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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDO.

Objetivos Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de

agarosa. Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos separados en geles de

agarosa. Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la

biotecnología.

IntroducciónLas endonucleasas de restricción o tipo II se caracterizan por su habilidad para reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla específicamente en ambas cadenas de la molécula de DNA. Si bien existen tres tipos de endonucleasas con características de reconocimiento y de corte del DNA distintas, son las del tipo II son las que se utilizan en biología molecular, debido a que son capaces de cortar directamente la secuencia que reconocen y a que no modifican la secuencia blanco. Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por bacteriófagos, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

Las enzimas de restricción generalmente reconocen secuencias palindrómicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de restricción (EcoRI, HindIII) rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simétricas del centro del palíndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetría, produciendo extremos romos (Figura 4.6).

EcoRI HindIII HaeIII

Figura 4.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restricción en una secuencia de DNA. Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se muestra y en el último ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del género y especie de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

Las enzimas de restricción son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las técnicas para el análisis y la manipulación de los ácidos nucleicos. Han sido utilizadas en la eliminación de secuencias genómicas que van desde un nucleótido hasta

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cientos de bases, así como en la introducción de secuencias ajenas a un genoma, lo que ha permitido la producción de proteínas recombinantes.

Existen diferentes factores que afectan la reacción de restricción por endonucleasas. Se inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS y una alta concentración de sales. Los efectos de la contaminación pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima añadida a la reacción, arriba de 10 a 20 U /g DNA, incrementando el volumen de reacción, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duración de la incubación. La digestión del DNA genómico por estas enzimas puede facilitarse por la adición de policationes como espermidina, que actúa uniendo contaminantes cargados negativamente. Cuando un plásmido está superenrollado es necesario añadir más enzima o bien, desnaturalizarlo.

El tratamiento de una molécula de DNA con enzimas de restricción permite producir fragmentos definidos que pueden separarse mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los grupos fosfato de los nucleótidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo eléctrico, estas moléculas migran hacia el electrodo positivo o ánodo. Cuando la migración ocurre en un gel, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su tamaño, porque las moléculas pequeñas se mueven más rápidamente a través del poro del gel que las más grandes.

Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restricción. Si el fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restricción, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molécula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restricción se denomina mapa de restricción. El análisis de los mapas de restricción constituye una importante herramienta para localizar secuencias de bases específicas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados.

Existen varias aplicaciones de los mapas de restricción, como la obtención de los patrones de RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”) utilizados en las pruebas de paternidad, así como también en la identificación de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen, cabello, etc.

En la práctica se utilizarán dos enzimas de restricción en una mezcla. Esto se debe a que el vector utilizado en la transformación (Figuras 4.3 y 4.4) tiene dos sitios de restricción para enzimas diferentes, de manera que sólo se podrá liberar el fragmento de DNA de interés al cortar por los extremos con las dos enzimas que reconocen dichos sitios. Material biológicoDNA plasmídico purificado de la práctica anterior.

Materiales y equipoRecipiente para hieloTubos para microfugaGradilla para tubos de microfugaRecipientes para teñir el gel.Micropipeta de 100-1000 μL

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Micropipeta de 20-200 μL Micropipeta de 0.5-10 μLCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 μL estérilesCaja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 μL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 μL estérilesCámara de electroforesis horizontalFuente de poderVórtex Horno de microondasMicrofugaBaño de incubación a 37CBaño de incubación o bloque de calentamiento a 100CTransiluminadorPantalla de acrílico Cámara fotográfica

Reactivos NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20C. BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20C.NOTA; Las enzimas de restricción son muy sensibles a la temperatura, mantenerlas en frío durante su manipulación. Amortiguador TANGO de restricción. Reactivo que es proporcionado por el proveedor

junto con la enzima NdeI. TAE 1X. Ver preparación en el apéndice. Agarosa Amortiguador de muestra Estándar de peso molecular. Proporcionado por el laboratorio, se utilizará de acuerdo

a las instrucciones del proveedor. Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)

Desarrollo experimental

Ensayo de restricción1. Etiquetar dos tubos de microfuga.2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 L de plásmido y 1 L de

Amortiguador Tango10X3. Incubar a 100C por 5 min.4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min.5. Pasado el tiempo de incubación, añadir al tubo 1 únicamente una de las dos enzimas

de restricción que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1 L BamHI y otro par de equipos 1 L NdeI. Mezclar suavemente después de añadir la enzima.

6. Al tubo 2 añadir 1 L de BamHI y 1L de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros golpes al tubo de microfuga.

7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el líquido se deposite en el fondo.

8. Incubar a 37C por 1.5 h.9. Se sugiere añadir 0.5 l de una solución de RNasa (1 g/mL) e incubar 30 min a 37C.

Este procedimiento eliminará el RNA y facilitará la visualización de los productos de la

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restricción en el gel. Otra opción para la eliminación del RNA es añadir 2 L de la solución de RNasa a los 35 mL de gel poco antes de vaciarlo a la cámara de electroforesis, cuando esté tibio.

10.Al término de la incubación colocar los tubos en hielo.11.Se recomienda que para visualizar más nítidamente los fragmentos de la restricción,

tomar todo el volumen usado en el ensayo de restricción de cada tubo para correr en un gel de agarosa.

Preparación del gel Se sugiere utilizar un gel por cada dos equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o

carriles en el gel. Colocar la bandeja de acrílico para hacer el gel dentro de la cámara y colocar el peine. Preparar un gel de agarosa al 1%. Pesar 0.35 g agarosa en un matraz Erlenmeyer,

añadir 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodón o una servitoalla. Se calienta la mezcla en microondas por 1 a 3 min. o hasta que la agarosa se disuelva bien.

Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60C, añadir entonces 2 L bromuro de etidio (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGÉNICO) para obtener una concentración final de 0.5 g/mL, agitar el matraz para mezclar. O bien añadir el reactivo SYBR Green (se recomienda usar 1 L de 10,000 SYBR Green I por cada 10 mL de gel)..

Depositar el gel en la bandeja de la cámara (Figura 4.7), evitando la formación de burbujas. Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min).

Quitar los acrílicos que hacen la bandeja y colocar el gel en la cámara de electroforesis.

Añadir el amortiguador TAE en la cámara. La cámara de electroforesis se llena con aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos.

Figura 4.7. Preparación de un gel de agarosa. Adición de la agarosa disuelta en TBE.

Preparación y cargado de las muestras.

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1. Tomar los tubos de microfuga que fueron usados en la restricción y etiquetarlos R1, R2. Además marcar dos tubos más uno como E de estándar y otro como P de plásmido sin digerir.

2. Añadir los reactivos como se indica en la tabla 4.1. Usar una punta de micropipeta distinta para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación cruzada.

Tabla 4.1. Preparación de muestras para aplicar en el gel de agarosa.Reactivos Estándar*

(E)Plásmido sin

digerir (P)

Plásmido digerido con una enzima

(R1)

Plásmido digerido con dos enzimas

(R2)Muestra 1 μL DNA-HindIII 10 μL 12 μL** 13 μL**H2O 9 μL Amortiguador de muestra

2 μL (Stop Mix) 3 μL 3 μL 3 μL

*El estándar que se usa en el laboratorio (lambda DNA digerido con HindIII) puede calentarse a 65°C por 10 min para separar las bandas de 23130 y 4361. Los pesos moleculares que deben encontrarse en el carril del estándar son 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 y 564 pb.** Volumen que quedó después de realizar el ensayo de restricción.

3. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el líquido en el fondo.

4. Retirar el peine de la bandeja. Muy importante: los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el cátodo, generalmente el electrodo es de color negro.

5. Tomar el volumen total de cada uno de los tubos de microfuga preparados según la tabla 4.1 y colocar en los pozos como se muestra en la Figura 4.8.

Figura 4.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.

6. Una vez depositadas las muestras, colocar la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro con negro) y conectar a la corriente. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras migren hacia el lado positivo de la cámara.

7. Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la observación de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lámpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiación ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrílico entre el observador y la fuente de luz UV.

8. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese propósito, los geles serán incinerados, junto con los guantes y puntas si es que estuvieron en contacto con el bromuro de etidio. Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de DNA detectadas. Construir la curva de estándares de peso molecular y

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Estimar el tamaño aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA así como del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estándar de peso molecular que se encuentran en la parte inferior de la tabla 4.1.

9. Analizar los resultados.

Cuestionario

1. ¿Qué parte de la molécula de DNA le confiere la carga negativa? 2. ¿Cuál es el papel de cada componente del amortiguador de carga, en particular de los

dos colorantes que contiene? 3. ¿Por qué el bromuro de etidio es un reactivo mutagénico?4. ¿A que se le denomina topoisómeros?5. ¿En la práctica se pudieron observar topoisómeros?6. ¿Qué peso molecular tienen los topoisómeros? 7. ¿Qué tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la práctica, romos o

cohesivos?8. ¿Cuántos fragmentos de DNA o restricción se obtuvieron al utilizar las dos enzimas

NdeI y BamH1?9. ¿Cuántos fragmentos se obtuvieron al utilizar sólo una de las enzimas de restricción?

¿Por qué?10.¿Cuál fue el peso molecular del DNA liberado y del plásmido o vector?11.¿Cuáles son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restricción?

Referencias

Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2 Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in

Protein Science (1998) A.4I.1-A.4I.3. Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences © 2001, John Wiley & Sons, Ltd.

www.els.net. Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition.

Cold spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.

279-317. Localización QH345 L43 Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual.

Cold spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ

specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.

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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE.

Objetivos Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli Realizar la inducción de una proteína recombinante (-lactamasa) Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes

Introducción La necesidad de producir proteínas heterólogas o recombinantes para varias aplicaciones científicas y comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular proteínas. Los sistemas bacterianos han sido los más utilizados para este fin, debido a que son fácilmente manipulables genéticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son económicos y se requiere sólo un entrenamiento mínimo para su manejo. Además, muchas de las características inherentes a los sistemas bacterianos permiten la automatización en proyectos de producción a gran escala, donde se requiere la producción y muestreo de cientos de clonas.

A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes: las proteínas de eucariontes o las proteínas de membrana generalmente no se expresan o no son funcionales. El carácter químico del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas (proteínas que se unen a las proteínas recién sintetizadas), así como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-traduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariontes. Por ejemplo, los sistemas de expresión de bacterias no glicosilan a las proteínas. Otros sistemas de expresión, como los sistemas de células de mamífero, de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las proteínas eucariontes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las proteínas es crítica, aunque el costo de estos sistemas es considerablemente más alto y la tecnología que se necesita es más complicada. Adicionalmente, la producción de grandes cantidades de proteínas, como algunos productos terapéuticos, se puede lograr tanto en plantas como en sistemas animales.

Muchas compañías ofrecen una serie de vectores con capacidades de expresión muy variadas, con o sin proteínas de fusión que funcionan como etiquetas para la detección y/o purificación de la proteína deseada, la presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y promotores distintos.

Los vectores de expresión como el pET son usados comúnmente para la expresión de proteínas heterólogas en E. coli. En los sistemas pET, los plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del promotor del bacteriofago T7, que controla la alta expresión de la RNA polimerasa T7. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiará con más detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresión de la proteína de interés, se tiene que introducir lactosa o un análogo de ésta, el más utilizado es el isopropil-D tiogalactosido (IPTG), análogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial del operón de la lactosa (Fig. 4.9). El IPTG se une a la proteína represora, ocasionándole a la proteína un cambio conformacional que le impide su función biológica de unirse al DNA. La actividad biológica de la proteína represora es unirse a una secuencia de DNA denominada operador impidiendo, en el caso del vector pET, la transcripción del gen para la RNA polimerasa T7 y por tanto la transcripción del transgene. El efecto del IPTG de liberar de la represión del gen es denominado inducción, por lo que el IPTG es llamado inductor. El gen que codifica a la proteína represora se encuentra incluido en el vector, LacI, y su transcripción ocurre a la par que todos los genes incluidos en el vector (Fig. 4.9).

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Así, a pocas horas de inducción, la formación de la proteína deseada puede llegar a ser más del 50% de la proteína total en la célula.

Figura 4.9. Mecanismo de acción del IPTG en la expresión de proteína mediada por el vector pET.

Como se mencionó anteriormente, la producción de la proteína recombinante en un organismo no relacionado puede llevar a que la proteína no sea funcional, ya sea porque no presenta las modificaciones post-traduccionales necesarias o bien porque no se plegó adecuadamente, provocando su aglomeración. Cuando las proteínas se aglomeran formando agregados que sólo pueden solubilizarse a través del uso de soluciones de detergentes, se dice que forman cuerpos de inclusión. En este caso, aumentan los costos de producción y/o recuperación de la proteína.

En la práctica se llevará a cabo el monitoreo de la inducción de la -lactamasa en células completas de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1-ompA-lactamasa (Figura 4.4), vector que fue producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostró en la Figura 4.3.

Material biológico por grupo1 matraz de 150 mL con 25 mL cultivo líquido saturado de células transformadas de E. coli (crecidas por 12 a 16 horas con agitación vigorosa).

Material y equipo1 mechero1 recipiente para hielo Tubos para microfuga de 0.5 mL 2 vasos de precipitados 25 mL1 pipeta Pasteur con bulboRecipiente de plástico para la tinción. Micropipeta de 2 a 10 LMicropipeta de 20 a 200 LMicropipeta de 200 a 1000 L1 caja de puntas de 10 L para micropipeta 1 caja de puntas de 200 L para micropipeta1 caja de puntas de 1000 L para micropipetaPlacas de vidrioPeine

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Separadores Pinzas para sujetar las placasCámara para electroforesisFuente de poderVórtexIncubadora a 37C con agitación Cámara fotográfica

Reactivos 1 tubo de 50 mL con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 g/mL) 100 mM IPTG Estándar de peso molecular de proteínas 8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotómetro.

Desarrollo experimentalInducción de proteína recombinante, -lactamasa (Figura 4.8).

1. Tomar 2.5 mL de un cultivo saturado de células de E. coli transformadas con el vector PET-TEM-1-ompA-lactamasa, y añadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina. Tomar una alícuota de 1 mL y leerla en el espectrofotómetro a 600 m contra un blanco de medio Luria (la absorbancia debe ser menor a 0.3). Incubar los tubos con agitación vigorosa a 37C (colocarlos en posición diagonal para que se mezcle bien el medio). El cultivo celular debe llegar a una absorbancia entre 0.6 a 0.8.

2. Para verificar que se llegó a la absorbancia indicada, tomar una alícuota de 1 mL y leerla en el espectrofotómetro a 600 m contra un blanco de medio Luria. Si aún no llega, volver a incubar el matraz con agitación vigorosa.

3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alícuota a la que llamaremos tiempo 0 (mantener en hielo el tubo de microfuga).

4. Agregar el IPTG para tener una concentración final en el tubo de 0.5 mM. El volumen del medio con células puede variar, dependiendo del número de alícuotas que se hayan tomado para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el cálculo tomando en cuenta el volumen final de medio con células.

5. Incubar nuevamente a 37C con agitación horizontal y tomar alícuotas de 1 mL cada 30 min por 1.5 o 2 h.

6. Guardar todas las alícuotas en tubos de microfuga a 4C.

Preparación de un gel de poliacrilamida-SDSDurante el tiempo de incubación e inducción de la proteína recombinante, preparar un gel de poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las instrucciones de elaboración se encuentran en la sección II, parte III del manual. O bien realizar los geles y la corrida de las muestras en otra sesión de laboratorio.

Preparación de las muestras y separación en un gel de poliacrilamida-SDS1. Tomar 15 L de cada una de las alícuotas que fueron recolectadas y mezclarlos con 10 L de

amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. Hacer una mezcla apropiada de estándares de peso molecular (se sugiere 7 L de los estándares de peso molecular más 18 L de amortiguador de muestra).

2. Ensamblar el gel en la cámara de electroforesis.3. Aplicar las muestras en el gel.4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del

colorante haya entrado en el gel separador. Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel.

5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel.

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6. Enseguida desprender el gel de las placas y realizar la tinción depositando el gel en una charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante.

7. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución desteñidora. Poner a agitar suavemente.

8. Tomar la foto del gel.9. Analizar los resultados. La proteína tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa si tiene el

péptido señal de la proteína ompA y de 29 kDa sin péptido señal.

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1 mL t = 0

1 mL t = 120 min

Elegir entre incubar hasta 90 o 120 min, ya que sólo hay 5

pozos disponibles por equipo. Recordar que

uno de los pozos contendrá el estándar

de peso molecular.

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Cuestionario

1. Menciona las diferencias entre las células de E. coli DH5 y las células E. coli BL21 2. ¿Qué es una proteína recombinante?3. ¿Por qué el cultivo de células debe de llegar a una densidad óptica de 0.6 a 0.8 antes de

comenzar el proceso de inducción de la proteína recombinante?4. ¿Cuál fue el tiempo en el que se produjo la máxima cantidad de proteína recombinante?5. ¿Qué otros parámetros se podrían modificar para obtener un mayor rendimiento de la

proteína?6. ¿Qué son los cuerpos de inclusión?7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si la proteína se encuentra en forma soluble o

en forma agregada?8. ¿Qué método propondrías para purificar a la proteína recombinante obtenida?9. Describe tres ejemplos de proteínas recombinantes que se producen actualmente de manera

comercial, explicando sus usos.

Referencias Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning

vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442. Hammlev D, Madden D, Nørby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for

biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE. LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in

Protein Science 5.1.1-5.1.8. Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold

spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium

enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.

Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.

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Células del cultivo saturadoIncubar a 370C / agitación vigorosa

durante 2 h

Incubar a 37 0C / agitación.Tomar una alícuota cada 30 min

1 mLt = 30 min

Medio LB-kanamicina

1.5 ml

Leer a 600 m hasta obtener 0.6-0.8 Abs.

Agregar__________L 100mM IPTG (concentración final 0.5 mM)

1 mLt = 60 min

1 mLt = 90 min

Aplicar 4 de las fracciones a un gel de poliacrilamida-SDS.

t = 0

Figura 4.10. Proceso de inducción de proteína recombinante en E. coli.