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Science, 307:1965 (2005)
Science, 307:1965 (2005)
At Arrow of intermediate IPTG Concentration:Gene 1 is still at low copy numberwhen Gene 2 is switched off.==> This will be seen in the Noise of the cascade
Gene 2Gene 1
Usage of Transfer Functions!
Stochastic GenesFrom Concentrations to Probabilities
Genes can be viewed as nodes in a complex network, with input being proteins such as transcription factors, and outputs being the level of gene expression. The node itself can also be viewed as a function which can be obtained by combining basic functions upon the inputs (in the Boolean network described below these are Boolean functions or gates computed using the basic AND OR and NOT gates in electronics). These functions have been interpreted as performing a kind of information processing within the cell which determines cellular behaviour. The basic drivers within cells are levels of some proteins, which determine both spatial (tissue related) and temporal (developmental stage) co-ordinates of the cell, as a kind of "cellular memory". The gene networks are only beginning to be understood, and it is a next step for biology to attempt to deduce the functions for each gene "node", to assist in modeling behaviour of a cell (see systems biology).
Mathematical models of GRNs have been developed to allow predictions of the models to be tested. Various modeling techniques have been used, including Boolean networks, Petri nets, Bayesian networks, graphical Gaussian models, Stochastic Process Calculi and sets of differential equations.
„Robuste“ vs. „ultrasensitive“Schalter
Einfaches Netzwerk mit positiverRückkopplung
Ohne Hysterese:Ultrasensitiver Schalter, rauschinduziertesSchalten
Mit Hysterese:Robust gegen Rauschen (Konzentrationvon A bleibt gering, falls anfänglicheKonzentration gering)
memory-less switch bistable switch
Hysterese
Ohne Hysterese:Ultrasensitiver Schalter,rauschinduziertes Schalten
Einfaches Netzwerk mit positiver Rückkopplung
Mit Hysterese:Robust gegen Rauschen (Konzentrationvon A bleibt gering, falls anfänglicheKonzentration gering)
Robuste Schalter / Bedeutung der Hysterese
Protein A = key regulator
active when present as a multimer.
multimerization => nonlinear dynamics ofthe system
production of A, f(ap)described by Hill-type function.
deactivation rate,described by a linear-type function, f(ad)
Bistable genetic Switches
Eigenschaften des Lac Netzwerkes
Die Induktion der lac syntheseist ein Alles-Oder-Nichts Prozess
Die Eigenschaft des genetischenZustandes kann vererbt werden
Novick & Weiner 1957
Der Lactose Abbauwegeine hierarchische Betrachtung
Molekulare WechselwirkungenZelluläres Netzwerk
Heterogenität in der Populationsdynamik
Zeitliches Verhalten des lac-Operon Schalters
Vilar, J.M.G et al, J.Cell Biol. 2003
Niedrige Induktor-Konzentration:
time (generations)
time (generations)
[β-g
alac
tosi
dase
]
[β-g
alac
tosi
dase
][β
-gal
acto
sida
se]
Hohe Induktor-Konzentration:
Verschiedene Farben Verschiedene Zellen=> Nicht alle Zellen schalten gleichzeitig!Durchgezogene Linie: Mittel über 2000 ZellenRote dots: Experiment (Novik, Wiener, PNAS 1957)
Gen-Regulation mit Feedback:lac-Operon
LacI
IPTG, TMG
Modell für lac Netzwerk
GlukoseKonz.konstant
GFP: Reportermolekül, Abbildung durchFluoreszenz-Mikroskopie=> je höher das Fluoreszenz-Signal destomehr LacZ,Y wird exprimiert
Experimenteller Nachweis eines Schalters mitHysterese
Anfang: nicht induziert
Nach Induktion 2 Populationen:induzierte Population grün, nichtinduzierte Population weiß
Bistabiler Bereich (grau)
Pfeil zeigt den Anfangs-Zustand Zustand derBakterien hängt vom Ausgangs-Zustand ab!
=> Schalter mit HystereseOzbudak et al, Nature 2004
Modell für lac Netzwerk
( )nT
x
y
xxR
R
xydt
dx
yRRdt
dy
0
0
1
1
1
1
+=
!=
!+
=
"#
$#x: intracellular TMG concentrationy: concentration of LacY (permease) (measuredin GFP fluorescence units)R: concentration of active LacI (repressor)RT: total concentration LacIn: Hill coefficient (LacI is tetrameric, but 1TMG is sufficient to interfere with LacI activity)
α: maximal activity level (if all repressors wereinactive)β: transport rate, TMG uptake rate per LacY
: repression factorR0: half saturation concentrationx0: half saturation concentrationτx, τy: time constants
2!n
01 RR
T+=!
steady state:
( )( )2
2
1
y
yy
!"
!#
+
+=
Ozbudak et al, Nature 2004
Phasendiagramm
01 RR
T+=!
α: maximal activity level (if all repressorswere inactive)β: transport rate, TMG uptake rate per LacY
: repression factor
• große ρ: diskontinuierlicher Übergang vomnicht-induzierten zum induzierten Zustandentspricht Phasenübergang 1. Ordnung,thermisches Rauschen wird durchchemisches Rauschen ersetzt
• kleine ρ: kontinuierlicher Übergang vomnicht-induzierten zum induzierten Zustandentspricht Phasenübergang 2. Ordnung
• in Wild Typ Bakterien wurden nurdiskontinuierliche Übergange beobachtet
=> Konstruktion einer Mutante
Ozbudak et al, Nature 2004
Phasendiagramm
[TMG](Inducer)
Fluorescence Intensity, [LacY]
Erniedrige ρ unter Wild Typ Niveau!
Mutante mit zusätzlichenBindungsstellen für LacI Repressor (b:4,c:25) => Reduktion der effektiven LacI(Repressor) Konzentration => Reduktionvon ρ
Fig c: Kontinuierlicher Übergang vomnicht-induzierten zum induziertenZustand!, kein Schalter
(entspricht einem Phasenübergang2. Ordnung)
Die Dynamik des Schaltverhaltens: Vergleich von Experimentund stochastischer Simulation (rot)
Quorum Sensing
Tintenfisch mit Scheinwerfer
Phänomen:Tintenfisch (Euprymna scolopes) emittiertnachts Licht=> wird im Mondlicht nicht als Beute erkannt
Erklärung:
Lichtorgan des Tintenfisches sammeltluminiszente Bakterien (Vibrio fischerei)
Frage:
Warum sind V. fischerei im Licht-Organ desTintenfischs luminszent, aber nichtfreischwimmend im Meer?
Quorum sensing
Bakterien detektieren ihre eigene Zelldichte => Regulation der Expression von Luminiszenz-Genen
K. Nelson, Cell-Cell Signalling in Bacteria
Bakterien teilen sich => exponentielles WachstumOD: optische Dichte
Molekulares Bild von QS
• Bakterien exportieren Oligopeptide (auch Pheromon, bakterielles Hormon, Autoinduktor)• Mit steigender Zellkonzentration akkumuliert Oligopeptid• Oligopeptid diffundiert durch Zellmembran, akkumuliert in der Zelle und reguliert Gen-Expression
Kompetenz Kompetenz: lateinisch competere = zusammentreffen, ausreichen,
zu etwas fähig sein, zustehen
„die bei Individuen verfügbaren oder durch sieerlernbaren kognitiven Fähigkeiten und Fertigkeiten,um bestimmte Probleme zu lösen, sowie die damitverbundenen motivational, volitional und sozialen
Bereitschaften und Fähigkeiten, um dieProblemlösungen in variablen Situationen erfolgreich
und verantwortungsvoll nutzen zu können.“– F. E. Weinert
Aus biologischer Sicht:Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmenund in ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren
Kompetenz: Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmen undin ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren
Nein: Meistens aber müssen die Zellen vorbereitet, kompetent gemacht werden.
=> künstliche Kompetenz.Wie? Durch Kombination von Reizen:
Hitze, Kälte, Salze (Calziumphosphat), Strom
Manchmal!Zellen sporenbildender Bakterien wie Bacillus subtiliskönnen unter bestimmten Umweltbedingungen DNAaufnehmen. => natürliche Kompetenz
Freiwillig?
Wann werden Bakterien kompetent?
• unter bestimmtenUmweltbedingungen
• Bacillus subtilis:in einem ganzbestimmtemLebensabschnitt:
der stationären Phase
OD 600nm
Time
competence
lag exponentiell stationär
Wie nehmen Bacillen die DNA auf?
MolekularesModell der DNA-Aufnahme über
die Zellmembranin
Bacillus subtilis
Dubnau:Rev Microbiol.1999;53:217-44
Nat Rev Microbiol.2004;2(3):241-9
Com = Abkürzungfür competence
Wie entscheiden sich Bakterien?
• Aktiv
• via quorum sensing
Quorum sensing: Die Fähigkeit von Bakterienmiteinander über Signal Moleküle (z.B. Pheromone)zu kommunizieren und ihr Verhalten zu koordinieren.
ComX-Pheromone
ComXPrecursor
ComPHistindinkinase
Membrane
PiComA
Transcriptionfactor
ComS
ComSProteinaseinhibitor
ComKmain
Transcriptionfactor
Activation of ~ 100
competence genes
Wie wird Kompetenz induziert?
After Tortosa and Dubnau,1999, Curr Opinion inMicrobiology, 2:588-592
