1Le nucléosomeLe nucléosome

ADN et chromosome

ADN et chromosome

2

Solomon,D 2004, Nat cell Biol :

Heterochromatic domains in a

mouse nucleus

• Dimethylated Lys 9 of Histone H3 is shown in green, the Swi/Snf core ATPase Brg1 in red, and DNA in blue. The image was obtained using a Nikon Microphot FX fluorescence microscope. Scale bar represnts 3 µm.

• The winner would like to acknowledge the support of his advisor, Erik Knudsen, and technical assistance from Nancy Kleene (both at the University of Cincinnati College of Medicine, USA).

3 m

Domaines hétérochromatiques dans un noyau de souris

3

Plan

I - Structure et fonction de l'ADN

II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne– organisation des gènes le long de la

molécule d'ADN

III - Structure globale des chromosomes– emballage de la molécule d'ADN dans les

chromosomes

4

III - Structure globale des chromosomes

1. Chromosomes en écouvillon

2. Chromosomes polytènes de la drosophile

3. Hétérochromatine / Euchromatinea – État de la chromatine expression des gènes

b – Télomères

c – Centromères

d - Défense contre les éléments mobiles d'ADN

4. Chromosomes mitotiques

5. Organisation des chromosomes dans le noyau interphasique

5

Structure globale des chromosomes (Rappel)

I - ADN

II - Nucléosomes 30nm (0,1 cm de long)

III - 30nm organisation supérieure même en interphase– Mal compris : boucles, enroulements

6

1 - Chromosomes en écouvillon

• Dans une cellule en interphase, on ne voit pas les chromosomes (trop petits et trop emmêlés)

• MAIS il y a quelques exceptions où on voit l'organisation supérieure des chromomes

• ET on pense que certaines caractéristiques sont représentatives pour tous les chromosomes

• Un exemple : les chromosomes appariés de l'ovocyte d'amphibien– très actifs en transcription

– forment des boucles de chromatine rigides et déroulées le nom de chromosome en écouvillon

– visibles en microscopie optique

7

Fig 4-36(A)

• Chromosome en écouvillon (4 molécules d'ADN par chromosome) Microscopie optique

0,1 mm

8

Fig 4-36(B)

20 m

• Microscopie optique à fluorescence AC contre les protéines de maturation de l'ARN

• La plupart des gènes portés par la boucle d'ADN est en cours d'expression

9

Fig 4-37

• Structure du chromosome en écouvillon– Environ 10 000

boucles au total

– La plupart de l'ADN est condensé en chromomère

– Chaque boucle correspond à une séquence d'ADN spécifique

– 4 copies de chaque boucle (diplotène)

10

Chromosomes en écouvillon : illustration du phénomène suivant

• La chromatine dont l'ADN est utilisé est décondensée

• La chromatine dont l'ADN n'est pas utilisé est condensée

11

Applications du modèle chromosomes en écouvillon

• Dans les chromosomes en écouvillons correspondance précise

• Mais rarement observé dans les autres espèces

12

Applications du modèle chromosomes en écouvillon

• De l'ADN de poisson (sans chromosomes en écouvillons) prend la forme de chromosomes en écouvillon quand on l'injecte dans l'ovocyte d'amphibien hypothèse :

• Les chromosomes en interphase de tous les eucaryotes sont organisés en boucles trop petites et trop fragiles pour être observables

13

Applications du modèle chromosomes en écouvillon

• Modèle d'étude pour l'ADN de mammifère qu'on injecte dans un ovocyte d'amphibien

• Corrélation– boucle

– gène

– séquence d'ADN

14

2 - Chromosomes polytènes de la drosophile

• Autre exemple de chromosome interphasique visible au microscope optique

• Plusieurs milliers de molécules d'ADN par chromosome = chromosome polytène

• chromosome polytène = 1 chromosome avec beaucoup de molécules d'ADN

• Cellule polyploïde = plusieurs lots de chromosomes avec chacun une molécule d'ADN

15

Chromosomes polytènes de la drosophile

• Très étudié dans les cellules des glandes salivaires de larve de drosophiles

• 10 réplications sans séparation des 4 chromosomes 210 (= 1024) molécules d'ADN par chromosome

16

Fig 4-38

• Lot complet de chromosomes polytènes dans une cellule de glande salivaire de drosophile

• 4 paires de chromosomes différents (2n = 8)

• Chaque paire est appariée chaque paire apparaît comme une seule structure

17

Fig 4-39

10m

• Microscopie optique d'une portion de chromosome polytène

• Alternance debandes sombres (95% de l'ADN) et d'interbandes claires (5% de l'ADN)

• Une bande ou interbande = 1024 séquences d'ADN alignées en phase

• Une bande = 3 000 à 300 000 paires de nucléotides

• Chaque bande est reconnaissable et numérotée

• Environ 5 000 bandes et 5 000 interbandes

18

Fig 4-40

• Microscopie électronique de chromosome polytène

•Chromatine plus condensée•ou contient plus de protéines•ou les deux

Chromatine moins condensée

19

Signification des bandes et des interbandes

• Toujours pas de réponse claire depuis 1930

• On a pensé que (faux)– nombre de bandes nombre de gènes – une bande un gène

• En fait c'est faux et– Nombre de gènes 3 X nombre de bandes

– On trouve des gènes dans des bandes et interbandes

– Certaines bandes ont plusieurs gènes

– Certaines bandes n'ont pas de gènes

20

Signification des bandes et des interbandes actuellement

• Bande / Interbande est le reflet de différents niveaux d'expression génique

• Interbandes– chromatine moins compacte

– gènes plus exprimés

• Bandes– chromatine plus compacte

– gènes moins exprimés

• Le chromosome polytène est le reflet de la nature hétérogène de la compaction de la chromatine de tous les chromosomes interphasiques

21

Ecdysone

• Hormone stéroïde qui contrôle l'expression des gènes des chromosomes polytènes de la drosophile

• Taux montent et descendent en fonction du dévelopement larvaire– si le taux monte les gènes codant

pour les protéines s'expriment

22

Boursouflures chromosomiques (= "puffs" = nodules)

• Au fur et à mesure du dévelopement des boursouflures chromosomiques apparaissent puis disparaissent quand de nouveaux gènes s'expriment ou s'éteignent

• Un puff décondensation d'une bande

23

Fig 4-41

• Renflements chromosomiques (bras gauche du chromosome 3) : apparition et disparition des renflements chromosomiques le long du chromosome polytène

• Chacun des 5 "puff" n'est actif que pendant une courte période

22 heures

24

Anneaux de Balbiani

• "Puff" particulièrement grand d'un chromosome polytène

• Arrangement de la chromatine en boucles (comme dans les chromosomes en écouvillon)

• Visibles en microscopie électronique

• Surtout (≈que) dans les cellules des glandes salivaires du moucheron Chironomus tentans

• Chaque boucle contient un gène unique

25

Fig 4-42(A)

• Synthèse d'ARN dans un "puff" chromosomique (Chironomus tentans) AC anti BrU

Nouvel ARN à partir d'un anneau de Balbiani

Nouvel ARN à partir d'un anneau de Balbiani

ARN synthétisés avant l'addition du BrUTP

ayant diffusé de l'anneau de Balbiani

ARN synthétisés avant l'addition du BrUTP

ayant diffusé de l'anneau de Balbiani

ARN synthétisés à partir d'un l'anneau de Balbiani avant l'addition du BrUTP

ARN synthétisés à partir d'un l'anneau de Balbiani avant l'addition du BrUTP

26

Fig 4-42(B)

Un "puff" d'un chromosome

polytène

27

Fig 4-43(gauche)

• Chromosome polytène de Chironomus tentans• Coupe dans un anneau de Balbiani (l'ensemble est un "puff")

28

Daneholt,B2001p7012

Salivary gland cells in the larvae of the dipteran Chironomus tentans offer unique possibilities to visualize the assembly and nucleocytoplasmic transport of a specific transcription product. Each nucleus harbors four giant polytene chromosomes, whose transcription sites are expanded, or puffed. On chromosome IV, there are two puffs of exceptional size, Balbiani ring (BR) 1 and BR 2. A BR gene is 35–40 kb, contains four short introns, and encodes a 1-MDa salivary polypeptide. The BR transcript is packed with proteins into a ribonucleoprotein (RNP) fibril that is folded into a compact ring-like structure. The completed RNP particle is released into the nucleoplasm and transported to the nuclear pore, where the RNP fibril is gradually unfolded and passes through the pore. On the cytoplasmic side, the exiting extended RNP fibril becomes engaged in protein synthesis and the ensuing polysome is anchored to the endoplasmic reticulum. Several of the BR particle proteins have been characterized, and their fate during the assembly and transport of the BR particle has been elucidated. The proteins studied are all added cotranscriptionally to the pre-mRNA molecule. The various proteins behave differently during RNA transport, and the flow pattern of each protein is related to the particular function of the protein. Because the cotranscriptional assembly of the pre-mRNP particle involves proteins functioning in the nucleus as well as proteins functioning in the cytoplasm, it is concluded that the fate of the mRNA molecule is determined to a considerable extent already at the gene level.

29

Daneholt,B2001p7012(fig1)

Electron micrograph showing chromosome IV with its three giant puffs (Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated as well as the nucleoplasm (Npl) and cytoplasm (Cpl). The arrows mark a few prominent transcription loops (cf. Fig. 2D). (Bar equals 2 μm.)

Electron micrograph showing chromosome IV with its three giant puffs (Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated as well as the nucleoplasm (Npl) and cytoplasm (Cpl).

Electron micrograph showing chromosome IV with its three giant puffs (Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated as well as the nucleoplasm (Npl) and cytoplasm (Cpl).

30

Daneholt,B2001p7012(fig2)

• Intracellular distribution of the cap-binding protein CBP20 in C. tentans salivary gland cells studied by immunoelectron microscopy. The assembly of the BR RNP particle is shown in A–D: proximal portions of the BR gene are displayed in A, distal portions in B and C, and a schematic drawing of the BR gene in D (p, proximal; m, middle; d, distal portions of the gene). The fate of the released BR particles is shown in E–H: BR particles are present in the nucleoplasm (E), at the pore (F), and in an unfolded conformation when passing through the pore (G and H). Gold particles are marked by arrows and indicate the position of CBP20. It should be noted that gold particles are at the leading 5′ end of the BR particle when it passes through the nuclear pore.(Bar equals 100 nm.)

31

Daneholt,B2001p7012(fig3)

• Assembly and transport of the BR RNP particle and its relation to a number of BR RNA-associated proteins. The BR particle is assembled on the gene (left), passes through the nucleoplasm, unfolds, and translocates through the nuclear pore (middle). On the cytoplasmic side, the BR RNP fibril becomes engaged in protein synthesis and the polysomes anchor at the endoplasmic reticulum (right). The tripartite nuclear pore complex with its central channel is seen in black and its nuclear and cytoplasmic fibers are presented in pink. The BR gene with its five exons is displayed above the BR particle scheme, and the flow patterns of the BR RNA-associated proteins are outlined below. snRNP, small nuclear RNP.

BR RNA-associated proteins

1, 2, 3, 4, 5 : exons

32

Fig 4-42(droite)

• Boucle de chromatine dans un anneau de Balbiani

33

Conclusions sur les anneaux de Balbiani

• Quand le gène s'exprime, la fibre de chromatine de 30 nm se décondense mais garde ses 4 histones

• Par défaut la fibre est sous la forme 30 nm• Peuvent décondenser cette fibre :

– les modifications des histones– les complexes de remodelage de la chromatine– les protéines de régulation de l'expression des

gènes

• La boucle serait un domaine fonctionnel indépendant

34

Extrapolation

• Tout l'ADN des chromosomes polythènes est organisé en boucles qui se condensent et se décondensent

• Tous les chromosomes interphasiques de tous les eucaryotes sont emballés en boucles contenant quelques gènes dont l'expression est régulée de façon coordonnée

35

Fig 4-44

• Modèle de structure du chromosome interphasique

• Déduit à partir de quelques cas rares

20 000 à 100 000 paires de nucléotides

36

3 - Hétérochromatine / Euchromatine

a. État de la chromatine expression des gènes

b. Télomères

c. Centromères

d. Défense contre les éléments mobiles d'ADN

37

Historique (1938)

• Deux types de chromatine en interphase (MO)– Hétérochromatine : toujours condensée

(même en interphase)

– Euchromatine : le reste

38

Actuellement

• Euchromatine ( fibre de 30 nm et boucles)

• Hétérochromatine– contient des protéines supplémentaires

– Plus compacte 10 % du génome est hétérochromatique

– Régions spécifiques : centromères et télomères

39

Hétérochromatine

• Son ADN ne contient presque pas de gènes• Les gènes emballés dans de l’hétérochromatine ne

peuvent pas s’exprimer• Fonctionnement des télomères et centromères• Certains gènes ont même besoin d’être localisés

dans de l’hétérochromatine pour s’exprimer• Le mot hétérochromatine comprend plusieurs types

de structure de chromatine avec un très haut degré d’organisation

• L’hétérochromatine n’est pas un emballage d’ADN "mort"

40

a - Expression de l'hétérochromatine

• Un gène qui s'exprime dans de l'euchromatine ne s'exprime plus s'il est localisé dans de l’hétérochromatine : il devient "silencieux" exemple d'effet de position

• Effet de position : l'activité d'un gène dépend de sa position le long du chromosome

41

Effet de position

• Découvert chez la drosophile• = influence de l'état de la chromatine le

long du chromosome sur l'expression du gène

• Chromosome = mosaïque de formes différentes de chromatine dont chacune a un effet particulier sur la capacité de l'ADN à être sous le contrôle de la cellule

42

Deux exemples de diversification par effet de position

• 1 - Gène ADE2 de la levure

• 2 - Gène white de la drosophile

43

Exemples de diversification par effet de position 1/2 : Gène ADE2

de la levure

• Gène ADE2 de la levure– Position normale expression– Position près du télomère (hétérochromatique)

pas d'expression

• ADE2 code pour une enzyme de la synthèse de l'adénine

• Si absence accumulation de pigment rouge• Parfois le gène redevient actif dans la

descendance : emballage moins serré de l'hétérochromatine

44

Fig 4-45 (A)

• Exemples de diversification par effet de position : Gène ADE2 de la levure

45

Exemples de diversification par effet de position 2/2 : Gène white de la drosophile

• Le gène white contrôle la couleur des yeux• Gène white normal (allèle sauvage white + yeux

rouges)• Gène white muté (allèle muté white - yeux blancs

[d'où le nom])• Le gène white normal (white +)

– Position normale expression yeux rouges– Position proche de hétérochromatine pas d'expression

yeux blancs– En fait mottes rouges et blanches : présence de rouge car

pas d'inactivation pendant la période embryonnaire

46

Fig 4-45 (B)

• Exemples de diversification par effet de position : Gène white de la drosophile

47

Deux exemples de diversification par effet de position : gène ADE2 de la levure et gène white de la

drosophile• Un gène peut se réactiver (colonies rouges

et blanches, yeux avec mottes rouges et blanches)

• Une fois réactivé, transmission aux cellules filles

• Si emballé avec l'hétérochromatine, inactivation transmises aux cellules filles

48

Deux caractères de l'hétérochromatine

• Dynamique

– Peut s'étendre puis se retirer

• État héritable d'une cellule à la fille

– Explique la "diversification par effet de position"

49

Fig 4-46(A)

• ADN limitant empêchant l'hétérochromatine de déborder sur l'euchromatine (peut disparaître au cours de remaniements)

50

Fig 4-46(B)

• Débordement variable de l'hétérochromatine au cours du développement hérité précocément aspect "bariolé" (variegated) de ces mouches

51

b – Télomères

• Le meilleur modèle : S. cerevisiae

• Pas d'expression de gène à 5000 paires de nucléotides des extrémités des chromosomes : structure hétérochromatique

• Intervention d'enroulement et de protéines

• Beaucoup de ces protéines sont connues chez S. cerevisiae : Silent information regulator (protéines Sir)

52

Protéines Sir (Silent information regulator)

• Des mutations dans les protéines Sir empêchent le silence des gènes proches des télomères

• Découverte d'un complexe de protéine Sir lié au télomère qui reconnaît les queues de certaines histones sous-acétylées

53

Fig 4-47(A)

• Hétérochromatine de l'extrémité des chromosomes

de levure

H4 H4

54

Kimura,A2002p370 Nat Genet(fig5)

• Model of the role of acetylation of H4–Lys16 in the localization of silencing proteins along chromosomes. a, Model of the region-dependent regulation of the interaction between Sir3p and H4 through the reversible acetylation of H4–Lys16 by Sas2p and Sir2p. b, Model of the function of the chromosomal gradient as a boundary to prevent the spread of silencing proteins. In the wildtype strain (top), the marked increase in the acetylation of H4–Lys16 from the end of the telomere to the telomere-proximal region acts as a steep ‘slope’ that Sir3p (green spheres) must overcome to diffuse throughout the chromosome. In the absence of Sas2p (middle), acetylation of H4–Lys16 in the telomere-proximal region is decreased, which allows Sir3p to diffuse. In the absence of Sir2p (bottom), deacetylation of H4–Lys16 at the ends of the telomere does not occur, and Sir3p is not retained in this region.

55

Suka,N2002p378(fig6) Nat Genet 32,(3):Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and

spreading of heterochromatin

56

Sir2 (Silent information regulator 2)

• Désacétylase d'histone sous acétylation d'histone propre à l'hétérochromatine emballage plus serré des nucléosomes

• Très conservée

57

Fig 4-47(B)

• Protéines de liaison à l'ADN spécifiques fixation d'une protéine Sir (Sir2?) le long du chromosome désacétylation des queues d'histones (par Sir2) création de nouveaux sites de fixation de Sir

58

Fig 4-48(A)

• Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine

59

Fig 4-48(B)

• Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine

60

Rôle des histones méthyl transférases

• Méthylent des lysines spécifiques (K9 de H3)

• Lue par les composants hétérochromatiques

• Assemblage en hétérochromatine

61

Intérêt des télomères

• Protection des extrémités des chromosomes

• Régulation de la longueur des chromosomes

• Ségrégation des chromosomes pendant la mitose

62

Résumé

• Modifications covalentes des histones

• Transmises

63

c – Centromères

• Séquences d'ADN qui permettent la ségrégation des chromosomes

• Présence d’hétérochromatine autour des centromères

• Centromères inclus dans de grandes étendues d'hétérochromatine où les gènes ne s'expriment pas (si on en met)

64

Hétérochromatine centrique (centromérique)

• Histones– Sous acétylées

– Méthylées

• Autres protéines

• Modèle d'étude : S. cerevisiae

65

S. Cerevisiae

• 125 paires de nucléotides sont suffisants pour former un centromère

• Plus une douzaine de protéines • Un nucléosome spécifique de

centromère

66

Fig 4-49

Variant de histone H3 (CENP-A) + H2A + H2B + H4plus d'autres protéines

• Nucléosome de centromère chez S. cerevisiae

67

Fig 4-49

• Chromosomes mitotiques de Drosophile

Histone H3 Histone H3 conventionnelle fusionnée conventionnelle fusionnée avec GFP (avec GFP ( couleur verte couleur verte

de H3)de H3)

En rouge composant du En rouge composant du kinétochore coloré par un kinétochore coloré par un

AC spécifiqueAC spécifique

68

Fig 4-49

• Chromosomes mitotiques de Drosophile

Histone H3 spécifique du Histone H3 spécifique du centromère fusionnée avec GFP centromère fusionnée avec GFP

(( couleur verte de H3) couleur verte de H3)++

En rouge composant du En rouge composant du kinétochore coloré par un AC kinétochore coloré par un AC

spécifiquespécifique==

Localisation des centromères Localisation des centromères en jauneen jaune

69

Organismes complexes

• Drosophile, humain

• Centaines de milliers de paires de nucléotides

• Pas de séquence d'ADN spécifique

• ADN satellite (petites séquences d'ADN répétées)

70

Fig 4-50

• Structure d'un centromère humain

71

Séquences centromériques

• Les mêmes séquences d'ADN satellite placées sur d'autres chromosomes ne forment pas de centromères !!!

• De plus formation du kinétochore ???

• Rôle des protéines > rôle de l'ADN ???

• Formation et maintien de centromère Formation et maintien de hétérochromatine

72

Aspect phylogénétique des centromères

• Présence d'ADN satellite non fonctionnel sur des chromosomes identique à l'ADN satellite des centromères

• Phénomène de fusion de chromosomes avec création d'un nouveau centromère qui devient inactif

• Possibilité de formation de néocentromères sans ADN satellite

73

Fig 4-51(AB)• Phénomène de

fusion de chromosomes avec création d'un nouveau centromère qui est devenu inactif

• Chromosome surnuméraire qui se crée un centromère sur de l'ADN non satellite

74

Fig 4-51(C)

• Modèle d'explication de

la plasticité et de l'héritabilité des

centromères

75

Plasticité des centromères

• Formation de complexes de protéines de liaison à l'ADN qui ont plus d'"appétit" pour l'ADN satellite

• Cette marque pourrait se "perdre" (!!!)

• Avantage évolutif

• Évolution des chromosomes par cassure-recollement (cf. évolution)

76

d – Défense contre les éléments mobiles d'ADN

• En résumé– Hétérochromatine courtes séquences répétées

d'ADN en tandem (pas de codage de protéines)

– Euchromatine riche en gènes à copie unique

• Mais – Il y a des gènes dans l'hétérochromatine

– Il y a des séquences répétées dans l'euchromatine

77

Mutité génique induite par la répétition du gène

• Si on introduit des séquences répétées de gènes dans le génome (souris ou drosophile) – Pas d'expression

– Formation d'hétérochromatine

• Si on introduit la séquence unique du même gène au même endroit – Expression du gène

78

Mutité génique induite par la répétition du gène

• Mécanisme de protection contre l'invasion par les éléments génétiques mobiles

• Emballage en hétérochromatine et mutisation des éléments pour éviter leur prolifération

• Même mécanisme pour l'hétérochromatine juxta centromérique ?

79

4 - Chromosomes mitotiques

• Stade ultime de condensation

• Seul moment où les chromosomes sont visibles (exception écouvillon, polythènes)

• Raccourcissement du chromosome interphasique de 10 fois

80

4 – Chromosomes mitotiques

• a – Caryotype• b – Emballage de la chromatine dans le

chromosome mitotique

81

a – Caryotype

82

Fig 4-52

• Chromosome mitotique typique: 2 chromatides contenant chacune une molécule d'ADN identique générée pendant la phase S du cycle cellulaire

83

Fig 4-53

• Extrémité d'un chromosome mitotique vue en microscopie à balayage : nombreux domaines en boucle après extraction des complexes de riboprotéines

84

Fig 4-54

• Microscopie électronique d'un chromosome mitotique

• Les boucles émanent d'une charpente centrale

• Boucle gène (très grossièrement)

85

Caryotype

• 46 chromosomes

• Marquage longitudinal

86

Caryotype : bandes G

87

Caryotype : bandes G

88

Caryotype spectral

89

• Bras (p ou q)

• Région (eg : p1)

• Bande (eg : p11)

• Sous-bande (eg : p11.2)

• Sous-sous-bande (eg : p11.23)

Caryotype : un chromosome

90

Bandes

• S'observent chez toutes les espèces : humain, drosophile…

• Très conservées

• Homme chimpanzé, gorille, orang-outan

91

Fig 4-57

• Comparaison du plus grand chromosome humain (le 1) avec celui du chimpanzé,du gorille et de l'orang-outan

• Les chromosomes sont organisés en très grands domaines importants pour leur fonction

92

Corrélationbande du chromosome métaphasique

bande du chromosome polythène

• Aucune relation

• Du début de la mitose à la fin les bandes sont– De moins en moins nombreuses (elles

fusionnent)

– De plus en plus épaisses

93

Corrélationbande du chromosome métaphasique

bande du chromosome polythène

– La bande la plus fine du caryotype contient plus d'un million de paires de nucléotides (≈ un génome bactérien)

– Bandes plus ou moins riches en GC (ou AT) à peu près aux bandes des

chromosomes

94

Zones GC riches

–Bandes R–Forte densité en gène–Gènes domestiques–Empaquetage des boucles de chromatine

–Plus de molécules qui participent à l'expression des gènes

95

Zones AT riches

• Bandes G

96

b – Emballage de la chromatine dans le chromosome mitotique

97

Fig 4-55

• Emballage de la chromatine

98

c - Condensation des chromosomes en mitose

• Deux conséquences– Individualisation des chromatides

– Protection des chromosomes

• Nécessité des condensines

99

Condensines(incluent les SMC)

• Utilisent de l'ATP

• Servent à l'enroulement du chromosome interphasique

• Gros complexes protéiques qui contiennent les protéines SMC (Structural Maintenance of Chromosomes)

100

Protéines SMC(sont incluses dans les condensines)

• Composants d'un complexe de condensine beaucoup plus gros

• Longues molécules dimériques• avec une charnière centrale• Domaine globulaire à chaque extrémité• ADN + SMC + ATP grandes boucles d'ADN

+ ADP• Composant important des chromosomes

mitotiques : une molécule tous les 10 000 nucléotides

101

Fig 4-56

• Protéine SMC

102

5 - Organisation des chromosomes dans le noyau interphasique

• Noyau différent d'un sac à chromosomes

• En interphase semble désordonné

• En mitose très orienté– Centromère d'un côté

– Télomères de l'autre

• Dans certains noyaux persistance de cette disposition en interphase : orientation rabl

103

Fig 4-58

• Racine de plante en interphase en fluo– Centromères en vert

– Télomères en rouge

104

Fig 4-59

Polymère en solution

Embryon de drosophile

105

Embryon de drosophile

• Division cellulaire toutes les 10 minutes

• Les chromosomes n'ont pas le temps de quitter l'orientation rabl

• Quand l'interphase est plus longue les chromosomes ont le temps de se replier

• Ce repliement est lié à des associations spécifiques à l'intérieur de différentes régions d'un même chromosome

106

Cellule "commune"

• Les centromères sont dispersés

• Chaque chromosome semble avoir une position donnée et son petit territoire : tous les chromosomes ne sont pas emmêlés les uns dans les autres

107

Fig 4-60

• Chromosome painting de deux chromosomes interphasiques de lymphocytes humains

Les deux chromosomes 18

Les deux chromosomes 19

108

Croft,A1999p1119(fig1)

• Human chromosomes 18 and 19 interphase territories. 2D preparations of nuclei, swollen in hypotonic and fixed either with MAA (a-d) or with 4% pFa (e), were hybridized with HSA18 and 19 paints. In the central panels of a-e HSA18 and 19 paints were biotinylated and detected with avidin-FITC (green). In the left-hand panels of a and b, paints were labeled either with biotin and detected with TR (red) or with digoxigenin and detected with FITC (green). All nuclei were counterstained with DAPI (blue). (a) Primary lymphocytes; (b and e) lymphoblastoid cell line; (c) primary fibroblasts; (d) HT1080 fibrosarcoma cells. Bars, 2 µm. On the right, histograms show the mean proportion of DAPI stain (blue bars), and HSA18 (filled bars) and HSA19 (open bars) hybridization signals in each of the five concentric shells of equal area eroded from the periphery (1) to the center (5) of 50 segmented nuclei. Error bars show SEM.

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Croft,A1999p1119(fig2)

• Fig. 2.   Subnuclear localization of HSA18 and 19 in optical sections through 3D-preserved nuclei. Confocal z series (1 µm) of hybridization to 4% pFa-fixed 3D human dermal fibroblasts with paints for either HSA18 (a and b) or HSA19 (c and d), prepared from randomly amplified total DNA from each chromosome and detected with FITC (green-yellow) and counterstained with PI (red). Cells were either untreated (a and c) or treated with DRB (b and d). Bars, 10 µm.

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Croft,A1999p1119(fig3)

• HSA18 and 19 territories through the cell cycle.

• (a) Combined FISH and immunofluorescence in 4% pFa-fixed 3D fibroblasts with either chromosome 18 or 19 paints (green) and with antibodies against pKi-67 (red) and B-type lamin (blue). The cells on the left are in early stages of G1 and those on the right in mid G1, S, or G2 based on their pattern of pKi-67 staining (Bridger et al., 1998 ). Bar, 5 µm.

• (b) FISH for HSA18 or 19 (red) in flattened preparations of MAA-fixed lymphoblast nuclei, pulsed with BrdU (green), and separated by centrifugal elutriation. Blue is DAPI. Bar, 2 µm. FACS® analyses of PI-stained nuclei from elutriated fractions chosen to represent G1, early S, late S, and G2 are shown beneath each panel. Horizontal bars on the FACS® profiles indicate the gating for cells in G1 (left) and for those in S and G2 (right).

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Croft,A1999p1119(fig4)

• Dependence of territory sizes on transcription and histone deacetylation

• (a) Frequency histograms of the proportion of nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) in 50 swollen and flattened MAA-fixed lymphoblastoid nuclei.

• (b) Histograms of the proportion of summed nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) through the confocal sections of 5-10 fibroblast nuclei fixed with 4% pFa. Vertical solid and dashed lines show mean proportionate areas for HSA18 and 19, respectively. Cells were either untreated, or treated with AMD, DRB, or TSA before harvest. DRB-treated cells were also grown for 1 h in the absence of DRB (DRB release).

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Croft,A1999p1119(fig5)

• Fig. 5.   The orientation of chromosomes 18 and 19 in normal nuclei and those from a t(18;19). (a and b) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 18p and q arms (Guan et al., 1996 ). 18p is in red in a and in green in b. 18q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (c and d) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 19p and q arms (Guan et al., 1996 ). 19p is in red in c and in green in d. 19q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (e) Flattened primary lymphocytes hybridized simultaneously with HSA18 paint (red) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (green) specific for 18pter and qter, respectively. DAPI counterstain is blue. (f) 3D-preserved nuclei cohybridized with HSA18 paint (green) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (red). Red signal in the cytoplasm is from endogenous biotin. Telomere signals are apparent with only one of the territories, those associated with the other territory are in a different focal plane. (g) FISH to a metaphase spread from an individual with t(18; 19)(p11;p13) with chromosome 18 material shown in green and 19 in red. The appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. (h and i) Interphase nuclei from t(18;19) cells. HSA18-derived material is detected in green in h and in red in i. HSA19 is detected in the reciprocal color in each panel as indicated. As in g, appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. A line was drawn from the center to the edge of the nucleus passing through each derived chromosome. A second line, perpendicular to the first, was put through the middle of the signal and it was ascertained which side of this line the translocated portion was found. (j) Histograms of the position of the edge of the signal in relation to the edge or the center of the nucleus, in 50 t(18;19) nuclei, for both the normal (open bars) and derived (filled bars) chromosomes 18 and 19. There is no significant difference in the positions of derived and normal chromosomes (P < 0.059 for HSA18 and P < 0.110 for HSA19).

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Croft,A1999p1119(fig6)

• Associations of HSA18 and 19 with nuclear substructure. Lymphoblastoid nuclei extracted with 0.5, 1.0, 1.2, and 1.8 M NaCl, fixed with MAA, and hybridized with alternately labeled chromosome 18 and 19 paints, the color of which is indicated at the right of each panel. DNA was stained with DAPI (shown in blue on the right and in black and white on the left). Chromosome 19 material is retained within the residual nucleus. HSA18 is released into the DNA halo at high salt concentrations. Bar, 2 µm.

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Schémas hypothétiques d'organisation des

chromosomes dans le noyau

1. Fixation du chromosome à l'enveloppe nucléaire

2. Existence d'un "nucléosquelette"

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1 - Fixation du chromosome à l'enveloppe nucléaire

• Par leurs télomère par exemple

• Toutefois position non fixe dans le noyau

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Fig 4-61

• Noyaux d'embryons de drosophile : localisations de deux régions différentes (jaune et magenta) du chromosome 2 proches de l'enveloppe nucléaire (AC antilamina en vert)

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2 - Existence d'un"nucléosquelette" (1de2)

• "Matrice" nucléaire• "Charpente nucléaire" (ce qui reste

après extraction)• Certaines des protéines peuvent se

lier à des séquences spécifiques de l'ADN appelées SARs (Scaffold Associated Regions)ou MARs (Matrix Associated Regions)…

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2 - Existence d'un"nucléosquelette" (2de2)

• …Formeraient la base des boucles• Existence in vivo ?• Organisation des chromosomes localisation

des gènes expression des gènes