1 Diferencias conceptuales entre las condiciones de estado...

Cinética enzimática avanzada Sem. 2014-2 Estado preestacionario

Material de apoyo para el módulo de CINÉTICA RÁPIDA.

Curso: Cinética Enzimática Avanzada

Modalidad: Intensiva

Coordinador: Dr. Ismaél Bustos Jaimes

Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Profesor del módulo: Rogelio Rodríguez Sotres

Semestre: 2014-1 (Enero-mayo, 2014).

AbreviaturasSS, Estado estacionario.

v, rapidez de reacción.

ode, ecuación diferencia ordinaria.

vi, rapidez instantánea.

v0, rapidez inicial.

t½, vida media.

1 Diferencias conceptuales entre las condiciones de estado estacionario y las condiciones de estado pre-estacionario.Los procesos biológicos ocurren a diferentes escalas de tiempo. Comúnmente consideramos quenumerosas reacciones químicas ocurren exclusivamente en los seres vivos, porque, en ausencia decatalizadores, su ocurrencia es muy lenta, a veces casi impreceptible.

Por el contrario, in vivo, la ocurrencia de mucha reacciones enzimática es demasiado rápida, por lo que,con el propósito de estudiarlas y conocer el efecto de diversas condiciones sobre la rapidez de lareacción (reactantes, productos, cofactores, catalizador, pH, temperatura, etc.), se manipulan lascondiciones para que la reacción de interés pueda seguirse con instrumentos convencionales, talescomo un cronómetro (de fracciones de minuto a horas,) y un colorímetro. Además, para que lamedición sea posible, el régimen de flujo de la reacción catalizada se limita al rango en que la cantidaddel reactante consumido o producto acumulado cae dentro del rango de sensibilidad del método demedición. El régimen de flujo más comúnmente empleado y que cumple con estas condiciones sedenomina estado estacionario (SS).

Sin embargo, muchos eventos que ocurren en fracciones de segundo y antes de que se establezca elestado estacionario, pueden brindar información muy valiosa acerca de la enzima y la catálisis, si bien,para detectarlos se requieren instrumentos especializados.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO pg. 1/37

Rogelio Rodríguez Sotres Ciencias Bioquímicas UNAM

Ejemplo 1.

Para ejemplificar lo anterior, consideremos un caso simple:

Suponga que tiene un material radiactivo cuya emisión se puede detectar con un contador Geiger. Sitodo lo que desea saber es la cantidad de radiactividad emitida usted registra las desintegraciones porminuto (dpm, aunque la práctica, algunas no las detectamos y lo que tenemos son más bien cuentas porminuto o CPM).

Lo anterior nos dice si el material es muy peligroso o no, porque mide la dosis de radiación querecibiría un sujeto expuesto al material, pero no nos dice mucho acerca de la naturaleza de dichomaterial.

Si ahora mido las variaciones en la radiactividad con el tiempo, es decir, hago esa misma determinaciónhoy, mañana, la semana entrante, dentro de un mes y dentro de 150 días, tengo el resultado que seilustra en la figura 1.

La teoría de la desintegración radiactiva nos dice que los átomos radiactivos son inestables, pero sedescomponen de maneara aleatoria. En un número muy grande de átomos radiactivos la probabilidadde observar una desintegración es proporcional a la cantidad de material radiactivo. es decir:

dpm=k C (Ecn. 1)

En donde C es la cantidad de átomos radiactivos y k una constante de proporcionalidad. Cadadesintegración significa que perdimos un átomo radiactivo, es decir, en un intervalo de tiemposuficientemente pequeño (dt) el material radiactivo perdido (-dC) se reduce de manera proporcional asu concentración:

−dCdt

=kC (Ecn. 2)

La ecuación 2 es lo que se conoce como una ecuación diferencial ordinaria (ode), porque contiene lavariables y sus diferenciales. Resolver una ecuación diferencial requiere expresar la variabledependiente (C) como una función de la variable independiente (t) que cumpla con lo que expresa laecuación. En este ejemplo, la variable t, sólo aparece como diferencial y se puede separar de la VariableC que aparece en ambas formas. Entonces las diferenciales se pueden eliminar mediante la operacióninversa, es decir la integración.

−∫C0

CdCC

=k ∫t=0

t

dt

que da

lnC=C0−k t (Ecn. 3)

podemos ajustar la curva de la figura 1 a la ecuación 3 y deducir que la vida media del material

( t1/2=ln2k

=17.17±0.23días) . Las vidas medias son invariantes características de cada material. De

aquí, podemos deducir de qué en este ejemplo el radionúclido era 32P y, también podemos estimar lacantidad de átomos de 32P presentes al día cero (quizá antes de haber tenido acceso al material).

Todos los derechos reservados MÉXICO D.F., ENERO, 2014 pg. 2/37


Figura 1. Cuentas radiactivas por minuto emitidas por un material en función del tiempotranscurrido (días). La línea muestra el ajuste a una curva de decaimiento exponencial conun valor inicial de 25017±53 y una constante de decaimiento 0.0403481±0.0003735 días-1.

Recapitulemos:

1. La medición de la cantidad de radiactividad es una medida de rapidez instantánea (vi) dedescomposición, ya que los segundos que toma hacer la medida son un instante, si se comparancon la vida media del material que son días.

2. La vi sólo depende del isótopo que se tiene y de la cantidad del mismo presente en la muestra.

3. La vi a lo largo del tiempo sigue un comportamiento definido, determinado por una ecuacióndiferencial, con la que puede determinar la vida media, que es una firma del material radiactivo.

4. Entre más corta la vida media, menos estable es el isótopo, lo que también se relaciona con lacantidad de energía que se libera cuando se descompone en átomos más estables.

De modo análogo, si estudiamos la rapidez de una reacción química en SS, la concentración de losdiversos intermediarios de la enzima ya es constante. Podemos saber quizá que intermediario es al másabundante y como esta situación varia con cambios en la temperatura, concentración de reactante, etc.Pero las vidas medias de los intermediarios serán desconocidas y no sabremos nada de su estabilidadrelativa.

Por el contrario, si podemos saber la vida media de un intermediario, podremos inferir sobre suestabilidad, su energía y podemos hacer propuestas acerca de su naturaleza.

La descomposición radiactiva es un mismo fenómeno si la medimos una vez o si la seguimos en el



tiempo. Del mismo modo, los principios que gobiernan el comportamiento de los sistemas en estacondición no son distintos de los que gobiernan las situaciones en equilibrio, en estado estacionario oen estado preestacionario, pero la complejidad del análisis aumenta en ese orden.

Así, lo que hace la diferencia entre estudiar un sistema en estado estacionario y estudiarlo en otrosregímenes de flujo es únicamente la manera en la que realizamos las medidas y la elección de lascondiciones experimentales. Por supuesto, tal elección determina también los instrumentos a usar y lamanera en que analizaremos nuestros datos.

2 Conceptos básicos: Equilibrio, estado estacionario, cicloslímite y estados transitorios.Fundamentalmente, los procesos químicos, al igual que los demás procesos naturales obedecen a lasleyes de la termodinámica. Al aplicarlas al caso especial de las transformaciones químicas se puedenderivar ciertos principios básicos.

1. La energía se conserva. Por lo tanto, los valores de energía de las partes, mídanse como semidan, suman siempre la energía del todo. Multiplicar energías equivaldría a crear energía ydividir dos energías equivale a desaparecer energía.

2. En las transformaciones químicas, la masa también se conserva. Lo que quiere decir que lasuma de la masa de todas las especies presentes en el sistema no cambia con el tiempo.

3. Una consecuencia de la segunda ley de la termodinámica es que todos los sistemas tienden alequilibrio. Tal tendencia, sin embargo, no nos dice cual es el camino que los sistemas siguenpara llegar a dicho equilibrio. En la mayoría de las transformaciones químicas, el proceso deaproximación al equilibrio ocurre transitando por la formación de un cierto número deintermediarios relativamente bien definidos. Cada intermediario que aparece en el sistema esresultado de una transformación de un intermediario anterior y, por ende, el sistema sigue unatrayectoria secuencial y definida, aunque puede estar ramificada.

4. En el equilibrio, los sistemas obedecen a un principio termodinámico postulado por LeChatelier, (Henri-Louis Le Chatelier; 1850 - 1936) que al ser aplicado a sistemas químicos dalugar a la llamada ley de acción de masas y se resume así:

“un proceso químico ocurre con un rapidez proporcional a la concentraciónde las especies que participan en dicha transformación".

5. Sin embargo, este principio se aplica a un sistema en equilibrio y sólo puede aplicarse a lastransformaciones en su trayectoria hacia el equilibrio, conocemos cuales son las especiesindividuales que participan en cada transformación parcial y el orden en que aparecen. A estasecuencia se le conoce como el mecanismo cinético de la reacción.

Lo anterior significa que las trayectorias se pueden modelar si plantemos una propuesta de mecanismocinético, si además se mide la aparición y/o desaparición de uno o más intermediarios, entonces esposible comparar los datos experimentales con el modelo propuesto. Al igual que en ejemplo de laradiactividad, la coincidencia entre los datos experimentales y el modelo es evidencia indicativa de queel mecanismo propuesto es correcto.

En un modelo de este tipo, la concentración de cada intermediario se representa como una función deltiempo. En dicha función se incluye el que la aparición de un intermediario depende de la



concentración de los intermediarios inmediatos anteriores y posteriores.

Para un sistema genérico: R→ n1 I 1 →n2 I 2 ...→m P

La concentración de las diferentes especies podrá describirse como una función del tiempo:

C R= f 0(t); C I i= f i( t) ... ;C P= f p(t )

Es decir, para un sistema con 5 intermediarios habrá 5 funciones del tiempo, aunque sólo cuatro seránindependientes, ya que la concentración de cualquiera especie puede deducirse conociendo laconcentración de las 4 restantes y la estequiometría de la reacción, es decir:

M TOTAL=C R+1n1

C I 1+ 1

n2

C I 2...+ 1

mC P

Las trayectorias de un sistema que transita hacia el equilibrio pueden pasar por varios regímenes deflujo con características que facilitan o dificultan su modelado. A saber:

a) Regímenes caóticos: Son aquellos en que la función que describe la concentración presentacambios que no siguen ningún patrón regular apreciable. Usualmente los sistemas químicosbajo condiciones controladas no siguen este tipo de regímenes, pero los sistemas complejos demúltiples reacciones pueden mostrar comportamientos que son cuasicaóticos.

b) Regímenes de ciclo límite o cuasiperiódicos: Son aquellos en que el sistema presentaoscilaciones regulares y los intermediarios aumentan y disminuyen su concentración entrevalores definidos, con intervalos de tiempo (periodos) definidos. Generalmente, tardanfracciones de segundo en establecerse y se agotan después de un tiempo. Mientras duran, esposible observar que la aparición de las especies finales (productos) ocurre con una rapidezconstante (véase figura 2).

c) Regímenes de decaimiento o crecimiento exponencial, o cuasiexponencial: Ocurren cuandoel aumento o la disminución en la concentración de una especie es proporcional a laconcentración de dicha especie, o de alguna otra especie relacionada.

b) Regímenes de estado estacionario: Son aquellos en los que las especies intermediarias semantienen casi constantes en función del tiempo. Su duración es corta, ya que persistenmientras la concentración de las especies iniciales no cambia de manera importante y los flujosse mantienen razonablemente constantes (ver figuras 3 y 4).

Figura 2. Un ejemplo de un ciclo límite es el flujo glucolítico en la levadura S. cereviciae incubada conconcentraciones muy elevadas de glucosa y en presencia de cianuro, mismo que puede monitorearsemediante la absorbencia de NADH en las células completas (Danø et al., 1999).



Inicio: el agua fluye rápidamente hacia el segundo tanque, pero sale lentamente por el orifício.

Más tarde, P1 se reduce y P2 aumenta, la fuga en el orificio iguala al flujo entre tanques.

Ejemplo físico: Imaginemos una orificio en la base del tanque pequeño del sistema anterior.

Energía potencial

acumulada P

Liberación de energía

Situación de equilibrio

P=0

A) Equilibrio

Ejemplo químico: Unión del oxígeno a la Mioglobina.

Ejemplo físico: Dos tanques conectados por un tubo

El volumen de agua es diferente, pero las presiones son iguales.

En el equilibrio el potencial químico se iguala (es decir G=0).

K equilibrio=[ MbO2]eq

[Mb]eq⋅[O2]eq

P

1

P

1

P

2 P

2Estado estacionario

(SS)

Nivel de agua aparentemente

constante

Nivel de agua constante

Ejemplo químico: Catálisis enzimática.

B) Estado estacionario.

K M=[ E ]ss[ S ]ss

[ E.S ]ss

La velocidad con la que E.S es formado, por la reacción entre E y S, iguala a la velocidad con la que E..S se disocia o cataliza la conversión de S a P.

La constante KM

no es una constante de equilibrio, se denomina constante de Michaelis

EL equilibrio puede describirse numéricamente mediante una constante de equilibrio.

O2 MbO2Mb +

E + S E·S E + productosKM kCAT

Figura 3. Comparación entre sistemas físicos y químicos en equilibrio (A), o en estadoestacionario (B).

La cinética de estado pre-estacionario considera los procesos que ocurren antes del establecimiento deun estado estacionario. En el caso de las reacciones enzimáticas, los procesos suelen seguir regímenesdel tipo (c), aunque se han reportado algunos casos en los que se observan comportamientos del tipo(b).

El modelado de los regímenes de tipo (c) es posible empleando métodos analíticos, en algunos casos, ométodos numéricos en otros. Una vez establecido un modelo válido, este puede usarse para calcular elvalor de los parámetros ajustables que mejor describen el comportamiento observado.



E + S E·S

E+productos

KM

kCAT

Figura 4. Comportamiento clásico de un sistema enzimático simple en su aproximación alrégimen de estado estacionario que conocemos como rapidez inicial ( v0 ).

Dado que el modelo se refiere a las diferentes especies del sistema, dichos parámetros indicanpropiedades de los intermediarios como estabilidad, cambios en la energía libre asociados a suaparición, etc. Todos estos datos pueden proporcionar gran información acerca de los actoresparticipantes, particularmente, acerca de la enzima en estudio.

3 Ejemplos que ilustran el poder de esta estrategia.

Ejemplo 1: Un sistema en equilibrio no equivale a reposo absoluto.

Supongamos una proteína P se une a una substancia L y forma PL

k1

Pk

2

PL

L+ (Esquema 1)

Entonces, suponiendo que la reacción ocurre con un mecanismo sencillo, la rapidez con la que P setransforma en PL estará dada por:

−dPdt

=k1[ P ]EQ[ L]EQ y, de igual manera, cuando se establece el equilibrio la cantidad de P L que

se estará convirtiendo de regreso en P será: −dP L

dt=k 2[PL ]EQ .



Para que el equilibrio ocurra, la rapidez de formación de PL tiene que igualar a la rapidez de

disociación, es decir: −dPdt

=−dPL

dty, por lo tanto: k 1[P ]EQ[L]EQ=k 2[ PL ]EQ

que, siempre que las concentraciones no sean cero, equivale a: [ P L]EQ

[ P ]EQ[L]EQ

=k 1

k 2

=K F (Ecn. 4)

El equilibrio es un proceso terminal, es el estado que alcanza cualquier sistema cuando su energía libreha sido consumida y el sistema puede permanecer ahí de manera indefinida (al menos en teoría), puestoque la concentración de las especies ya no cambiará.

Pero, ¿Es el equilibrio un estado en el que las moléculas se encuentran en reposo?

!Claro que no¡ veamos:

Ejercicio resuelto 1. Tasa de conversión en el equilibrio.

Asumamos que el ejemplo anterior tenemos una concentración de 1×10−9 M total de la proteína y

1×10−5 M total del ligando, siendo k 1=100 M−1 s−1 y k 2=0.1 s−1 , en estas condiciones:

K F=k1

k2

=100 M −1 s−1

0.1 s−1 =1×103 M−1 y, cuando se alcanza el equilibrio, tenemos:

Sea x EQ la concentración del complejo proeína-ligando en el equilibrio ( [PL ]EQ ). Entonces, laestequiometría de la reacción indica que

[ P]EQ=1×10−9 M − xeq , [ L]EQ=1×10−5 M −xeq y substituyendo en la Ecn. 4 tendremos:

K F=xeq

1×10−9 M −xeq1×10−5 M −xeq=1000 M −1

es decir:

1000 M −1 xeq2 −11×10−21×10−6xeq1×10−11 M =0 , de donde:

x EQ=11×10−21×10−6± 11×10−21×10−62−4×10−8

2000M =9.9×10−12 M , por lo que:

[ P]EQ=1×10−9−9.9×10−12 M =9.901×10−10 M y,

[ L]eq=1×10−5−9.9×10−12 M =9.999×10−6 M .

De lo anterior, se sigue d [ PL ]

dt=k2[P L]EQ=0.1 s−19.9×10−12 M =9.9×10−13 M / s .

Si consideramos una cubeta de 1 ml y tomamos en cuenta el número de Avogadro tendremos:

d [P L]dt

=(9.9×10−13 mmol ml−1 s−1)(6.022×1020 moléculas mmol−1)=5.962×109 moléculas / s

Es decir, aún en el equilibrio y a concentraciones tan bajas como las que se suele manejar en loslaboratorios, la tasa de reacción es muy elevada, sólo que ocurre en ambos sentidos por igual.



Ejercicio no resuelto 1.

Calcule la tasa de interconversión usando ahora la expresión equivalente −dPdt

=k1[ P ]EQ[ L]EQ y

compruebe que el flujo en ambas direcciones es el mismo.

Ejemplo 2: Tiempo en que se requiere para que se alcance el equilibrio en el sistema del ejemplo anterior.

Para modelar la trayectoria de aproximación al equilibrio, requerimos considerar la velocidad con laque ocurren ambas reacciones, tanto la de asociación como la de disociación. En el ejemplo anterior,ambas tasas de reacción eran iguales, puesto que ya se había alcanzado el equilibrio. Pero mientras nose establezca el equilibrio, la tasa neta de acumulación de P L dependerá de su taza de formaciónmenos la rapidez de descomposición. si “x” es la cantidad de PL formato a un tiempo t. tenemos:

dxdt

=k1(P0−x )(L0−x)−k 2 x=k 1 P0 L0−k 1(P0+L0+k 2

k1

)x+k 1 x2 (Ecn 5).

Aún este caso sencillo nos da un ecuación diferencial no tan sencilla, ya que es de primer orden, perono homogénea y de segundo grado. Existen métodos para resolverla y casi todos los casos frecuentesque tienen solución analítica ya han sido descritos. Lo más sencillo es consultar la tabla 2 de lareferencia: Kuby, SA. A study of Enzymes. Vol. I Chap. 10 pp. 377-415.

Pero antes de ello, aprovechemos este sistema para aprender como podemos simplificar problemasrelativamente complejos si manipulamos las condiciones experimentales para facilitar el manejo.

En nuestro caso, la concentración de proteína total es cuatro órdenes de magnitud inferior a la deligando. Por lo tanto, la cantidad de complejo formado x será muy pequeña en comparación con lade ligando libre y es válido asumir que x≪ L0⇒ [ L ]=L0− x≈ L0 , por lo que, el mecanismoanterior puede considerarse como:

LPL

APPk1= k

1Pk

2

(Esquema 2)

y la ecuación diferencial 5 se simplifica a:

dxdt

=k1(P0−x )[L ]−k 2 x= k 1APP P0−( k 1

APP +k 2) x (Ecn. 6)


Resuelva la ecuación diferencial anterior por el método de separación de variables ilustrado en lasolución de la ecuación 2 (pag. 2, confronte su resultado con la solución indicada abajo, en la ecuación7)

x=([P ]0−[P ]EQ)(1−e−( k 1APP +k 2)t) (Ecn. 7), siendo [P ]EQ=

k 2

k1APP +k 2

[ P ]0



Recapitulando:

a) Antes de atacar un sistema es necesario eliminar del modelado las complejidades innecesarias(aquellas que no tienen efecto apreciable en el comportamiento del sistema bajo las condiciones deestudio). Esto facilita el modelo y el identificar la información relevante en el sistema.

b) En la solución (Ecn. 7), x se aproxima a la concentración de equilibrio [P ]0−[ P]EQalcanzándola cuando la exponencial vale cero, es decir a tiempo infinito.

c) La tasa con la que el sistema se aproxima al equilibrio sigue una exponencial decreciente, lo quequiere decir que se acerca muy rápido al inicio, pero se va frenando conforme más cerca está delequilibrio.

Como consecuencia de los dos puntos anteriores, tendríamos que suponer que nada llega jamás alequilibrio, si bien puede aproximarse mucho a él. Sin embargo, hay que recordar que la funcionesempleadas son funciones de variables continuas, pero los sistemas moleculares son discretos; i.e., lassoluciones presentadas aproximan bien el comportamiento del sistema mientras se extraiganpredicciones que dependan de muchas moléculas, de tal modo que un cambio de concentración noimplique fracciones de molécula.

Ejercicio resuelto 2. Tiempo necesario para que la concentración de P L remanente sea 99% de la concentración al equilibrio.

Llamemos t 99 al tiempo en el que x=0.99[P L]EQ=0.99 ([P ]0−[P ]EQ ) .

De la ecuación 7 x=[P ]0−[ P ]EQ1−e−k1 Lk 2 t99 . Substituyendo los valores dados en el ejercicioresuelto 1 tendremos:

0.99 [P ]0−[P ]EQ =[ P ]0−[P ]EQ1−e−k1 Lk 2 t99 , por lo que:

e−k1 L k2 t99=1−0.99=0.01 y t 99=− ln (0.01)k 1 L+k 2

=45.6 s

Para fines prácticos, aún es esta reacción, que podemos considerar lenta, ¡se requiere menos de unminuto para que se establezca el equilibrio!

Note que si aumentamos la concentración de proteína, esto no tendrá un efecto apreciable en el tiempoen el que se alcance el equilibrio, en tanto no se viole nuestra aproximación de que la concentración deligando inicial se mantenga casi constante durante la aproximación al equilibrio (es decir, mientras nopongamos proteína a un nivel cercano al de ligando).

Una particularidad de este ejemplo, que suena bastante sorprendente, es que la concentración deproteína es irrelevante para determinar el tiempo en el que se alcanza el equilibrio, pero además, laconcentración de ligando tampoco tienen un efecto apreciable, en tanto [L] no alcance valoressuperiores a 10 mM, ya que 100 M−1 s−1[L]≪ k 2 (ver los datos en el ejemplo 1). Es decir, a pesar deque numéricamente, la constante de rapidez de la disociación del complejo parece pequeña para sermuy relevante - lo que determina la rapidez con la que se alcanza el equilibrio es la rapidez del procesode descomposición del complejo - ¡no la rapidez con la que se forma!

Esta es una situación común en muchos sistemas dinámicos, los pasos que determinan la dinámico del



proceso global son a menudo pasos que intervienen en el proceso que ocurre en la dirección opuesta aaquella en la que se observa un flujo neto, es decir “ los frenos pueden ser más significativos que elempuje”.

Note también que, en alícuota de 1 nl de la solución anterior, tendríamos:

0.99[P L]EQ=0.99×9.9×10−12 nmol nl−1×(6.022×1014 moléculas nmol−1)=5902.2 moléculasml−1 Es decir aún con tan poco proteína y en un volumen muy pequeño tenemos muchas moléculas y la diferencia entre 5902 y 5902.2 moléculas es despreciable.


Estime el tiempo adicional que tendré que esperar para pasar de 99% de la concentración de P LEQ

para llegar a 99.99% de su concentración de equilibrio.

Ejemplo 3. Aceleración de una reacción enzimática en su camino hacia el estado estacionario.

En el sistema anterior, no había ninguna reacción química, tan sólo un proceso físico de asociación deproteína y ligando. Curiosamente, las ecuaciones que empleamos para describir la cinética de estosprocesos no difieren de la cinética de transformaciones químicas. Consideremos la forma más sencillade reacción química catalizada enzimáticamente, un único reactante, un sólo producto y sólo dosformas de la enzima (Esquema 3).

SE·S

k1

Ek

2

E·Pk

CAT

EP

(Esquema 3)

Este proceso no está ahora en equilibrio y es una trasformación química, pero para modelarlorecurrimos a las mismas herramientas que antes, es decir, la rapidez de la reacción química se midecomo:

dPdt

=k CAT [ E.S ] (Ecn. 8) y la rapidez de formación y desaparición del complejo está dada

por: d [E⋅S ]

dt=k1[ E ][ S ]−k2k CAT [E⋅S ]=k 1E0−[ E⋅S ][S ]−k 2kCAT [E⋅S ] ,

que se simplifica a: d [E⋅S ]

dt=k1 E0[S ]−k 1[S ]k 2k CAT [E⋅S ] (Ecn. 9)

Si asumimos nuevamente que [S] >> [E] y que durante el tiempo del experimento la [P] << [S]. Lacantidad de S consumida en la formación de E·S y de P es despreciable y se puede considerar que[S]≈[S]0 y permanece aproximadamente constante. Ahora, derivando la ecuación 8, obtenemos la Ecn.10.

d 2[ P ]dt 2 =k CAT

d [ E⋅S ]dt

(Ecn. 10) por lo tanto, multiplicando la ecuación 9 por k CAT y

obtenemos la Ecn. 11.



k CAT

d [E⋅S ]dt

=k CAT k 1 E0 [S ]−k CAT k 1[S ]k 2kCAT [E⋅S ] (Ecn. 11). Substituyendo 8 en 11

y la expresión resultante en 10 tendremos:

d 2[P ]dt 2 =k CAT k 1 E0[ S ]−k1[ S ]k 2kCAT

dPdt

y que se ordena para dar:

d 2[P ]dt 2 k 1[S ]k 2k CAT

dPdt

−k CAT k1 E0[S ]=0 (Ecn. 12).

Esta ecuación diferencial ya no se puede resolver con los métodos que empleamos para resolver laecuación 3 (pag. 2), pero observemos que [P] sólo aparece como derivadas, por lo que parasimplificarla se recurre a un truco sencillo, substituir la variable:

sea =d [ P ]

dt, por lo tanto:

d dt

=d 2[ P ]

dt 2 de donde se tiene:

d dt

k 1[S ]k2k CAT −k CAT k1 E0[S ]=0 (Ecn. 13). Ahora si podemos separar las

variables y ordenarla, es decir:

d −k 1[S ]k2k CAT k CAT k 1 E0[ S ]

=dt

d

−[S ][k 2kCAT

k1

]k CAT E0[S ]=k 1 dt

(Ecn. 14).

si definimos:

K M =k 2kCAT

k 1

(Ecn. 15) y V MAX=k CAT [E0] (Ecn. 16),

substituyendo 15 y 16 en 14 y como a t=0 , [ E⋅S ]=0 y 0=0 nos queda la siguiente integraldefinida:

∫0

d

−[ S ]K M V MAX [S ]=k 1 ∫

t=0

t

dt , que se resuelve para dar:

− 1[S ]K M

[ ln −[S ]K M vV MAX [S ]−ln V MAX [ S ] ]=k 1t , o bien:

ln V MAX [ S ]V MAX [S ]−[S ]K M =k 1[S ]K M t ,

que es la solución en su forma logarítmica, en su forma exponencial tendremos:V MAX [ S ]=ek1 [S ]KM t V MAX [S ]−ek1 [S ]K M t[S ]K M , es decir:



d [ P ]dt

==V MAX [S ][S ]K M

1−e−k1 [S ]KM t (Ecn. 17).

¡Sorpresa! El resultado es la ecuación de Michaelis y Menten multiplicada por un factorexponencial. Ahora, si queremos determinar como varía la concentración de producto en función deltiempo, ya sólo tenemos que integrar esa función. Suena a una integral complicada, pero no olvidemosque [S] se consideró constante en el planteamiento inicial, de manera que en realidad no tenemos queconsiderarla variable ahora, por tanto, podemos simplemente separar las variables para poder integrar,considerando que la concentración inicial de producto es cero.

∫0

P [S ]K M V MAX [ S ]

d [P ]=∫0

t

1−e−k1 [S ]K M t dt

[ P]=V MAX [S ]

[S ]K M t e−k1 [S ]K M t−1k1[S ]K M (Ecn. 18), que equivale a:

[ P]=V MAX [S ]

[ S ]K M k 1[S ]K M te−k 1 [S ]KM t−1k 1[S ]K M

Para analizar el comportamiento de esta ecuación consideremos primero que la reacción se encuentraen los primeros momentos; así, la función exponencial se puede simplificar considerando sólo los

primeros tres términos de la expansión de Taylor ( ex=1xx2

2!...

xn

n! ), es decir, el numerador

de la expresión anterior dentro del paréntesis se convierte en:

−k 1[S ]K M t 1−k 1[ S ]K M t1/2k 12[S ]K M 2 t 2−1=

k12 [S ]K M 2t 2

2

y toda la expresión se simplifica a:

[ P]=V MAX [S ]

2 k1 =

k 1 k CAT E0[ S ]2

t2 (Ecn. 19).

Una gráfica de [P] vs. t 2 es aproximadamente lineal y tiene pendiente 1/2k1 k CAT E0 S0 .

Ahora, si k CAT y K M han sido determinadas de los datos de estado estacionario, E0 esconocida y aceptando la ecuación 15 como una definición correcta de K M , entonces es posiblecalcular todas las constantes.

A tiempos largos, la ecuación 18 puede simplificarse considerando que el término de decaimientoexponencial se hace despreciable, con lo que la ecuación se reduce a:

[ P]=V MAX [S ]

[S ]K M t− 1k1[S ]K M (Ecn. 20).

En estas condiciones se alcanza el estado estacionario, el cual es ahora descrito por esta recta cuya

pendiente es V MAX [S ]

[S ]K M y cuya intercepción con la ordenada está del lado negativo del eje y

equivale a:



−V MAX [S ]

k 1[S ]KM 2 .

Si ahora extrapolamos la recta al las abscisas ([P]=0), nos da k 1[S ]K M t−1

k1[S ]K M 2 =0 . Despejando el

tiempo, al que llamaremos periodo de retardo ( ) o fase "lag", tenemos = 1k1[S ]K M . De

nuevo, si se conoce K M , o si la concentración de sustrato es saturante [S ]K M ≃[S ] , se puededeterminar el valor de k 1 .

Este caso puede no ser muy realista, porque se asume que la reacción es completamente irreversible yque en el proceso catalítico sólo interviene un complejo ES (lo cual no siempre es una aproximaciónválida). Sin embargo, ilustra el poder de la medición de la reacción en condiciones previas alestablecimiento del estado estacionario y muestra que la cinética de estado preestacionario nos puededecir que tan rápido se asocian la enzima y el sustrato, que tan rápido se disocia el complejo y ELVALOR VERDADERO DE LA CONSTANTE DE DISOCIACIÓN DEL COMPLEJO Enzima-Sustrato.

Este enfoque fue empleado por Gutfreund para determinar las constantes de la reacción de hidrólisis deesteres sintéticos de aminoácido catalizada por la quimitripsina. El siguiente ejemplo es una adaptaciónde sus resultados.




La quimotripsina cataliza la hidrólisis de ésteres de aminoácido como la acetil-tirosina (AcY). loreacción puede seguirse por el cambio en la fluorescencia de TYR cuando se desacetila. Se realizaronlas siguientes mediciones con 0.3 μmol de enzima, en cubetas de 3 ml y variando la concentración delsustrato, según se indica, bajo condiciones de estado estacionario.

[S] (μM) δP/δt (μmol min-1) ± SE.3.5 1.14 0.106.0 1.69 0.0211.0 2.34 0.0820.0 2.97 0.1435.0 3.42 0.3360.0 3.91 0.23

Luego se siguió la reacción en el periodo pre-estacionario mezclando dos soluciones (par partesiguales) una con 20 μM de enzima y otra con 100 μM de sustrato en un equipo de flujo detenido. Losresultados obtenidos fueron los siguientes:

tiempo (ms) [P] (µM) tiempo (ms) [P](µM) tiempo (ms) [P] (µM)0.0 0.000 6.2 0.362 14.1 1.2000.9 0.012 6.5 0.387 14.6 1.2611.0 0.014 6.7 0.406 15.0 1.3121.2 0.021 7.0 0.432 15.5 1.3641.5 0.030 7.3 0.459 16.0 1.4271.8 0.040 7.5 0.487 16.6 1.4902.0 0.051 7.8 0.509 17.0 1.5432.3 0.063 8.1 0.538 17.5 1.6072.5 0.078 8.3 0.561 18.0 1.6612.8 0.091 8.5 0.584 18.5 1.7253.0 0.105 8.7 0.607 19.0 1.7793.2 0.121 9.0 0.640 19.5 1.8343.5 0.141 9.3 0.664 20.0 1.9003.8 0.156 9.5 0.689 21.0 2.0214.0 0.175 9.7 0.714 22.1 2.1424.2 0.192 10.0 0.748 23.1 2.2644.5 0.214 10.5 0.800 23.9 2.3654.8 0.232 11.0 0.854 25.0 2.4995.0 0.252 11.5 0.909 26.1 2.6225.2 0.272 12.0 0.965 27.0 2.7355.5 0.293 12.5 1.023 28.1 2.8585.7 0.315 13.0 1.081 29.1 2.9826.1 0.344 13.5 1.140 30.0 3.091

Asumiendo que esta enzima sigue el modelo del Esquema 3 (Pag. 11) determine el valor de lasconstantes k 1 , k 2 y k CAT .



4 Métodos para cuantificar los tiempos de relajación. “Stopped Flow”, “Quenched Flow” y “Equilibrium Jump”.Los primeros experimentos de cinética rápida reportados son los realizados por Hartridge y Roghton en1923, quienes se inspiraron en un instrumento diseñado por Reschig (1905), diseñado para estudiarreacciones en fase gaseosa. Es esos experimentos, Hartridge y Roghton mezclaron una solución dehemoglobina con otra de monóxido de carbono y la mezcla se hizo fluir por un tubo delgado que teníauna serie de termopares (sensores) a los largo de tubo. Como la reacción de la hemoglobina con elmonóxido desprende calor, ellos fueron capaces de seguir la exención de la reacción por el calordesprendido. Lo más interesante es que si la velocidad de flujo es constante, en cada punto del tubo lasolución tiene una edad diferente después del mezclado, el resultado es que cada termopar estádetectando el proceso de la reacción a diferentes tiempos después del mezclado. Este experimento es deconcepción simple y el equipo que requiere no es muy sofisticado en cuanto a la resolución y el tiempode respuesta, ya que en cada punto del tubo la solución es continuamente reemplazada por otra soluciónigual. Sin embargo se requieren cantidades enormes de proteína, que difícilmente pueden obtenersecuando no se trata de la hemoglobina.

Figura 5. Diseño de un equipo clásico de flujo detenido. En el esquema se muestran loscomponentes básicos, incluyendo dos diferentes diseños de celdas y un mezclador de 4vías.

En 1940, Chance realizó un experimento semejante, pero detuvo el flujo intempestivamente en la celdade un detector. Si el flujo se detiene cuando la solución ha envejecido apenas unos milisegundos, sepuede seguir el devenir de la reacción en la celda mediante el uso de algún espectroscopio(espectrofotómetro o espectrofluorómetro, son los más comunes).



El diseño clásico de un equipo de flujo detenido se muestra en la figura 5, en ella se muestran lajeringas de reactantes que contienen dos soluciones distintas, con los componentes de la reacciónseparados de manera que la reacción no se inicia, hasta después del mezclado. La mezcla ocurre en undispositivo mezclador que provoca un régimen de flujo hidrodinámico turbulento en la conjunción delas tuberías.

En un equipo de flujo rápido típico (Fig 5), la solución se conduce hacia una cámara de observación yse recoge finalmente en una jeringa receptora. Las jeringas de reactantes son empujadassimultáneamente, generalmente por un dispositivo automatizado. El émbolo de la jeringa receptora estátambién acoplado a un transductor que enciende el registro cuando el empujado hasta su posición final.Los detectores estaban inicialmente acoplados a un osciloscopio para permitir un registro de lo ocurridoen la celda en los primeros 10 a 100 ms de la reacción. En los equipos modernos dispositivoselectrónicos computarizados colectan los datos en formato digital. Sin embargo, se trata de equiposcostosos debido a que los procesadores de la señal deber ser capaces de registrar y procesar los datoscon gran rapidez y la sincronía entre la mecánica y la electrónica debe ser precisa.

A B C

Figura 6. A) Diseño de un equipo clásico de flujo extinto (QUENCHED FLOW). En elesquema se muestran los componentes esenciales, pero en este equipo el tiempo de reacciónestá fijado por la longitud del trayecto ente los mezcladores y la velocidad del flujo. B) semuestra una fotografía de un equipo comercial. C) Equipo básico de flujo extinto pulsado.En este equipo luego de un pulso en el impulsor A, un sistema adicional de válvulas puederetener el líquido en el tubo de incubación por el periodo deseado, en tanto que un pulso delimpulsor B desplaza el líquido de la incubadora al segundo mezclador para detener lareacción.

Para algunas reacciones que no es posible seguir en los espectroscopios, se han diseñado equipos quese conocen como de flujo extinto (“quenched flow”). un esquema básico de ellos se muestra en la figura6. Los equipos de flujo extinto difieren de los de flujo detenido en que tienen un asegunda cámara demezclado que permite combinar la reacción con una solución que la detiene, generalmente con ácido oalguna otra substancia que ejerza su efecto de manera casi inmediata, esto en comparación con larapidez con la que ocurre el proceso en estudio.

Aunque se requieren cantidades grandes de proteína y para seguir la reacción en el tiempo hay querecurrir a trucos como pulsar o variar el flujo, lo que generalmente se realiza con un sistema de



válvulas controladas por computadora, pero esto generalmente se traduce en experimentos más largos,con buen gasto de proteína y se obtiene una cantidad abundante de muestra por analizar.

El tiempo que transcurre para que el líquido llegue desde la cámara de mezclado a la celda se llama“tiempo muerto” del equipo. Aunque puede reducirse acortando la longitud de la tubería, en la prácticahay un límite a esta distancia, ya que los fenómenos de transporte en la soluciones durante el mezcladoimpiden que los reactantes formen una mezcla homogénea en tiempos demasiado cortos.

A pesar de los enormes adelantos tecnológicos, los tiempos muertos de los equipos de flujo detenido nohan logrado reducirse gran cosa desde que se fabricaron los primeros equipos. Recientemente, equiposque emplean los adelantos en la tecnología de materiales para fabricar tubería muy delgada, con muypoca fricción y cámaras de mezclado óptimas, con diseños asistidos por computadora han logradoreducir los tiempos muertos de 2 o 3 ms a tan sólo 0.5 ms. Como se ve, el avance no ha sidoespectacular.

Cuando se desea estudiar reacciones en tiempos aún más corto se ha recurrido a la técnica deperturbación del equilibrio. Esta técnica tiene la ventaja de que no depende de la difusión para elmezclado, porque la reacción se mezcla y se deja llegar a equilibrio dentro de la cámara deobservación. Entonces, se emplea un cambio en las condiciones del medio que modifique la posicióndel equilibrio y se detecta como es que las especies se redistribuyen para satisfacer la condición deequilibrio. Estos estudios reciben el nombre de “salto del equilibrio” (EQUILIBRIUM JUMP).

Dos tipos equipos han sido los más empleados:

I) los que modifican la temperatura, lo cual puede hacerse de manera muy eficiente en tiempos tancortos como 0.1 ms, sobretodo si el cambio es de unos pocos grados. Aunque su diseño puedeconsiderarse tan sencillo como el de un espectrofotómetro con control de temperatura por efectoPeltier, la necesidad de transmitir el calor en tiempos muy cortos y permitir su flujo hacia el cuerpo dela solución en periodos igualmente cortos, hace de este tipo de instrumentos equipos muy costosos.Recientemente el uso de luz láser (Fig. 7) permite calentar específicamente el solvente (usando un láserde Oxidos de Ytrio y Aluminio envenenados con Neodimio, conocido como Nd-YAG, que emite luzinfrarroja de 1064 nm) en tiempos aún más cortos. En teoría el límite inferior de resolución de estaestrategia puede ser llevado al orden de 10 ps.

II) Los que modifican la presión, cuyos efectos en la solución se transmiten de manera casi instantánea,especialmente en solvente poco compresibles como el agua. Sin embargo, para que se observencambios importantes en las constantes de equilibrio se requiere aplicar cambios de presión de varioscientos o, incluso, miles de atmósferas, lo que no es resistido por cualquier equipo, especialmente en lacámara de observación, que tiene que permitir el registro de los eventos que ocurren en su interior.Frecuentemente en estos equipos la celda de observación es un conductímetro y el diseño general delequipo se realiza en acero inoxidable, excepto por el disco o membrana de ruptura que es de Nylan uotros materiales poliméricos resistentes a la deformación.

Finalmente, algunas reacciones pueden estudiarse mediante “saltos” del equilibrio que puedenprovocarse con luz o con electricidad mediante efectos fotoquímicos o electroquímicos. Aunque estasestrategias están limitadas a reacciones en las que el proceso químico lo permite, su aplicación puedeser muy informativa, dado que se puede tener un control muy estricto del inicio del proceso.

Un aspecto muy importante de esta estrategia es el tipo de registro espectroscópico que se ha derealizar. Se han empleado muy comúnmente espectrofotómetros y fluorímetros en el rango UV/visible.Pero más recientemente se ha introducido el uso de espectrofotometría infrarroja (IR), resonancia



paramagnética del electrón (EPR), fluorescencia de energía transmitida por resonancia (FRET) yresonancia magnética nuclear (NMR). En algunos casos, ha sido posible el introducir marcaje isotópicoen sitios específicos del ligando o de la proteína. Esta técnica es de utilidad si se combina con laespectrofotometría IR, ya que el espectro diferencial entre la mezcla sin y con el marcaje isotópicoproporciona la señal de aquellos átomos que están covalentemente unidos al isótopo.

A B

Figura 7. A) Diseño esquemático de un espectroscopio de salto de temperatura basado encalentamiento por medio de luz láser. B) Emisión a 340 nm en respuesta a un salto detemperatura de 5 a 25 oC de una solución con 20 μM de triosa fosfato isomerasa (TIM). (a) apo-TIM; (b) TIM con 5 mM gliceraldehído-3-fosfato. La línea roja es el registro de la señal y laverde el ajuste de los datos. La señal transitoria entre 14 y 50 ns no tiene aún explicaciónsatisfactoria (tomado de Callender y Dyer, 2002).

5 Escalas de tiempo, resolución de los espectroscopios y límites de la técnica.Para ilustrar la capacidad de resolución de esta técnica consideraremos lo siguiente.

1. Los diferentes métodos tienen diferente capacidad para mostrar información dependiendo de larapidez con la que es posible “disparar” el fenómeno. Las técnicas que implican mezclado(stopped flow or quenched flow) tienen un límite técnico 0.1 ms, aunque en la práctica losmejores equipos actuales usualmente llegan a los 0.5 ms. Las técnicas de salto del equilibrio sonmucho más eficientes y permiten registrar los fenómenos en tiempos de hasta 0.05 s. Aunquelos equipos modernos utilizan un láser "sintonizado" para calentar el solvente (agua) y permitenllevar la resolución a límites 10 veces inferiores.



2. A 3. B 4. C

5. Figura 8. Diseño clásico de un equipo de salto de presión A) esquema general B)diagrama de la bomba de presión para detección con conductividad. C) diagrama

de la celda de conductividad y su montaje (tomado de Takahashi y Alberti)

6. Sin embargo, para que muchos de estos equipos puedan controlarse con precisión, la tecnologíamoderna se apoya principalmente en los dispositivos electrónicos. Tales dispositivos dependenen general de un circuito básico llamado oscilador, que puede generar señales sinusoidales decorriente alterna de diversas frecuencias. Las frecuencias determinan en gran medida el tamañode los fenómenos que se pueden codificar o inspeccionar con tal señal. En general, aquellosfenómenos cuya frecuencia es mucho menor que la frecuencia de la onda de sondeo se pierden,simplemente porque el sondeo se basa en la perturbación de la onda por la señal que se estáobservando. Nuestros dispositivos actuales trabajan en frecuencias que se mueven en el ordende los 0.1 a 100 MHz (millones de oscilaciones por segundo). Esto quiere decir que se puedesondear bien cosas que ocurren en rangos de micosegundos o menos, pero también quiere decirque las señales son capaces de viajar por el aire y generar un importante nivel de ruido en losequipos. Por lo mismo, las señales observadas deben tener una intensidad apreciable para quepuedan separarse del ruido. Este problema ha sido obviado en parte gracias a la conversióndigital. Los mejores circuitos disponibles en la actualidad manejan conversiones en el orden de96 MHz. Lo que significa que para analizar una curva con una duración de 1 µs podemosprocesar unos 96 puntos de la señal. Si vemos la curva de la figura 9, observaremos que paraanalizar una curva de este tipo se requiere de un mínimo de 3 o 4 puntos para definir la regiónlineal, pero podríamos requerir 10 o más puntos para definir bien la parte curva, lo cual dependemucho también de la dispersión debida al ruido.



Figura 9. Datos del problema 4 ( pag. 15) en forma gráfica. La líneaverde es resultado del ajuste por regresión no lineal a la parte finalde la curva, la línea azul es una parábola de la forma y=x2

ajustada al inicio de la curva. Ambas líneas fueron extendidas másallá de la región en que fueron ajustadas.

7. Por último, en la reacciones químicas catalizada por enzimas los fenómenos generalmenteocurren en soluciones acuosas. Ello significa que la rapidez con la que un fenómeno de segundoorden ocurre no superan un valor de 4×109 M −1 s−1 , pero los fenómenos que no dependendel choque entro dos moléculas, como podría ser la transferencia de un protón en el sitio activode la enzima, si pueden presentar constantes mayores. En el primer caso, para determinar elvalor de una constante de segundo orden de 1×109 M−1 s−1 , si el menor valor de quepodemos medir es de digamos 1 ms, necesitamos una concentración de sustrato de 1 μM, perocon una concentración de sustrato de ese nivel, la cantidad de producto acumulado sería 50veces menor a la que se muestra en la figura 3, lo que significaría que aún por fluorescenciasería casi imposible detectar la señal del producto acumulado. Con la fluorescencia se genera unproblema adicional, ya que la excitación lumínica decae por fluorescencia en tiempos quepueden exceder un milisegundo, por lo que es posible que las medidas no se presenten en estadoestacionario y entonces habría que resolver también los tiempos de relajación debidos a laacumulación o pérdida de la forma excitada del fluoróforo.

8. Con las constantes de primer orden el problema es que no dependen de la concentración, lo quesignifica que son inversamente proporcionales a los tiempos de relajación y, por lo tanto,valores superiores a 1×104 s−1 escapan a auscultación directa por técnicas de flujo detenido,o bien 1×106 s−1 para las técnicas de salto del equilibrio.

9. Por último, cuando un intermediario sufre dos isomerizaciones consecutivas, sus tiempos de



relajación aparecen sumados en las ecuaciones, es decir, lo que veremos es la suma de ambostiempos de relajación, si uno de ellos es muy lento con respecto al otro, su valor dominará en elproceso y sólo podremos ver uno de ambos intermediarios.

6 Solución analítica de mecanismos cinéticos comunes y sus implicaciones.En la primera parte de este escrito tratamos de un caso relativamente sencillo, que seguramente nopuede ser aplicado más que a unos pocos casos, ya que supone que la formación de producto se da enun sólo paso y la liberación del producto ocurre sin la presencia de formas intermediarias del complejoenzima producto. Si se asume que la concentración de sustrato no es limitante y que permanececonstante en los experimentos, es posible obtener una solución analítica para el sistema completoconsiderando la reacción reversible y varias formas intermediarias, por ejemplo:

SE*S

k1

Ek

2

E·Pfk

CAT

EP

E·Sik

2

ik4

rkCAT

E*Pik

6

ik8

k4

k3

(Esquema 4)

Por supuesto, no es difícil imaginar que la concentración de producto en función del tiempo tendrá unaforma compleja.

Para empezar podemos ver que se trata de un sistema que generará 4 ecuaciones diferencialesindependientes, una por cada especie enzimática menos una, más la ecuación de balance de masa parala enzima. La formación de producto en función del tiempo dependerá de la conversión de ES en EP, lacual puede además revertirse, es decir:

−d [P ]

dt= k CAT

f [E∗S ]− kCATr [E∗P] (Ecn 21)

Pero para resolver la ecuación 21 en términos de la concentración de sustrato, producto, enzima total ylos valores de las constantes de rapidez, necesitamos saber como varía la concentración de E*S y E*Pen función del tiempo, lo que implica conocer también las demás formas, ya que todas ellas estáninterconectadas por los eventos químicos.

Matemáticamente se puede demostrar que un sistema de ecuaciones diferenciales lineales de primerorden con 5 ecuaciones independientes (incluyendo el balance de masa de la enzima) y 5 funcionesdesconocidas (una describiendo la variación en la concentración de cada especie como función deltiempo) tiene al menos una solución completa.

La manera más evidente de obtener tales soluciones es usar las funciones exponenciales, ya que estafunción, al ser derivada da lugar a si misma, lo que significa que puede eliminarse de las ecuacionesigualadas a cero (por factorización) y se resuelve entonces una ecuación algebraica con loscoeficientes, que permite determinar los valores de todos los coeficientes, el resultados será de laforma:

[ P] t =A0 f t A1et / 1A2 et / 2A3 et / 2A4 et / 4A5e t / 5

en donde f t es usualmente una función algebraica de t, A0 , A1 , etc. son las amplitudes de



los componentes exponenciales y 1 , 2 , etc. son los llamados tiempos de relajación de loscomponentes exponenciales., que son funciones de las constantes de rapidez. Los tiempos de relajaciónson funciones algebraicas racionales de las constates de velocidad, la concentración de sustrato y laconcentración de enzima total.

En la actualidad, es incluso posible ajustar las curvas experimentales a los datos directamente a lasecuaciones diferenciales, ya que hay programas capaces de resolver el sistema en forma numérica yluego aproximar los valores de las constantes mediante ajuste por iteraciones sucesivas. Si bien, talesalgoritmos son complejos, requieren numerosos controles para solventar las complicaciones numéricasde hacer cálculos repetidamente y son, por ello, costosos en tiempo de cálculo. Afortunadamente, laaproximación puede realizarse en la computadoras de escritorio modernas en tiempo bastanterazonables, pero uno tiene que realizar experimentos con diversas condiciones iniciales contrastantes,con el fin de asegurar que el modelo es consistente con los datos en todas ellas. Además, existenprogramas que manejan las ecuaciones en forma simbólica y pueden ayudar a obtener la solución de unsistema en forma completa.

En cualquier caso, como se podría esperar, hay un pelo en la sopa, ya que las sumas de funcionesexponenciales tienen formas que siguen pareciéndose a una función exponencial y para determinar elnúmero de componentes exponenciales que explican un sistema se requiere que los valores de lostiempos de relajación ( τ ) y las amplitudes se encuentren bien separadas (es decir, serán demagnitudes razonablemente distintas). En la práctica, resulta casi imposible separar razonablementemás de 3 componentes a partir de un sólo conjunto de datos experimentales.

Un análisis completo de un sistema como el mostrado en el esquema 4 es posible si se asume que lasconcentraciones de los ligandos S y P, así como otros ligandos intermedios que puedan aparecer en elmecanismo, se pueden mantener en niveles cuasiconstantes. Es decir, que existen valores promedio

L̄i promedio que describen el comportamiento del sistema de manera razonable, bajo las condicionesexperimentales en estudio. Tal análisis ha sido descrito en detalle por Hammes y Schimmel (1966;1967).

Estos esquemas ilustran que se pueden analizar secuencias de reacciones consecutivas y resolver laaparición y desaparición de los intermediarios, para determinar las constantes del sistema.

Ejemplos de la aplicación de este análisis hay muchos, por ejemplo la emisión de luz por la aequorinareportada por Hastings et al., (1969). Un caso interesante fue reportado por Halford, Johnson &Grinsted (1979), usando la enzima de Resitricción EcoRI. En dicho trabajo, se aprovecha que la enzimarealiza el corte en cada hebra en momentos distintos y usando un plásmido superenrrollado se puedensepara el DNA superenrrollado (sustrato) del DNA circular relajado (cortado en una hebra, pero noabierto) y el DNA abierto (cortado en ambas hebras).

En estos dos casos, los mecanismos pueden ajustarse al esquema 5.

A B C

k23

k12 (Esquema 5)

Cuya solución estaría dada por las Ecn. 22y 23.

C A( t)=C A(0)e−k 12 t (Ecn. 22)



C B(t)=C A(0)k 12

k12+k 23

(e−k 12 t−ek 23 t) (Ecn. 23)

Un ejemplo reciente de la aplicación este tipo de análisis para el estudio de la enzima piranosa-2-oxidasa se puede consultar en el trabajo de Prongjit y colaboradores (2009). En dicho estudio losautores aseguran haber resuelto hasta 5 componentes exponenciales independientes, lo cual es muypoco común.

7 Manipulación de la condiciones para reducir la complejidad del problema.Los ejemplos anteriores y la sección previa nos hacen ver que la elección de las condicionesexperimentales es crucial para reducir la complejidad del problema.

Por ejemplo, consideremos el esquema 4 (Pag. 22). Si la concentración de sustrato no sólo es constante,sino además saturante, podemos considerar que la formación de complejo ES es muy rápida y sudisociación en E + S prácticamente no ocurre. Esto puede hacer que el paso de ES a E*S y losposteriores sean mucho más lentos y determinen la cinética, por lo que la contribución de ese primerpaso se puede “esconder” a los ojos del espectroscopio.

Usualmente además, la presencia de producto es muy baja y los pasos de reversión de la reacción(determinado por k 3 P ) no es observable, lo que ciertamente simplifica bastante la forma de lasecuaciones y, por lo tanto, su análisis.

Pero uno podría añadir una cierta cantidad de producto, provisto que no sea tanto que enmascare lamedida del que se está formando, o bien, si existe alguna señal espectroscópica de la proteína que seacaracterística de alguna de las formas intermediarias, como pasa en aquellas enzimas que dan señalesfluorescentes con la unión de algún ligando. En este caso, enlentecemos mucho el paso de conversiónde sustrato a producto y podemos hacer que este paso domine las curvas, por lo que nuestro procesopodría darnos señales más fáciles de analizar.

También es posible modificar la rapidez de los cambios conformacionales de la proteína alterando latemperatura, el pH, la viscosidad del medio o la presión. Con lo cual, si logramos que alguno de lospasos sea afectado de manera particular, podemos hacerlo suficientemente lento para estudiarlo sininterferencia apreciable de los demás eventos.

Desde luego no existe una receta única, cada sistema tiene sus peculiaridades propias y es necesarioconocerlas bien, a fin de explotarlas cabalmente. Es decir, cada sistema requiere una buena cantidad detrabajo de caracterización previa para que su análisis pueda realizarse con éxito.

Veamos un caso más, reconsideremos el ejemplo 3, pero ahora hagamos que la cantidad de enzima ysustrato sean tales que la formación de producto casi se agote luego de un ciclo catalítico. Sensuestricto deberíamos resolver nuevamente el modelo, porque en él se asume que la concentración desustrato será una constante, lo cual ya no ocurre en esta nueva situación. Sin embargo, en aras de lasimplicidad consideremos que existe una “concentración de sustrato promedio ( [S ] )” tal que losvalores de las constantes serán también promedio y que las desviaciones causadas por las variacionesde [S ] afectan el valor de las constantes, dentro de la incertidumbre del error experimental, pero nola forma de las curvas.



Consideremos que: i) la cantidad de enzima es igual o superior a la de sustrato, por lo que la formacióndel complejo E⋅S será bimolecular y mucho más rápida que otros eventos; ii) la enzima es de talforma que complejo E⋅S se convierte en un intermediario I que da una señal espectroscópicasemejante a la del producto (si estuviésemos hablando de una deshidrogenasa, equivale a decir que elNADH pegado a la enzima absorbe casi igual al NADH soluble); ii) la reacción no se revierte con lascantidades de producto que se generan durante el experimento, es decir la termodinámica de la reaccióndificulta su reversibilidad. El modelo puede escribirse a hora como sigue:

SI

kf

Ek

r

kL

EP

(Esquema 6)

Para simplificar el esquema y la solución haremos un truco introducido originalmente por Cleland yusado de manera amplia por Fersht, que consiste en abreviar el mecanismo escribiendo constantes develocidad aparentes que reemplazan a las verdaderas (net rate constants), pero que reducen cada paso aun sólo evento pseudoirreversible. como se muestra en el esquema 7.

Ia

E EP

b (Esquema 7)

Para estas constantes a y b , consideramos que el tránsito de E a EP pasando por Ies igual a la probabilidad de que E pase a I ( k f [ S ] ) multiplicada por la probabilidad de que

I pase a EP en lugar de romperse de nuevo (k L

k Lk r

) , es decir:

a=k L

k Lk r

k f [ S ]=kCAT / K M [ S ] (Ecn. 24),

en tanto que el paso de I a EP estará determinado únicamente por b=k L= k CATAPP (Ecn.

25), entonces, la formación de intermediario I estará determinada por:

d [ I ]dt

=a [E ]−b [I ] , la liberación de producto por d [ P ]

dt=b[ I ] y [ E ]0=[E ][ I ] .

Substituyendo [E] en la primera expresión tenemos:

d [ I ]dt

=a [E ]0−(a+b)[ I ] (Ecn. 26),

Que de nuevo puede resolverse por separación de variables, ya que [ E]0 es constante.

Usemos esta ecuación para usar la herramienta maxima, que nos permite obtener soluciones simbólicas.

La figura 10 presenta el trabajo de obtención de la solución en este software y la solución se puedesimplificar a:



[ I ]t =[ E ]0a

ab 1−e−ab t (Ecn. 27), ahora, como:

d [ P ]dt

=b[ I ]=[E ]0a b

ab 1−e−ab t , obtenemos una ecuación diferencial integrable

fácilmente para obtener [ P] t .

[ P ] t=[E ]0ab

abt−[ E ]0

ab

ab2 1−e−ab t (Ecn. 28).

La ecuación 28 es de hecho equivalente a la ecuación 18 (Pag. 13), lo que se puede ver reemplazandoa y b por sus valores originales. Recordando que el intermediario y la señal espectroscópica del

producto no son distinguibles, tendremos que la señal total F(t) = [I](t) + [P](t) (de Ecn. 27+ Ecn. 28) :



(%i1) assume(nra>0,nrb>0,E0>0); (%o1) [nra > 0, nrb > 0, E0 > 0]

(%i2) declare(E0,constant); declare(nra,constant);declare(nrb, constant);(%o2) done |||(%o3) done |||(%o4) done

(%i5) mmodeq: 'diff(In, t)= nra*E0 - (nra+nrb)*In; dIn(%o5) ─── = nra E0 - (nrb + nra) In dt

(%i6) gsolmmodeq: ode2(mmodeq, In, t); - (- nrb - nra) t nra E0 %e (- nrb - nra) t(%o6)In = (────────────────────────── + %c) %e nrb + nra

(%i9) icsolmmodeq: expand(ic1(gsolmmodeq, t=0, In=0)); (- nrb t - nra t) nra E0 nra E0 %e(%o9) In = ──────── ─ ──────────────────────────── nrb + nra nrb + nra

(%i10) velmmodeq: 'diff(P,t)= nrb*rhs(icsolmmodeq); - nrb t - nra t dP nra E0 nra E0 %e(%o10) ── = nrb (───────── ─ ────────────────────────) dt nrb + nra nrb + nra

(%i11) solvelmmodeq: ode2(velmmodeq, P,t); (- nrb - nra) t nra nrb E0 %e nra nrb E0 t - ───────────────────────────── - nrb - nra(%o11) P = ──────────────────────────────────────────── + %c nrb + nra

(%i12) icsolvelmmodeq: expand(ic1(solvelmmodeq, t=0, P=0)); - nrb t - nra t 2 nra nrb E0 %e nra nrb E0 t(%o12) P = ──────────────────────────── + ─────────────────────── 2 2 2 2 nrb + 2 nra nrb + nra nrb + 2 nra nrb + nra 2 nra nrb E0 t nra nrb E0 + ───────────────────────────────────────────────── 2 2 2 2 nrb + 2 nra nrb + nra nrb + 2 nra nrb + nra

Figura 10. Solución de la Ecn. 26 en el programa máxima. El resultado (%o9) es equivalente a la Ecn.27, en tanto (%o12) es equivalente a la Ecn. 28.

[P] t[I ]t =[ E ]0a b

abt−[E ]0

a b

ab2 1−e−ab t [E ]0

aab

1−e−ab t , o bien,



[ F ]t =[E ]0a b

abt[ E ]0

aab

1−e−ab t 1− bab

[ F ] t =[E ]0ab

abt[ E ]0

a2

ab21−e−ab t (Ecn. 29)

Esta expresión tiene un término lineal en t y un término exponencial decreciente. A tiempos muycercanos a cero, el término exponencial se acerca a cero. Por lo tanto, esta expresión describe uncomportamiento inicial de una recta que parte del origen y representa la acumulación inicial del

complejo [I], es decir [ F ] t =[E ]0a b

abt . La recta adquiere curvatura conforme el término

exponencial alcanza un valor detectable y, cuando t es grande y el término exponencial se aproxima a

cero (ver figura 11, pag 29), nos queda ahora una recta dada por [ F ] t =[E ]0ab

abt[E ]0

a2

ab2

.El valor del corte con el eje “Y” de esta segunda fase es iY=[ E ]0a2

ab2 , que como se puede ver,

es proporcional a [ E]0 .

Aquí podemos tener dos situaciones:

i) [S ] es relativamente saturante, a2

(a+b)2=(k CAT [ S̄ ]/ K M )2

(kCAT [ S̄ ]/K M+k CAT )2=

[ S̄ ]2

([ S̄ ]+K M )2≈1 ,

lo que significa iY=[ E ]0 . En este caso deben usarse [E] muy elevadas, ya que [S ]≈[ E0] .

ii) si [S ] no es saturante, la gráfica iY vs. [S ] sigue una curva de tipo sigmoidal, pero quepuede convertirse a una recta tomando iY como función de [S ] .


Derive la forma de la función iY vs. [S ] , demuestre que es una línea recta y determine la formaalgebraica de su pendiente y su intersección con las ordenadas en dicho regráfico.



Figura 11. Resultado de un experimento de cinética de la explosión, que permite ver lavariación en el intercepto a la ordenada (respecto de la enzima total) con la concentraciónde sustrato empleada. Note que a concentraciones elevadas de sustrato este valor seaproxima a 1. La presente estrategia se ha empleado en numerosos artículos para titular eltotal de sitios activos realmente funcionales de una enzima.

Un aspecto interesante que surge de la comparación entre el análisis presentado en el ejemplo delapartado 3 (pag 11) y este último es el hecho de que la constantes respectivas k 2 y k r no sonnecesariamente equivalentes. Ello debido a que en un caso se está midiendo la liberación neta delproducto del sitio activo de la enzima, en tanto que en el segundo la medición monitorea tanto alproducto liberado como aquel que se encuentra atrapado en los complejos intermediarios EP (quepueden ser uno o más, pero que se ven juntos). Es decir, nuestro análisis parte de una simplificación, alaplicarla los valores de algunas constantes son aparentes y pueden incluir pasos adicionales. Dadas lacondiciones experimentales y la estrategia de monitoreo de la reacción, dichos pasos no puedenresolverse y quedan ocultos.

Un mecanismo que contiene en realidad los pasos mínimos para la catálisis por una hidrolasa como lamayoría de las proteasas, carbohidrolasas, fosfatasas y lipasas, asumiendo que la hidrólisis esesencialmente irreversible en medio acuoso diluido, debería ser:

SE·S

k1

Ek

2

E·PQk

CAT

EP

E.QQ

k4

k6

k3

k5

(Esquema 8)

En el que se asume que los productos se liberan ordenadamente (lo cual es cierto para las serinaproteasas y las lipasas, pero no necesariamente para otras hidrolasas). Note entonces que en este último



análisis, la concentración de intermediario que se mide es [E.PQ]. En cambio, [E] + [E.Q] , son vistascomo “enzima libre” y [E.S] es una especie “invisible” cuyo impacto en la cinética queda oculto, dadaslas condiciones experimentales y cuya influencia está enmascarada en los valores de algunasconstantes. Es decir algunos parámentros estimados son valores aparentes, que dependen de otrasvariables y que serán afectados por un cambio en las condiciones del experimento.

En cambio, en el primer análisis (ejemplo 3, apartado 3, pag 11)) los valores de k 1 y k 2 deben serreales, pero k CAT

obs es un valor aparente que involucra tanto a k CAT , k 4 y k 6 , quizá con algunainfluencia menor de k 3[ P ] y k 5[Q ] , en la medida en que su acumulación no resulta tandespreciable como usualmente se asume.

Nuevamente, para conocer en detalle un mecanismo cinético es necesario recurrir a una variedad decondiciones experimentales que permitan realizar un análisis completo de los diversos pasos de lareacción.




En el siguiente experimento se midió la actividad de la quimotripsina con p-nitrofenilacetato, cuyaseñal se detecta desde la ruptura del enlace ester en el sitio activo de la enzima, antes de la liberacióndel segundo producto (que permanece unido covalentemente a la proteína), misma que es el paso lentode la reacción y determina la rapidez neta de la catálisis.

Asuma que los parámetros cinéticos ( K M y V MAX ) determinados en el ejercicio 4 (Pag. 15) sonválidos para este sustrato (lo que no implica que las constantes de velocidad también los sean). Paraestas medidas, la cantidad de sustrato empleada fue cercana a la concentración de proteína (1:1 o 3:1),variando entre 10 y 90 µM (0.21 a 1.89 mg/ml). Otras condiciones experimentales fueron iguales a lasdel problema 1. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

[S ]0[ E ]0

=1[S ]0[ E ]0

=3

[S ]0 =10 30 (µM) 50 (µM) 90 (µM) 30 (µM) 60 (µM) 150 (µM) 270 (µM)t

(ms)ΔA/ε(µM)

t(ms)

ΔA/ε(µM)

t (ms)

ΔA/ε(µM)

t(ms)

ΔA/ε(µM)

t(ms)

ΔA/ε(µM)

t(ms)

ΔA/ε(µM)

t(ms)

ΔA/ε(µM)

t(ms)

ΔA/ε(µM)

2.6 0.89 1.7 4.68 1.3 9.38 1.9 34.29 2 1.93 1.1 8.65 1.1 21.44 1.1 55.234.4 1.44 3 7.70 2.4 15.70 2.9 43.95 3.5 3.14 2.2 14.60 2.4 34.31 1.9 71.096 1.86 4.3 9.86 3.6 20.12 3.9 50.68 4.9 4.03 3.3 18.60 3.1 38.31 2.9 79.89

7.3 2.19 5.5 11.55 4.7 23.38 4.8 55.65 6.1 4.72 4.4 21.42 4.6 43.43 3.9 84.558.6 2.48 6.6 12.89 5.7 25.94 5.8 59.46 7.3 5.29 5.4 23.46 5.4 45.11 5 87.149.8 2.73 7.7 14.02 6.7 27.99 6.8 62.50 8.4 5.77 6.5 25.02 6.1 46.39 6.1 88.8610.9 2.96 8.7 14.97 7.8 29.69 7.8 65.04 9.5 6.18 7.6 26.22 7.7 48.29 7.2 90.1112 3.16 9.7 15.81 8.7 31.13 8.8 67.19 10.6 6.55 8.6 27.18 8.5 48.99 8.4 91.3213 3.35 10.7 16.55 9.7 32.41 9.8 68.99 11.6 6.87 9.7 27.97 9.2 49.63 9.5 92.52

14.1 3.52 11.7 17.21 10.7 33.51 10.8 70.60 12.6 7.16 10.8 28.67 10 50.23 10.6 93.7315 3.68 12.7 17.82 11.7 34.50 11.7 72.04 13.6 7.43 11.9 29.26 11.6 51.33 11.8 94.9616 3.82 13.7 18.36 12.7 35.39 12.7 73.30 14.6 7.67 13 29.83 12.4 51.83 12.9 96.2717 3.96 14.6 18.86 13.6 36.20 13.7 74.45 15.6 7.90 14 30.33 13.2 52.38 14.1 97.51

17.9 4.10 15.6 19.34 14.6 36.94 14.7 75.54 16.6 8.11 15.1 30.82 14 52.87 15.2 98.8718.8 4.22 16.5 19.77 15.5 37.63 15.7 76.53 17.5 8.31 16.2 31.27 15.6 53.85 16.3 100.219.7 4.34 17.5 20.18 16.5 38.27 16.7 77.43 18.5 8.49 17.3 31.71 16.4 54.37 17.5 101.520.6 4.46 18.4 20.56 17.5 38.87 17.7 78.28 19.4 8.67 18.4 32.15 17.2 54.86 18.6 102.921.5 4.57 19.3 20.91 18.4 39.43 18.7 79.08 20.4 8.84 19.5 32.58 18 55.40 19.7 104.222.4 4.67 20.3 21.27 19.4 39.96 19.7 79.78 21.3 9.00 20.6 32.99 19.6 56.41 20.9 105.623.2 4.77 21.2 21.60 20.4 40.44 20.8 80.49 22.3 9.15 21.7 33.41 20.4 56.94 22 107.024.1 4.87 22.1 21.91 21.3 40.92 21.8 81.16 23.2 9.30 22.8 33.81 21.2 57.43 23.1 108.425 4.96 23.1 22.21 22.3 41.39 22.9 81.77 24.1 9.44 23.9 34.24 22 57.95 24.3 109.7

25.8 5.05 24 22.49 23.3 41.79 23.9 82.31 25.1 9.58 24.9 34.65 23.6 59.02 25.4 111.126.6 5.14 24.9 22.76 24.3 42.21 25 82.89 26 9.72 26 35.07 24.4 59.53 26.5 112.427.5 5.22 25.9 23.03 25.3 42.59 26.1 83.41 26.9 9.85 27.1 35.48 25.2 60.06 27.7 113.828.3 5.31 26.8 23.28 26.3 42.97 27.1 83.84 27.9 9.98 28.2 35.90 26 60.57 28.8 115.229.2 5.39 28.7 23.75 28.3 43.66 28.2 84.32 28.8 10.10 29.3 36.31 28.4 62.13 30 116.530 5.47 30 24.06 30 44.20 30 84.95 30 10.26 30 36.57 30 63.19 30 116.6

¿cuántos sitios activos hay por molécula de quimotripsina?

¿Cuánto vale la constante de liberación de producto i.e. la tasa de catálisis neta?

¿cómo se compara este valor con la k CAT obtenida en el primer experimento?



8 El problema del mezclado.Como se puede deducir de la discusión anterior, a pesar de que se ha realizado buena dosis deinvestigación en el tema (véase por ejemplo el artículo Wong et al., 2004, Sensors and Actuators B100:359–379), uno de las limitaciones a las que no se les ha logrado superar es la reducción de lostiempos de mezclado. Los mejores resultados se aproximan a los 0.1 ms, pero esto depende mucho deaspectos como la viscosidad de medio, que, en el caso de las proteínas, se eleva de manera importante.Sin embargo, en lo que se ha avanzado substancialmente es en lo referente al volumen de la muestrarequerido para cada lectura y en el filtrado electrónico de los datos que permite mejorar la sensibilidada través de elevar la relación señal/ruido. Se ha logrado también avances importantes en lo referente ala versatilidad de los equipos de “quench-flow”, ya que el control computarizado de la instrumentaciónpermite la manipulación de los tiempos de incubación de las mezclas previas a la extinción, ya seavariando la rapidez del flujo, o bien recurriendo a flujos pulsados con un control muy preciso de lademora entre el mezclado de la enzima con el sustrato y su posterior mezclado con la solución deextinción.

Por otro lado, la reducción en el volumen de la muestra también trae asociado una limitante que, denuevo, tiene que ver con el mezclado. El mezclado es más eficiente cuando el flujo se vuelveturbulento, pero la turbulencia del flujo es directamente proporcional a la velocidad, inversamenteproporcional a la viscosidad y directamente proporcional a los que se conoce como la longitudcaracterística del flujo, la cual es una función directa del diámetro de la tubería (para tuberías desección circular).

Esto significa que al disminuir el volumen de muestra es necesario reducir el diámetro de las tuberías yesto lleva a aumentar los flujos. En consecuencia, los experimentos requieren presión, pero la presióngenera cambios en los valores de las constantes de rapidez, lo que también puede complicar el análisisde los experimentos.

Una alternativa a estas complicaciones es el uso de los métodos de relajación. En estos métodos lalimitante es que la reacción debe ser susceptible de alcanzar una situación de equilibrio, lo cual nosiempre es posible, pero en muchos casos si lo es.

Consideremos la reacción:

k1

Pk

2

PL

L+ (Esquema 9)

El sistema parte de un condición de equilibrio hacia la condición final nueva en la que [ P]EQi= p ' ,[ PL]EQ=c ' y [ L]EQi=l ' . Después de un intervalo de tiempo t después del cambio de condiciones

el c ' se encuentra a una distancia del equilibrio que llamaremos x .

Así [ P]=p=p ' x , [ L]=l=l ' x y [ PL]=c=c '−x .

El cambio en el sistema puede describirse como:

d c '−x dt

=k 1 p ' xl ' x −k 2c '−x



que puede reordenarse en:

dc 'dt

− dxdt

=k 1 p ' l '−k 2 c '+k 1( p '+l ' )x+k 2 x+k1 x2

Pero cuando se alcance la nueva situación de equilibrio tendrá que verificarse que:

dc 'dt

=k 1 p ' l '−k2 c '=0 , por lo que la ecuación de arriba se reduce a:

−dxdt

=k1( p '+l ' )x+k 2 x+k1 x2

Dado que la diferencia entre ambos equilibrios no es usualmente muy grande x , es usualmente lobastante pequeña para despreciar el término de segundo grado x2 .

La ecuación anterior se integra entonces para dar:

x=( p− p ' )ek 1 (p ' +l ' )+k 2

Podemos entonces ver que la relajación del sistema hacia el nuevo equilibrio es un decaimientoexponencial simple con un tiempo de relajación:

1τ=k1( p '+l ' )+k 2

.

Una gráfica del tiempo de relajación ( τ ) obtenido a diferentes concentraciones de ligando y proteínacontra la concentración de ligando más proteína libre al equilibrio ( p '+l ' ) dará una recta cuyapendiente es igual a la constante de segundo orden y cuyo intercepto a la ordenada es el valor de laconstante de primer orden.

Evidentemente los mecanismos en los que hay más de dos especies de proteína en equilibrio involucranmúltiples tiempos de relajación, lo cuales están usualmente acoplados. Por ejemplo en un esquemacomo el que sigue:

SE*S

k1

Ek

2

E·Sik

2

ik4

(Esquema 10)

El análisis del experimento rinde el valor de los dos tiempos de relajación que se recuperan acoplados yque pueden resolverse ajustando la señal a sumas de exponenciales (Naraghi, 1997), de la forma:

S OBS (t )=∑k =1

n

ak (1+ τkτ−τk

e−t / τ k− ττ−τk

e−t / τ)en la que τ es el tiempo de relajación del equipo y del detector combinados (convolucionados).

El producto y como la suma de los tiempos de relajación estarían dados por las expresiones siguientes:



1τ1

+ 1τ2

=k 2+k1(eEQ+sEQ)+ k 2i + k 4

i

( 1τ1

)( 1τ2

)=k 2 k 4i +k1( k 2

i +k 2)(eEQ+sEQ)

en las que las e EQ y sEQ son las concentraciones de enzima y sustrato libres al equilibrio (final).

De estos valores el posible recalcular los valores de las constantes, en la mayoría de los casos.

Un ejemplo de este tipo de análisis se muestra en la figura 7 (pag. 19).

9 Información susceptible y refractaria a la auscultación mediante estas metodologías.Después de toda este análisis, cabe aún preguntarse que es lo que puedo averiguar con estasmetodología sobre una enzima (u otro catalizador) y que es lo que está fuera del alcance de estosmétodos.

Para contestar a esta pregunta consideremos lo siguiente:

En estos métodos las determinaciones consisten en cuantificar la presencia de alguna especie químicadetectable. Sin embargo, hay especies químicas cuya vida media es muy corta y no presentan señalesespectroscópicas únicas que permitan diferenciarlas de otros componentes en la mezcla. En muchoscasos, puede tratarse de estados de transición o confórmeros desconocidos por no haberse aislado, i.e.sus propiedades no nos son familiares y, por ello, no siempre es posible asociarlos a alguna señaldetectable.

A pesar de que la electrónica y la espectroscopia se han sofisticado substancialmente, las especies devida media muy corta suelen encontrarse en cantidades muy pequeñas, por lo que su baja concentraciónpuede impedir el alcanzar certidumbre cuando se intenta medirla, aún si conocemos alguna propiedadque nos permita su detección.

Los métodos aquí estudiados muestran fenómenos en función del tiempo, pero en términos generales,nuestros modelos asumen que los diferentes estados son en sí especies químicas definidas. Enformulaciones alternativas (como la teoría de la fluctuaciones y la teoría de las tasas de reacción) seplantea que cada especie química es en si un conjunto confórmeros semejantes (ensambles), pero noidénticos; o bien, que un confórmero puede atravesar por una infinidad de microestados siguiendo unpaisaje de casi infinitas trayectorias, algunas de los cuales son de menor energía por un estrechomargen (figura 12). Así, las “barreras energéticas” que parecen existir y que representamos comoconstantes de velocidad dependientes de la temperatura y la presión, son en sí una consecuencia de unensamble en el que sólo algunos de los individuos pueden llegar “al otro lado del camino” y todos losdemás estados deben esperar a que el azar los lleve a esos estados “privilegiados” capaces de transitarhacia el siguiente intermediario (que a su vez es otro ensamble), o alternativamente, sólo algunosconfórmeros “aciertan” a seguir la trayectoria que finalmente conduce al siguiente intermediario, sindesviarse en el camino. Estas formulaciones son difíciles de concebir con moléculas pequeñas, dadaslos escasos grados de libertad que se presentan cuando existes sólo unos cuantos átomos, pero sonparticularmente atractivas con macromoléculas, especialmente, dado lo que hemos aprendido de lamacromoléculas con el análisis conformacional que permite la espectroscopia de resonancia magnéticanuclear.



El comportamiento predicho de las macromoléculas en tales modelos no es tan diferente al propuestopor la teoría clásica, excepto por detalles sutiles de difícil auscultación, lo que explica que no existatodavía un consenso en la literatura acerca del modelo que mejor describe a la naturaleza.

Dado que las metodología estudiadas en este apartado se basan en la inspección de los intermediarios através de técnicas que tienen a promediar las propiedades de los posibles confórmeros, estasmetodologías no permiten establecer cual de estos modelos es más cercano a la realidad ya que todosellos pueden ajustarse para explicar las observaciones experimentales de la cinética de estado pre-estacionario.

múltiples estados de energíaintermedia

Multiples trajectorias,pero sólo una efectiva

estado de alta energía

Un camino definidode un estado a otro

Multiples veredas con tiempos de tránsito

diversos

Figura 12. Dos tipos de modelos para explicar el impedimento para que una especiequímica se convierta en otra. El modelo clásico de Eyring propone un intermediario conconfiguración poco favorable requiere de elevada energía en forma transitoria. En otros, lateoría de las tasas de reacción y las teorías de las fluctuaciones proponen que las moléculasno atraviesan por estado realmente, pero si pueden quedar temporalmente “atrapadas” enconfórmeros que no pueden convertirse directamente en productos, o bien transitar portiempos largos entre estados de energía intermedia sin “encontrar la ruta” hacia losproductos. En ambos casos, de la población de moléculas presente, sólo una fracción estáen posibilidad real de completar la reacción, ya sea por que tiene la energía suficiente, oporque alcanzó el confórmero o trayectoria efectiva.

A pesar de lo anterior, la combinación de las técnicas fisicoquímicas y analíticas modernas puededarnos información sobre la termodinámica, la química y los fenómenos cuánticos asociados a los



fenómenos químicos observados. Toda esta información en conjunto podría en el futuro ayudarnos aresolver estas interrogantes.

Adicionalmente, el análisis de la cinética de estado pre-estacionarios es excelente para detectarintermediarios y medir el curso temporal de reacciones fisiológicas en las que las respuestas de lacélula depende de respuestas transitorias controladas por la rapidez relativa de reacciones alternativasque compiten por la misma posa de reactantes.

A pesar del poder de estas técnicas existen consideraciones importantes que uno debe hacer paraplanear un experimento informativo:

a) ¿Las condiciones experimentales son posibles?

c) ¿El modelo matemático de la situación a inspeccionar tiene soluciones expresas? o bien, ¿Contamoscon métodos numéricos que integren el modelo de manera confiable?

b) Los métodos numéricos y el poder de las computadoras disponibles permiten extraer la informaciónbuscada en forma fidedigna.

10 Ejemplos de la literatura que ilustran el poder de esta estrategia.Shore & Gutfreund (1970) Estudiaron la reacción catalizada por la alcohol deshidrogeneas hepática(LDH). En este estudio existe la ventaja de que tanto la proteína como el nucleótido poseen señalesfluorescentes características que varían a lo largo de la reacción. Además, es posible seguir la liberaciónde protones mediante el uso de indicadores de pH y se puede usar alcohol deuterado para determinar larelevancia de la transferencia del hidruro en la reacción general.

Ellos observaron que el alcohol deuterado era oxidado con una tasa de reacción mucho más lenta y quela liberación de protones precedía ligeramente a la reducción del nucléotido en el sitio activo de laenzima, por lo que propusieron un mecanismo como el que sigue:

EH+ EH+EH+E

etOH

NAD+ NADH

etO

NADH

(Esquema 11)

Travers et al. (1979) encontraron que por debajo de 4oC hay un cambio dramático en la energía deactivación de la reacción catalizada por la Creatina cinasa (CK).

Trabajando a estas temperaturas pudieron subdividir el transcurso inicial de la reacción catañlizada porla CK en una fase lag, una explosión y un estado estacionario. En esta enzima el complejo ternario(E.ATP.Creatina) está en equilibrio rápido con las especies libres y aparece un intermediario que nocontiene cretina fosfato, pero es diferente al complejo ternario.



E EEE

ATP ATP

Cr

ADP

EX E

CrP

k1

k2

k3

k4

k5 (Esquema 12)

Un éxito notable de este trabajo fue el haber podido determinar el valor de las cinco constantes derapidez involucradas en los pasos entre el complejo ternario y la regeneración de la enzima libre.Otra enzima estudiada extensamente con estas técnicas es la miosin-ATPsa. Numerosos trabajosrealizados con esta enzima allanaron el camino de la interpretación de la información estructural deesta proteína en relación con su función en la contracción muscular, todo ello, apesar de que en esaépoca (70s y 80s) no se contaba con suficiente información cristalográfica de esa proteína (Greeves,1991).

Estos métodos has sido empleados también para analizar el comportamiento de reacciones acopladasdel tipo R −Eb→ I −Ea→ P. Cuyo entendimiento facilita la interpretación de diversas vía metabólicas enla célula, pero también es importante en el diseño de ensayos enzimáticas acoplados, procesosindustriales y otras situaciones de índole práctico.

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Travers, Barman y Bertrnad (1979) Eur. J. of Biochem. 100:149-155


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1 Diferencias conceptuales entre las condiciones de estado...

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