) абс. % абс. %
Подгруппа
1.1.1 40/80 20 50 20 50 68,1±10,1
Подгруппа
1.2.2 80/80 52 65 28 35 72,6 ± 8,6
Подгруппа
1.3.3 40/40 24 60 16 40 73,5±7,1
Подгруппа
1.4.4 26/26 15 61 11 39 69,25±8,04
М - среднее значение, σ - среднеквадратичное отклонение, n-количество пациентов. 1исследование изменений глазной поверхности при продолжительном применении местных
антиглаукомных препаратов; 2изучение пигментации трабекулярной сети под влиянием
длительного применения антиглаукомных препаратов; 3изучение состояния митохондрий и
апоптоза клеток трабекулярной сети у пациентов с ПОУГ; 4оценка степени выраженности
апоптоза клеток дренажной зоны у пациентов с продвинутыми стадиями ПОУГ.
Гистологическое исследование, анализ которого выполнялся с помощью
системы, включающей микроскоп ZESS AXIO Imager A1, телекамеру ProgRes
C14plus, компьютер под управлением операционной системы Windows XP с
программным обеспечением MS Office XP Professional, Adobe Photoshop CS3
Extended, Corel Draw X3. Такая система позволяла измерять размеры целевого
объекта в миллиметрах, а не в пикселях. В расчетах фиксировались площадь
ткани и площадь меланина, и далее вычислялось отношение этих двух параметров
- процент меланина исследуемого образца.
Электронная микроскопия выполнялась на микроскопе JEM 1200 EX (JEOL,
Япония). Анализ полученных данных осуществлялся специалистом визуально.
Иммунохимическое исследование выполнялось по двум методикам:
окрашивание образцов ткани ядерным красителем Hoechst 33342, позволяющем
визуализировать ядра всех клеток, а для выявления апоптотических клеток по
10
разрывам их ДНК, применяли метод TUNEL, используя набор реагентов фирмы
Promega (Dead End Fluorometric TUNEL System, Promega, США). Анализ
проводился с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM RXA2
(Германия), оснащенного набором светофильтров, компьютерной приставкой и
программой Leica for Windows (Германия). Изображения анализировались с
помощью компьютерных программ Adobe Photoshop CS3 Extended, Corel Draw
X3.
Все результаты вносились в память персонального компьютера с
последующим статистической обработкой (программа Statistica, версия 6.0,
StatSoft, Inc., Австралия-США), с использованием лицензионного программного
обеспечения.
Основные результаты и их обсуждение
Первой была выполнена работа, целью которой стало выявление
закономерностей изменений глазной поверхности в норме и у больных глаукомой
разных возрастных групп. В исследовании учтены данные подгруппы 1.1. (n=40)
и группы 2 (n=20). Для проведения статистического анализа были использованы
следующие характеристики: тест Ширмера, толщина роговицы в оптической зоне,
толщина стромы, количество клеток эндотелия, представленные в таблице 3.
Уровень офтальмотонуса всех обследованных был компенсирован и оставлял
16,5±3,5 мм рт.ст. на начальной стадии, 15,1±1,5 мм рт.ст. на развитой стадии,
14,7±2,6 мм рт.ст. на далеко зашедшей стадии глаукомы и 15,4±2,0 мм рт.ст. в
группе контроля. Статистически достоверной разницы между этими показателями
обнаружено не было (p>0,05).
Были обнаружены достоверные отличия показателей теста Ширмера у
пациентов с начальной и далеко зашедшей стадиями: угнетение слезопродукции
на III стадии было более выражено (19,0±11,9 мм против 11,0±3,4 мм, р=0,003).
Изменения показателя слезопродукции на развитой стадии ПОУГ и в
контрольной группе были недостоверные (р>0,05).
Толщина роговицы в оптической зоне у пациентов с начальной глаукомой
достоверно отличалась от таковой на продвинутых стадиях (начальная стадия -
11
508,0±32,0 мкм, развитая - 537,9±43,1 мкм, далеко зашедшая - 536,0±28,5 мкм,
р=0,04 и р=0,02). Получив противоречивые с литературными данными значения
толщины роговицы в ее центральной зоне (ЦТР) I и III стадий, мы решили
изучить другие ее характеристики, а именно процентное отношение толщины
стромы ко всей толщине. Эта величина уменьшалась и была достоверно выше в
группе контроля (89,9%) и начальной стадии ПОУГ (87,2%) в сравнении с
развитой (84,7%) и далеко зашедшей (84,0%) стадиями заболевания (р=0,05).
Изменения количества эндотелиоцитов были статистически значимыми между
начальными и продвинутыми стадиями глаукомы (2693,7±471,1 кл/мм2,
2428,6±476,51 кл/мм2, 2124,7±448,7 кл/мм2, р=0,02 и р=0,003), а также между II и
III стадиями глаукомы (р=0,03).
Таблица 3
Показатели исследования слезопродукции и роговицы, M±σ
Основные
показатели
ПОУГ (подгруппа 1.1.) Норма
(группа 2),
n=40 I ст.,
n=30
II ст.,
n=26
III ст.,
n=24
Тест Ширмера (мм) 19,0±11,91 8,3±4,1 11,0±3,4 8,3±4,3
ЦТР (мкм) 508,0±32,0 537,9±43,12 536,0±28,53 534,0±37,8
Строма (мкм) 443,2±35,2 455,5±54,2 450,6±42,1 480,3±36,8
Строма (%) 87,24 84,74 84,04 89,9
Клетки эндотелия
(кл/мм2) 2693,7±471,15 2428,6±476,56 2124,7±448,77 2798±267,6
М - среднее значение, σ - среднеквадратичное отклонение; n - количество глаз;
1р=0,003 в сравнении с ПОУГ III; 2р=0,04 в сравнении с ПОУГ I; 3р=0,02 в сравнении с ПОУГ I; 4р=0,05; 5р=0,02 в сравнении с ПОУГ II; 6р=0,03 в сравнении с ПОУГ III; 7р=0,003 в сравнении с
ПОУГ I.
Для дифференциальной диагностики изменений глазной поверхности
параметры пациентов были разделены в зависимости от характера
инстилляционых назначений - комбинированная терапия с препаратами
простагландинового ряда и другие комбинации гипотензивных средств. В таблице
4 представлены базовые характеристики пациентов, получавших разные
комбинации местных антиглаукомных препаратов.
12
У пациентов, в режим инстилляций которых были включены аналоги
простагландинов (ПГ), установлены статистически значимые отличия средних
значений теста Ширмера (9,0±2,8 мм против 14,6±8,1 мм, р=0,003) и значимые
отличия средних значений ЦТР при сравнении с данными пациентов, в режим
инстилляций которых входили другие препараты (514,8±27,7 мкм против
537,1±35,7 мкм соответственно, р=0,04).
Таблица 4
Показатели исследования слезопродукции и роговицы у пациентов в зависимости
от получаемой ими антиглаукомной терапии, M±σ
Основные
показатели
Комбинации
с аналогами ПГ,
n=48
Комбинации с ИКА,
n=32
Тест Ширмера (мм) 9,0±2,8 14,6±8,11
ЦТР (мкм) 514,8±27,7 537,1±35,72
Клетки зндотелия
(кл/мм2) 2583,7±271,1 2493,7±354,63
М - среднее значение, σ - среднеквадратичное отклонение; n - количество глаз;
1р=0,003 по сравнению с группой пациентов, получавших аналоги ПГ; 2р=0,04 по сравнению с
группой пациентов, получавших аналоги ПГ; 3р>0,05 по сравнению с группой пациентов,
получавших аналоги ПГ.
План исследования включал определение статистической достоверности
рассчитанных параметров. С целью детализации результатов корреляционный
анализ был проведен отдельно для каждой стадии ПОУГ. В таблице 5 указаны
показатели корреляции в целом для всех стадий и в некоторых случаях
статистически значимые - для отдельных стадий глаукомы.
Таблица 5
Взаимосвязь параметров глазной поверхности, возраста пациентов, длительности
анамнеза заболевания, стадии ПОУГ и количества используемых препаратов, (r)
Возраст Длительность
заболевания Стадия ПОУГ
Кол-во
препаратов
Тест Ширмера -0,5* -0,15 -0,22 -0,4*/-0,61*
ЦТР 0,7*/0,762* -0,02 -0,2 -0,4
Клетки эндотелия
-0,17 -0,67*/-0,792* -0,5* -0,38*/-0,623*
1начальная стадия ПОУГ, 2развитая стадия ПОУГ, 3далеко зашедшая стадия ПОУГ; *р<0,05
13
При проведении линейного корреляционного анализа (таблица 5) в группе
пациентов с ПОУГ была выявлена умеренная отрицательная корреляция между
такими показателями как возраст пациентов и тест Ширмера (r=-0,5, р<0,05). С
увеличением числа препаратов, получаемых пациентами, было отмечено
снижение показателей слезопродукции (r=-0,4, р<0,05). Пациентам с начальной
стадией заболевания было присуще снижение показателей теста Ширмера с
усилением режима гипотензивной терапии (r=-0,6, р<0,05), чего, однако, не
наблюдалось при развитой и далеко зашедшей стадиях. Была выявлена умеренная
и сильная отрицательная корреляция между такими показателями как количество
клеток эндотелия - длительность анамнеза (r=-0,67, р<0,05) и стадия заболевания
(r=-0,5, р<0,05). С увеличением числа препаратов, получаемых пациентами, было
отмечено снижение количества эндотелиоцитов (r=-0,38, p<0,05). На развитой
стадии ПОУГ обнаружена сильная корреляция длительности анамнеза с
количеством эндотелиальных клеток (r=-0,79, р<0,05). Далеко зашедшая стадия
характеризовалась умеренной отрицательной корреляцией между количеством
клеток эндотелия и числом используемых препаратов (r=-0,62, р<0,05).
В подгруппе 1.2 (n=80) выполнена работа с целью изучения пигментации
трабекулярной сети пациентов с ПОУГ при длительном применении различных
классов антиглаукомных препаратов. В исследование включены данные
пациентов, поступившие на оперативное лечение в связи с отсутствием
стабилизации зрительных функций. Средний уровень офтальмотонуса в
подгруппе составил 25,2±1,7 мм рт.ст. Всем пациентам была выполнена
модификация антиглаукомной проникающей операции. В ходе оперативного
вмешательства был удален участок трабекулы, который затем подвергался
гистологическому исследованию с помощью светового микроскопа. После
обработки изображений с помощью специально адаптированных программ были
вычислены следующие параметры: площадь ткани, площадь меланина и их
отношение - процент меланина исследуемого образца. Результаты представлены в
таблице 6.
14
Среднее процентное содержание меланина в группе комбинированной
терапии с ПГ на I, II, III стадиях составило соответственно 11,3±13,2%,
10,6±10,3%, 10,6±6,2%. Отмечена статистически значимая разница между
содержанием меланина в группе пациентов с далеко зашедшей глаукомой,
получавших комбинированную терапию с ингибиторами карбоангидразы (ИКА) и
группой пациентов, получавших комбинированную терапию с включением ПГ
(соответственно 4,2 ± 3,5% и 10,6 ± 6,2%, p<0,01).
Таблица 6
Морфологические характеристики трабекулярной сети, M±σ
Cреднее
значение
Группа
пациентов
S
ткани
(мм2)
S
меланина
(мм2)
%
меланина
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с ИКА (III
ст.), n=20
0,025 ± 0,018 0,001 ± 0,001 * 4,2 ± 3,5
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с ПГ (I ст.),
n=20
0,02 ± 0,01 0,003 ± 0,006 11,3 ± 13,2
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с ПГ (II ст.),
n=20
0,02 ± 0,005 0,002 ± 0,001 10,06 ± 10,3
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с ПГ (III ст.),
n=20
0,009 ± 0,008 0,0008± 0,0007 *10,6 ± 6,2
М - среднее значение, σ - среднеквадратичное отклонение, n – количество глаз, *р<0,05
Кроме того, был использован параметрический корреляционный анализ (r)
для оценки взаимосвязи между гистологическими параметрами трабекулярной
сети, возрастом пациентов, сроками установленного диагноза, применяемой
терапии. Результаты приведены в таблице 7.
15
Таблица 7
Корреляционные характеристики исследуемых параметров, (r)
Параметры
Группы
Возраст/
S меланина
Возраст/
S ткани
Возраст/
% пигмента
Длительность
анамнеза/
S меланина
Длительность
анамнеза/
S ткани
Длительность
анамнеза/
% пигмента
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с
ИКА (III ст.),
n=20
0,24 -0,73 0,29 -0,57* 0,34 -0,47*
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с ПГ
(I ст.), n=20
-0,82 0,19 -0,81* 0,4 -0,97 0,29
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с ПГ
(II ст.), n=20
0,6 0,2 0,79* -0,06 -0,39 0,42
Комбинированная
терапия
β-блокаторы с ПГ
(III ст.), n=20
0,02 0,06 -0,29 -0,34 0,28 0,39*
*р<0,05; n - количество глаз.
Выявлена сильная отрицательная корреляция между возрастом пациентов и
содержанием меланина в трабекулярной сети на I стадии заболевания при
применении комбинированной терапии с ПГ (r=-0,81, р<0,05), т.е., чем старше
пациент, тем менее выражена пигментация. Сильная положительная корреляция
обнаружена между возрастом пациентов и содержанием меланина в той же группе
на II стадии (r=0,79, р<0,05), т.е. на развитой стадии глаукомы пигментация
увеличивается с возрастом.
Умеренная положительная корреляция с длительностью анамнеза
определена для пациентов с далеко зашедшей стадией глаукомы, получавших
комбинацию препаратов с применением ПГ (r=0,39, р<0,05), т.е. длительный
анамнез глаукомы приводит к усилению пигментации трабекулярной сети.
Умеренная отрицательная корреляция найдена при анализе зависимости
длительности анамнеза заболевания и площади меланина у больных с далеко
зашедшей стадией глаукомы, получавших комбинированную терапию: β-
блокаторы с ИКА (r=-0,57, р<0,05) и длительностью анамнеза и относительным
16
количеством меланина у этих же пациентов (r=-0,47, р<0,05), т.е. длительность
анамнеза заболевания не влияла на степень пигментации трабекулярной сети
пациентов этой группы.
Для проведения третьего этапа исследования были использованы данные
пациентов подгруппы 1.3 (n=40), длительно получавших местную
гипотензивную терапию (бета-блокаторы, аналоги простагландинов и ингибиторы
карбоангидразы) при максимально переносимом режиме инстилляций,
поступивших на оперативное лечение в связи с отсутствием компенсации
офтальмотонуса и стабилизации зрительных функций. Уровень ВГД пациентов с
развитой стадией глаукомы составил 25,2±2,1 мм рт.ст., с далеко зашедшей
стадией - 24,3±2,5 мм рт.ст.
На этом этапе было проведено изучение состояния митохондрий и степени
выраженности апоптоза клеток трабекулярной сети у больных глаукомой. В ходе
проведенного оперативного вмешательства был удален участок трабекулы,
который подвергался обработке и оценке с помощью электронного микроскопа.
При электронно-микроскопическом исследовании фрагментов трабекулярной
сети пациентов с развитой и далеко зашедшей стадиями глаукомы были
обнаружены признаки дистрофических изменений дренажной зоны: разрежение
межклеточного пространства, уплотнение зон контакта между продольными и
поперечными коллагеновыми волокнами, значительное содержание пигментных
гранул в цитоплазме фибробластических клеток. В образцах визуализировалось
большое количество разрушенных митохондрий, увеличенных в размерах, с
дезорганизованными кристами, просветленным матриксом. Во фрагментах
трабекулярной сети пациентов с далеко зашедшей стадией глаукомы
митохондрии обнаруживались реже. Значительное количество клеток в
состоянии апоптоза. В развитой стадии преобладало маргинальное расположение
хроматина ядра, характерное для начальных проявлений апоптоза. Фрагментация
ядра была зафиксирована в далеко зашедшей стадии глаукомы.
В четвертой клинической части работы оценивалась степень выраженности
апоптоза клеток дренажной зоны пациентов с различными стадиями первичной
17
открытоугольной глаукомы. В итоговый протокол были включены данные
пациентов подгруппы 1.4. (n=26), длительно получавших антиглаукомную
гипотензивную терапию (бета-блокаторы, аналоги простагландинов и местные
ингибиторы карбоангидразы) при максимально переносимом режиме
инстилляций, и поступившие на оперативное лечение в связи с отсутствием
компенсации офтальмотонуса и стабилизации зрительных функций. Средний
уровень внутриглазного давления в подгруппе составил 24,4±4,5 мм рт.ст. у
пациентов с развитой стадией и 24,4±4,34 мм рт.ст. у пациентов с далеко
зашедщей стадией глаукомы. Всем пациентам была выполнена антиглаукомная
операция проникающего типа. В ходе хирургического вмешательства удален
склерально-трабекулярный комплекс, который затем был подвергнут
иммунохимическому анализу. После обработки изображений дренажной зоны и
подсчета клеток при помощи специально адаптированных программ, было
вычислено процентное отношение апоптозных клеток к их общему числу.
В таблице 8 представлены средние данные для пациентов развитой и далеко
зашедшей стадий.
Таблица 8
Морфологические характеристики дренажной зоны, М±σ
Среднее
значение
Группа
пациентов
Общее кол-во клеток,
абс.
Кол-во апоптозных
клеток,
абс.
Апоптозные
клетки,
%
ПОУГ II ст.,
n=12 197,20±143,41 59,80±62,83 23,95±12,30*
ПОУГ III ст.,
n=14 143,42±76,22 34,57±15,46 25,34±7,70*
Средние данные 165,83±106,84 45,08±41,45 24,76±9,37
М – среднее значение, σ – среднеквадратичное отклонение, n - количество глаз, *р>0,05
Обнаружено, что различия в относительном количестве апоптозных клеток
(%) у пациентов с развитой и далеко зашедшей стадиями глаукомы были
статистически недостоверны (23,95±12,30 и 25,34±7,70, p>0,05).
18
При проведении корреляционного анализа на развитой стадии ПОУГ
выявлена умеренная положительная корреляция возраста пациентов с
количеством апоптозных клеток (r=0,57, р<0,05), а на далеко зашедшей -
умеренная положительная корреляция количества апоптозных клеток с
длительностью глаукомного анамнеза (r=0,55, р<0,05).
Выводы
1. Особенностями исследуемой выборки пациентов с ПОУГ, включённых в
исследование, были: пожилой и старческий возраст (средний возраст
70,88±8,96 лет), что выше в сравнении со средней продолжительностью жизни
в Российской Федерации по состоянию на 2011 г.; преобладание мужчин
(61,8%), что отличается от общепринятых статистических данных,
указывающих на более частую встречаемость ПОУГ у женщин.
2. Выявлены факторы, оказывающие отрицательное влияние на показатели
слезопродукции: возраст пациентов (r=-0,5, р<0,05) и количество
применяемых антиглаукомных препаратов (r=-0,4, р<0,05). Показатели
слезопродукции у пациентов с начальной стадией глаукомы были выше, чем у
больных с далеко зашедшей стадией (19,0±11,9 мм и 11,0±3,4 мм, р=0,003).
Соотношение толщины стромы роговицы с ее остальными слоями
уменьшалось от стадии к стадии. Обнаружено, что вместе с
прогрессированием заболевания происходит уменьшение плотности
эндотелиального слоя роговой оболочки: на начальной стадии количество
эндотелиальных клеток составило 2693,7±471,1кл/мм2, на развитой -
2428,6±476,5 кл/мм2, на далеко зашедшей - 2124,7±448,7кл/мм2, в группе
контроля - 2798±267,6 кл/мм2 (р<0,05).
3. Пациенты, длительное время получавшие комбинированный режим
инстилляций, включающий бета-адреноблокаторы и аналоги простагландинов,
имели достоверные отличия в средних значениях теста Ширмера (9,0±2,8 мм и
14,6±8,1 мм, р=0,003) и данных пахиметрии (514,8±27,7 мкм и 537,1±35,7 мкм,
р=0,04), по сравнению с результатами группы пациентов, получавших
19
комбинированную терапию с бета-адреноблокаторами и ингибиторами
карбоангидразы.
4. Обнаружено меньшее количество меланина в трабекулярной сети на далеко
зашедшей стадии глаукомы у пациентов, получавших комбинированную
терапию, включавшую ингибиторы карбоангидразы, по сравнению с группой
больных, получавших комбинированную терапию, включавшую
простагландины (4,2±3,5% и 10,6±6,2%, p<0,01).
5. Обнаружены признаки нарушения энергетической функции клеток
трабекулярной сети с различными стадиями апоптоза у пациентов с
продвинутыми стадиями глаукомы. Иммунохимический анализ образцов
дренажной зоны не выявил статистически значимых различий в количестве
апоптозных клеток у пациентов с развитой и далеко зашедшей стадиями
глаукомы (23,95±12,30% и 25,34±7,70%, p>0,05). У пациентов с развитой
стадией глаукомы была установлена умеренная положительная корреляция
между количеством апоптозных клеток и возрастом (r=0,57, р<0,05), а при
далеко зашедшей стадии такая корреляция была установлена с длительностью
глаукомного анамнеза (r=0,55, р<0,05).
Практические рекомендации
1. Предлагается рекомендовать пациентам, длительно получающим местную
гипотензивную терапию, в режим инстилляций включать препараты -
заменители слезы и средства, улучшающие эпителизацию роговицы.
2. Для предотвращения возможной избыточной пигментации трабекулярной сети
у пациентов с далеко зашедшей стадией глаукомы выбором медикаментозной
терапии является комбинация препаратов β-блокаторов и ингибиторов
карбоангидразы.
3. Для проведения объективного анализа изображений, полученных с помощью
световой микроскопии и иммунохимических исследований, рекомендовано
использование специально адаптированных программ Adobe Photoshop CS3
Extended, Corel Draw X3.
20
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова. Бета-блокаторы в терапии первичной
открытоугольной глаукомы: преимущества и недостатки // Глаукома: теории,
тенденции, технологии: Сб. научн. ст. конф.- М., 2008. - С.355-370.
2. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова. Бета-блокаторы в терапии первичной
открытоугольной глаукомы. Преимущества и недостатки. Обзор //
Офтальмология.- 2008.- №4.- С.4-17.
3. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, В.В. Городничий, Е.Б. Цалкина, М.А.
Маканин, А.Н. Петров. Медикаментозно-индуцированное «пигментное
поражение» трабекулы при длительном применении отдельных классов
антиглаукомных препаратов (предварительное сообщение) //
Офтальмология.- 2009.- №4.- С.33-36.
4. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, В.В. Городничий, Е.Б. Цалкина, М.А.
Маканин, А.Н. Петров. К вопросу об изменении трабекулярной сети
пациентов с глаукомой, длительно получавших гипотензивную терапию //
Глаукома: теория и практика: Регион. конф.: Сб. научн. труд.- СПб., 2010.-
С.60-64.
5. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, В.В. Городничий, Е.Б. Цалкина, М.А.
Маканин, А.Н. Петров. Гистологические исследования трабекулы у пациентов
с глаукомой на фоне продолжительной инстилляционной терапии // Совр.
техн. реабил. больн. глаукомой в Центр.-Азиатск. регионе: Научн.-практ.
конф.: Материалы.- Алматы, 2010.- С.75-77.
6. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, В.В. Городничий, Е.Б. Цалкина, М.А.
Маканин, А.Н. Петров. Электронно-микроскопические исследования
трабекулярной сети пациентов с глаукомой длительное время получавших
комбинированную терапию // IX Всероссийск. школа офтальмол.: Сб. научн.
труд. - М., 2010.- С.85-89.
7. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, В.В. Городничий, Е.Б. Цалкина, М.А.
Маканин, А.Н. Петров. О влиянии комбинированных антиглаукомных
препаратов на структурные характеристики трабекулярной сети // Новые
технол. в офтальмол.: Сб. научн. ст.- Казань, 2010.- С.103-106.
8. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, В.В. Городничий, Е.Б. Цалкина, М.А.
Маканин, А.Н. Петров. Структурные характеристики трабекулярной сети у
пациентов с глаукомой на фоне продолжительной инстилляционной терапии //
Восток-Запад: Межд. научн.-практ. конф. по офтальмохирург.: Сб. научн.
труд.- Уфа, 2010.- С.199-201.
9. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова. Состояние отдельных внутриглазных
структур у больных глаукомой на фоне применения инстилляционных форм
21
антиглаукомных препаратов // Глаукома. Журн. НИИ ГБ РАМН.- 2010.-
№2.- С.50-54.
10. Е.А. Егоров, А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, М.А. Маканин, А.Н. Петров.
Медикаментозно-индуцированное «пигментное поражение» трабекулы при
длительном применении отдельных классов антиглаукомных препаратов //
Съезд офтальмол. России IX-й: Тез. докл.- М., 2010.- С.146.
11. V. Ogorodnikova, V. Gorodnichy, E. Tsalkina, M. Makanin, A. Kuroyedov.
Medical induced pigmentary affection trabecular meshwork of long-term exposure
to topical intraocular pressure lowering medicines (preliminary report) // Book of
Absracts IX EGS Congress.- Madrid, Spain, 2010.- P.65. (E-absract).
12. А.Е. Егоров, В.Ю. Огородникова. Изменение глазной поверхности под
влиянием длительного применения антиглаукомных препаратов. Обзор
литературы // Клин. офтальмология.- 2011.- №1.- С.41-43.
13. А.Е. Егоров, В.Ю. Огородникова. Изменение глазной поверхности под
влиянием длительного применения антиглаукомных препаратов. Обзор
литературы // X Всероссийск. школа офтальмол.: Сб. научн. труд. - М., 2011.-
С.36-41.
14. В.Ю. Огородникова. Синдром «сухого глаза».- Аптечный бизнес.- 2011.- №5.-
С.18-20.
15. В.Ю. Огородникова, А.В. Куроедов, А.Е. Егоров. Возможные механизмы
вовлечения внутриклеточных структур в алгоритм метаболических реакций
глаукомной оптической нейропатии // Глаукома. Журн. НИИГБ РАМН.-
2011.- №2.- С.67-72.
16. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, Е.А. Смирнова. Изменение митохондрий
в клетках трабекулярной сети глаза больных первичной открытоугольной
глаукомой // Офтальмология.- 2011.- №2.- С.8-11.
17. В.Ю. Огородникова, А.В. Куроедов, А.Е. Егоров. Внутриклеточные изменения
в алгоритме метаболических реакций глаукомной оптической нейропатии».-
Глаукома: теории, тенденции, технологии: Сб. научн. ст. конф.- М., 2011. -
С.296-308.
18. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, Е.А. Смирнова. Состояние митохондрий в
клетках трабекулярной сети глаз больных с первичной открытоугольной
глаукомой // Глаукома: теория и практика: Регион. конф.: Сб. научн. труд.-
СПб., 2012.- С.134-138.
19. A. Kuroyedov, V. Ogorodnikova, V. Gorodnichy, E. Smirnova. Changes of
mitochondria in trabecular meshwork cells of glaucoma patients // Book of
Abstracts Word Ophthalmology Congress 2012.- Abu Dabi, United Arab Emirates,
2012.- P. 519.
22
20. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, Л.А. Александрова. Так ли важна
проблема дженериков в глаукоматологии? // XI Всероссийск. школа
офтальмол.: Сб. научн. труд. - М., 2012.- С. 85-88.
21. А.В. Куроедов, В.Ю. Огородникова, Л.А. Александрова. Дженерики: есть ли
повод для сомнений? // «Новости Глаукомы».- 2012.- №2(22).- С.29-30.
22. В.Ю. Огородникова, Е.А. Егоров, А.В. Куроедов, Ю.В. Маркитантова, А.Н.
Петров. Результаты исследования апоптоза клеток дренажной зоны методом
иммунохимического анализа у пациентов с продвинутыми стадиями глаукомы
// Клин. офтальмология.- 2012.- №3.- С.82-85.
23. В.Ю. Огородникова, Е.А. Егоров, А.Е. Егоров, А.В. Куроедов, И.А.
Романенко. Изменение переднего отрезка глаза у пациентов с
продолжительным анамнезом первичной открытоугольной глаукомы //
Практическая медицина.- 2012.- №4.- С.226-229.
23
Список сокращений
TUNEL - Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling -
введение концевой метки биотинилированным dUTP с использованием
терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы
ВГД - внутриглазное давление
ГКС - ганглионарные клетки сетчатки
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИКА - ингибиторы карбоангидразы
ПГ - простагландины
ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома
ПЭК - плотность эндотелиальных клеток роговицы
ЦТР - толщина роговицы в ее центральной зоне