Date post: | 03-Apr-2015 |
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2
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR(fragment d'ADN
capable de réplication autonome)
Principe
Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur
Exemple : gène associé à
une maladie
Amplification de cet ADN, expression des protéines correspondantes...
Obtention d'un ADN Recombinant
3
Définitions
• Génie Génétique ou technologie de l’ADN recombinant : ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations.
Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent exprimer la protéine recombinante (par exemple une protéine d’une espèce différente, une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette…)).
• L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce totalement différente).
• Le clonage désigne plusieurs choses :
- Une multiplication à l'identique (conservation parfaite de l'information génétique) : à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de l’organisme entier (clonage reproductif).
- L’amplification d’un fragment d’ADN par des micro-organismes après son insertion dans un vecteur
4
Plan
• A/ Les principales techniques du génie génétique
• B/ La diversité des techniques du génie
génétique
• C/ Les applications de la technologie de
l’ADN recombinant
55
A/ Les principales techniques du génie génétique
6
Principe de la technologie de l’ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR(fragment d'ADN
capable de réplication autonome)
Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
Expression et purification des protéines correspondantes, étude du niveau d’expression et des
fonctions des protéines...
I) O
bten
tion
de l’
AD
N r
ecom
bina
ntII
) U
tilis
atio
n de
l’A
DN
rec
ombi
nant
7
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR(fragment d'ADN
capable de réplication autonome)
Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
2) Amplification du fragment d’ADN du donneur
3) Présentation d’un vecteur
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur : - Digestion - Ligation
5) Amplification de l’ADN recombinant obtenu 6) Vérification de la construction
8
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
9
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
L'ADN de l'organisme donneur peut être :
- de l'ADN génomique (extrait à partir d'une culture cellulaire...)
- de l’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par
transcription réverse sur des ARN messagers
(L’ADNc comporte une information sur les régions 5' et 3'
non traduites, et ne contient pas d'introns)
10
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
AAAAAA 3’ARNm avec queue polyA 5’
=> Obtention d'un brin d’ADN complémentaire
Pour obtenir le deuxième brin d’ADNc, une PCR est réalisée sur l’ADN obtenu
avec une ADN polymérase (voir principe diapo 12). L’ARN peut être éliminé
par un traitement la RNase.
On peut obtenir une banque d'ADNc : clonage de tous les ADNc (cela dépend des ARNm exprimés par une cellule à un moment donné dans des conditions données)On peut aussi cloner un ADNc spécifique en choisissant une amorce à cheval sur la queue polyA et le 3' du transcrit
Pri
ncip
e d
e la
tran
scri
ptio
n ré
vers
e
TTTTT
1) Hybridation avec un
oligonucléotide complémentaire
de la queue polyA
2) Élongation de l'amorce par la transcriptase réverse
11
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
2) Amplification du fragment d’ADN d’intérêt
12
2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt : la PCR
• Amplification du fragment d'ADN d'intérêt (gène entier ou tronqué) par PCR : Polymerase Chain Reaction
• La PCR est une réaction de polymérisation en chaîne à partir d'amorces spécifiques de l'ADN d'intérêt, grâce à l'action d'une enzyme, l’ADN polymérase dans un milieu contenant des nucléotides
13
2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt : la PCR
Séquence à amplifier
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
14
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Temps
Tem
péra
ture
(°C
)
95
72
Tm
1ère étape : dénaturation
de l'ADN à 95°C (séparation des brins complémentaires)
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
15
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Temps
Tem
péra
ture
(°C
)
95
72
Tm
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'
3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
Amorce
Amorce
2ème étape : hybridation des amorces (séquence de nucléotides complémentaires de l’extrêmité de la région à
amplifier) à une température Tm (spécifique de l'amorce)
(en général amorces de 15-25 nucléotides)
5’ G T C 3'
3' C G C 5'
16
Temps
Tem
péra
ture
(°C
)
95
72
Tm
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5'
G T C3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
5'
3ème étape : élongation (synthèse du brin complémentaire à partir des amorces grâce à l’enzyme ADN polymérase et aux nucléotides présents dans le milieu réactionnel). Fonctionnement de l’enzyme à 72°C.
G G A A T C C A T G C G T A C G
A T A G C A G C C T T A G G T A
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Fin du premier cycle de PCR : aucune molécule obtenue ne correspond au produit désiré (souligné). Un nouveau cycle de PCR (dénaturation-hybridation-élongation) commence.
17
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5'G T C G G A A T C C A T G C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' 5’G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'C A G C C T T A G G T A C G C 5'
5'G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5' G T C3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
5' G G A A T C C A T G C G T A C G 3’
3'A T A G C A G C C T T A G G T A
Produits du 1er cycle de PCR :
Produits du 2ème cycle de PCR : (les amorces sont en magenta)
Brin 1Brin 2
Brin 3Brin 4
Produit PCR formé à
partir du brin 1
Produit PCR formé à
partir du brin 2
Produit PCR formé à
partir du brin 3
Produit PCR formé à
partir du brin 4
18Temps
Tem
péra
ture
(°C
)
95
72
Tm
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
G T C G G A A T C C A T G C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'
G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'C A G C C T T A G G T A C G C 5'
G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
5'
5'
5'
1er cycle 2ème cycleMolécules obtenues à la fin du second cycle de PCR. Aucune ne représente le produit d'intérêt (souligné).
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
1919
T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
5'5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
Fin du troisième cycle :
deux produits PCR
attendus apparaissent.
Ces produits vont
ensuite se multiplier de
façon exponentielle par
rapport aux produits
non souhaités.
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Molécules d’ADN obtenues à la fin du 3ème cycle de PCR :
2020
T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C
G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C
5'5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Quatrième cycle de PCR :
8 fragments d'ADN
d'intérêt
Cinquième cycle de
PCR :
22 fragments
d'intérêt
Les deux molécules d’intérêt obtenues au 3ème cycle donnent chacune deux molécules d’ADN d’intérêt au 4ème cycle.4 fragments simple brin des autres molécules pourront donner un produit PCR souhaité au 4ème cycle.
21
• Répétition des 3 étapes : dénaturation-hybridation-élongation (la machine à PCR fait des cycles de température) => Amplification du fragment d'intérêt de façon exponentielle à partir du troisième cycle
• L’enzyme ADN polymérase ne doit pas être dénaturée à 95°C : utilisation de l'ADN polymérase de bactéries thermophiles (par exemple la Taq polymérase provient de Thermophilus aquaticus, microorganisme vivant près des sources d’eaux chaudes (50 à 80°C) ; la Pfu polymérase provient de Pyrococcus furiosus)
• Différentes enzymes peuvent être utilisées selon le degré de fidélité souhaité pour l'amplification du fragment (la Pfu est beaucoup plus fidèle mais plus lente pour l'amplification par exemple)
2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
22
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR(fragment d'ADN
capable de réplication autonome)
3) Présentation d’un vecteur
Le clonage repose sur l'insertion d'un fragment d'ADN exogène dans un vecteur, ce qui permet ensuite d'exprimer l'ADN dans des cellules
23
3) Présentation d’un vecteur de clonage
• Grande diversité des vecteurs : (détaillée en B)
• Cosmides
• Bactériophages
• Chromosomes artificiels de levure (YAC) et de bactérie (BAC)
• Plasmides : très souvent utilisés, réplication dans les bactéries (exemple choisi)
• Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une origine naturelle (plasmides, bactériophages) mais ont été largement modifiés
24
3) Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur
• Capacité de réplication autonome dans une cellule hôte donnée
• Possession d’un site de clonage multiple pour l'insertion du fragment d'ADN (correspond à différents sites uniques de restriction = des sites où le vecteur peut être ouvert, voir 4))
• Insertion d'un fragment d'ADN plus ou moins grand bien supportée
• Présence fréquente d’un marqueur de sélection (gène de résistance à un antibiotique, marqueur de sélection métabolique)
25
3) Présentation d’un vecteur : Exemple du plasmide
a) VecteurSite de clonage multiple : nombreux sites de restriction (voir 4)) uniques permettant l'insertion de l'ADN après le promoteur
Origine de réplication dans la bactérie
Marqueur de sélection : résistance contre l'antibiotique kanamycine
Plasmide : petite molécule extrachromosomique, d'ADN double brin circulaire, de 3 à 10 kilobases. Capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien et pouvant être transféré d'une cellule à une autre.
Promoteur (pour pouvoir exprimer la protéine d'intérêt il faut cloner la séquence d'ADN en phase avec le promoteur (cf. cadre de lecture de la traduction)
26
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR(fragment d'ADN
capable de réplication autonome)
Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur
4) Insertion de l’ADN dans le vecteur :
27
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Définition des enzymes de restriction
• Une enzyme de restriction est une protéine capable de couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. C'est une endonucléase (coupure à l'intérieur du brin d'ADN au niveau des
liaisons phosphoesters). • Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement
connues, dont un grand nombre se retrouve naturellement chez la bactérie. En effet, les enzymes de restriction peuvent couper (et ainsi conduire à la destruction) de l'ADN étranger (notamment des virus). Cela limite les infections virales chez les bactéries, d'où le terme de restriction. L'ADN bactérien lui-même est protégé de la coupure par des modifications du type méthylation.
2828
GAATTC
CTTAAG
Exemple : site de restriction de l'enzyme EcoRI (provenant de la bactérie Escherichia coli)
5'
5'
3'
3'
5'
5'
G AATTC
CTTAA G 5'
3'5'
3'
Coupure par EcoRI
Rq : Certains sites de restriction sont des séquences palindromiques
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Exemple d’une enzyme de restriction
Formation d'extrémités dites cohésives, ou bouts collants
Rq : Certaines enzymes donnent des bouts francs après coupure.Exemple : SmaI :
CCC GGG GGG CCC
29
Vecteur (plasmide)
Vecteur digéré
+Petit fragment d’ADN dégagé
lors de l’ouverture du plasmide
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Principe
Site de restriction Enzyme1
Site de restriction Enzyme 2
Digestion par les enzymes 1 et 2Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2.
Digestion 1 heure dans le tampon adapté à
l'enzyme (cf. quantité de sels...) à la température
optimale de l'enzyme
Si l’on digère le fragment d’ADN par les
deux mêmes enzymes 1 et 2, donnant des
bouts collants, on obtient des extrémités
cohésives complémentaires avec celles du
vecteur. Ceci permet l’insertion du fragment
d’ADN dans le vecteur.
TTAAAATT
TTAA
AATT
VecteurFragment à cloner
30
5'
ADN d'intérêt
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Digestion du fragment d’ADN
Le fragment d’ADN d’intérêt ne contient pas forcément les bons sites de restriction. Comment peut-on les ajouter aux extrêmités de l’ADN à cloner ? Cela se fait par PCR avec des amorces spéciales :
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' C G C
G T C 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'
5'
Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 1
Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 2
31
G T C G G A A T C C A T G C G
C A G C C T T A G G T A C G C ADN d'intérêt
5'
5'3'
3'
Voici l'ADN obtenu après PCR, avec les sites de restriction à ses extrémités. Il pourra être utilisé pour le clonage.
Séquence du site de restriction de l'enzyme 1
Séquence du site de restriction de l'enzyme 2
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Digestion du fragment d’ADN
32
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :
Digestion du vecteur
Vecteur (plasmide)
Vecteur digéré
+Petit fragment d’ADN dégagé
lors de l’ouverture du plasmide
Site de restriction Enzyme1
Site de restriction Enzyme 2
Digestion par les enzymes 1 et 2Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2.
Le fragment d’ADN doit être cloné
dans le vecteur digéré. Le petit
fragment dégagé peut se réinsérer
dans le vecteur digéré à la place du
fragment d’ADN à cloner. Il est donc
nécessaire de séparer les deux
produits de la digestion du vecteur et
de purifier le vecteur digéré pour la
suite du clonage.
33
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du
vecteur : Purification du vecteur digéré
• L’électrophorèse est une méthode de séparation des particules chargées électriquement par migration différentielle sous l’action d’un champ électrique. Elle s’applique aux : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques, nucléotides
• La migration dépend de la charge et de la géométrie des particules
• L’électrophorèse peut se faire en veine liquide ou sur un support homogène, poreux et relativement inerte (papier, gels…)
34
Solution d'électrolytequi recouvre le gel(assure la conduction électrique)
Gel d'agarose
Les fragments de restriction sont visualisés sur gel d'agarose par électrophorèse :ci-contre le dispositif utilisé
Dépôt des échantillons dans les puits du gel
+
Générateur électrique
-
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification
du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose
cham
p él
ectri
que
Principe : migration des fragments d'ADN dans un champ électrique, séparation en fontion de leur taille
35
Fragments de restriction : vecteur digéré et bout dégagé par la restriction
Dépôt dans le puits du gel
-
+
Particule de gel
Migration des fragments d'ADN entre les particules de gel selon le gradient électrique(les acides nucléiques sont globalement négatifs, déplacement vers le pôle +)
Les fragments d'ADN migrent de façon inversement proportionnelle à leur taille : les plus gros fragments migrent peu tandis que les petits fragments migrent beaucoup
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification
du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose
Principe de l’électrophorèse :
36
Révélation du gel par incubation avec un intercalant d'ADN (fluorescent)
1
1 : bande du vecteur digéré2 : petit fragment extrait du vecteur lors de la digestion
2
Il est possible de récupérer la bande 1 : on découpe la bande sur le gel, on extrait l'ADN de l'agarose et on le purifie sur une colonne (fixation de l'ADN sur la colonne, lavage, puis élution de l'ADN purifié) => on récupère ainsi l'ADN du vecteur digéré, utilisé pour le clonage.Cette purification sur gel permet aussi d’éliminer en partie les traces de vecteur non digéré. Si le fragment d’ADN dégagé à éliminer est très petit, une purification sur colonne peut être suffisante.
Marqueur de poids moléculaire : fragments de taille connue (obtenus par exemple après digestion enzymatique de l'ADN du bactériophage Lambda) => cela permet de déterminer la taille des bandes d'intérêt par comparaison au marqueur
4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification
du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose
37
5'
3' 5'
3'
Fragment d‘ADN à cloner
5'
3' 5'
3'
=> Création d'extrémités collantes complémentaires. Insertion du fragment d’ADN dans le vecteur ouvert purifié, hybridation au niveau des extrêmités complémentaires. Il reste à lier ces deux morceaux d’ADN de façon covalente.
4) Insertion de l’ADN dans le vecteurb) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur
Vecteur (plasmide)
Vecteur digéré
+Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide
Site de restriction Enzyme1
Site de restriction Enzyme 2
Digestion du vecteur et du fragment d’ADN à cloner par les enzymes 1 et 2
38
• La ligase est une enzyme capable de former des liaisons covalentes (formation de liaisons
phosphoester) entre deux molécules d'ADN (au niveau d'une zone d'hybridation des molécules d'ADN)
Fragment d'ADN d’intérêt inséré dans
le vecteur
5' P
3' 0H
P 5'
OH 3'
-P-0--0-P-
Ligase
Liaison phosphoester
Après ligation, on obtient un plasmide recombiné
4) Insertion de l’ADN dans le vecteurb) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur
• Intérêt d'utiliser deux enzymes différentes lors de la digestion :
• insertion orientée de l’ADN à cloner dans le vecteur
• limitation de la religation du vecteur sur lui-même
39
I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR(fragment d'ADN
capable de réplication autonome)
Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu
40
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Transformation des bactéries
1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace
(les bactéries compétentes ont été traitées pour faciliter l'entrée d'ADN : leur paroi a été fragilisée par un traitement au chlorure de calcium)(utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissance rapide)
2) Choc thermique à 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les bactéries
4) Étalement sur boîte (pour la sélection)
3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, croissance 1h à 37°C(cela permet l'expression des protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure)
41
Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées
Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l'antibiotique
Colonie de bactéries transformées
Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné)
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Sélection des bactéries transformées
42
• Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C
=> Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide)
• Il faut ensuite récupérer le plasmide
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Extraction du plasmide recombiné
43
• Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique.
• L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification d’ADN.
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Extraction du plasmide recombiné
44
I) Obtention de l’ADN recombinantORGANISME DONNEUR :
Extraction d'un fragment d'ADN
d'intérêt
VECTEUR(fragment d'ADN
capable de réplication autonome)
Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant amplifié
6 ) Vérification de la construction
Les bactéries poussant sur le
milieu+antibiotique
possèdent un plasmide avec
le gène de résistance à
l’antibiotique. Mais ce
plasmide contient-il l’insert
cloné ? Il peut y avoir
religation du vecteur sur lui-
même. Nécessité d’un crible
pour trouver les clones
positifs ayant intégré l’ADN à
cloner.
45
6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations
PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose
1 2
46
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations
PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose :Résultats du gel d’agarose :
(1) (2)
Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2), mais un produit visible pour le plasmide recombiné (1)
6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR
47
Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur :
(ex : MscI)
12
6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction
48
(1) (2)1) Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis
2) Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose
On obtient des cartes de restriction différentes :une seule coupure et donc une seule bande pour le vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes pour le plasmide recombiné (1)
6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction
49
ADN de séquence connue
ADN de séquence
inconnue, à séquencer
6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaîne synthétisée
Pnucléotide
Et de nucléotides didésoxyribose.
5’-P-polynucléotide
Choix d'une amorce
Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase
La synthèse du brin complémentaire est faite en présence de nucléotides désoxyribose,
Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaîne synthétisée)
P nucléotide
5’-P-polynucléotide
50
• Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré :
A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A
amorce
ADN à séquencer
5'
3'
ddTT-A-ddTT-A-T-C-G-ddTT-A-T-C-G-T-A-A-ddTT-A-T-C-G-T-A-A-T-ddTT-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT
5'
5'
5'
5'
5'
5'
Brins formés en présence de didésoxy-thymine (ddT) dans le milieu réactionnel
6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
51
• Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou fluorescence.
• Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif (détection d'une différence d'un nucléotide)
1
2
3
45
6ddT 1T-A-ddT 2 T-A-T-C-G-ddT 3 T-A-T-C-G-T-A-A-ddT 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6
5'
5'
5'
5'
5'
5'
6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
52
T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T
A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A
ddT ddA ddG ddC
ADN à séquencer :
Lecture du brin complémentaire :
Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire (en partant des plus petits fragments vers les plus gros)
12
34
3'
5'
6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
53
ADN à séquencer :
Lecture du brin complémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A
3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T
Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN.
On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (ici barre verte : confiance maximum)
6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du
séquençage
54
II) Utilisation de l’ADN recombinant
Obtention d'un ADN Recombinant amplifié
Utilisation de l’ADN recombinant, notamment
pour comprendre le fonctionnement des gènes
Quelques exemples :
- Production et purification de la protéine étudiée en grandes quantités (pour des
analyses structurales, recherche de protéines associées, de modifications post-
traductionnelles…)
- Etude de l’expression des gènes, quantitative et qualitative ; temporellement et
spatialement
- Etude de la fonction des gènes (fabrication de protéines mutantes…)
1) Production de protéines recombinantes
1) Production de protéines recombinantesa) Protocole : contraintes et solutions
55
• Expression des protéines dans des bactéries E. coli dépourvues de protéases (préservation de la protéine produite)
• Les cellules sont cultivées en grandes quantités (dans des fermenteurs pour la production de protéines à l'échelle industrielle)
• Problème : avec un fort taux de croissance et une synthèse très importante des protéines recombinantes, les cellules meurent rapidement, ce qui limite alors l'expression des protéines recombinantes
• Pour résoudre ce problème : découplage entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d'intérêt) et une phase d'expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine)
56
• Une cellule hôte procaryote présente certaines contraintes :
• nécessité d'un promoteur procaryote pour que la bactérie
puisse transcrire le gène d'intérêt (il faut donc travailler avec
un vecteur adéquat)
• la bactérie ne fait pas d'épissage. Ce problème est évité
par une construction à partir d'un ADNc (comme il est obtenu à
partir d'un ARNm mature, il est dépourvu d'introns)
• Cependant, culture facile et croissance rapide des bactéries
(contrairement aux cellules eucaryotes comme levures et ovules)
1) Production de protéines recombinantes a) Protocole : contraintes et solutions
57
1) Culture des bactéries dans du milieu nutritif + antibiotique nécessaire à la sélection => à 37°C, jusqu'à une densité optique de 0,6 environ (cela correspond à la phase exponentielle, les bactéries sont en pleine croissance)
0) Transformation de bactéries compétentes par le plasmide d'intérêt, culture à partir des colonies obtenues
2) Induction de l'expression des protéines par activation de la trancription du gène de la protéine
3) Récupération des protéines
1) Production de protéines recombinantes a) Protocole
58
La transcription du gène codant pour la protéine d’intérêt est contrôlée à l’aide de promoteurs inductibles :
• Promoteurs thermosensibles (changement de l’expression suivant la température)
• Promoteur de l’opéron lactose
1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
59
Présentation de l’opéron lactose :
P LacI T CAP P O LacZ TLacY LacA
P : promoteurT : terminateurO : opérateurCAP : site de fixation de CAP (récepteur de l'AMPcyclique), activateur de la transcription
Répresseur de l'opéron lactose : en se fixant sur l’opérateur, il bloque la transcription de LacZ, LacY et LacA
Bétagalactosidase(clivage du lactose en glucose + galactose)
Perméase (pompage du lactose dans la cellule)
Transacétylase
1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
Gène régulateur Gènes de structureSites de contrôle
4) Lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Transcription basale
P LacI T CAP P O Gènes de structure
3) Lactose, peu de glucose dans le milieu : => Transcription active
LacI
P LacI T CAP P O Gènes de structure
Analogue de lactose
CAP Polymérase
Fonctionnement de l'opéron lactose dans la bactérie :
1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
1) Absence de lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Absence de transcription
P LacI T CAP P O Gènes de structure
LacI
2) Absence de lactose, peu de glucose dans le milieu : => Absence de transcription
P LacI T CAP P O Gènes de structure
LacICAP
60
61
Pour les clonages,remplacement du gène LacZ par la séquence du gène de la protéine d'intérêt.Utilisation d'IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), un analogue de lactose : l'IPTG se lie avec le répresseur, l'empêchant alors de se fixer sur l'opérateur. Cela permet l'activation de la transcription
P LacI T CAP P O Gène de la protéine d'intérêt T
Modification de l'opéron lactose pour les clonages :
1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
LacI
LacI IPTG
Transcription active
Les protéines sont dans le cytoplasme des bactéries, qui ont aussi une paroi.Il est donc nécessaire de lyser les bactéries pour récupérer les protéines.
Etape de sonication (destruction mécanique par des ultrasons) et ajout d’un détergent (lyse chimique)
62
1) Production de protéines recombinantes c) Extraction des protéines
Prélèvement d’un échantillonde l’extrait bactérien, supposé
contenir nos protéines
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
dénaturant
Le gel de polyacrylamide est une matrice inerte formant beaucoup de liaisons croisées à travers lesquelles migrent les protéines. Il joue le rôle d'un tamis moléculaire. La taille des pores peut être ajustée suivant la taille des protéines que l'on souhaite visualiser.
63
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
Prélèvement d’un échantillonde l’extrait bactérien, supposé
contenir nos protéines
Dénaturation des protéines par mélange
avec du tampon de charge, et chauffage
5min à 95°C
Le tampon de charge (Laemmli) contient notamment : - du glycérol qui augmente la densité de l’échantillon et facilite son dépôt dans les puits du gel
- un colorant, qui facilite le suivi de la migration des échantillons sur gelET SURTOUT :
- des agents réducteurs : destruction des ponts disulfures des protéines,
- un détergent anionique SDS (sodium dodécylsulfate) : fixation sur les régions hydrophobes de la protéine, cela provoque alors son dépliement => la protéine est soluble dans la solution de détergent
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant
64
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
La charge intrinsèque de la protéine est masquée par les charges négatives du SDS. Les protéines vont donc migrer vers le pôle positif lors de l'application d'une tension. Les grandes protéines, quoi que plus chargées négativement migrent moins loin car elles sont davantage retenues par le maillage du gel. Les protéines sont alors fractionnées selon leur masse moléculaire.
Rq : Cette méthode est très puissante : elle permet d'analyser des protéines insolubles dans l'eau, protéines membranaires, protéines de gros agrégats... Elle apporte des informations sur la composition des sous-unités d'un complexe protéique.
Prélèvement d’un échantillonde l’extrait bactérien, supposé contenir
nos protéines
Dénaturation des protéines
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant
65
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
+
Générateur électrique
Solution d'électrolyte
Solution d'électrolyte
Gel d’acrylamide dénaturant
Dépôt des échantillons dans les puits du gel
-
Migration des
protéines selon leur
taille
Plus lourd
Plus léger
Electrophorèse en conditions dénaturantes (destruction des structures tertiaires et quaternaires), migration des protéines inversement proportionnelle à leur masse
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
• Toutes les protéines fortement exprimées peuvent être détectées par leur coloration dans le gel (au bleu de Coomassie ou avec du nitrate d'argent pour des protéines moins concentrées). C’est une détection globale de toutes les protéines fortement exprimées.
• Des protéines en plus faibles quantités peuvent être détectées par Western Blot après transfert sur membrane (ex : membrane de nitrocellulose). Cette détection est spécifique.
67
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines :
Coloration ou transfert sur membrane
Les protéines se déplacent selon le champ électrique, elles passent du gel à la membrane. Le transfert se déroule pendant une à 2 heures. Le même principe est utilisé pour le transfert des acides nucléiques (qui peuvent aussi être transférés en une nuit par capillarité, en absence de champ électrique)
Gel Membrane
-
+Générateur électrique
68
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines :
Transfert sur membrane
Principe du transfert sur membrane :
Papiers buvard imbibés de tampon
Papiers buvard imbibés de tampon
Détection des protéines sur la membrane par WESTERN BLOT : reconnaissance spécifique de la protéine qui nous intéresse à l'aide d'un anticorps dirigé contre cette protéine.
1) Saturation des sites non spécifiques par incubation avec du lait (les protéines du lait vont se fixer sur la membrane, ce qui limite la liaison des anticorps sur des sites non spécifiques)
Membrane
Protéine d'intérêt
69
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines :
Détection des protéines par Western blot
2) Incubation avec l'anticorps primaire spécifique de la protéine :Reconnaissance de la protéine par l'anticorps
Anticorps primaire spécifique de la protéine
3) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés)
Membrane
Protéine d'intérêt
Anticorps primaire spécifique de la protéine
4) Incubation avec l'anticorps secondaire, qui reconnaît l'anticorps primaire. Une enzyme est fixée sur l'anticorps secondaire
Anticorps secondaire spécifique du premier anticorps
Enzyme fixée sur l'anticorps
70
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines :
Détection des protéines par Western blot
5) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés)
Membrane
Protéine d'intérêt
Exemple d'image obtenue sur film photosensible
Signal de notre protéine
La lumière émise peut être détectée sur
un film photosensible, ou par une
caméra
Marqueur de poids
moléculaire (kDa)
40
60
71
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines :
Détection des protéines par Western blot
6) Révélation du Western Blot : le substrat de l'enzyme est ajouté. La réaction enzymatique transforme ce substrat en un produit luminescent
Substrat de l'enzyme
La réaction enzymatique donne un produit luminescent
Les électrophorèses sur gel d'acrylamide sont aussi utilisées pour la séparation des acides nucléiques de petite taille ; pour des fragments plus grands, un gel d’agarose est utilisé. La révélation se fait après transfert sur membrane :
• Pour les ADN : on révèle les ADN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de SOUTHERN BLOT.
Le Southern Blot a été inventé par Edward M. Southern en 1975.
Cette méthode a ensuite été appliquée à d'autres molécules que les
ADN (Western Blot pour les protéines et Northern Blot pour les ARN)
• Pour les ARN : on révèle les ARN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires de la séquence de l'ARN étudié, marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de NORTHERN BLOT.
72
1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques
Remarque : Comment marquer une molécule d’ADN pour obtenir une sonde ?
73
1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques
Fragment d’ADN de restriction purifié5’
5’3’
3’
Dénaturation et hybridation avec un mélange
d’oligonucléotides de 6 nucléotides
5’
3’
3’
5’
PCR avec ADN polymérase en présence de
nucléotides marqués : soit radioativement, soit
chimiquement (détection avec un anticorps
spécifique du groupement chimique)
5’
3’
3’
5’
5’
5’ 5’
Obtention de petits ADN marqués, complémentaires
de différentes zones sur les 2 brins de l’ADN
considéré
74
II) Utilisation de l’ADN recombinant
Les protéines recombinantes sont exprimées en
grandes quantités, mais sont mélangées avec les
protéines bactériennes. Il est donc nécessaire de
purifier la protéine d’intérêt.
2) Purification des protéines
75
Une technique de séparation des protéines est la chromatographie. Elle
nécessite une phase stationnaire et une phase mobile, la séparation se fait en
fonction de l’affinité des protéines pour chacune des phases. Exemple d’une
chromatographie sur colonne :
Phase stationnaire
2) Purification des protéinesa) Chromatographie
1) Solutés(mélange) 2) Passage
continu d’une phase mobile (solvant)
3) Séparation des composants de l’échantillon suivant leur affinité pour la phase mobile et la phase stationnaire
- Chromatographie de partage (en phase inverse) : phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire. Séparation selon le degré de polarité des composés.
- Chromatographie d’échange d’ions : phase stationnaire chargée positivement ou négativement. Séparation suivant la charge des composés.
- Chromatographie d’exclusion : support poreux. Séparation en fonction de la taille : les grosses molécules sortent très vite de la colonne tandis que les plus petites, qui peuvent traverser les pores sont retardées et sortent plus tard.
- Chromatographie d’affinité : séparation selon des propriétés de forme. C’est la technique la plus puissante car elle repose sur des interactions spécifiques.
2) Purification des protéinesa) Chromatographie
+++
-
-
-
-
+
++
Flux de solvant
Molécules chargées négativement retenues sur les billes chargées positivement
Flux de solvant
Petites molécules retardées par la traversée des billes poreuses ; grosses molécules non retardées
76
Cette technique est spécifique de la protéine étudiée. Des anticorps reconnaissant la protéine sont fixés à des billes (phase stationnaire).
billes
anticorps
Dépôt de l’extrait cellulaire sur la colonne (phase d’accrochage sur les anticorps)
77Protéine d’intérêt
Chromatographie d’affinité : - Immunopurification : utilisation de l’interaction Anticorps/Ligand
2) Purification des protéinesb) Chromatographie d’affinité
Après lavages (élimination des molécules interagissant de façon peu spécifique), les protéines d’intérêt peuvent être éluées (par exemple avec un peptide compétiteur).
L’immunopurification permet de purifier une protéine spécifique, mais il faut disposer d’un anticorps suffisamment efficace et spécifique. De plus, on n’a pas toujours de systèmes d’élution efficaces.
78
Etiquette (molécule de fusion, par exemple peptide de fusion)
Protéine d'intérêtProtéine
d'intérêt fusionnée à une étiquette
On utilise aussi d’autres systèmes de chromatographie d’affinité reposant sur des interactions ligand/récepteur du ligand et l’utilisation d’une protéine recombinante fusionnée à une étiquette.
2) Purification des protéinesb) Chromatographie d’affinité
Protéine d'intérêt avec une étiquette
Protéine d'intérêt
Protéines bactériennes
Peptide de fusion
Des groupements (récepteurs du ligand) fixés sur la colonne interagissent avec le peptide de fusion. Toutes les autres protéines, non retenues sur la colonne sont éliminées.
Dépôt de l'extrait cellulaire sur la colonne
Rétention de la protéine d'intérêt
Protéines non retenues sur la colonne
Lavages pour éliminer les
éventuels contaminants 79
2) Purification des protéinesb) Chromatographie d’affinité
Ajout d'un agent permettant l'élution (un compétiteur)
Protéines d'intérêt éluées
Après élution on obtient les protéines d'intérêt fusionnées.Un clivage peut être effectué entre la protéine d'intérêt et le peptide de fusion. Un nouveau passage sur colonne d'affinité permet de retenir les peptides de fusion et de récupérer les protéines purifiées
Clivage spécifique
Rétention de la protéine de fusion sur la colonne
Protéine d'intérêt purifiée
80
2) Purification des protéinesb) Chromatographie d’affinité
Conclusion : Utilisation des protéines recombinantes :- Avec de grandes quantités de protéine purifiée, possibilité d’analyser la structure 3D par diffraction des rayons X ; possibilité d’analyser les modifications post-traductionnelles de la protéine au spectromètre de masse- Possibilité de co-purifier des protéines associées à la protéine étudiée si les lavages ne sont pas trop stringents
La protéine est digérée pour obtenir un ensemble de peptides. Dans le spectromètre de masse, les peptides sont fragmentés, et la masse des fragments obtenus est mesurée. L’ensemble des masses des différents fragments est caractéristique d’une molécule donnée. Cette technique permet d’identifier des molécules, mais aussi de détecter des modifications sur une protéine connue
Billes
Anticorps Protéine d’intérêt
Protéines
associéesSéparation des protéines sur gel ; études par Western blot pour des protéines connues ou par spectromètre de masse pour des molécules inconnues
81
82
II) Utilisation de l’ADN recombinant
Différents types cellulaires sont caractérisés par l’expression de protéines
différentes.
L’expression différente des gènes (codant notamment pour des protéines
homéotiques) dans un embryon joue un rôle clé dans la mise en place du
plan d’organisation de l’organisme.
Suivant les conditions, les besoins en différentes protéines changent
(exemple du stress).
Comment étudier l’expression des gènes, à la fois d’un point de vue
quantitatif et qualitatif, et d’un point de vue spatial et temporel ?
3) Etude de l’expression des gènes
- Par Western blot : pas de quantification absolue. On peut obtenir des données comparatives qualitatives entre différentes conditions. Un gène de ménage est souvent utilisé comme référence.
- Par dosage : méthodes spectroscopiques, immunologiques, enzymatiques
- Indirectement par Northern blot : information sur la quantité d’ARN messager correspondant à la protéine (Rq : une augmentation des ARNm peut provenir d'une augmentation de la
transcription ou d'une augmentation de la stabilité des ARNm). Le Northern blot fournit des informations plus quantitatives qu’un Western blot (moins de problème de saturation du signal)
83
3) Etude de l’expression des gènesa) Quantification des protéines dans un extrait cellulaire
Le niveau d’expression d’un gène peut être quantifié à l’aide de gènes rapporteurs : remplacement de la portion codante du gène considéré par un gène rapporteur :
- gène d'une enzyme (mesure enzymatique)- gène d'une protéine fluorescente (mesure de la fluorescence)
Exemple : Remplacement de la séquence codante du gène étudié par la séquence codante d’une enzyme : la luciférase.
Mesure de l'activité enzymatique in vitro avec ajout du substrat. Ce sont des données relatives, qui doivent être comparées à une référence.
3) Etude de l’expression des gènes :b) Les gènes rapporteurs
luciférine (substrat de l'enzyme)
Séquences
promotrices
Séquence
codante du
gène d’intérêt
Séquence
de la
luciférase
Luciférase
Réaction enzymatique => Emission d'un photon (quantification possible par spectrophotométrie)
84
85
3) Etude de l’expression des gènes :b) Les gènes rapporteurs
On obtient des informations sur le niveau d’expression d’un gène dans une cellule à un moment donné, pour des conditions données (résultats quantitatifs contrairement au Western blot)A
ctiv
ité lu
cifé
rase
1 2 Gène X quatre fois plus exprimé dans la condition 1 que dans la condition 2
Exemple : niveau
d’expression d’un gène X
sous deux conditions
différentes (1et 2)
86
3) Etude de l’expression des gènes :b) Les gènes rapporteurs
Ce genre de construction permet également d’analyser ce qui contrôle l’expression des protéines : Exemple :
Séquence codante du gène X
Séquence codante du gène rapporteur
1 2 A B C DCellules
Séquences promotrices
La séquence régulatrice 1 active l’expression du gène X dans la
cellule A, la séquence 2 active l’expression de X dans la cellule C
87
3) Etude de l’expression des gènes :b) Les gènes rapporteurs
Il est possible d’obtenir des animaux transgéniques exprimant les
séquences promotrices d’un gène étudié fusionné à un gène
rapporteur.
La révélation du produit du gène rapporteur sur des embryons à
différents stades apporte des informations spatiales et
temporelles sur l’expression du gène étudié.
Stade 1 : pas d’expression du gène
Stade 2 : expression postérieure du gène
Exemple :
Comment localiser notre protéine dans des cellules ?Deux possibilités :
1) Regarder la protéine endogène par immunofluorescence
2) Construire une protéine fusionnée à une protéine fluorescente
Dans les 2 cas, l'observation est faite avec un microscope à
fluorescence. On peut regarder la localisation de la protéine d'intérêt
dans des cellules en culture ou des coupes de tissus. Dans tous les
cas, les cellules sont préalablement fixées (elles sont alors
immobilisées et les macromolécules sont stabilisées et bloquées en
l'état). 88
3) Etude de l’expression des gènes :c) Localisation des protéines
Pour localiser des protéines endogènes dans une cellule (ou sur une coupe de tissu), une technique proche du Western blot est utilisée : l'immunofluorescence
Cellulefixée sur lamelle et perméabilisée
noyau
protéine étudiée
Analyse du signal fluorescent par observation au microscope à fluorescence => localisation de la protéine d'intérêt
lavages lavages
Détection de la protéine par un anticorps spécifique (anticorps primaire) après incubation avec de la BSA (bovine serum albumine, pour saturer les sites de liaison non spécifiques)
noyau
Reconnaissance de l'anticorps primaire par un anticorps secondaire fusionné à un fluorophore
89
3) Etude de l’expression des gènes :c) Localisation des protéines : immunofluorescence
On peut fusionner une protéine fluorescente à l'extrêmité C-terminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt. Des plasmides contenant les protéines fluorescentes existent, et contiennent des sites de restriction permettant de cloner la protéine d'intérêt.
Ex : fusion à la GFP (Green Fluorescent Protein). La GFP est une protéine issue d'une méduse Aequorea victoria, capable d'émettre une fluorescence verte après excitation par une lumière bleue.
protéine d'intérêt
GFPExcitation par lumière bleue
Emission de fluorescence verte
Localisation des protéines dans une cellule par observation au microscope à fluorescence
90
3) Etude de l’expression des gènes :c) Localisation des protéines : fusion à une protéine
fluorescente
Les ARN et ADN peuvent être localisés dans une cellule ou une coupe de tissus grâce à l'hybridation in situ (FISH en anglais, pour Fluorescent in situ hybridization) : Utilisation d'une sonde fluorescente d'ADN complémentaire de l'ARN ou ADN étudié et visualisation sur un microscope à fluorescence.
Pour l'ADN chromosomique : les chromosomes sont préalablement exposés à un fort pH ce qui détruit les appariements de bases de l'ADN. La sonde complémentaire de la région étudiée a alors accès à l'ADN.
Pour l'ARN : pas d'exposition à un fort pH pour que l'ADN reste bicaténaire et ne fixe pas la sonde. Fixation douce pour que l'ARN soit conservé dans une forme exposée.
91
3) Etude de l’expression des gènes :d) Localisation des ARN et ADN
Les sondes utilisées sont souvent de l'ADN. Elles sont fluorescentes.Autrefois les sondes étaient marquées radioactivement. On peut également trouvé des sondes avec un marquage chimique, détecté ensuite par des anticorps.
Protocole : les sondes sont dénaturées. Elles sont incubées avec les cellules fixées et perméabilisées en présence d'ARNt et de BSA pour saturer les sites non spécifiques. Des lavages permettent d'éliminer les sondes non fixées, avant l'observation microscopique.
92
3) Etude de l’expression des gènes :d) Localisation des ARN par Hybridation
Fluorescente In Situ (FISH)
Conclusion : Etude de l’expression des gènes :
93
Les analyses se font de plus en plus à une échelle globale.Exemple : les puces à ADN permettent de comparer l’ensemble des ARNm présents dans 2 échantillons différents :
Collection de molécules d’ADN, spécifiques de gènes,
ampifiées par PCR , puis fixées sur une lame de verre
ARNm issus de l’échantillon
1 marqués par un
fluorochrome rouge
ARNm issus de l’échantillon
2 marqués par un
fluorochrome vertHybridation sur la lame, lavages, et
analyse des signaux fluorescents
Les spots rouges correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 1 que dans l’échantillon 2Les spots verts correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 2 que dans l’échantillon 1Les spots jaunes correspondent à des gènes exprimés de la même façon dans les deux échantillons et les spots noirs à des gènes non exprimés dans les deux échantillons
94
II) Utilisation de l’ADN recombinant
4) Etude de la fonction des gènes/protéines
Approche génétique classique : point de départ, des
mutants avec un phénotype intéressant ; puis recherche
des gènes impliqués
Approche génétique inverse : développée grâce à la
technologie de l’ADN recombinant ; il est possible de
cibler une mutation dans une séquence donnée.
Cette version mutante peut être transférée dans une
cellule pour son étude (voir partie B).
4) Etude de la fonction des gènes/protéinesa) Approche génétique classique
95
Mutagenèse aléatoire :par insertion (d’un transposon…), chimique…
Crible pour identifier un phénotype intéressant
Recherche du/des gènes impliqués
- Test de complémentation entre mutants pour savoir si ce sont ou non les mêmes gènes impliqués- Localisation du gène impliqué :
- Séquençage autour de l’insertion après avoir récupéré le fragment correspondant - Test de liaison (position relative par rapport à d’autres gènes connus ou séquences particulières)
- Recherche d’homologies de séquence ; étude de l’expression du gène spatiale et temporelle
Comment est obtenue une version mutée d’un gène ? - Par PCR mutagène (PCR en présence d’un déséquilibre entre les différents nucléotides et d’un tampon différent) => mutations aléatoires dans la séquence - Par mutagenèse dirigée : PCR avec des amorces particulières => insertion d’une mutation à un endroit précis (exemple : modification d’un acide aminé particulier)
Exemple : Séquence à muter :cag cgc gat ttc Q R D F => remplacement de l'aspartate par une alanine : Séquence de l'amorce: cag cgc gCC ttc Q R A F
ADN matrice à muter :le plasmide entier avec la séquence du gène d’intérêt à muter
amorces utilisées pour la PCR
Zone de mésappariement de l'amorce avec la matrice, correspondant à la mutation à introduire
On fait une PCR sur un plasmide entier avec des amorces présentant un mésappariement (mutation à introduire) avec la matrice
4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse
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A la fin de la PCR de la mutagenèse dirigée on se retrouve avec un mélange de plasmides initiaux sans la mutation et de plasmides contenant la mutation
plasmide initial
plasmide avec la
mutation
Le plasmide initial est méthylé car il a été amplifié dans une bactérie (méthylation de séquences d'ADN spécifiques).
Afin de sélectionner les plasmides avec la
mutation, traitement par une enzyme qui coupe
des séquences d’ADN particulières seulement si
elles sont méthylées, puis transformation dans
des bactéries. Seul le plasmide muté, non
digéré, pourra se répliquer dans les bactéries.
4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse
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4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : différents
types de mutants
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- Mutation avec gain de fonction : souvent liée à la surexpression du gène (le gène peut être placé sous le contrôle d’un promoteur puissant, et sur un plasmide multicopies)- Inactivation de gène (knockouts)- Mutation effet dominant négatif :Pour une protéine entrant dans la formation d’un complexe, une mutation peut conduire au dysfonctionnement total de ces protéines, y compris des protéines non mutantes :
4 protéines associées en complexe,protéines actives
4 protéines mutantes associées en complexe, protéines inactives
1 protéine mutante dans le complexe, toutes les protéines sont inactivées
4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : utilisation
des mutants
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- Etude des phénotypes des mutants- Complémentation fonctionnelle :(expériences sur des mutants conditionnels)
Si restauration de la fonction X : complémentation
fonctionnelle (identification d’un gène équivalent à
celui muté chez la levure dans un autre organisme)
Rq : ce test peut aussi mettre en évidence des gènes suppresseurs
Levures thermosensibles mutantes pour un gène X
Banque d’ADNc d’un autre organisme eucaryote, dans un vecteur levure, avec un marqueur de sélection
Transformation des levures, étalement sur milieu sélectif à température permissive (la mutation du gène X ne s’exprime pas)
Incubation à température permissive :toutes les cellules se développent
Incubation à température non permissive (la mutation du gène X s’exprime) : seules les cellules ayant une protéine qui complémente le défaut de X poussent
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II) Utilisation de l’ADN recombinant : Conclusion
Gène ou ADNc
Protéine
Clonage dans un vecteur d’expression
Production et purification de protéine recombinante
A partir de la séquence partielle en acides aminés,
synthèse d’une sonde ADN, hybridation sur banque
d’ADN génomique ou ADNc