m s lihros de Editorial ACRIBIA, S. A., sobre IJIOLOGÍA MOLECULAR y BIOTECNOL06ÍA . ( 1\ 1 ,ulI", 1 ROlll 'C( ION A LA 1l10TECNOLOGi A I Y 11tH)'" ) Il ( NOI .o( ¡iA HASICA () N ros DE IlJOLOGIA MOLECULAR \ II1Ih hk J, NI JI m il DL 1 AS ENZIMAS • IJ v <.OIe, s, N, IIOl,I A "rol ECULAR DE LAS PU}NTAS 1, 11 'C N( 11 OGíA DE lA CERVEZA Y LA MAUA (, v I ¡:Ivid, IH' NOI (¡G/A (INTRODUCCiÓN CON EXP.ER T MENTOp MODELO) \\ . ) fl r illlf'OSC, S. B. N I/'IOS Uf MANIPULACiÓN GENÉTICA I I ( ,I ' NJ'-'RIA GENÉTICA Y SUS APLICACIONES I p, y O[¡OS 11 NO! O<l IA: LOS P R1NCIP IOS BIOlÓGICOS !\I () (J IA I\IOU::CULAR y BIOTECNOLOGÍA ( , NI! RI IlIOQu fMICA ) J,,, ,,., , M, <1 , K. I ( NO! OCiIA VEGETAL AGRíCOLA \ ( II'IOS J)J BIOTrCNOLOGiA \ I \1 ni , BIOI e( NOI aulA J)l ' LOS eNZIM AS lO I BIOTECNOLOGIA DE LA f · FERMENTACION OWEm P. WARD • •
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1. ms lihros de Editorial ACRIBIA, S. A., sobre IJIOLOGA
MOLECULAR y BIOTECNOL06A . ( 11 ,ulI", 1ROlll 'C( ION A LA
1l10TECNOLOGi A I Y 11tH)'" ) Il ( NOI .o( iA HASICA () NJ),~I/ ' N
ros DE IlJOLOGIA MOLECULAR I ~II1Ihhk J, NIJI m il DL 1AS ENZIMAS
IJ v clllivn econmicamente que los mtodos de fermentacin. En 1973
la crisis d~1 petrleo, con el consiguiente incremento de los
precios hizo que el mundo cnlero se interesase por combustibles
renovables alternativos. Por ejemplo, Bra- .il se embarc en un
programa nacional sobre el alcohol que apuntaba hacia el desarrollo
de la capacidad de fermentacin que produjese en 1987 tres billa nes
de galones de etanol anuales a partir de caa de azcar. El gobierno
federal de USA alent el desarrollo de la produccin de alcohol a
partir de la fermenta- cin del maz mediante el Gasohol Program,
reduciendo los impuestos del ga- sohol (gasolina con un 10 "lo de
alcohol), por lo que se establecieron un nme- ro considerable de
plantas de fermentacin de pequela y gran escala que produ- can
alcohol mediante procesos de fermentacin continuos y discontinuos;
el objetivo de este programa era conseguir un volumen de produccin
anual de 1,8 billones de galones a mitades de los ochenta. Tambin
se obtiene etanol por la fermentacin del suero de leche con
K/uyveromyces fragi/is, aunque el volu- men de produccin obtenido
por este procedimiento es minsculo comparado con el producido por
S. cerevisiae a partir de malz o caa de azcar. La fermen- tacin del
lactosuero (que solo tiene aproximadamente un 5 "lo de lactosa en
peso/volumen) debe llevarse a cabo en lugares prximos a las fbricas
de que sos, puesto que si no los costos de transporte seran
prohibitivos. Actualmente solo un pequelo nmero de productos
qumicos de gran volu- men de consumo se obtienen por fermentacin,
ya que prcticamente todos ellos ~e manufacturan a partir del
petrleo y del gas natural. Las fluctuaciones del costo y el
incierto suministro de petrleo, as como la inquietud frente al
agota- miento definitivo de las fuentes no renovables han
intensificado el inters del empleo de recursos no petrolferos para
la produccin de energa y de compues tos qulmicos. Aminocidos
Durante los ltimos treinta aos, la.m-oduccin de aminocidos mediante
procesos de fermentacin aerobia ha experimentado una rpida
e~ru!!lsin. El glutamato monosilico y la lisina son los que se
producen en cantidades mayo- res, con niveles de produccin mundial
anuales de 370.000 Tm y 40.000 Tm, res- pectivamente. Los procesos
deJermentacin~re.s.ultado de un.elegnte tra- bajo de investigacin
acerca de los mecanismos bioqumicos que regulan la bio- INl
RODUCCION sntesis de aminocidQs por los microorganismos,
consiguiendo la superproduc cin de aminocidos mediante una
combinacin de mutaciones y del conl rol de los procesos de
fermentacin. Las tcnicas empleadas intentan estimular a las clulas
para que ingiera nuevos materiales, previniendo o impidiendo las
reac- ciones laterales, as como inducir y activar a los enzimas
biosintticos y reducir o inhibir la actividad enzimtica que podra
degradar el producto, y finalmelllc facilitar la excrecin del
aminocido. Las investigaciones clsicas utilizadas por el desarrollo
de la fermentacin del cido glutmico han dado un Impetu signi-
ficativo a los procesos de fermentacin para la produccin de otros
metabolitos primarios, de forma que actualmente la mayora de los
aminocidos se produ cen comercialmente mediante estos procesos. Se
han aplicado tcnicas similares a la produccin de monofosfatos de
inosina y guanosina, potenciadores del sabor. Biopolmeros En los
ltimos alias se han diseado un gran nmero de fermentacionesjn-
dustriales destinadas a la produccin de bio olmeros mi bjanos. La
mayora de los polimeros son sintticos y por tanto son sensibles a
las fluctuaciones del precio del petrleo, de forma que los
biopolmeros pueden ser especialmente importantes cuando se eleve el
precio del crudo. El ~6opolmerg ms importante en funcin del volumen
de su produccin es la- m xan ano, titizada como gelificante o
estabilizan!e de suspensiones, producida por ermentacin aero la e a
actena ant omonas campes/riso Existen otras gomas microbianas de
inters comercial que se obtienen-a partir de Aze/obac/er vine/andii
(alginato), Aureobasidium pul/u/ans (pululano), Se/e- rotinum
(escleroglucano) y Pseudomonas e/odea (gelano). Los elevados pesos
moleculares y viscosidades de los polisacridos extracelulares
plantean proble- mas en los procesos de mezclado y transferencia de
masa y calor existentes en un fermentador, por lo que deben ser
tenidos en cuenta a la hora de diselar un aparato ptimo para estos
procesos. Un polmero muy prometedor que est siendo desarrollado
actualmente es eI-polihidroxibutirato, poliester termoplstico que
se puede acumular intracelu- larmente en algunos tipos de
A/caligenes entrophus hasta un nivel del 70 "lo en peso de biomasa.
Este producto podra permitir el empleo de plsticos biode- gradables
en lugar de los plsticos obtenidos a partir del petrleo, no
biodegradables. Vitaminas En la actualidad la mayorla de las
vitaminas se producen por mtodos qul- micos. Aunque se han descrito
mtodos de fermentacin ara un mn nmero de vitaminas del grupo
B,comQ.l.a tiamina>biotina ~o flico, cido an.lo1C, 14. 10
11IOTECNOLOOIA DE LA FERMI'N IAl ION IIko, piridoxamina, vitamina 8
12 y ribonavina. nicamente las dos ltimas se l hll ~nCII mediante
mtodos biolgicos. La sntesis qulmica de la vitamina B ' 2 C ~, I
rcm adamente complicada por lo que slo se obtiene comercialmente
me- d,lIIle fermentacin industrial con Pseudomonas. En la produccin
de ribofla-lila lo, procesos de fermentacin compiten eficazmente
con los mtodos de "(lIlcsis o de semisntesis qumica, de forma que
la tercera parte del volumen lit produccin de esta vitamina se
obliene por fermentacin. En 1935, se utiliz 1" ImCf'dmenle
Eremolhecium ashbyii para obtener la vitamina, consiguindose UIIOS
rendimientos que fueron incrementndose gradualmente hasta alcanzar
los 5,3 g/I, aunque debido a la inestabilidad de la cepa,
posteriormente se prefirie- ron olras especies, como Ascomyceles y
Ashbya gossypii. Una patente reciente (1984) describe una cepa
recombinante de Bacill"s sub/ilis capaz de producir 4,5 g de
ribonavina en 24 h de fermentacin, perodo muy in feriar al
necesario con los Ascomyce/es, que se aproxima a los 5 das.
Insec/icidas microbianos Los insecticidas qumicos, empleados con
gran xito en agricultura y para favorecer la salud pblica, han sido
ampliamente utilizados este siglo. Sin em- bargo, las crlicas
acerca de que pueden matar organismos distintos al blanco O de que
los organismos blanco pueden volverse resistentes a ellos han
conduci- do al desarrollo y comercializacin de insecticidas
microbianos, de forma que la investigacin es continua en este
campo. La produccin de Bacillus /hurin- giensis supera con mucho la
de cualquier otro insecticida microbiano produci- do
comercialmente. Las condiciones de fermentacin se disean de tal
modo que se alcance un rendimiento y una bioactividad de la
endotoxina, producida de forma concomitante con la esporulacin,
mximos. Las distintas cepas de 8. fhuringiensis y de otros
organismos capaces de sintetizar insecticidas bacte- rianos y
fngicos manifiestan toxicidades diversas. Los genes de la toxina de
Bacillus fJllIringiensis han sido clonados en Escherichia coli y
Bacillus sublilis, mejorando potencialmente las velocidades de
produccin y alterando su espec- tro de eficacia. Giberelinas Las
giberelinas, diterpenoides que tienen cuatro anillos de carbono, se
apli- can para la aceleracin de la germinacin de la cebada en la
produccin de mal- ta. La primera giberelina fue descubierta en 1938
y en la actualidad se conocen ,esenta compuestos distintos. El cido
giberlico se produjo inicialmente me- diante cultivo en superficie
en una fermentacin prolongada, consiguindose rendimientos de 40-60
mg/ I de producto. Hoy en da las fermentaciones comer- ciales por
cultivos sumergidos producen rendimientos significativamente
mayores. IN I KOtllJ('C'ION 11 ENZIMAS MICROBIANOS La explotacin
comercial de enzimas microbianos aislados fue iniciada por Jokichi
Takamine, un japons que emigr a USA, y que en 1894 patent un mtodo
para la preparacin de enzimas diastsicos a partir de mohos, comer-
cializados con el nombre de Takadiastasa. Este mtodo, que implica
el creci- miento de los mohos en la superficie de un substrato
slido, como trigo o salva- do, era reflejo indudablemente de los
procesos similares de preparacin de ali mentos orientales
fermentados. El desarrollo de fermentaciones de enzimas in
dustriales bacterianos fue iniciado por Boidin y Effront, en
Francia y Alema nia, respectivamente, quienes en 1917 patentaron el
empleo de Badllus subfili, y Eacillus mesenlericus para obtener
amilasas y diastasas tambin mediante tc nicas de cultivo en
superficie. Los mtodos de cultivo en superficie para la pro- duccin
de enzimas fngicos se utilizaron en USA hacia los anos cincuenta y
an hoy continan emplendose, especialmente en Japn. Las
fermentaciones fngicas sumergidas se emplearon en USA y Europa para
la produccin de en- zimas basndose en la experiencia conseguida con
las fermentaciones sumergi- das en el desarroUo del proceso de
produccin de Penicillium, en los Northern Regional Research
Laboratories (NRRL) de USA. La introduccin de enzimas microbianos
industriales en el mercado estable- ci el fundamento de la
tecnologa para la aplicacin de enzimas, particular- mente en reas
del procesado de alimentos como la produccin de cerveza y zumos de
frutas y la manufactura de hidrolizados de almidn. En los aos se-
senta el mercado de los enzimas industriales se expandi
dramticamente al in- cluirse proteasas alcalinas en los detergentes
en polvo. La produccin y empleo de glucosa isomerasa microbiana
para la man ufactura de jarabes de maz ricos en fructosa represent
un hito muy importante en esta dcada, producindose un gran impacto
en el mercado de edulcorantes calricos, dominado hasta en- tonces
por la sacarosa. En USA, la industria destinada a la elaboracin de
bebi- das era el usuario industrial ms importante de azcar, pero
hacia 1984 las prin- cipales compaas de fabricacin de bebidas no
alcohlicas haban llevado a cabo la substitucin total de la sacarosa
por los jarabes de maz ricos en fructo- sao Otro desarrollo tcnico
significativo de los aos setenta consisti en la co- mercializacin
de a-amilasa estable a temperaturas elevadas obtenida a partir de
Bacillus licheniformis. La capacidad de este enzima para licuar el
almidn a temperaturas de hasta 110 oC no slo ha hecho ms eficaz el
proceso de hi- drlisis del almidn sino que tambin ha impulsado el
aislamiento o modifica- cin de otros enzimas con estabilidad
elevada. 15. 12 BIOTE NOLOGIA DE LA FERMI!NTACION 1-IOQUerOS DE USO
MEDICO IIIflh6ficos Durante cincuenta anos, siguiendo la sugerencia
de Pasteur de que los efec- to, antagonistas de unos
microorganismos frente a otros podan tener potencia- les efectos
teraputicos, se probaron como medicina sin xito diversas prepara-
ciones microbianas. Finalmente, en el ano 1928, Alexander Fleming
observ que el Prmicillium nOfacum, contaminante de los cultivos de
Staphyfococcus aureus, mataba las bacterias, demostrando que el
ingrediente activo, denominado peni- cilina, poda inhibir otras
muchas bacterias. Una vez aislada la penicilina en una forma activa
estable por Florey y Chain en 1940, se demostr su destacada
actividad antibacteriana y se desarroll en USA un proceso de
fermentacin co- mercial con el apoyo del NRRL (Northern Regional
Research Laboratories) y la colaboracin de varias compaas
farmacuticas americanas. El desarrollo con xito de la obtencin por
fermentacin de la penicilina marc el inicio de la industria de los
antibiticos. Muy pronto se aislaron mu- chos nuevos antibiticos,
como la estreplomicina, a partir de especies de Sfrep- fomyces y se
descubrieron las cefalosporinas, producidas por Cephafosporium
acremonium. Las penicilinas, cefalosporinas y estreptomicinas
fueron los pri- meros antibiticos ms importantes descubiertos,
aunque desde los anos cua- renta hasta nuestros dlas se aislan
anualmente cientos de nuevos antibiticos. El desarrollo del proceso
de fermentacin de la penicilina tambin ha dado lugar a avances
generales claves en la fermentacin industrial, marcando el co-
mienzo de los procesos eficaces de fermentacin fngica sumergida. La
edad de oro de la gentica microbiana clsica, que implicaba tcnicas
de mutacin y seleccin, iniciada aproximadamente en el ao 1940, ha
permitido incremen- tar, por ejemplo, los rendimientos de
penicilina desde unos pocos mg por litro hasla 20 gi l de cultivo.
Tambin se iniciaron estudios sobre la naturaleza del complejo
proceso metablico implicado en la produccin de metabolitos secun-
darios, molculas pequeas, como los antibiticos, que no lienen un
papel ob- vio en el crecimiento y mantenimiento de la clula.
Inicialmente se obtuvieron penicilinas modificadas (semisintticas),
con ac- tividad o sensibilidad frente a la inactivacin por cidos o
enzimas alterada por transformacin qumica de la penicilina natural;
postedormente, algunas de las etapas de semisintesis fueron
llevadas a cabo por conversiones biolgicas. Transformaciones de
eSferoides El empleo de microorganismos para llevar a cabo
transformaciones enzim- licas altamente selectivas y especificas de
productos farmacuticos represent un avance decisivo en el
desarrollo de medicamentos con hormonas esteroides. INI HOllUl ION
En los aos cuarenta se estableci que la cortisona, esteroide
secrclado po, lu glndula adrenal, aliviaba el dolor de los
pacientes con artritis reumatoicle. pt'" lo que se dise un
procedimiento de sntesis qumica que requera 37 etapa; para la
produccin de cortisona, a un costo de 200$ el gramo. En 1952, los
cien- tficos de Upohn Company descubrieron una cepa de Rhizopus
arrhizus qlc hidroxilaba la progesterona, produciendo
ll-a-hidroxiprogesterona, lo que per miti que el procedimiento de
sntesis de cortisona pasase de 37 a II ctapas y se redujese su
costo a 16$/g. A lo largo de los anos se han introducido mejora,
constantes en el proceso, que han ido disminuyendo progresivamente
los COSlu, de produccin de forma que en 1980 ste era de slo
O,46$/g. Se han aplicado tcnicas de biotransformacin microbiana
similares pum la sntesis de otros esteroides, particularmente
a1dosterona, prednisona y p,cu nisolona. Las tcnicas son tambin
importantes para la sntesis de otros cam puestos qulmicos, tanto
farmacuticos como sin aplicaciones mdicas. Vacunas Existen
referencias acerca de las enfermedades infecciosas en algunos unt
i- guos escritos hindes y evidencias arqueolgicas de lesiones
tuberculosas en las momias de las primeras tumbas egipcias. La
capacidad de conferir resistencia a la enfermedad mediante
vacunacin fue descrita en primer lugar por lenner, en 1798, quien
observ que los indivi- duos inoculados con viruela vacuna o
vaccinia eran inmunes a la viruela. El empleo de vacunas, as como
la inmunologia, comenzaron hacia 1877, cuando Pasteur dirigi su
atencin a las causas y forma de prevenir las enfer- medades
infecciosas del hombre y los animales. En 1890 Behring y Kitasato
in- munizaron animales con toxinas inactivas de difteria y ttanos,
seguidamente Koch aisl el Vibrio choferae y la primera vacuna del
clera fue administrada en 1894 por Ferran y Clua, mdico espaol,
mediante inyeccin subcutnea de caldos de cultivo vivos a ms de
30.000 espaoles. Durante la primera Guerra Mundial los ejrcitos
fueron sometidos a programas de vacunacin contra el tifus y en la
segunda Guerra Mundial se introdujo un programa similar contra el
ttanos. A finales de los aos treinta comenz la vacunacin masiva
contra la difteria. El uso extendido de las vacunas contra la
IOsferina y la poliomielitis da cuenta del xito obtenido en los
ensayos realizados en 1955 con estas vacu- nas. Hacia 1936 Calmette
y Ourin observaron que el cultivo en serie de bacilos tuberculosos
infecciosos o virulentos en un medio artificial durante largos pe-
riodos atenuaba su actividad hasta el punto de que ya no eran
capaces de cau- sar la enfermedad. Tres aos ms tarde se introdujo
la primera vacuna BeG (Bacilo de Calmette y Ouerin) que inmunizaba
frente a la tuberculosis. El uso de vacunas atenuadas sufri un gran
reves diez aos despus, en el llamado de- 16. 14 1lI011'CNOLOO IA DE
l A H .RMENI'AC ION ' ''Mle de Lbcck, en el que 72 de los 240 nilos
vacunados con la BCG murieron ~()"' O resullado del tratamiento Con
un lote de vacunas que contenan el bacilo dc la 1ubercuJosis
virulento. Las vacunas bacterianas utilizadas hoy consisten l' n
cepas vivas atenuadas de los organismos productores de enfermedades
o de r q)l) rtlacionadas estrechamente, cepas patgenas muenas o
componentes ce- IIllare> que contienen anligenos y que son
efectivos pam inducir la inmunidad I,ollle 3 las correspondientes
enfermedades infecciosas. Aunque la produccin ue v'lcunas es una
aplicacin importante del proceso de fermentacin, su escala de
manufactura es relativamente pequea. La tecnologa de fermentacin
utili- la procesos continuos o discontinuos cuyas condiciones deben
ser diseadas con objeto de optimizar la produccin celular del
material inmunognico. La tecnologa de las vacunas vricas fue
primitiva durante muchos aos, de- bido a la necesidad de emplear
animales como fuente de virus. Los embriones de pollo se utilizaron
como fuente de virus hasta que, hacia 1950, se desarrolla- ron las
tcnicas de cultivo celular. Con estas tcnicas, la produccin de
vacunas viricas entr a formar parte del campo de la fermentacin
industrial. Las clu- las de mamiferos se cultivan en un medio
apropiado y, en una cierta etapa del crecimiento, se inoculan con
los virus, que se multiplican en las clulas huspe- des. Esta tcnica
permite preparar grandes cantidades de virus mucho menos
contaminados por materiales extraos del husped, bacterias o virus,
que esta- ban presentes en los obtenidos por los mtodos antiguos.
Impacto de las tnologas de hibridomas y de DNA recombinante Los
recientes e importantes avances en la tecnologla de hibridomas y en
la ingeniera gentica han extendido el alcance y el potencial de la
tecnologa de la; fermentaciones industriales. ANTICUERPOS
MONOCLONALES En 1975, Kohler y Milstein fusionaron un melona de
ratn (clula de cn- cer de piel) con un glbulo blanco productor de
anticuerpos obteniendo una clula hibrida (hibridoma) que combinaba
las distintas capacidades de las clu- las padre, la divisin celular
y la produccin de anticuerpos; tambin desarro- llaron la tecnologa
bsica para la produccin de anticuerpos monocionales, pre-
paraciones de anticuerpos especficos individuales obtenidos a
partir de clulas producidas por un nico antepasado o clan. Los
anticuerpos monoclonales tie- IN I Rllllun IUN I ~ nen una elevada
especificidlld uc unin a receptores individuales, moleulo' o
superficies y tienen muchas aplicaciones potenciales quc aprovechan
sus carac terlsticas nicas, particularmente en anlisis clnicos y en
la terapia para deter- minadas enfermedades. El mercado de
anticuerpos monoclonales ha crecido 1'11- pidamente y se espera que
alcance el billn de dlares en 1990. La produccin de anticuerpos
monoclonales se ha llevado a cabo in vivo por inyeccin del clan del
hibridoma en el lquido de la cavidad abdominal del animal
(usualmente ratones) o in vilro en una gran variedad de sistemas de
cultivo celular. Estos sistemas permiten conseguir una mayor
productividad global por lo que se han diseado y comercializado una
gran variedad de reactores para cultivos celulares. TECNOLOGIA DE
DNA RECOMBINANTE La ingeniera gentica implica la formacin de nuevas
combinaciones de ma- terial gentico mediante la insercin de genes
extraos, producidos fuera de la clula, a un organismo husped en el
que no existen de forma natural. El pri- mer gen fue clonado en
1973 y desde entonces las tcnicas han avanzado tanto que en la
actualidad se podran producir proteinas extraas en cantidades
comerciales a partir de una gran variedad de cepas recombinantes de
procario- tas y eucariotas, incluyendo clulas de animales y
plantas. La industria farma- cutica ha invertido mucho en
investigacin y desarrollo en este campo, siendo el primer producto
que ha conseguido la autorizacin para su uso teraputico la insulina
humana producida por una cepa recombinante de E. coli. 1lunbin se
han preparado otras muchas protenas mediante esta tcnica, entre
ellas otras hormonas humanas y varios factores de crecimiento,
compuestos antitumorales y antivricos, y antgenos virales y
enzimas. La primera vacuna obtenida me- diante ingeniera gentica
comercializada ha sido una vacuna de uso veterinario introducida en
1986 contra la pseudorrabia, un virus tipo herpes que infecta a los
cerdos. Las investigaciones pioneras sobre ingenjera gentica y los
primeros pro- ductos comercializados utilizaron E. coli como husped
ya que sus sistemas ge- nticos eran muy conocidos. Los caballos de
batalla de la fermentacin indus- trial, Bacillus, Aspergillus y
Saccharomyces pueden ser mejores huspedes a largo plazo, una vez
que sus sistemas genticos se conozcan con ms profundidad. El E.
coli no secreta en general proteinas, mientras que los Bacillus
producen rendimientos altos de protenas extracelulares. Como los
procariotas no glicosi- lan las proteinas, las diferentes especies
deSaccharomyces y Aspergillus pueden ser los huspedes adecuados
para la produccin de glicoprotenas animales o humanas. Se sabe que
Aspergillus niger es capaz de secretar hasta 20 gi l de pro- te!na
a partir de un nico gen de un enzima extracelular. Algunos
productos 17. OIOTBCNOLOOIA DE ~A FERME~HA 'ION IlIrlllUCUUcos
rccombinantes se han obtenido mediante S. cerevisiae. Sin embar-
Hn, Ins sistemas de secrecin y sntesis proteiea son
signilicativamente ms com- pleJus en e,'tos microorganismos
eucariotas que en los procariotas, por lo que tltn~1I que ser
investigados ms completamente para permitir el uso de estos
orgunlsmos en los procesos de fermentacin, particularmente para la
produc- cin de productos recombinantes no farmacuticos, por
ejemplo, enzimas. Las protenas y los pptidos, productos de
traduccin de los genes estructu- nllcs, son el primer objetivo
obvio de produccin mediante la tecnologa de ADN recombinante. A
largo plazo, podra ser posible la manipulacin del metabolis- mo
primario y secundario para mejorar la produccin de metabolitos
mediante la ingeniera gentica de enzimas clave en la secuencia
metablica. En los siguientes capitulos se describen algunos de los
aspectos ms espec- ficos de este terna. Introduccin Captulo 2
Biologa de los microorganismos de uso industrial ~~ctos
comercialmente importantes de las fermentaciones industria- les e
enecen a 4 categoras principales: u m'crobianas mol~~gran.:: des
c~lI]oJnzi as'y polis~W, proJllcto~~olito.uecunda rios que no son
necesarios para el crecimiento celular. Las clulas utilizadas pa-
ra obt~r estos productos tienen una gran variedad de propiedades
bioqumi- cas y fisiolgicas. La produccin comercial de productos de
fermentacin ha empleado rincipalmente diversas especies de
bacterias, levaduras hon os aun- que los avances recientes en el
desarrollo e t COleas e cu tivo de clulas de animales lantas han
perm"fIdo mtroduclr clulas ms com leas en lo ro- cesos de
fermentacin En este captulo se van a tratar las propiedades de las
especies ms mportantes utilizadas as! como los aspectos generales
del creci- miento y metabolismo microbianos que son importantes
para los procesos in- dustriales de su cultivo. Microorganismos
industriales En la naturaleza existen dos clases fundamentales de
clulas, as rocarlotas y las eucariotas, ambas utilizadas en los
procesos de fermentacin industrial. 17 18. I~ DIOTECN01.OGIA DE LA
FERMENTACION I,,~ clula~ ellcariotas tienen un ncleo diferenciado
rodeado por una membra- IIlJ , 'i .su ADN nuclear est asociado a
protenas y se encuentra en estructuras drli"ldas denominadas
cromosomas. y adems tambin tienen otras estfUctu- '''~ 11 orgnulos
con funciones bioqumicas o fisiolgicas especficas. Por el con-
l,ul10. las procariotas carecen de un ncleo bien definido, de tal
modo que el lIIoterial gentico, en forma de ADN en doble hlice, no
est separado de los otros constituyentes de la clula por una
membrana; estas clulas tambin care- cen de otros orgnulos
especializados existentes en las eucariotas, como por ejem- plo las
mitocondrias, y los enzimas asociados a estos orgnulos en los
eucario- tas se encuentran en el protoplasma y en la membrana
plasmtica de las proca- riotas. En la Tabla 2.1 se comparan las
propiedades de las clulas eucariotas y procariotas. En los procesos
de fermentacin se emplean clulas bacterianas. que son procariotas,
y hongos, levaduras y clulas animales y vegetales, que son
eucariotas. Los microorganismos tambin se distinguen en funcin de
sus necesidades de oxigeno, pudiendo dividirse en los aerobios
estrictos, como los Slreplomyces y la mayora de los hongos filamen
tosos, que pueden llevar a cabo su metabo- lismo y crecimiento
nicamente en presencia de oxigeno atmosfrico, los anae- robios
estrictos, como los C/oslridia, que nicamente pueden crecer en
ausen- cia de oxigeno y los organismos facultativos. entre ellos
las levaduras industria- les, que pueden crecer en situaciones de
aerobiosis y de anaerobiosis. Las b-cterias implicadas en los
procesos de fermentacin son_principalmen- te quimoorgantrofos, esto
es. pueden obtener su energla ysu carbono per oxi- dacin de los
compuestos.orgnicos, En ;; Tabla 2.2 se muestran algunas de Tabla
2.1. Caractersticas que diferencian a las eucariotas de las
procariotas Caracterfstica Orgdnulos Ncleo Mitocondria Rotlculo
endoplsmico Genotna No. de molculas de DNA ONA en orgnulos DNA
formando estructuras cromosmicas Procariotas Eucariotas + + + >
1 + + l. Las bacterias pueden contener fragmentos pequenos de DNA
(plsmidos) adems del genoma principal. 1l10LOGIA DE LOS MI
HOORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL I~ Tabla 2.2. Propiedades del gnero
de bacterias quimo-organotrficas de im portanda en las
fermentaciones industriales Gllero Elllrrobolaia J' Il'udomUl/llS
.rlllffhom01Ul;J ,Itdohacter A/rflligenes Dad/bu Clastridium
LtuClJlI()sllJ( I..(l(toballus Cory11f bacterium Reaccin Gram ... +
+ + + Propiedades Endos- poras Forma Varilla Varilla Varilla
Varilla Varilla/coco + Varilla + Varilla Esfrica Varilla Irregular
Ejemp/o de especies Aerobias' (produclos) + + + + + E. coti
(protelnas recombinanles) p. ovalis (cido glucnico) p. j1uorescens
(2-oxoglucon.lO) X. campesr,.s (gom. xantano) A. aceti (cido
aclico) A. faecatis (gom. curdlao) B. subliJis, B. licheniformis,
B. amy/otiquefa- ciens etc. (enzimas extracelulares) B. coagulalls
(glucosa isomerasa) B licheniformis (bacitracina) B. brevis
(grarnicidin. S) B. rhuringiensis (insecticida) e acerobutylicum
(acetona, bulanol) e Ihermocellum (acetato) L. mesenleroides
(dextranol, _ o L. delbruckii (cido lctico) + C. gluramicum
(aminocidos) C. simple.x (conversin de oSlcrolde) 19. 20 BlarE
NOLOOIA DE LA FERMENTA< ION '",biD 2,2, Continuacin Reaccin
alrllero Gram 1 I )'l'lIhcltrillrtl +/}ra ,-dia + + Propiedades
Endos- poras Forma Filamentos ramificados Sin micelio Micelio
fragmentado Micelio intacto 1. Aerobio: + = aerobio; - = anaerobio;
= ambos. Ejemplo de especies Aerobios! (productos) + Mycobacterium
spp. (transformacin de esteroides) + N. mediterranei (rifamicinas)
Nocardia spp. (transformacin de esteroides) + S. erylhreus
(eritromicina) S. aureofaciens S. rimosus (tetraciclinas) S.
Iradiae (glucosa isomerasa) S. roseochromogens (hidroxilacin de
esteroides) las propiedades de los gneros ms importantes de estas
bacterias, as como al- gunos ejemplos de especies. Las bacterias se
pueden dividir en Gram-positiva o Gram-negativa en funcin de su
respuesta a la coloracin de Gram, que afec- ta a los
peptidoglicanos. La envoltura celular de las bacterias
Gram-positiva con- siste en su mayor parte en una capa de
peptidoglicanos, de 15 a 80 nm de espe- sor, que recubre a una
membrana citoplsmica sencilla. En las Gram-negativa, esta capa de
peptidoglicano es de slo 2-3 nm de espesor. Las bacterias Gram-
negativa tienen dos membranas, la externa y la citoplsmica,
separadas por el espacio periplsmico. En la Figura 2.1 se muestran
estos dos tipos de estructu- ras. Ngunos procariotas, por ejemplo,
los Streptomyees productores de anti- biticos, tienen mamentos o
mcelios. La reproduccin de las bacterias tiene lugar por divisin
celular asexual se- gn se muestra esquemticamente en la Figura 2.2
para el E. eoli. El nico cro- mosoma de ADN circular se replica y
en el centro de la clula aparece una mem- BIOLOCIA DI' I.OS MI(
HOUKe'ANISMOS DE USO INDUSTR IAL OrnmpoSlllva r ..... PepHdogricano
- 80 nm J ........... Membrana O O O O O cJ!oplsmlca ..... 8nm
00000000 1 000000 G/am-negatlva 00000 000000 000000 00000 uvO 0_0.
0 0000%0000 00000 Citoplasma T N8nm 1....2 nm T"-7nm +.....8nm 1
Membrana externa Peplidoglicano Membrana periplsmica Membrana
citOplsmlca 21 F1g. 2.1. Comparacin esquemtica entre la composicin
de las envolturas celuJares de las bacterias Gram-positiva y
Gram~negativa. Ha, 2,2, Divisin asexual del Escherichia eoli. brana
O septo que separa el cromosoma nuevo del viejo; despus el septo se
trans- forma en pared y las clulas se separan. Las esporas se
producen porlas bacte- rias formadoras de esporas usualmente en
respuesta a condiciones adversas del medio, ya que stas son ms
resistentes al calor y a los compuestos lxicos que las clulas
vegetativas, y cuando pasan a un medio apropiado germinan dando
lugar a clulas vegelativas. Los hongos tambin son quimoorgantrofos
con rufas filamentosas rgidas y ramificadas cuyo dimetro est
comprendido usualmente entre 2 y 18 nm, Los hongos superiores
tienen tpicamente paredes trasversales o septos a intervalos dados
a lo largo de la hifa, aunque en los hongos inferiores esta
caracterrslica 20. 22 1l10T~ t"OLO ,lA DE LA I IlRMI't" IAl ION
"'11 lluscntc. Los hongos ms importantes implicados en Ins
fermentaciones in- dll,,,iales se clasificanprincipalmente en dos
grupos, los Zygol11ycotina~ as9'- IlId"" c0l110 los gneros Mucor y
Rhizopus, Ylos Deuteromycot ina, seplados, (l JilIlgi Impcrfecli,
por ejemplo los Trichoderma, Aspergillus, I't!nicillium,
IlIl'l'obasidium YFusarium (Fig. 2.3). Los Zygomycotina producen
micelios vegetativos haploides. Las esporas ase- xuales se forman
en el esporangio, aunque tambin se reproducen sex:ualmente. Los
Dcuteromycotina producen micelios vegetativos haploides, y las
esporas ase- , unles son usualmente inducidas por determinadas
condiciones medioambien- tales; por ejemplo, en Aspergil/us niger
se activa la formacin de esporas en los conidios cuando el
contenido de nitrgeno llega a ser limitante. En los Zygomycotina
los principales constituyentes de las paredes celulares son el
quitosano y la quitina, en tanto que en los Deureromycina
predominan el glucano y la quitina. El crecimiento vegetativo de
los hongos filamentosos implica la extensin hifal, y tiene lugar en
el extremo de las hifas, y tambin se produce la ramificacin con el
desarrollo de nuevas zonas de extensin, de fomla que la longitud de
las hifas y la cantidad de ramificaciones depende del medio de
crecimiento. En los fermentadores las fuerzas de cizalla pueden
oca- sionar la fragmentacin de las hUas y dar lugar a la produccin
de micelios ms cortos altamente ramificados. En los hongos, el
extremo rufal es la principal rea de actividad protopls- mica (Fig.
2.4). la pared celular que recubre el plasmalema tiene solamente 50
nm de espesor en la regin apical, aunque por detrs del extremo
puede alcan- lar hasta 125 nm y el compartimento protoplsmico se va
volviendo gradual- mente ms vacuolado a medida que est ms distante
del pice. Las levaduras son microhongos que se encuentran
generalmente en forma de clulas nicas y que se reproducen mediante
gemacin (Fig. 2.5). Algunas levaduras estn formadas nicamente por
clulas individuales y a veces cadenas cortas mientras que otras se
encuentran con un cierto rango de formas celula- res, in~luyendo
diversos tipos de filamentos. Una caracterstica de la poblacin en
crecimiento de las clulas de levaduras es la presencia de yemas,
prodUCidas cuando la clula se divide. la clula hija comienza siendo
una pequefia yema, que va creciendo hasta que alcanza un tamao
similar al de la madre y entonces se separa. En las levaduras, la
envoltura celular incluye la membrana citopls- mica, constituida
por Iipidos, protenas y mananos, el espacio pcriplsmico y la pared
celular, que contiene algunas protenas y gran cantidad de glucano y
manano. La levadura ms utilizada en las fermentaciones industriales
es Saccharomyces cerevisiae, sobre todo en la produccin de alcohol
y en panadera; esta levadura na degrada la lactosa, por lo que para
producir alcoholo biomasa a partir de suero de leche se utiliza
Kluyveromyces lactis, que contiene los enzimas necesa- 1l10lOl,IA
1)1' 10 MIIIIIHlIlf,ANIS/oM)S DE USO INDUSTRIAl 21 rios para
transportar y ucgn,dur la lactosa. Olras levaduras importantes
indu" Irialmeme son Calldlda lItilis y Elldomycopsis flbuliger. Las
clulas de los mamferos son generalmente ms complejas que las de los
hongos o las levaduras, y, como normalmente se encuentran en medios
iso- tnicos controlados, no tienen paredes celulares exteriores
resistentes. la super- ficie exierna de la membrana plasmtica tiene
una capa o gcocalix consistente en cadenas de oligosacridos cortos
unidas a lipidos y protenas de la membra- na intrnseca y a algunas
protenas adsorbidas. En los tejidos distintos de los reproductivos,
las clulas son diploides y se dividen aproximadamente cada 24
horas. Segn el tipo, las clulas animales pueden crecer en cultivos
en forma de monocapas unidas a superficies (dependientes del
soporte) o como clulas suspendidas (independientes del soporte) en
medios agitados suavemente me- diante giro lento. Las necesidades
nutritivas de las clulas de los mamferos son muy complejas, y adems
son muy sensibles a las fluctuaciones de parmetros como la
temperatura, el pH, el oxgeno y el C02 disueltos. Las lneas
celulares preparadas directamente a partir de tejidos animales ge-
neralmente no sobreviven, aunque esto puede no ser as. Usualmente
tambin exhiben inhibicin por contacto, es decir, detienen su
crecimiento cuando se to- can entre ellas. Sin embargo, despus de
pasajes repetidos, algunas lneas celu- lares primarias pueden
haberse transformado, es decir, pueden multiplicarse y crecer ms
rpidamente y a mayores densidades que las clulas primarias, pue-
den cultivarse ndefinidamente y perder la propiedad de inhibicin
por contac- to. las lneas de clulas tumorales se transforman
fcilmente. Las clulas de hibridomas se construyen fusionando una
clula de mieloma con una clula productora de anticuerpos, de forma
que las clulas hbridas tie- nen las caractersticas de las clulas
transformadas y a la vez son capaces de sintetizar un nico
anticuerpo, denominado anticuerpo monoclonal. Estas c- lulas se
utilizan en cultivos celulares o se implantan en el peritoneo de
animales para producir anticuerpos monoc1onales. Muchos tipos de
clulas vegetales pueden crecer en un medio slido o en suspensin
mediante tcnicas similares a las empleadas para el cultivo de clu-
las animales. Adems de las necesidades del medio, que suele ser
complejo e incluir extractos de plantas y auxinas, tambin deben
aadirse carbohidratos, puesto que en las clulas cultivadas la
fotosntesis no es tan eficaz como en la planta entera. Los tejidos
vegetales crecen en un medio slido como un callo formado por una
mezcla de clulas parenquimatosas. Mediante el subcultivo repetido,
las clulas tienden a crecer ms rpidamente, necesitan un medio me-
nos complejo, pueden cambiar su nmero de cromosomas y son menos
capaces de diferenciarse. El cultivo en suspensin es el mtodo de
cultivo de clulas ve- getales ms utilizado, y su principal ventaja
es que puede conseguirse un medio homogneo a lo largo del reactor.
21. 2< BIOTECNOLOGIA DIlI..A H !RM IlN IA( ION SIOLO lA DIl LOS
MI ROORGAN ISMOS DE USO INDUSTR IAL 2 .; u ~:;; ~ "-s J E ~ k ~ t~
,~ ~ ~ u ! e o, ': '"Cu e~ i1~ .~ ti i "g ~ 5 o ~.gg n~i . -Q i.g~
1 ~H !H &~! , ~ "u ~ u C '"1:: 8. .5 !.a o 8 ~ ~ .2.!J 3~ 11
':: 01"'] 8 H t~.8~~ei~.'l1i8=jS: -:;: ' "52 'l"i .. g. ';~ 6
-'"~~68 -qg!l t~ ~~~ . ~~]~ .~~ -. .H dH()I{Ui NISMOS DE USO
INDUSTRIAL JI a I'm" cuando la fuenle de carbono limitantc es mayor
que 10 Ks o 10-100 m& dm - 3. Las concentraciones de
carbohidrato elevadas pueden inhibir el creci- miento debido a los
efectos osmticos que, como hemos visto antes con la acti- vidad del
agua, tienen una influencia ms acusada sobre las bacterias que
sobre los hongos. Se ha comprobado que la cantidad de masa celular
total formada durante el crecimiento celular es frecuentemente
proporcional a la cantidad de substra- to utilizado 'Y X/ S Biomasa
producida (g) Substrato consumido (g) ( 10donde "YXJS coeficiente
de rendimiento de biomasa Metabolismo METABOLISMO PRIMARIO El
crecimiento microbiano depende de la capacidad de la celula para
utili- zar los nutrientes de su medio ambiente y sintetizar los
compuestos macromo- leculares de las estructuras celulares y tambin
los principales compuestos de peso molecular bajo necesarios para
la actividad celular. El metabolismo inter- mediario incluye las
reacciones que transforman los compuestos de carbono y nitrgeno que
entran a la clula en nuevo material celular o en productos que son
excretados. La sintesis de estos compuestos necesita energa, y la
mayora de las clulas utilizadas en las fermentaciones industriales
son hetertrofas y obtienen su energa a partir de la ruptura de
compuestos orgnicos. En los pro- cesos respiratorios o aerobios,
los organismos son call1'ces de oxidar completa- mente algunos de
los substratos a CO, y H,O, obteniendo el mximo de energa para la
conversin de los substratos remanetes en nueva masa celular. En el
metabolismo fermentativo o anaerobio, las clulas sonmenos
eficaces--la hora de convertir los substratos orgnicos en material
celular y usualmente excretan intermediarios degradados
parcialmente. Las rutas productoras de energa o catablicas generan
ATP y los coenzi- mas reducidos necesarios para las diversas
reacciones biosintticas, e interme- diarios qumicos utilizados como
puntos de partida para las reacciones de biosntesis. 25. 32
BIOTECNOI.OCIA DE LA I'ERMI'N l'Al'ION Los azcares se rompen por
una de las Lres vlas, la de Embden-Meyerhof- I'amas (EMPl, la de la
hexosa monofosfato (HMPl, y la de Entner-Doudoroff (1 D). La ruta
EMP, que convierte la glucosa en dos molculas de piruvato a Imvs de
la Iriosa fosfato est muy djfundida en las clulas de arumales,
plan- tas. hongos, levaduras y bacterias, y como no produce
precursores para la bio- s{ntesis de aminocidos aromticos, ADN y
ARN, los microorganismos que ni- camente utilizan esta ruta para la
asimilacin de la glucosa deben abastecerse de factores de
crecirrtiento. UI ruta ED est relativamente restrigida, ya que la
utilizan unas pocas bacterias, entre ellas las Pseudomonas, que no
metabolizan la glucosa por la ruta EMP. Un ciclo de la ruta HMP da
lugar a la conversin neta de glucosa en CO, con produccin de 12
molculas de NADPH + H + . Los microorganismos pueden utilizar esta
ruta para producir piruvato. UI im- portancia de la ruta HMP radica
especialmente en la obtencin de precursores de aminocidos aromticos
y vitaminas y del NADPH y H + necesarios para muchas reacciones
biosintticas. Un producto final significativo de todas estas rutas
es el cido pirvico, que en el metabolismo aerobio se introduce en
el ciclo de los cidos tricarboxJ1icos (TCA) siendo asirrtismo
precursor de los cidos, alcoholes y otros productos fi- nales del
metabolismo anaerobio. Un gran nmero de microorganismos cubren sus
necesidades de energa mediante el ciclo de los cidos
tricarboxlicos. El acetil CoA (2C) formado a partir del piruvato se
condensa con el oxalaeetato (4C) formando citrato (6C), que a Su
vez se convierte en oxalacetato siguieudo el ci- clo, con produccin
de dos molculas de CO, (vase Fig. 2.9a). De este modo el piruvato
se oxida a CO, con formacin de coenzimas reducidos que pueden
volver a oxidarse pasando sus electrones a travs de la cadena de
transporte hasta los aceptores de electrones, como el oxgeno.
Durante el proceso de respiracin parte de la energa producida se
utiliza para formar ATP, necesario para las biosfntesis. Los
intermediarios del ciclo de los cidos tricarboxilicos (TCA) tambin
sir- ven como precursores para la bios!ntesis de muchos aminocidos,
algunos ci- dos orgrucos y otros productos de fermentacin. Cuando
estos intermediarios se derivan de esa forma hacia procesos
biosintticos, se debe mantener el nivel de oxalacetato necesario
para que se condense con los grupos acetilo proveruentes del
piruvato, mediante una serie de reacciones; entre ellas, la
principal implica la carboxilacin del piruvato o del
fosfoenolpiruvato para formar oxalacetato o malato. Los
rrticroorganismos que crecen utilizando como fuentes de carbono
cidos grasos y acetato, o sus precursores, utilizan el ciclo de los
cidos tricar- boxlicos para la produccin de energa y de las
materias primas para los prce- sos biosintticos. El acetil CoA
formado se condensa con el oxalacetato para enlrar en el ciclo. El
oxalacetato y el malato, convertidos en fosfoenol piruvato y
piruvato, pueden utilizarse como precursores de las hexosas y las
pentosas a BlOLOCIA D ' LOS Mil RO()ROANI~MOS DE USO INDUSTRIAL
Fosloenolplruvalo (C,) FosloenolpiruvalO (el) IPlruvato le3)
!Acetil CoA (el) _ Acetato Oxalecetal0 L Cilrato (Ct.) (C.) /~ Acet
lI CcA Malato lsocitrato (Ct.) (C.) GIIOXilal0' / 2 (C~ Fumarato ~
Cetoglularato (es) (C~) Succinalo ICo) / 1Plfuvato (el) /~.JCoA
(c,) I '"-l. Citrato (C.J Oxalacelalole.) Malato ( Isocitrato (e,)
(C.)J Fl1marato _ O!Cetoglutaralo (e,) (Ca) Succinato (Co) 1.1 Ibl
Fig. 2.9. (a) Reacciones anaplerticas en las que,interviene el
ciclo?e los cidos tri~ar boxlicos cuando un organismo crece en
carbohldratos. (b). ReaccIones anaplerttcas y otras reacciones
claves para la sntesis de precursores de hexosa y pentosa cuando un
organismo se culliva en subslratOSque generan acetato como
principal fuente de carbono. travs de las reacciones reversibles de
las rutas EMP YHMP. Nuevamente, en ausencia de reacciones
anaplerHcas (restauradoras) los intermediarios del ci- clo TCA
podrian agotarse. En este caso la introduccin de dos reacciones
.enzi- mticas conduce a otro mecanismo cclico, conocido como ClelO
del ghoslJato, que repone los cidos de cuatro tomos de carbono
utilizando los acetil CoA que entran. En la Figura 2.9 se resumen
estas reacciones anaplerticas. cl~ve. El ciclo del glioxalato
tambin puede utilizar para reponer los mtermedlanos d~l ciclo de
los TCA el acetil CoA producido a partir de las hexosas por la vla
piruvato. , Las hexosas se convierten en protenas de organismos
unkelulares (SCP) me- diante la accin de levaduras Yhongos
utilizando generalmente una combina- cin de las rutas EMP YHMP,
seguidas del ciclo TCA y la reSpiracin. La pro- duccin de protenas
de organismos unicelulares a partir de alcanos implica la oxidacin
del alcano a unidades de acetato y su asimilacin por los CIclos del
glioxalato y de los TCA, mediante los enzimas de las rutas EMP YHMP
utiliza- dos para la bios!ntesis de hexosas, pentosas y otros
constituyentes celular.es. En la produccin de SCP a partir de
metanol por las especIes. Merhylophl{~s, el substrato se convierte
en formaldehdo, que a su vez es OXIdado en la vla de la ribulosa
monofosfato (vase Fig. 6.4). 26. , 14 BIOTECNOIDGIA DD LA II'RM~N
1111 ION En el proceso de fermentacin para la oblencin del dci LA
FERMI 'N IC ION delnu, substancias aromatizantes como la quinina y
cl lll ollla del Jazmln y la l1Iel1l3, O insecticidas como las
piretrinas. Es posible que algunos de estos com- ilUC~LOS puedan
obtenerse en el futuro por cultivos en suspensin. Para obtener
rendimientos altos de metabolitos secundarios vegetales parece ser
necesario un cierto grado de agregacin y diferenciacin celular, lo
que no siempre es desea- ble en una planta a gran escala ya que
generalmente el perodo de cultivo nece- sario para las clulas
diferenciadas es ms largo que el necesario para las no
diferenciadas, lo que aumenta los costos y eleva el riesgo de
contaminacin microbiana. Regulacin del metabolismo Una clula
cualquiera tiene el potencial gentico necesario para producir apro-
ximadamente 1.000 enzimas. Naturalmente, con tan compleja red de
rutas me- tablicas operando, estos enzimas deben ser sintetizados
en proporciones co- rrectas y deben trabajar en forma coordinada
para permitir a la clula funcio- nar como una unidad eficiente. Los
microorganismos son capaces de alterar su composicin y metabolismo
en respuesta a cambios medioambientales, y los prin- cipales
mecanismos reguladores que les confieren esta flexibilidad operan
tanto a nivel de la sntesis de enzimas como de modificacin de su
actividad. En un proceso de fermentacin dado el flujo de substrato
a travs de la com- pleja red de rutas anablicas y catablicas puede
verse influido por una gran variedad de mecanismos. Determinados
enzimas limitantes de la velocidad es- tn situados estratgicamente
en las diversas rutas, y usualmente son sensibles a mecanismos de
induccin/represin Yactivacin/inhibicin (vase ms ade- lante). La
sobreproduccin de metabolitos primarios se debe a las altas veloci-
dades de flujo diferencial de las reacciones anteriores que dan
lugar a la acu- mulacin del metabolito y tambin a las bajas
velocidades de las reacciones pos- teriores que podrian causar su
degradacin o utilizacin. Los procesos que re- gulan la produccin de
metabolitos secundarios son ms complejos y menos conocidos, aunque
es evidente que muchos de estos mecanismos son similares a los que
controlan el metabolismo primario. Naturalmente, en el desarrollo
de los procesos de fermentacin para la so- breproduccin de un
metabolito particular, es esencial tener en cuenta los di- versos
procesos de regulacin en el diseo de las condiciones
medioambientales ptimas, as como en el aislamiento o manipulacin de
las cepas microbianas productoras. 1JI0WJI" 1)1' J(, MI f(()()1
IANISMOS DE USO tNDUSTRti L 7 SINTESIS yOr:OI1AOACION oc ENZIMAS La
concelllracin total de un enzima intracelualr particular presente
en las clulas viene regulada por las velocidades relativas de
sntesis y degradacin o inactivacin de tal enzima. Enlas clula.>,
las Il'0tenas estn siendo degradada conti?~~baj~-'a ~c~in de los
enzimasjlroteolticos, de forma que cada protelDa llene una Vida
lumtada. Las protenas varan en su susceptibilidad frente al ataque
proteottico, de forma que la sntesis neta de un enzima se produce
cuando su velocidad de sntesis es superior a lade degradaci. En la
Figura 2.11a se ilustra el mecanismo general de sintesis proteica
de los procariotas. Una nica ARN polimerasa reconoce y se une a
centros ADN especficos denominados promotores, iniciando la sntesis
del ARNm y la Irans- cnpeln de un opern. En el extremo del gen
estructural, una regin de termi- nacIn hace que la ARN polimerasa
cese la transcripcin y se disocie del ADN. En los procariotas,
muchas ARNm son policistrnicas, esto es; codifican cade- nas
polipeptdicas mltiples, mientras que la mayora de los ARNm de los
euca- riotas son monocistrnicos. La sntesis de cada protena se
inicia por la unin de los ribosomas a un centro especfico del ARNm
y la traduccin comienza incluso antes de que la ARN polimerasa haya
alcanzado la seal para la terminacin. . En algunos casos la
transcripcin bacteriana se inicia a una velocidad cons- tante
(usualmente lenta), sin regulacin, en tanto que en otros la
velocidad a la que el ARN inicia la sntesis est gobernada por
protenas que interactan 5' 3~....l,__ Transporte Ncleo ADN
Citoplasma Transcripcin primaria ~~som.Prolelna nacIente Ibl Flg.
2.11. Snte,is proteica en los procariola, (a) y eucariotas (b). 28.
38 B10TECNOLOOIA DE LA FERMENTA ION en Ilna forma especfica con las
regiones del ADN denominadas operones, 10- cullladas cerca de los
centros promotores. Las protenas reguladoras que se unen 11 los
operones se denominan represoras o activadoras, dependiendo de si
dismi- nuyen o incrementan la velocidad de iniciacin de la
transcripcin. Algunos ope- Iones estn controlados por protefnas
activadoras y represoras y en los proca- riotas los centros
promotor-operador controlan frecuentemente la transcripcin del ADN
que codifica ms de una protena. Las regulaciones de la sntesis pro-
teica tienen lugar en la mayora de los casos mediante control de la
velocidad de iniciacin de la transcripcin, aunque a veces la
regulacin se produce en el momento de la terminacin de la
transcripcin o en los pumos de iniciacin de la traduccin. En la
Figura 2.11b se ilustra el mecanismo de la sntesis proteica en los
euca- riotas. La transcripcin se produce en el ncleo, y el ARN
primario que se trans- cribe se modifica ampliamente en el ncleo
antes de que salga al citoplasma para asociarse con los ribosomas.
En los eucariotas el control de la sntesis pro- teica puede
ejercerse al nivel del procesado del ARN as como en la transcrip-
cin o en la traduccin. En los procariotas la regulacin en la etapa
de traduc- cin es muy poco importante. 13.nto en los procariotas
como en los eucariotas, la estabilidad o vida media del ARNm tambin
puede influir en la velocidad de sntesis proteica. Los dis- tintos
ARNm tienen estabilidades diferentes, de forma que el efecto en la
snte- sis proteica global es complejo. Induccin Algunos enzimas se
producen siempre en cantidades substanciales cuando la clula est
creciendo, mientras que otros son inducibles, es decir, se forman
nicamente en presencia de determinados substratos en el medio. Los
genes es- tructurales de los enzimas inducibles son normalmente
inactivos u operan a ve- locidades basales>. muy bajas en
ausencia de substrato. Cuando el substrato se encuentra presente,
el gen estructural se pone en marcha y se produce la trans- cripcin
y la traduccin; este proceso se ilustra segn el modelo de Jacob y
Mo- nod para la induccin de la l3-galactosidasa del E. co/i (Fig.
2.12). En ausencia de inductor, un gen regulador sintetiza un
represor que se une a un gen opera- dor, evitando que la ARN
polimerasa se mueva a lo largo del ADN para trans- cribir el gen
estructural. Sin embargo, en presencia del inductor, ste se une al
represor, arrancndolo del gen operador y permitiendo que tenga
lugar la transcripcin. Represin por el carabolito Este fenmeno se
produce frecuentemente cuando la clula crece en un me- dio que
contiene ms de un substrato utilizable para el crecimiento. En la
repre- OIOLOOtA DE LOS MICRO ROANISMOS DE USO INDUSTRIAL o =qI~
~n,~RNRepresor pollm."" e s ADN En ausencia de Inductor AAN
poUmerasa ~ lehl Represor Represor Inactivo Con inductor I ADN
'.Transcripcin , AANm 1Traduccin ~ Enzima Flg. 2.12. Representacin
de un sistema enzimtico inducible. si6n por el catabolito carbono,
se sintetizan enzimas que catabolizan el mejor substrato,
usualmente glucosa, y nicmente cuando ste se ha agotado se pro-
ducen enzimas que descomponen el substrato ms pobre. La inhibicin
de la formacin de 3'-5' -adenosn monofosfato cclico (AMPc) parece
ser el factor clave en la represin por el catabolito en el E. coli;
esle compuesto es necesario para la sntesis de ARNm. El metabolismo
de la glucosa reduce el contenido de AMPc de las clulas unas 1.000
veces. El nivel de AMPc depende de la adenil ciclasa y la AMPc
fosfodiesterasa, que sintetizan y degradan el AMPo, respecli-
vamente. La adenil ciclasa parece estar inhibida por el transporte
de compues- tos de carbono utilizables en la clula. Aunque la
represin por la glucosa se produce ampliamente en los hongos,
levaduras y Bacillus, los mecanismos re- guladores an no son bien
conocidos. . Muchos enzimas, por ejemplo las proleasas, son
reprimidos por la presen- cIa de ammocldos o amoniaco ulilizables
rpidamente (represin del cataboli- lO nitrgeno). La limitacin de
amoniaco en el medio de crecimiento fermenta- tivo desreprime
rpidamente la sntesis de estos enzimas. 29. 40 BlafECNOLOOIA DE LA
FERMENTA I N Represin feedback Mientras que la sintesis de enzimas
catablicos est controlada frecuente- mente por induccin y represin
de catabolitos, la biosnlesis de enzimas ana- blicos puede estar
regulada por la represin feedback producida pOI el pro- ducto
final. la represin feedback se utiliza ampliamente en la naturaleza
para controlar la sntesis de aminocidos, purnas, pirimidinas y
vitaminas. En el mo- delo clsico de represin feedback (Fig. 2.13)
el gen regulador produce una pro- lena apo-represora, que,
combinada con un ca-represor (producto final), se une al centro
operador y bloquea la transcripcin. En ausencia de producto final,
no se produce la represin. tla. 2.13. -L--~~--ARN~~---S--~--_AD_N--
_ POllmerasa. / Apo-represor ~ ~ '--------- ""'I'!""J" Repeeso<
Co-represor R ~ -Apo-represor Ca-represor presente ADN pollmerasa S
ARN '.Transcripcin ~ Traduccin ARNm Sin ca-represor ~ EnZma
Representaci6n de un sistema enzimtico de represin por
retroinhibicin, 11101 OC11 11 11' itlS Mil IltlUltOlINISMOS DE USO
INDUSTRIAl. 41 MODULI>CION OC LA ACfIVIDAD t NZIMATlCA Muchos
enzimas tienen uno O ms centros distintos al cenlro activo, deno
minados centros alostricos, que ligan reversiblemenle metabolitos
particulares o molculas efectoras, produciendo un cambio en la
configuracin del enzima y por tanto aumentando o disminuyendo su
actividad. Las actividades de olros enzimas estn reguladas de forma
covalente, de tal modo que la formacin o degradacin enzimtica de un
enlace covalente en el enzima sirve para activarlo o inactivarlo.
Compuestos como el ATP, el ADP, el AMP y los nucletidos de la
nicotinamida, que reflejan el nivel de energa disponible de las
clulas, mo- dulan tambin la actividad enzimtica y controlan el
metabolismo ajustando el balance entre los procesos catablicos y
los procesos anablicos que consu- men energa. REGULl>CION DE LAS
RUTAS METABOLlCAS RAMIFICADAS Las rutas metablicas biosintticas
tienen frecuentemente una secuencia de enzima comn con
ramificaciones que conducen a la formacin de ms de un producto
final . Los microorganismos han desarrollado mecanismos de
retroali- mentacin (feedback), por los cuales la acumulacin del
producto final causa un efecto en el primer enzima de la rama que
conduce a ese producto. Adems, existen mecanisms en los que el
producto final de una ruta ramificada produ- ce la inhibicin
feedback parcial del primer enzima de la secuencia comn de forma
que el flujo de substrato que pasa a travs de esta secuencia se va
re- duciendo proporcionalmente. Este efecto se consigue a nivel
biolgico median- te el uso de isoenzimas y mecanismos de regulacin
feedback concertados y acumulativos (Fig. 2.14). Estos efectos
reguladores pueden ser de dos tipos: inhibicin de la actividad
enzimtica"y represin de la sntesis de enzimas. En los casos en los
que estn implicados los isoenzimas (mltiples formas de un enzima
capaces de catalizar la misma reaccin), la sntesis ojnhibicin de
cada forma enzimtica puede estar regulada por un producto fmal
distinto. En la regulacin feedback concertada, nicamente est
implicado un enzima, aun- que debe haber ms de un producto que
inhiba su actividad o reprima su sinte- siso En las regulaciones
feedback acumulativas, cada producto fmal produce una inhibicin o
represin parcial y son necesarios todos los productos finales para
bloquear completamente la actividad o la sntesis. AsImilacin del
substrato/secrecin del producto Para el rpido crecimiento celular
son necesarios unos mecanismos eficaces de flujo de entrada de
substrato y de salida de producto, as como el suministro 30. 42
U1OTECNOLOOlA DE LA FERMENTACION lSOENZIMAS r..--------------~/i E
A -::::::OS- C/ ,F_G --l . ~H I , '..--------------- , ~-----------
- -------------- - --' CONCERTADO E ------ -- ~ /' " O ' A -1-t>
B----+ C/ .F--+ C----~~-~ 'H--------- ----./' : ~ -- ----- - -- -
-- - --- - - ---- ----- - - - - - - ---' ACUMULADO r ------- - --
-------- -- [ : O...... , / A ~ . B ----+ C ~F____+ G t "'" ' I ~
___ ___ ___ ____ __ _ H : L _ __________ ____ __ ___ _____ .J Ag.
2.14_ Mecanismo de regulacin por retroinhibicin de rutas metabijcas
ramifi- cadas (reproducido con permiso de Dernaio, 1971). de
substrato para su conversin en metabolitos primarios y secundarios
y otros productos, y para la excreccin del producto. En los
procariotas, el substrato se mueve dentro y fuera de la clula
directamente atravesando las membranas asociadas con la envoltura
celular. Algunas fermentaciones bacterianas han si- do manipuladas
para alterar la membrana celular o la composicin de la pared con
objeto de modificar los mecanismos de entrada o facilitar la
excreecin (vase Capitulo 9: produccin de cido glutmico). Adems de
la membrana plasm- tica externa, los eucariotas tambin tienen un
extenso sistema de membranas y orgnulos internos. Algunos
materiales son transportados a la clula por en- docitosis, proceso
en el que una regin de la membrana plasmtica se invagina formando
una vescula que contiene el material proveniente del exterior de la
clula. La vescula se funde con otro orgnulo, un lisosoma primario,
forman- do un Iisosoma secundario en el que gran parte del material
externo es degrada- do y transportado al citoplasma. Los produclos
de degradacin se almacenan en veslculas hasta ser expulsados por
exocitosis (Fig- 2.15); estas vesculas estn presentes en gran nmero
en los pices de las hifas de los hongos. En conse- cuencia, en los
eueariotas, muchos de los procesos de transporte de substratos y
productos a travs de la membrana se producen entre el protoplasma
de la clula y orgnulos, como por ejemplo las vesculas y el reculo
endoplsmico. Los solutos son transportados a travs de las membranas
sin modificacin (a) por difusin pasiva a favor de un gradiente de
concentracin, (b) por difu- 0101..00 1/ DI! LOS MICROORO/NtSMOS DE
USO INDUSTRIAl. Lisosoma Membrana plasmtica Ha. 2.15. Proceso de
endo y exocitosis en los eucariotas. 41 sin facilitada por un
gradiente de concentracin, por medio de un sistema de transporte,
que, al igual que los enzimas, presenta cinticas de saturacin, y
(e) por transporte activo, que tambin implica un sistema de
transporte pero que permite el movimiento del soluto contra un
gradiente electroqumico. Los solu- tos tambin pueden modificarse
durante la translocacin por enzimas con pro- piedades vectoriales.
Las protenas de transporte especficas parecen ser responsables del
trans- porte de muchos solutos a travs de las membranas, algunos de
los cuales estn ligados a la energa y otros son inducibles. En la
biosntesis de algunos produc- tos extracelulares microbianos el
enzima biosinttico fmal puede estar asociado a la membrana y
funcionando facilita la excrecin. Por ejemplo, se ha implica- do a
las translocasas en la extrusin de exopolisacridos de las clulas.
SECRECION DE ENZIMAS Los precariotas y eucariotas Gram-posit.ivos
tienen una nica membrana plas- mtica en su superficie. Por el
contrario, las paredes celulares de las bacterias Grarn-negativas
tienen dos membranas separadas mediante un espacio peripls- mico.
Los enzimas extraeelulares, sintetizados por las bacterias
Gram-positivas, son transportados a travs de la membrana
citoplsmica, difundindose por la pared celular y acumulndose en el
lquido de cultivo extracelular. Los enzimas 31. 44 DIOTE NOLOOIA DE
LA FHRM 'NTAI ION rXI ",celulares o protenas secretoras son
sintetizados por los eucariotas en la 'lI[lcrOcie del retculo
endoplsmieo y transportados a travs de la membrana ni e,pacio de
dicho retculo. Las protefnas eonlenidas en estos espacios vesieu-
lures se procesan posteriormente en el aparato de Golgi y en otras
vesculas y ,c secretan al medio ambiente externo de la clula por
fusin de las vesculas eDil la membrana plasmtica (Fig. 2.16). La
glicosilaein de las protenas se pro- / '----1------+---+ Espacio
cisternal Exocllosls Vesfculas secretoras Aparato Retlculo de GOIgI
endoplsmlco rugoso Flg. 2.16. Ruta de secrecin de proteinas en los
eucariotas. duce en el espacio vesicular del retculo endoplsmico
yen los cuerpos de Gol- gi. Esta ruta secretora general parece ser
similar en los eueariotas superiores y en las levaduras y
probablemente se produzca en los hongos filamentosos, aun- que
pueden existir variaciones en el proceso. En las bacterias
Grarn-negativas muchos enzimas son transportados a travs de la
membrana citoplsmica y se localizan en el espacio periplsmico. Las
protenas secretadas a travs de las membranas contienen usualmente
un pptido amno terminal de extensn, denominado secuencia seal. El
ppti- do seal, que sobresale del ribosoma, interacciona con la
superficie ms interna de la membrana plasmtica de la bacteria o con
el re((culo endoplsmico de los eucariotas, formando un poro o
canal. A medida que el polipptido se elon- ga pasa a travs del poro
en la membrana, en un proceso conocido como secre- cin
co-traduccional, y una peptidasa seal localizada en la parte
externa de la membrana elimina el pptido seal, permitiendo a la
protena asumir su es- tructura tridimensional normal_ En la Figura
2.17 se muestra un diagrama acer- ca de la hiptesis seal para la
secrecin eo-traduccional de la protena. A1gu- OIOtOOlA UI toS MI(
KIIUUOANISMOS DE USO INOUSTR IAI 1; =:-0 ~ ,92 R' -_"senal i =
~~a== r del rlbosoma Receptor ~sel'al Centro de accin de la
peptidasa senal Flg. 2.17. Representacin de la secrecin
cO-lranslacional (reproducido con permiso de Priest, 1984). nas
protenas extracelulares son secretadas despus de que han sido
sintetizadas en un proceso (que tambin implica un pptido seal)
conocido como secrecin post-lraduccional. 32. Captulo 3 Sistemas de
fermentacin Procesos continuos y discontinuos Las fermentaciones
pueden Llevarse a cabo mediante procesos discontinuos, discontinuos
alimentados a intervalos o continuos as como por variaciones de
estos procedimientos. Los cultivos discontinuos..pueden
considerarse como un sistema cerrado, excepto para la_aireagn.,
q~co~tiene ~a c;:mad hmirada- de medio, en el que el inoculado pasa
a travs de un nmerode fases-;5egn se muestra en la curva tpica de
crecimiento discontinuo (vase Fig. 2.6). Mien- tras que en el
cultivo discontinuo todo eLsubslralQSe aade al comienzo de la
fermentacin, en los procesos discontinuos alimentados el substrato
se va aa- diendo a intervalos a lo largo del proceso; esta forma de
trabajo elimina los efectos de represin por las fuentes de carbono
uWizables rpidamente, reduce la viscosidad del medio y los efectos
de los constituyentes txicos, o simplemen- te, hace que la etapa de
formacin de producto sea lo ms larga posible. Los sistemas de
cultivo discontinuo alimentados a intervalos, o continuos, se
utili- zan en la mayora de los procesos de fermentacin industrial y
estn particular- mente adaptados a los procesos de fermentacin en
los que el producto se for- ma mayoritariamente despus de la fase
de crecimiento exponencial. La princi- pal desventaja de las
fermentaciones discontinuas cuandQ ~e util~ para la pro- duccin de
productos asociados al crecimiento, es que la formacin eficiente de
producto tiene lugar nicamente durante una fraccin del ciclo de
fermenta- 47 33. 48 Inoculacin BIOTECNOLOGIA DE ~A FERMENTA ION
Ciclo de lermentacin FOnT'Ia'cln de producto eficaz I I Proouclo
Tiempo Recoleccin del producto Lavado del fermentadO! Formacin de
lotes Esterilizacin Inoculacin Formacin de producto eficaz Ag. 3.1.
Ciclo de fermentacin discontinuo. cin_(Fig. 3.1). Los sistemas
continuos con volmenes de salida de producto 'ele- vados pueden
ser, en consecuencia, mucho ms eficaces en determinadas aplica-
ciones en trminos de productividad del fermentador (volumen de
produccin por unidad de volumen por unidad de tiempo, Kgm - 'h -
'). Las fermentacio- nes continuas pueden considerarse como un
sistema abierto en que el medio se va aadiendo continuamente al
biorreactor y se va eliminando simultnea- mente igual volumen de
medio fermentado. Existen dos tipos principales de reac- lores
continuos, los reactores de mezcla completa y los de flujo pistn.
En un cultivo discontinuo, la concentracin de biomasa por unidad de
tiempo (t) es: Donde x XR x- x.= Y(S. -s) concentracin celular en
el tiempo t inculo o concentracin celular inicial rendimiento para
el substrato limitante (g de biomasa por g de subs- trato
consumido) s = concentracin de substrato en el tiempo t SR
concentracin inicial del medio Por tanto x - )(R r=-- S.-s SISTEMAS
DE FERMENTACION 49 La cantidad de biomasa alcanzada en la fase
estacionaria depende lerica- mente de la concentracin inicial del
substrato limitan!e del crecimiento y de la eficacia del organismo
para convertir el substrato en material celular. Por tanto.
suponiendo que el substrato limitante del crecimiento sea S = Oen
la fase estacionaria r=-x-XR S. En un reactor continuo de mezcla
completa en una sola etapa, la adicin de substrato a una velocidad
adecuada combinada con la eliminacin a una ve- locidad volumtrica
igual de medio de cultivo del recipiente produce un estado
estacionario en el que la formacin de biomasa est en equilibrio con
la prdi- da de clulas. En estas condiciones: (a) La velocidad de
crecimiento especfico (JL) viene controlada por la ve- locidad de
dilucin (D) puesto que JL = D (b) La concentracin de substrato en
estado estacionario, T en el quimos- tato viene determinada por la
velocidad de dilucin, segn la ecuacin: si las cinticas siguen el
modelo de Manad y D < JLma, (e) La concentracin de biomasa en el
estado estacionario, )( viene deter- minada por las variables
operacionales SR y D, segn la ecuacin: x= r[s.- K,O J_ llm u~-j)
Estas ecuaciones se deducen de la Figura 3.2. En la Figura 3.3 se
muestra el efecto de la velocidad de dilucin en las con-
centraciones de substrato y biomasa en estado estacionario yen la
productivi- dad de biomasa. Como se ve, a medida que D se aproxima
a JLm",' la concen- tracin residual del substrato timitante
necesaria para soportar el aumento de velocidad de crecimiento se
eleva, y por tanto la concentracin de substrato tam- bin aumenta
(hasta el lmite superior s = SF) mientras que la de biomasa dis-
minuye. Cuando se emplea un sistema de cultivo en continuo, por
ejemplo en el proceso de fermentacin industrial de produccib de
protenas de organis- mos unicelulares, la cantidad de clulas
producidas por unidad de tiempo (ve- locidad de produccin) y por
unidad de substrato utilizado ('Y) deben ser mxi- mas. En estado
estacionario, la velocidad de produccin ser igual al producto de la
velocidad de flujo por la concentracin celular. Para que la
produccin 34. 50 UlOTECNOLOO IA DE LA FERM ~N IAllON I.u velocidad
de dilucin D (h- 1), que representa el flujo del medio en el
quimoslalo Imr unidad de volumen de liquido contenido se define
como: f) = Fj J' donde V ~ volumen (m') F ~ velocidad de flujo (m'
h- 1) 1:.1 cambio neto de biomasa con el tiempo, suponiendo que
todas las clulas son viables, puede expresarse como: dx/dl=
crecimiento - produccin =ILt- Dx En estado estacionario la
concentracin de clulas en el reactor es constante, por tanto: d.{d/
= O x = D. II=D Cuando D :S;. 0,9 .umax' la velocidad de produccin
celular en el fermentarlor est exacta- mente equilibrada con la
velocidad de produccin celular, y en estado estacionario esta
condicin se cumple (x = constante). Por otro lado, cuando el valor
de D es similar al de Pomu' la produccin de clulas en el efluente
es superior a su velocidad de produc- cin por crecimiento en el
fermentador y se produce el colapso, siendo dx/dt negativo 1" est
relacionado con la concentracin de substrato (s) medianle la
ecuacin de Monod Ilm:uS 1'= - - I,+s Enestado eslacionario, lA. =
D. y para el modelo cintico de Manad de crecimiento celular D= J1
mllll T K~ +T donde ses la concentracin de substrato residual en
estado estacionario Ilmlu - D como D - J.Lmax' entonces s-SR La
concentracin de biomasa en el quimostato en estado estacionario
para el caso de una alimentacin estril (XR o X F = O), viene dado
por x= reS.- $) por tanto cuando D -- J.L m ,x -- O Lo
productividadde biomasa, P' para un proceso de fermentacin continuo
en esta- do estacionario viene dada por c: .18. 3.1. Cln~li c8s del
cultivo continuo. ~o ~ 0 E o :o ~ u ~ no ~ SIS liMAS t)l'
FPRMnNTACION Velocidad de dilucin (O) p' e x ~ J s, Aa 3.3.
lnftuencia de la velocidad de dilucin en las concentraciones de
biomasa Ix) y substralo (S) en el estado estacionario y
productividad de la biomasa (P;J. celular sea mxima, la velocidad
de dilucin deber ser alta, aunque no tanto que exceda a I"max o se
produzca la prdida de material. La productividad m- xima,
oombinando una produccin elevada con una utilizacin de substrato
efi- caz, se obtiene a una velocidad de flujo igual a la mxima
velocidad de produc cin, o ligeramente inferior, y con la mayor
concentracin de substrato posible prcticamente en el flujo de
alimentacin. En los procesos de produccin de algunos metabolitos
primarios, se pueden adoptar medidas similares para optimizar las
condiciones del quimostato. Sin embargo, en el caso de metabolitos
secundarios, en el que el producto no va asociado al crecimiento,
no se puede utilizar un nico quimostato de mezcla perfecta, sino
que deben emplearse quimostatos multietapas para permitir que
prevalezcan distintas condiciones medioambientales en las etapas
separadas, si las condiciones ptimas paJa el crecimiento y la
formacin de producto son di ferentes. los quimostatos que
incorporan procesos de reciclado de biomasa oon centrada para
incrementar la concentracin de biomasa en el reactor han en-
contrado aplicaciones industriales en la produccin de alcohol y en
el tratamiento de efluentes. En los reactores de flujo pistn, el
cultivo fluye por un reactor tubular sin mezcla en contracorriente.
En la entrada del reactor se van aadiendo conti- nuamente las
clulas y el medio, por lo que la composicin del medio, la con 35.
52 BIOTECNOLOGIA DE LA FERMENTA ION ~cl1lracin de biomasa y las
concentraciones de producto varan con la longitud del rcactor de
una forma anloga a los cambios ocurridos a lo largo del tiempo ell
1111 fermentador discontinuo. Usualmente debe incorporarse un
sistema de Icriclado de la biomasa para obtener un ineulo continuo
en la entrada. Bisco del fermentador La funcin principal de un
fermentador es la de proporcionar un medio am- biente controlado
que pennita el crecimiento eficaz de las clulas y la forma- cin de
prOdUct:-EI fermentador tpico moderno de laboratorio se ha diseado
como una unidad sofisticada con las caractersticas y la
instrumentacin nece- sarias para llevar a cabo una gran variedad de
procesos de fermentacin. A la hora de discutir acerca de los
fermentadores poto, debera recordarse que los fermentadores a
escala duroduccin industriilsOsualmente unidades cons- truidas a
medida teniendo en cuenta los costos y objetivos esped lCOS, y
disea- das parali"proceso oUa serie de procesos relaciOados, y en
consecuencia, nicamente tienen las caractersticas e instrumentacI n
especl- icados para un proceso de produccin particular. ---
CONDICIONES PARA OPERAR EN MEDIO ASEPTICO Muchos biorreactores
tienen que trabajar en condiciones aspticas utilizan- do un inculo
puro del microorganismo y excluyendo los organismos contami-
nantes; por consiguiente, el biorreactor, al igual que la red de
tuberias asocia- das, ha sido diseado como un recipiente a presin
de tal forma que tanto el ,istema como el medio que contenga puedan
esterilizarse a la temperatura/ pre- sin adecuadas, un minimo de
121 C/ 15 psi durante 15-30 minutos. Las vlvu- las utilizadas en
las secciones esterilizables deben ser utilizadas en condiciones
aspticas. Las vlvulas de estrangulamiento y las de diafragma son
particular- mente adecuadas, puesto que su mecanismo de operacin
est separado del me- dio Ifquido o gaseoso por un tubo O un
diafragma flexible. Los puntos de entra- da al recipiente yel
proceso para aadir y eliminar gases o lquidos al/del reac- lor
durante la fermentacin tambin deben estar diseilados de forma que
man- tengan las condiciones aspticas (Thbla 3.1). En la Figura 3.4
se ilustra una vl- vula de muestreo asptica. No todos los procesos
de fermentacin necesitan condiciones totalmente es- triles; en
algunos se reduce simplemente su contaminacin por pasterizacin,
mientras que otros dependen realmente de la poblacin microbiana
natural, por SISI [MAS DE I'[RMENMCION Tabla 3_1. Diseno del
fermelllador y operaciones relacionada, con el ",",1Ie nimiento de
su eSlerilidad Componente o proceso FundamenlO 1. Recipiente 2.
Entrada y salida al fermentador 3. Tuberfas 4. Vlvulas 5.
Prensaestopas y cojinetes del agitador Diseftado para ser
esterilizado con vapor a presin, resis~ tente a la corrosin qumica
y con materiales no txicos para el organismo Esterilizables con
vapor de agua Sin bolsillos o espacios muer- tos, inclinadas hacia
el punto de drenaje Adecuadas para operar asp- ticamente. Los
materiales de construccin deben ser ca- paces de tolerar las condi-
ciones de temperatura y presin del proceso y ser resistentes a los
componen- tes qumicos utilizados Sellados para trabajar en
condiciones aspticas prolongadas Ejemplos o comentarios (a) Vidrio
de un espesor apTO piado para fermentadores pequeftos y mirillas
(b) Acero inoxidable resis- tente al pH del proceso las ....lvu1as
varan en su grado de idoneidad. Las vlvulas de compresin y las de
diafrag- ma son especialmente aptas para uso asptiro. pueSlo que su
mecanismo est separado mediante un lubo flexible y 1.Ul diafragma,
respectivamen- te, del caldo o del gas que fluye (a) Capas de
asbesto o de hi- los de algodn empaque- tados contra el eje (b)
Cierres: forros de metal, las condiciones aspticas se mantienen por
contacto superficial uniforme de precisin entre un forro de cierre
giratorio y el estacio- nario del eje del agitador. En los cierres
mecnicos, el componente estacionario y el giratorio se mantienen
juntos mediante resortes o fuelles que se expanden (e) Dispcsitivos
de agitacin magnticos que no pene- tran en d recipiente. Un eje
externo hace giw al eje de un agitador interno me- diante una
fuerza magntica 36. 54 B10TECNOLOOlA DE LA FERMENTACION 'TilMa 3,1.
Continuacin Componente o proceso Fundamento (,. Entrada de gas 7.
Salida de gas 8. Alimentacin de aditivos 9. Alimentacin, inculo y
lneas de muestreo Filtro de aire para esterilizar el aire que
entra. EsteriLizable con vapor de agua. Vlvula de no retomo situada
entre el difusor y el fUtro de aire para evitar el flujo en
conLraCo Triente del medio a1 filtro Diseado de forma que no se
produzca la contaminacin por flujo en contracorriente Alimentacin
esterilizada por calentamiento o filtracin Esterilizables con vapor
de agua antes y despus de su uso Ejemplos o comen/arios (a) Lana de
vidrio, fibra de vi drio u otro material empa- quetado que atrapa
fisi- camente las particulas (b) Filtro de membrana plega da
fabricado con ster de celulosa, niln polisulfona u otros materiales
El nitro de salida puede utili- zarse cuando no se desee la
liberacin de organismos del cultivo al medio ambiente Acido, lcali
(liquido o gaseoso), carbohidrato, .... precursor Secuencia de
muestreo (vase Fig. 3.4): (a) apertura de las vlvulas 2 y 3 para
esterili- lar la tuberfa, (b) cierre de la vlvula 3, (e) apertura
de la vlvula 4 para enfriar la tuber!a estril caliente antes de
introducir la muestra, (d) cierre de la vlvula 4, aper- tura de la
vlvula 1, (e) desechar el cultivo del es- pacio muerto, (O recoger
la muestra, (g) cierre de la vl- vula 1, (h) repetir (a) y (b) lo
que el diseo del reactor y del equipo necesarios para cada proceso
deben simplificarse de acuerdo con esto. AIAEACION y MEZCLADO El
proceso de fermentacin industrial aerobio debe disponer de un
sistema de aireacin y mezclado del cultivo. El reactor de tipo
tanque con agitacin con- vencional incluye un sistema de agitacin
mecnico consistente en un eje verti- cal con varios agitadores, en
tanto que la mayora de los biorreactores de platos SISTEMAS DE
FERMENTACION Vapor de agua 3 f-.....o-'-_.,. 4 2 ~Muestra 55 Fig.
3.4. Puerta de muestreo asptico. Los nmeros 1, 2 Y 3 corresponden a
vlvulas. (Rushton) estn equipados con turbinas de discos
localizadas a lo largo del eje y con dimensiones controladas para
conseguir un buen mezclado y una buena dispersin a...travs del
medio. Adems disponen de varios deflectores (usual- mente entre 4 y
6) cuya anchura representa el LO "', del dimetro del recipiente,
localizados a lo largo del permetro del reactor con objeto de
incrementar la turbulencia. El aire estril se introduce por la base
del tanque, normalmente por un anillo pulverizador, y es dispersado
eficazmente a travs del medio por la accin del sistema de agitacin.
En la Figura 3.5 se esquematizan los compo- nentes del sistema de
agitacin. La geometria de los fermentadores aireados debe disearse
de forma que se facilite la eficacia del intercambio gaseoso. Las
caractersticas finales deben tener en cuenta los fenmenos de
transporte que existen en los procesos biolgicos. Flujo de fluidos
Los fluidos se denominan newtonianos cuando su flujo obedece a la
ley de viscosidad de Newton. Supongamos que un fluido est contenido
entre dos pla- cas paralelas de seccin A separadas una distancia X;
si una placa se mueve en una direccin a una velocidad constante, la
capa de lquido adyacente a la placa que est en movimiento tambin se
mover en esa direccin impartiendo parte de su momento a la capa ms
prxima, haciendo que se mueva a una velocidad ligeramente inferior.
La ley de Newton de la viscosidad establece que la fuerza 37. S6
D1OTECNOLOGIA DE LA FERMEN IA( ()N Relaciones geoml!lcas lIp1cas
Dellector H V 02.5 - 3.0 f -- O 1D . w AI ~ 0.25 - 0.33H i- D I L
Agitador de turbina de disco I ~ ET~- h 025 Y I 4 I+-l T d .d aw Wy
0.75 - D. 5 1---d----+l Z Entrada de aire .(fI .l!ri.,t'U'
,'("l,lllml'(!' kallam)"Cfll(U.1 /'''/1 /11111 )'(1'1 nlt'(/l f -
-- - Produclo Reologlo del cultivo Hidroxilaci6n de esteroides
Glucoamilasa Penicilina Estreptomicina Kanamicina Novobiocina
Binghnm PscudoplSlico PseudoplSlico Bingham Bingham Bingham La
velocidad de transferencia de masa entre las fases lquida y gaseosa
est fuertemente influenciada por la solubilidad del gas en la fase
Uquida. El oxge- no es poco soluble en soluciones acuosas, y en
consecuencia, en muchos proce- sos de fermentacin aerobios el
suministro de oxgeno es el factor crucial deter- minante de las
velocidades metablicas por la que la transferencia de masa del
oxigeno tiene un papel importante en el diseo del fermentador.
Transferencia de oxrgeno La transferencia de oxgeno a la clula
durante la aireacin del fermentador implica la transferencia de
oxgeno desde las burbujas de aire a la solucin, la transferencia de
oxgeno a travs del medio a la clula y finalmente la absorcin Jel
oxgeno por la clula. La transferencia de oxigeno a partir de las
burbujas de aire a la solucin, que es la etapa limitante de la
velocidad en las fermenta- ciones en medios no viscosos, y que es
incluso an ms limitante en las fermen- taciones en cultivos
viscosos, puede ser descrita por la ecuacin: deL _ , - = ALII(C* -
eLI di ' donde CL es la concentracin de oxgeno disuelto en el seno
del lquido (mmol dm -') I es el tiempo (h) dCl/dl es el cambio de
la concentracin de oxgeno con el tiempo (mmo les dm - 'h - 1) o la
velocidad de transferencia de oxgeno (arR) Kl es el coeficiente de
transferencia de masa (cm h -1) aes la superficie interfacial
gas-lquido por volumen de lquido (cm' cm - ') C* es la concentracin
de oxgeno disuelto en saturacin (mmol dm - '). A I atm y 30 oC la
solubilidad del oxgeno en agua es de 1,16 mmoles dm -'. Kla,
coeficiente de transferencia de masa volumtrica (h - 1), es una
medio 'ilS II 'MAS 111 ' I ~RMCNTA ION da de la cUllndd"d de
Hileacin del fermentador en las condiciones de la prueba (a mayor
valor de K,u, mayor es la capacidad de aireacin). La concentracin
de oxigeno disuelto en el medio del fermentador ser el balance
entre el sumi nistro de oxigeno disuelto y la demanda por parte de
los organismos. uando en el fermentador Kla es demasiado baja para
satisfacer la demanda de oxge no de los organismos, las
concentraciones de oxgeno disuelto caern por deba- jo del nivel
crtico (C"it), usualmente inferior a 0,05 mmol dm - '. Por tanto,
el Kla del fermentador deber ser suficientemente grande como para
mante- ner la concentracin de oxigeno disuelto ptima para la
formacin del produc- to. Entre los factores que influyen en el
valor de Kla alcanzado en un fermen- tador de una geometra dada se
incluyen la velocidad de flujo de aire, la veloci- dad de agitacin,
(por ejemplo la velocidad de rotacin de los agitadores), las
propiedades fsico-qumicas y reolgicas del cultivo y la presencia de
agentes antiespumantes. Cuando una fermentacin se aumenta de escala
es importante que en la escala mayor se utilice el valor ptimo de
KLa encontrado a escala ms baja. Por consiguiente, tanto KLa como
el conocimiento de los factores que influyen en su valor son
importantes a la hora de disear y aumentar de escala un proceso de
fermentacin. En particular, en las fermentaciones de fluidos no
newtonianos la estrategia de aumento de escala intenta mantener
constantes la velocidad punta y el valor de KlQ variando en el
tanque ms grande el dime- tro de los agitadores frente al dimetro
del recipiente. Transferencf'a de energra Para que el crecimiento,
metabolismo y transferencia de masa se produzcan a las velocidades
deseadas, debe suministrarse o eliminarse energa del reactor.
Durante la esterilizacin y durante los procesos de control de la
temperatura se intercambia calor. En el metabolismo se produce
energa metablica que se d.isipa en fo:~a de calor, y tiende a
elevar la temperatura del caldoje fermenta- c,n. Thmb.en se puede
generar calor como resultado de la energa mecnica necesaria para
los procesos de agitacin y de aireacin. Cuando los biorreacto- res
funcionan a temperaturas superiores a la ambiente, se necesita una
fuente de calor para mantener la temperatura. Las exigencias netas
de calentamiento o enfriamiento externo del fermentador se
determinarn realizando un balance entre los procesos que generen y
consuman calor siendo necesario usualmente utilizar cambiadores de
calor. En los fermentadores la transferencia de calor se produce
mediante circulacin de agua a travs de una camisa por el exterior
del recipiente o mediante serpentines situados dentro de los
reactores. Las fer- mentaciones aerobias son usualmente exotrmicas
durante las fases de crecimiento y metabolismo activos y exigen
refrigeracin para controlar la temperatura. 39. 60 BIOTECNOLOGIA DE
LA FERMENTACION Ih/('II 10- ' para las turbinas Rushton) '1 dimetro
del agitador (cm) velocidad de rotacin del agitador (cm s - ')
densidad del lquido (g cm - ') viscosidad del nuido Cuando se agita
un liquido newtoniano no gasificado en un recipiente pro- visto de
deflectores, la entrada de potencia al lquido (la potencia
absorbida por el lquido) puede representarse por otro nmero
adimensional, el nmero de po- tencia (Np)' P v-- -P- {J.' ' D'
donde P es la potencia externa del agitador (no gasificado) En un
fermentador agitado equipado con defectores, el nmero de potencia
est relacionado con el nmero de Reynolds mediante la ecuacin: donde
e es una conSlante dependiente de la geomtria de la vasija e
indepen- diente de su tamao y z es un exponente. Por tanto _ P_
=C[(D 2 .I'Pl'] pN' D' '1 de forma que los valores de P a distintos
valores de N, D, ~ Yp pueden determi- narse experimentalmente. Las
potencias tpicas para fermentadores de 100,2.500 Y50.000 1de
capaci- dad son de 1-2, 15 Y 100 Kw respectivamenle. OTROS DISEOS
DE FERMENTADORES Sistemas de cultivo sumergidos En la produccin de
vinagre se ulili.a especialmente un reactor tanque con agitacin
aireado modificado, el Frings acetaton>. En este aparato el aire
es SISTEMAS DE FERMENTACION (,1 aspirado y distribuido mediante un
rotor de turbina de cuerpo hueco de nllo velocidad, conectado a una
tubera de succin de aire. El aireador es aUloa,pi- rante y por
tanto no se necesita aire comprimido (vase Fig. 7.8). El reactor de
tipo tanque con agitacin es el biorreaclor ms utilizado en las
fermentaciones aireadas debido a su fiabilidad y flexibilidad. No
obstante, los costes de mantenimiento e inversin son relativamente
elevados, y adems se plantean problemas a la hora de disear
agitadores pala los fermentadores muy grandes debido a la longitud
del eje del agitador. En los biorreactores sin agitacin mecnica,
como los biorreactores tipo torre y los de bucle, la airea- cin y
el mezclado se llevan a cabo utilizando caudales de gas elevados.
En los fermentadores tipo torre (Fig. 3.7) el aire se introduce por
la base del aparato y el mezclado se produce por las burbujas
ascendentes, de forma que la fuerza de cizalla que sufren los
organismos es mnima. Este tipo de fer- menladores se ha utilizado
para producir cido ctrico, con grnulos de A. ni- Tubo de
clarlflcacin Indicador de temperatura Salida de aire ~J"_ Salida de
liquido Dellector Entrada de aire .. . Punto de mueSl reo Ha. 3.7.
Fermentador lipo torre (reproducido con permiso de Kristiansen y
Chamber- lain, 1983). 40. (,2 ulen E(;NOIOOIi DE 1i H 'HMI N
111< IoN Uf" Y~cpa> de Candida guilliermortdii, y tambin para
la Ilrouucch1I ue vlna- ~IC, Illcohol industrial y cerveza. Como el
mezclado vertical"" rclullvamcnte 111010 en los fermemadores de
tipo torre, se puede operar de forma continua, con alimentacin por
la parte baja y salida por la parte alta, consiguindose as! una
retencin de biomasa elevada. En los fermentadores tipo torre no
airea- dos, utilizados en la produccin de cerveza O de alcohol
industrial, la retencin de biomasa es mxima cuando se emplean
levaduras de fermentacin con bue- nas propiedades floculantes. El
biorreactor de bucle impulsado por aire contiene un tubo interno o
exter- no, a veces con deflectores, que incrementa el mezclado al
forzar un flujo direc- cional en el seno del lquido (Fig. 3.8). La
fuerza impulsora de la circulacin se crea por la diferencia de
densidad (debida a diferencias en la cantidad de bur- bujas de aire
dispersadas) entre las secciones de !lujo ascendente y descendente.
En el reactor de este tipo diseado por ICI, por ejemplo, el aire se
introduce por la base del fermentador y pasa a la solucin por la
presin hidrosttica de la columna (vase Figs. 6.1a y 6.1e). En el
captulo 6 podr verse que se han utilizado con xito diseos similares
para la produccin de biomasa a partir de organismos unicelulares.
En el cultivo de caldos micelianos filamentosos visco- sos para la
produccin de protenas de organismos urucelulares se han desarro-
llado sistemas de agitacin y tubo de recirculacin combinados (vase
Fig. 6.1f). Alc. t Aire lal :;;; o '.o o o o' o Aire Ibl Jile. 3.8.
Biorreactor con bucle interno (a) y externo (b) (reproducido con
permiso de Smith, 1985). 'I1~11 Mil 111 1I HMI N1lit ION 111 En las
fcrmcnlnckll1cs IlIdu,ltlub mn ,lulas de animales y plantas, I1lt!.
MIS cepliblcs a ,ufrir donos lUI as IUCI L.1> de cizalla que las
clula!> microbinllus, se han aprovcchado IU$ vcntaJas del menor
efecto de cizalla de los fermentadt) res agitados por airc. En los
sistemas de tratamiento de aguas residuales con lodos activados be
han utilizado algunas variaciones de eslOS tipos de reactores de
cultivo sumeri do. El proceso convencional se basa en la agitacin
vigorosa con aire u oxige- no inyectado por difusores de burbujas,
paletas, agitadores, etc. (Fig. 3.9). Tam- bin se han desarrollado
sistemas de cultivo sumergido basados en los funda- mentos del
fermentador de bucle impulsado por aire (Fig. 3.10). Los recientes
y dramticos progresos en el cultivo de clulas de animales y en la
tecnologa de hibridomas han conducido al desarrollo de nuevos
proceso> de cultivo industriales para la elaboracin de productos
derivados de clulas ani- males. La forma ms simple de crecimiento
de clulas de mamferos es en culti vos en suspensin. La mayora de
las clulas de origen leucmico u Iinfoideo crecen como clulas
individuales en cultivos en suspensin estacionarios o agi- tados.
Muchas clulas dependientes de anclaje pueden no crecer en cultivos
en suspensin, a menos que se empleen procedimientos especiales. El
mtodo ms prometedor en tales casos utiliza perlas
microtransportadoras, fabricadas con polfmeros naturales o
sintticos, como soportes de las clulas. Entre los proble- mas
asociados con la produccin a gran escala de clulas animales en
cultivos en suspensin se incluyen las densidades celulares
limitadas conseguibles en los sistemas de cultivo convencionales y
la sensibilidad de las clulas a las fuerzas de cizallas. Se han
utilizado fermentadores agitados suavemente de forma me- cnica o
por aire, as como reactores de tipos ms modernos. La encapsulacin,
Q, ". ..Incorporacin " '.r .'de arre "!,~ .. .~: '. ';' :.... t }
,:,., ,.; :', ;',:...:. .:,! ;" w ,. '.. , ". :.J,', ~. "." ......
...:.'.;.:~J: ?_r-----------------------~ ~.- . Ha. 3.9.
Biorreactor de lodos activos (reproducido con permiso de Smith,
1985). 41. 1I1C)t heNOLO olA DI> LA i'l' RMI 'N IAI 'ION Airo ~
- nec!. ImJu Ju loUutl - """'>t--:--I I 'e==-- '- Y;:;:- Salid.
;., f'--- Aire inicial t I l ', ._____ II(IC l( l(loe ~ /Aire
procesado ,,, I I F Descendente Ascendente .:- Revestimiento del
reaClor Fig. 3.10" Planta de traramiento de efluentes del tipo de
pozo profundo. (Reproducido eOIl permISO de Wheatley, 1984). de
clulas de hibridoma en perlas de alginato permite emplear reactores
de tipo tanque con agitacin, producindose concentraciones elevadas
de clulas yan- tlc~erpos d~ntro de la cpsula. Otro mtodo implica el
uso de sistemas de per- fUSin, eqUIpados can tubos porosos y
membranas semip