8/9/2019 1994 Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) a New Marker to Study Human Colonic Cell Proliferation

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G u t 1 9 9 4 ; 3 5 : 5 3 0 - 5 3 5P r o l i f e r a t i n g c e l l n u c l e a r a n t i g e n ( P C N A ) : a newm a r k e r t o s t u d y human c o l o n i c c e l l p r o l i f e r a t i o nF J G M K u b b e n , A P e e t e r s - H a e s e v o e t s , L G J B E n g e l s , C G M I B a e t e n , B S c h u t t e ,JWA r e n d s , RW S t o c k b r u g g e r , G H B l i j h a m

D i v i s i o n s o f H a e m a t o -O n c o l o g y a n dG a s t r o e n t e r o l o g y ,D e p a r t m e n t o f I n t e r n a lM e d i c i n e ,F J G M K u b b e nA P e e t e r s - H a e s e v o e t sRWS t o c k b r u g g e rD e p a r t m e n t o f G e n e r a lS u r g e r y ,C G M I B a e t e nD e p a r t m e n t o fP a t h o l o g y , A c a d e m i cH o s p i t a l , M a a s t r i c h t ,The N e t h e r l a n d sJWA r e n d sD e p a r t m e n t o fG a s t r o e n t e r o l o g y ,M a a s l a n d H o s p i t a l ,S i t t a r d , The N e t h e r l a n d sL G J B E n g e l sD e p a r t m e n t o f M o l e c u l a rC e l l B i o l o g y , U n i v e r s i t yo f L i m b u r g , M a a s t r i c h t ,The N e t h e r l a n d sB S c h u t t eD i v i s i o n o f H a e m a t o -O n c o l o g y , D e p a r t m e n t o fI n t e r n a l M e d i c i n e ,A c a d e m i c H o s p i t a l ,U t r e c h t , T heN e t h e r l a n d sG H B l i j h a mC o r r e s p o n d e n c e t o :DrFJGMKubben,D e p a r t m e n t o f I n t e r n a lM e d i c i n e , A c a d e m i c H o s p i t a l ,PO B o x 5 8 0 0 , 6 2 0 2 AZM a a s t r i c h t , T h e N e t h e r l a n d sA c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n2 6 J u l y 1 9 9 3

A b s t r a c tI m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f t h e S p h a s e r e l a t e dp r o l i f e r a t i n g c e l l n u c l e a r a n t i g e n (PCNA) w a ss t u d i e d a s a n a l t e r n a t i v e t o e x - v i v o b r o m o -d e o x y u r i d i n e ( B r d U ) i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yf o r a s s e s s m e n t o f human c o l o n i c c e l l p r o l i f e r a -t i o n . From 1 6 s u bj e c t s w i t h o u t c o l o n i c d i s e a s eb i o p s y s p e c i m e n s w e r e c o l l e c t e d f r o m f i v ed i f f e r e n t s i t e s a l o n g t h e c o l o r e c t u m a n d p r o -c e s s e d f o r BrdU a n d PC NA i m m u n o h i s t o -c h e m i s t r y . The mean p r o l i f e r a t i o n i n d e x o fPC NA w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r a t 1 3 3 % o f t h ev a l u e o b t a i n e d w i t h B r d U . T h e r e w a s , h o w -e v e r , a g o o d c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e r e s u l t sf r o m b o t h t e c h n i q u e s ( r = 0 - 6 2 7 5 ; p < 0 0 5 ) .D e c r e a s e i n p r o l i f e r a t i o n i n d e x a l o n g t h ec o l o r e c t u m w a s s e e n w i t h b o t h s t a i n i n gm e t h o d s b u t w a s c l e a r e r w i t h PC NA i m m u n o -h i s t o c h e m i s t r y ( c a e c u m / a s c e n d i n g c o l o n vr e c t u m : 1 2 - 0 v 7 - 2 ; p < 0 0 0 4 ) . The t o t a ln u m b e r o f c r y p t c e l l s a l s o d e c r e a s e d f r o mp r o x i m a l t o d i s t a l ( 1 3 4 t o 1 2 8 ; p

8/9/2019 1994 Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) a New Marker to Study Human Colonic Cell Proliferation

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P r o l i f e r a t i n g c e l l n u c l e a r a n t i g e n ( P C N A ) : a n e w m a r k e r t o s t u d y h u m a n c o l o n i c c e l l p r o l i f e r a t i o no f t h y m i d i n e m o n o p h o s p h a t e b y i n h i b i t i o n o f i t sd e n o v o s y n t h e s i s w i t h 5 - f l u o r o d e o x y u r i d i n e , ' 5 " 1 6a d d i t i o n o f 5 - f l u o r o u r a c i l , w h i c h i s i n t r a c e l l u -l a r i l y c o n v e r t e d t o 5 - f l u o r o d e o x y u r i d i n e ,r e s u l t e d i n s l i g h t l y b e t t e r i m m u n o s t a i n i n g w i t h -o u t d i f f e r e n c e s i n p r o l i f e r a t i o n i n d e x .

C o m p a r i s o n o f i n v i v o l a b e l l i n g w i t h t r i t i a t e dB r d U w i t h 5 a n d 5 0 m g B r d U / k g i n m i c e s h o w e da s e n s i t i v i t y o f 9 4 - 8 a n d 9 8 - 4 % a n d a s p e c i f i c i t y o f9 9 - 6 a n d 9 9 - 4 % r e s p e c t i v e l y . 9 C o m p a r i s o n o f e xa n d i n v i v o l a b e l l i n g w i t h B r d U i n m i c e s h o w e d av e r y g o o d c o r r e l a t i o n b e t w e e n b o t h t e c h n i q u e s .From f i v e h o u r s o f e x v i v o l a b e l l i n g o n w a r d s , t h ep r o l i f e r a t i o n i n d e x d e c r e a s e d i n c o m p a r i s o n w i t ht h e p r o l i f e r a t i o n i n d e x o b t a i n e d b y i n v i v ol a b e l l i n g .T h e r e a f t e r t h e s p e c i m e n s w e r e i m m e r s i o nf i x e d i n e t h a n o l 70% a t 4 C , a n d s t o r e d a t t h es a m e t e m p e r a t u r e . F i x a t i o n a n d p r o c e s s i n g f o ra n t i - B r d U i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a r e p o t e n t i a ls o u r c e s o f v a r i a b i l i t y i n p r o l i f e r a t i o n i n d e x .I t w a s p r e v i o u s l y s h o w n t h a t t i s s u e s f i x e d i nd e n a t u r i n g f i x a t i v e s s u c h a s e t h a n o l o r C a r n o y ' sf l u i d i n v a r i a b l y s h o w e d i m m u n o r e a c t i v i t y , w h i l ec r o s s l i n k i n g a g e n t s , f o r e x a m p l e , f o r m a l i n a n dg l u t a r a l d e h y d e s h o w e d w e a k o r n o r e a c t i o n a ta l l . B y p r e t r e a t m e n t o f t i s s u e s e c t i o n s w i t hp e p s i n , t h e s t a i n i n g i n t e n s i t y o f c r y p t c e l l s w a si n c r e a s e d a f t e r f o r m a l i n f i x a t i o n . T h e e f f e c t o fp e p s i n d i g e s t i o n c a n b e e x p l a i n e d b y a f a c i l i t a -t i o n o f DNA d e n a t u r a t i o n a s a r e s u l t o f d i g e s t i o no f c h r o m a t i n a s s o c i a t e d p r o t e i n s . ' 7 F i n a l l y ,s p e c i m e n s w e r e e m b e d d e d i n p a r a p l a s t a n d c u ta t 2 F t M o n a R e i c h e r t - J u n g m i c r o t o m e ( t y p e2 5 4 0 , v a r i a t i o n a c c o r d i n g t o m a n u f a c t u r e r ' ss p e c i f i c a t i o n s 1 0 % ) .

F i g u r e 1 : T h e r u n n i n ga v e r a g e o f p r o l i f e r a t i o ni n d e x i n n o r m a l l o o k i n gc o l o n i c m u c o s a o f o n es u b j e c t .

IMMUNOHISTOCHEMISTRYA f t e r r e m o v a l o f p a r a f f i n a n d r e h y d r a t i o n , e n d o -g e n o u s p e r o x i d a s e w a s b l o c k e d i n 0 - 3 % h y d r o -g e n p e r o x i d e i n m e t h a n o l f o r 2 0 m i n u t e s . I n t h es l i d e s t o b e p r o c e s s e d f o r a n t i - B r d U i m m u n o -h i s t o c h e m i s t r y , DNA w a s h y d r o l y s e d i n 2 N

0 - PCNA -0- B r d U I

H C l f o r 3 0 m i n u t e s a t 3 7 C a n d s e c t i o n s w e r es u b s e q u e n t l y r i n s e d i n 0 1 M s o d i u m t e t r a b o r a t e( p H 8 - 5 ) . A f t e r i n c u b a t i o n w i t h a m o n o c l o n a la n t i - B r d U a n t i b o d y 9 o r a n I g M a n t i - P C N Aa n t i b o d y ( c l o n e 1 9 A 2 , C o u l t e r E l e c t r o n i c s ,M i j d r e c h t , T h e N e t h e r l a n d s " ) f o r o n e h o u r a t3 7 C , s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h r a b b i t a n t i -m o u s e I g G - H R P ( o n e h o u r , r o o m t e m p e r a t u r e ) .A s p e r o x i d a s e s u b s t r a t e 3 , 3 ' d i a m i n o b e n z i d i n e -t e t r a h y d r o c h l o r i d e ( S i g m a , S t L o u i s , USA) w a su s e d a c c o r d i n g t o G r a h a m a n d K a r n o v s k y . " 8N u c l e i w e r e c o u n t e r s t a i n e d w i t h h a e m a t o x y l i n .P o s i t i v e c o n t r o l s i n c l u d e d i n v i v o l a b e l l e ds p e c i m e n o f m i c e o r r a t a n d e x v i v o l a b e l l e dhuman b i o p s y s p e c i m e n s k n o w n t o b e p o s i t i v e .N e g a t i v e c o n t r o l s i n c l u d e d human a n d r a ts p e c i m e n w i t h a n d w i t h o u t i n c o r p o r a t e d B r d U ,l e a v i n g o u t t h e a n t i - B r d U o r a n t i - P C N A a n t i -b o d y o r t h e c o n j u g a t e d r a b b i t a n t i - m o u s e p o l y -c l o n a l a n t i b o d y . O n l y s l i d e s o f b a t c h e s w i t hc o r r e c t c o n t r o l s w e r e e v a l u a t e d .SCORING AN D METHOD OF C O U N T I N G OF STAINEDSECTIONSO n l y U s h a p e d l o n g i t u d i n a l l y c u t c r y p t s w i t ho p e n l u m i n a a l o n g t h e c r y p t a x i s , w i t h t h e b a s e o ft h e c r y p t t o u c h i n g t h e m u s c u l a r i s m u c o s a e , w e r ee v a l u a t e d . T h e t o t a l n u m b e r o f i m m u n o r e a c t i v en u c l e i / c r y p t w a s c o u n t e d a s w e l l a s t h e t o t a ln u m b e r o f c r y p t n u c l e i . T o a v o i d s e l e c t i o n b i a s ,a l l c r y p t s s h o w i n g a t l e a s t o n e B r d U i m m u n o -r e a c t i v e n u c l e u s w e r e i n c l u d e d a n d c o m p a r e dw i t h t h e a p p r o p r i a t e PCNA i m m u n o r e a c t i v en u c l e i . T h e p r o l i f e r a t i o n i n d e x o f t h a t c r y p t w a sd e f i n e d a s t h e p e r c e n t a g e i m m u n o r e a c t i v e c r y p tc e l l s o f t h e t o t a l n u m b e r o f c r y p t c e l l s . I na d d i t i o n , t h e d i s t r i b u t i o n o f i m m u n o r e a c t i v ec e l l s a l o n g t h e c r y p t l i n i n g w a s s t u d i e d b yd i v i d i n g t h e c r y p t i n t o t h r e e p a r t s ( l o w e r ,m i d d l e , a n d u p p e r ) a n d b y d e t e r m i n i n g i n w h a tp a r t t h e l a b e l l e d c e l l s w e r e l o c a l i s e d p r e d o m i -n a n t l y . S l i d e s w e r e a n a l y s e d b y o n e i n v e s t i g a t o r( F J G M K ) w i t h a b l i n d e d m e t h o d . T h e r e p e a t -a b i l i t y c o e f f i c i e n t ' 9 w a s c a l c u l a t e d a t 1 0 8 %( n = 1 0 ) , w h i c h m e a n s t h a t 9 5 % o f d i f f e r e n c e s i nr e p e a t e d m e a s u r e m e n t s ( i n t r a o b s e r v e r v a r i -a b i l i t y ) a r e e x p e c t e d t o b e l e s s t h a n 1 0 8 % . 2 0 D a t aw e r e a n a l y s e d a s i m m u n o r e a c t i v e n u c l e i / c r y p t ,n o t p e r n u m b e r o f c r y p t c e l l s . B a s e d o n t h e' r u n n i n g a v e r a g e ' 2 ' d a t a i n t h r e e p a t i e n t s , wec o u l d s h o w t h a t s i x w e l l o r i e n t e d a n d w e l l s t a i n e dc r y p t s w e r e s u f f i c i e n t t o o b t a i n a r e l i a b l e p r o -l i f e r a t i o n i n d e x ( F i g 1 ) . T h e r e f o r e t h e a n a l y s i sw a s r e s t r i c t e d t o b i o p s y s p e c i m e n s t h a t f u l f i l l e dt h i s c r i t e r i u m . P a i r e d a n d u n p a i r e d t t e s t s w e r eu s e d t o c o m p a r e B r d U / P C N A s t a i n i n g a n d s t a i n -i n g a t d i f f e r e n t c o l o n i c s i t e s r e s p e c t i v e l y .R e s u l t sB r d U s t a i n i n g w a s s u c c e s s f u l i n o n l y 44% o f w e l lo r i e n t e d c r y p t s c o m p a r e d w i t h 86% w i t h PC NA

1 0 1 5 20N o o f c r y p t s c o u n t e d

( T a b l e I ) . I n s o m e m u c o s a l s e c t i o n s g o o d BrdUs t a i n i n g w a s s e e n i n some p a r t s w h e r e a s i n o t h e rp a r t s c r y p t s w e r e c l e a r l y n e g a t i v e . T h i s s h o w st h a t l a b e l l i n g i n e f f i c i e n c y r a t h e r t h a n i m m u n o -h i s t o c h e m i s t r y p r o b l e m s c o n t r i b u t e d t o t h ec o m p a r a t i v e l y l o w s u c c e s s r a t e . T h i s i s s u b s t a n -t i a t e d b y t h e h i g h s u c c e s s r a t e o f PC NA s t a i n i n g ,

1 2 1

1 0

xa 1 )0CUa 1 )a - -

8

6

4

2

o l0 - 5

5 3 1

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K u b b e n , P e e t e r s - H a e s e v o e t s , E n g e l s , B a e t e n , S c h u u e , A r e n d s , S t o c k b n i g g e r , B l i j h a m

1 6 r- 1 4zo 1 2X 1 0* : 8c0a )!- 4

a . 2

- r d U , l o w e r t h i r (M P C N A , l o w e r t h i rED B r d U , m i d d l e t h iCM P C N A , m i d d l e t h

1 : B r d U , u p p e r t h i r EP C N A , u p p e r t h i r

0

00 0

0

0 0 0

PC NA p r o l i f e r a t i o n i n d e x w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r a t 1 3 3 % o f t h e BrdU p r o l i f e r a t i o n i n d e x .T h i s d i f f e r e n c e s e e m s t o b e s y s t e m a t i c a s t h ec o r r e l a t i o n m a t r i x i s s h o w i n g s i g n i f i c a n t c o r r e l a -t i o n ( r = 0 6 3 ; p < O 0 0 5 ) ( F i g 2 ) . F u r t h e r m o r e , t h ed i s t r i b u t i o n o f BrdU a n d PCNA i m m u n o r e a c -t i v e c e l l s a l o n g t h e c o l o n i c c r y p t w a s s i m i l a r . I nF i g u r e 3 , t h i s d i s t r i b u t i o n o v e r t h e l o w e r ,m i d d l e , a n d u p p e r c o m p a r t m e n t s o f t h e c o l o n i cc r y p t i s d e p i c t e d , s h o w i n g i n b o t h c a s e s t h a t 8 0 %o f t h e s e c e l l s a r e l o c a t e d o n t h e l o w e r t h i r d a n dv i r t u a l l y n o n e i n t h e u p p e r t h i r d . T h i s i si l l u s t r a t e d ( F i g 4 ) i n t w o s e r i a l s e c t i o n s o f t h es a m e c o l o n i c c r y p t .B r d U a n d PCNA i m m u n o r e a c t i v i t y w e r ed e t e r m i n e d i n r e l a t i o n t o t h e s i t e a l o n g t h eh u m a n c o l o r e c t u m ( F i g 5 ) . B o t h p r o l i f e r a t i o ni n d i c e s d e c r e a s e d f r o m p r o x i m a l t o d i s t a l ; t h i sw a s m o s t p r o n o u n c e d f o r t h e PC NA s t a i n i n gi n d e x w i t h a d e c r e a s e o f 40% b e t w e e n t h e r i g h ts i d e d c o l o n a n d t h e r e c t u m . F o r t h e PC NAs t a i n i n g i n d e x , t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n r e c t u ma n d s i g m o i d w e r e n o t s i g n i f i c a n t ; d i f f e r e n c e sw i t h a n d b e t w e e n t h e d e s c e n d i n g , t r a n s v e r s e ,a n d a s c e n d i n g c o l o n w e r e , h o w e v e r , s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( p = 0 0 0 0 4 a n d p =0 0 2 r e s p e c t i v e l y ) .C r y p t h e i g h t d e f i n e d a s t h e n u m b e r o f m u c o s a lc e l l s p r e s e n t i n o n e c o l u m n o f a l o n g i t u d i n a l l yc u t c r y p t , w a s a l s o d e t e r m i n e d a l o n g t h e e n t i r ec o l o r e c t u m ( s e e F i g 5 ) . C r y p t h e i g h t w a s t h el o w e s t i n t h e r e c t u m , b u t t h e d i f f e r e n c e s w e r en o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t c o m p a r e d w i t hd e s c e n d i n g , t r a n s v e r s e , a n d a s c e n d i n g c o l o n( p = 0 0 6 ) . B r d U i m m u n o r e a c t i v i t y ( c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t 0 - 0 0 0 8 , p v a l u e n o t s i g n i f i c a n t ) a n dPC NA i m m u n o r e a c t i v i t y ( c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t0 - 1 6 1 6 , p v a l u e n o t s i g n i f i c a n t ) w e r e n o t s i g n i f i c -a n t l y c o r r e l a t e d w i t h t h e c r y p t h e i g h t .

0 L I D i s c u s s i o n0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 C h a n g e s i n p r o l i f e r a t i v e c h a r a c t e r i s t i c s o fP r o l i f e r a t i o n i n d e x ( B r d U ) c o l o r e c t a l m u c o s a a r e i m p o r t a n t m a r k e r s f o r

a n i n c r e a s e d r i s k o f d e v e l o p i n g n e o p l a s i a . I nd d a d d i t i o n t o t h e p r o b l e m s i n f i x a t i o n , t h e e x v i v or d l a b e l l i n g s t e p w i t h B r d U i s a n i m p o r t a n t s o u r c ei r d o f p r o b l e m s i n t h e i m p l e m e n t a t i o n o f a n t i - B r d Ud i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y f o r a s s e s s m e n t o f p r o -r d l i f e r a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s i n r o u t i n e e n d o s c o p yl a b o r a t o r i e s . M o r e i m p o r t a n t l y , p o o r p e n e t r a -t i o n o f t h e DNA p r e c u r s o r s o r t h e f i n i s h o f DNAs y n t h e s i s i n t h e e x v i v o s i t u a t i o n m a y c a u s e t h el a b e l l i n g t o b e h e t e r o g e n o u s a n d o f l o w e f f i c a c y .F o r i n s t a n c e i n t h i s s t u d y l e s s t h a n 5 0 % o fe v a l u a b l e c r y p t s w a s a d e q u a t e l y l a b e l l e d w i t hBrdU d e s p i t e m e a s u r e s t o f a c i l i t a t e l a b e l l i n g b yp e r f o r m i n g i n c u b a t i o n n e x t t o t h e e n d o s c o p yr o o m , b y u s i n g a r i c h i n c u b a t i o n m e d i u m , a n db y a d d i n g h y d r o g e n p e r o x i d e t o i m p r o v e o x y g e nt e n s i o n . T h i s c l e a r l y i l l u s t r a t e s t h e n e e d f o r t h ed e v e l o p m e n t o f l o g i s t i c a l l y m o r e e a s y a n d t e c h -

n i c a l l y m o r e r e l i a b l e w a y s t o d e t e r m i n e p r o l i f e r a -t i v e c h a r a c t e r i s t i c s . O u r e x p e r i m e n t s w e r ec a r r i e d o u t t o v a l i d a t e t h e u s e o f PCNA i m m u n o -h i s t o c h e m i s t r y a s an a l t e r n a t i v e p r o l i f e r a t i v ea s s a y f o r h u m a n c o l o r e c t a l m u c o s a .I n T a b l e I I I , some e x v i v o c e l l k i n e t i c s t u d i e s, S i S . . .n e n d o s c o p i c a l l y a n d h i s t o l o g i c a l l y n o r m a lD e s c e n d i n g S i g m o i d R e c t u m h u m a n c o l o n i c t i s s u e i n n o r m a l s u b j e c t s a r eo r PCNA s t a i n i n g a l o n g c o l o r e c t a l crypts. s u m m a r i s e d , s h o w i n g a p r o l i f e r a t i o n i n d e x

T A B L E I S u c c e s s r a t e o f B r d U a n d PC NAi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yS t a i n i n gBrdU P C N A

N o o f c r y p t s e x a m i n e d 2 0 3 5 7 6 1No o f p o s i t i v e c r y p t s 9 0 1 ( 4 4 % ) 6 5 1 ( 8 6 % )B r d U = b r o m o d e o x y u r i d i n e .P C N A = p r o l i f e r a t i n g c e l l n u c l e a r a n t i g e n .T A B L E I I C o m p a r i s o n o f B r d U a n d PC NAi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f t h e h u m a n c o l o r e c t a l m u c o s a

Mean p r o f l i f e r a t i o nS t a i n i n g i n d e x S D R a n g eB r d U 6 - 9 2 - 4 2 - 1 - 1 2 - 6P CNA 9 - 2 * 3 - 6 4 - 0 - 1 6 - 1S i x t e e n s p e c i m e n s w i t h a t l e a s t s i x e v a l u a b l e c r y p t s f o r e a c hs t a i n i n g . * p = 0 0 0 0 4 ( p a i r e d t t e s t ) ; a b b r e v i a t i o n s a s i n T a b l e I .w h i c h i s n o t d e p e n d e n t o n a p r e v i o u s e x v i v ol a b e l l i n g s t e p .B r d U a n d PCNA s t a i n i n g w e r e t h e n c o m p a r e do n t h e s i n g l e c r y p t l e v e l . F o r t h i s we s e l e c t e d 1 6s p e c i m e n s f o r w h i c h a t l e a s t s i x c r y p t s w i t h BrdUw e r e a v a i l a b l e , t h e r e b y m a k i n g a d i r e c t c o m p a r i -s o n w i t h PCNA p o s s i b l e ( T a b l e I I ) . T h e m e a n

F i g u r e 2 : C o r r e l a t i o nB r d U / P C N Ai m m u n o h i s t o c h e m i s t r y .

U o0 .

A s c e n d i n g T r a n s v e r s eF i g u r e 3 : P r e d o m i n a n t s i t e o f BrdU c

5 3 2

3

8/9/2019 1994 Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) a New Marker to Study Human Colonic Cell Proliferation

4/6

P r o l i f e r a t i n g c e l l n u c e a r a n t i g e n ( P C N A ) : a n e w m a r k e r t o s t u d y h u m a n c o l o n i c c e l l p r o l i f e r a t i o n , . : . . J4 ' , 5 ; 9# 1.

-.'t ' .

4 b . ..- ' 5 eS.; . : ' b

* 5 W : .494*..-,L