This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

VERSUCHE ZUM RÜCKKOPPELUNGSEFFEKT 777

S e i s h i bestätigen. Audi bei uns kommt es zur 100-proz. Oxydation des Cysteins innerhalb von 12,5 Tagen (Unterschiede sind durch pn'Differenzen bedingt).

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß bei Ausschaltung der Schwermetallkatalyse und des Lich­tes Cystein eine Autoxydation zeigt, deren Halb­wertszeit, bei ph 7,2 —7,5 ~ 6 —7 Tage beträgt. Man kann diesen Vorgang gut als Restoxydation bezeichnen. Dabei bleibt offen, ob dieselbe über­haupt an den Sulfhydrylschwefel gebunden ist.

Unter Bestrahlung mit UV kommt es sowohl zur Bildung von Schwefelradikalen des Cysteins als auch zu solchen des Wassers und deren Folgeprodukte. Der Sauerstoffgehalt der Gasphase ist ebenfalls zu berücksichtigen. In zur Zeit laufenden Versuchen prüfen wir, welche dieser Vorgänge am meisten an der durch Licht ausgelösten Oxydation des Cysteins beteiligt sind.

Eine weitere biologisch interessante Frage ist, inwieweit die lichtbedingte Autoxydation des Cy­steins wellenlängenabhängig ist.

Das für Cystein angeschnittene Problem gilt sicher für alle Cysteinyl-Verbindungen, d. h. sowohl für entsprechende Peptide als auch Proteine. Um so

11 W. G o r d y , Symp. on Inform ation Theory in Biology, P er­gamon Press 1958, S. 241.

12 T. H e n r i k s e n u . A. P i h l , N ature [London] 185, 307 [I960].

mehr als in letzter Zeit mit Hilfe der ESR nachge­wiesen werden konnte, daß die Lokalisierung einer im Peptid oder Protein gesetzten Radikalstelle offen­sichtlich endgültig an vorhandenen Schwefelatomen erfolgt ( G o r d y u , H e n r i k s o n und P i h l 12, K o c h und M a r k a u 5 ) . Dabei nimmt K o f m a n 13 jedoch an, daß bei UV-Bestrahlung von Eialbumin Denaturierung und Oxydation der Sulfhydrylgruppe zwei unab­hängig verlaufende Prozesse sind. Auch an denatu­riertem Eialbumin lassen sich (nach T s e n und T a p -

p e l 14) noch die für Cystein typischen Oxydations­vorgänge verfolgen, was der Auffassung K o f m a n s

entsprechen würde. Es sind also Denaturierungs­prozesse nicht mit Oxydationsvorgängen an der SH- Gruppe des Cysteinanteils gleich zu setzen. Doch ist anzunehmen, daß eine weitgehende Oxydation der Cysteinyl- oder Cystinylgruppen eines Peptides oder Proteins schwerwiegende Folgen für seine Struktur und biologische Funktion hat. Damit sei nur kurz auf die Bedeutung des von uns studierten Phänomens hingewiesen.

Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t , Bad Godesberg und der F r a u n h o f e r - G e s e l l - s c h ä f t e . V., München, durchgeführt.

13 E. B. K o f m a n , Biofizika [Moskau] 2, 215 [1957].14 C. C. T s e n u. A. L. T a p p e l , Can. J. Biochem. Physiol. 38,

539 [I960].

Hemmungsanalytische Versuche zum RückkoppelungsefTektbei Hydrogenomonas

Von H. G. S c h l e g e l und R. v. B a r t h a

Aus dem Institut für Mikrobiologie der Universität Göttingen (Z. Naturforschg. 16 b, 777—780 [1961]; eingegangen am 21. April 1961)

The H2 uptake by washed suspensions of diem olithotrophically grown Knallgasbacteria is three to four times larger with carbon dioxide than without it. E lectrontransport proceeds a t a maximum rate only if endergonic CO, fixation is made possible. Two types of inhibition experiments were carried out: a) without C 0 2 , b) with C 0 2 . In the absence of C 0 2 , 2.4-dinitrophenol accelerated the H2 uptake by only 20%; thiazinpigments such as methylene blue or thionine caused typical uncoupling reactions leading to an increased H2 uptake by a factor of two to three. In the presence of C 0 2 , sulf- hydryl group poisons such as monoiodoacetate or monoiodoacetamide, which inhibit the interm ediary processes of C 0 2 fixation, decrease the rate of H2 uptake to that of the C 0 2 free control. If the CO, fixation, inhibited by monoiodoacetate, is separated from the hydrogen transport chain by the addition of methylene blue then the rate of H , uptake increases again.

Chemolithotroph (in einem mit 70% H2-f20% von Knallgasbakterien (Hydrogenomonas Stamm 16)0 2 + 10% C 02 begasten mit 650 U/min gerührten oxydieren Wasserstoff in Gegenwart von Kohlen­Mineralmedium) herangezogene und in der expo- dioxyd nahezu viermal schneller als bei Abwesenheit nentiellen Wachstumsphase geerntete Suspensionen von C 02 2. Auch durch nicht-wachsende „ruhende“

1 H. G . S c h l e g e l , G . G o t t s c h a l k u . R. v . B a r t h a , Nature 2 H. G . S c h l e g e l u . R. v . B a r t h a , Naturwissenschaften 48, [L o n d o n ]191,463 [1961]. 414 [1961].

778 H. G. SCHLEGEL UND R. VON BARTHA

Zellen wird C 02 fixiert und zur Synthese von Poly- /?-Hydroxybuttersäure (Poly-HBS) verwertet. Die Befunde lassen sich mit der Annahme erklären, daß die über die „Leerlauf-H2-Oxydation“ (ohne C 0 2) hinausgehende H2-Oxydation mit der C 02-Fixierung sehr eng gekoppelt ist und der eine Prozeß nicht ohne den anderen ablaufen kann. Die Erscheinung deutete auf die Funktion eines Rückkoppelungs- systems, an dem das Adenylsäuresystem (ATP-ADP) als Energieüberträger zwischen der Oxydationskette und der energiebedürftigen C 02-Fixierung beteiligt ist.

Zur Prüfung dieser Hypothese wurde zunächst versucht, an die Stelle der C 02-Fixierung einen anderen energieaufwendigen Syntheseprozeß zu setzen. An Stelle von C 0 2 verabreichte Essigsäure oder Bernsteinsäure wurde zwar auch verwertet und zu Poly-HBS umgesetzt, erhöhte die H2-Oxydation aber nur wenig. Dieser Befund läßt sich mit der Tatsache erklären, daß die Synthese der polymeren /5-HBS aus organischen Säuren auch nicht annähernd so viel Energie verbraucht wie die Synthese aus C 02 und H2 .

Um Aufschluß über die Art der Koppelung von Ho-Oxydation und C 02-Fixierung zu gewinnen, wurden zwei Gruppen von Hemmungsversuchen mit Stoffwechselgiften durchgeführt: a) Durch Zusatz von entkoppelnden Giften sollte die Geschwindigkeit der H2-Oxydation auch in Abwesenheit von C 02 auf die Höhe des C 0 2-haltigen Ansatzes gesteigert wer­den; b) durch Zusatz von Giften, die den Elektronen­transport der Atmungskette nur wenig beeinflussen, aber an der C 0 2-Fixierung beteiligte Enzymreaktio­nen spezifisch hemmen, sollte die durch C 02 erhöhte H2-Oxydation relativ stärker betroffen werden als die Leerlauf-H2-Oxydation.

a) D ie W i r k u n g e n t k o p p e l n d e r A g e n z i e n

Zur Erfassung der entkoppelnden Wirkung von ausgewählten Giften (2.4-DNP, Arsenat, Azid, Me­thylenblau, Thionin. 2.6-Dichlorphenolindophenol, Methylviologen) wurde die Gasaufnahme der in0.066-m. Phosphatpuffer pn 7,0 aufgeschwemmten Zellen in Standard - W a r b u r g - Gefäßen untera) C 0 2 enthaltendem Knallgas (70% H2 + 15% 0 2 + 15% C 0 2) und b) C 02-freiem Knallgas (70% H2 + 15% 0 2 + 15% N2) gemessen. Nach 1-stdg. Lauf­

3 H. G. S c h l e g e l u . R. L a f f e r t y , Arch. Mikrobiol. 38, 52[ 1 9 6 1 ] .

zeit wurden die genannten Hemmstoffe aus dem Seitenarm zugekippt; der Verlauf der Gasaufnahme wurde weitere 4 Stdn. lang verfolgt. In einigen An­sätzen wurde gleichzeitig mit dem Hemmstoff NaH14C 03 zugesetzt; die Menge des fixierten Koh­lendioxyds wurde zu Versuchsende nach der Mem- branfiltermethode3 durch Radioaktivitäts-Messung bestimmt.

Die am stärksten entkoppelnde W irkung ging von den beiden Thiazinfarbstoffen Methylenblau (MB1) und Thionin aus. MB1 entkoppelte die Phosphory­lierung von der Oxydation im Rattenleber-Mito- chondrien-System4 und überbrückte als abiologi- scher Sauerstoff-Überträger die durch KCN ge­hemmte Oxydation bei Hydro genomonas5. 2 • 10~3-7n. MB1 beeinflußt die Geschwindigkeit der durch C 0 2 erhöhten H2-Oxydation nur wenig (Abb. 1, Kurven A u. B) ; erst bei mehrstündiger Laufzeit wird eine

Stdn.— *►

Abb. 1. Entkoppelung der Knallgasreaktion durch M ethylen­blau. Chemolithotroph gewachsene Zellen von H ydrogeno­monas Stamm 16 wurden in der exponentiellen Wachstums­phase geerntet, gewaschen und in 0,066-m. Phosphatpuffer PH 7.0 aufgeschwemmt. Gaswechselmessung in Standard- W a r b u r g - Gefäßen mit 2,5 ml dieser Suspension und Zu­sätzen ad 3,00 m l; 30 °C ; 0,2 ml 20-proz. KOH im Zentralgefäß (bei C und D) ; 2 -103-m. M ethylenblau (bei B und C) ; Gas­atm osphäre: 70% H , + 10% 0.> + 12% C 0 2 (bei A und B),

70% H2 + 18% 0 2 + 12% N2 (bei C und D).

leichte Hemmwirkung bemerkbar. Die Geschwindig­keit der Leerlauf-H2-Oxydation (Kurve D) wird durch dieselbe MBl-Konzentration stark erhöht (Kurve C) und erreicht beinahe diejenige des C 02-

4 A. L . L e h n i n g e r , J. biol. Chemistry 178, 625 [1949].5 H. G. S c h l e g e l , Arch. Mikrobiol. 18, 362 [1953].

VERSUCHE ZUM RÜCKKOPPELUNGSEFFEKT 779

haltigen Ansatzes; allmählich geht die Förderung jedoch ebenfalls zurück. Daß Methylenblau und Thionin die C 0 2-Fixierung unterbinden, geht aus Abb. 2 hervor. Die beiden Farbstoffe entfalten eine ausgesprochen entkoppelnde W irkung: sie erhöhen die Geschwindigkeit der Gasaufnahme in Abwesen­heit von C 02 auf einen Wert, der dem des C 0 2-haI-

2.0

1.0 \

Abb. 2. Entkoppelung der Knallgasreaktion von der C 02- Fixierung durch M ethylenblau und Thionin. Bedingungen wie Abb. 1; jedoch einheitliche Gasatmosphäre (85% H2 + 15% 0 2) und keine K O H ; 30 min nach Versuchsbeginn wurden fol­gende Zusätze aus dem Seitenarm herübergeholt: A: lO ^M ole N aH 14C 0 3 , B: 10/tM ole NaH14C 0 3 + 4/^M ole Thionin, C: lO wMole NaH14C 0 3 + 4 ^M ole M ethylenblau, D lief als C 0 2- freie Kontrolle ohne Zusatz. 60 und 120 min nach H erüber­holen der Zusätze wurde der Reaktionsablauf mit 0,5 ml 1-n. H2S 0 4 unterbrochen. Die Menge des fixierten Kohlendioxyds

ist in Säulenform wiedergegeben («M ole C 0 2) .

tigen Ansatzes nahekommt; sie unterbinden die nor­malerweise mit der H2-Oxydation gekoppelte C 02- Fixierung. In den Tab. 1 und 2 sind Daten über die Abhängigkeit der genannten Effekte von der MB1- Konzentration wiedergegeben.

Im Vergleich zu den durch Methylenblau und Thionin bewirkten Entkoppelungseffekten erscheinen die durch die übrigen Gifte erzielten Effekte wenig signifikant. 2.4-Dinitrophenol steigerte die Ge­schwindigkeit der Leerlauf-H2-Oxydation nur wenig (10-3-m. DNP um 20%, 10~4-m. um 10%), hemmte aber die durch C 0 2 erhöhte H2-Oxydation. Auf eine geringe Entkoppelungswirkung deutet die Tatsache, daß die C 02-Fixierung etwas stärker gehemmt wird

Gasauf-

MB1 narh “ e * (Mole/1)

G asauf­nahm e * *

F ö rd e­rung * * *

[% ]

- c o 2: +co2 - c o 2 +co2 —CO, 1 + C O j

3 • 10-3 206 259 10-3 176

3 • IO“4 123 - 10-4 95

kein 88 245

118 17188 - 35

70 157

75,1 105,7 56,0 - 14.6 - 4,4 - 0 100

Tab. 1. Erhöhung der Gasaufnahme durch Methylenblau- Zusatz im Verhältnis zu der durch Zusatz von 10% C 0 2 be­wirkten Erhöhung der Gasaufnahme. * Manometrische Meßwerte während der 1. Versuchsstunde nach MBl-Zu- satz. ** Gasaufnahme abzüglich der Leerlauf-Gasaufnahme ( —C 0 2; — MB1). *** Gibt das Verhältnis von der durch MB1 zu der durch C 02 bewirkten Erhöhung der Gasaufnahme an. Bedingungen wie Abb. 1; das im Seitenarm befindliche MB1 wurde 30 min nach Beginn der Ablesungen in den

Hauptraum herübergeholt.

MB1(Mole/1)

C 0 2-E inbau in ;j.Molen CO.,/3 ml

nach

Hem m ung des CO.,-Einbaus *

nach

30 min 60 min 90 min 30 min 60 m in 90 min

3 • 10-3 0.016 0.024 0,024 98.2 98.5 98,9io - 3 0,025 0,027 0,042 97,2 98,3 98,1

3 • IO“4 0,421 0,769 1,234 51,5 50,5 42.810-4 0.783 1,249 1.844 9.7 19,6 14,5

kein 0.867 1,552 2,155 0 0 0

Tab. 2. Hemmung der CO.,-Fixierung durch M ethylenblau. * In Prozenten der ungehemmten Kontrolle. Die in 0,066-m. Phosphatpuffer pn 7,0 aufgeschwemmten Zellen wurden zu je 2C'0-ml - E r l e n m e y e r - Kolben verteilt, begast (85% Hs + 15% 0 2) und mit MB1 und 100 ttMolen NaH14C 0 3 versetzt. Die Kolben wurden bei 30 °C im W asserbad geschüttelt. Proben von je 3 ml wurden nach 30, 60 und 90 min ent­

nommen und nach der Membranfiltermethode analysiert.

als die H2-Oxydation. Die an Knallgasbakterien er­hobenen Befunde stehen im Einklang mit den un­längst an Azotobacter vinelandii und zellfreien P rä­paraten gemachten Erfahrungen 6> 7. Die Möglichkeit einer teilweisen Reduktion von DNP 8 zu dem weni­ger wirksamen 2.4-Diaminophenol 9 haben wir aus­geschlossen. 3 • 10~3 und 3 ‘10_2-m. Arsenat hatten auf die Leerlauf-H2-Oxydation keine Wirkung. Azid (10 4, 10-3 , 10~2-m.) hemmte die C 02-Fixierung nur wenig mehr als die H2-Oxydation. 2.6-Dichlor- phenolindophenol, Melhylviologen und Amytal hat­ten ebenfalls keine entkoppelnde Wirkung.

6 H . G. H o v e n k a m p , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam]34, 485 [1959].

8 H. D. P e c k , J. biol. Chemistry 235, 2734 [I960],

A. T e m p e r l i u . P . W . W i l s o n , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 320, 195 [I960].A. F. B r o d i e , J. biol. Chemistry 234, 398 [1959].

780 VERSUCHE ZUM RÜCKKOPPELUNGSEFFEKT

b) D ie W i r k u n g v o n S H - G r u p p e n - G i f t e n

Der Medianismus der C 0 2-Fixierung durch Knall­gasbakterien scheint dem der grünen Pflanzen ähn­lich zu sein 10, n . Da an der Regeneration des C 02- Acceptors Ribulose-1.5-diphosphat auch Triosephos- phat-Dehydrogenase beteiligt ist und dieses Enzym gegenüber Monojodessigsäure (MJ) sehr empfind­lich i s t12,13, sollte sich die C 02-Fixierung durch ge­eignete Konzentrationen von MJ spezifisch hemmen lassen. Die Experimente (Abb. 3) bestätigten diese Annahme. Die Leerlauf-H2-Oxydation (Kurve C) wird durch 10_3-m. MJ nicht beeinträchtigt (Kurve D ). Dieselbe Konzentration setzt jedoch die

Stdn. — *~

Abb. 3. Hemmung der mit der C 0 2-Fixierung gekoppelten Knallgasreaktion durch M onojodacetat und teilweise E nt­hemmung durch M ethylenblau. Bedingungen wie Abb. 1; jedoch Gasatmosphäre 75% H.,+ 15% 0 2 + 10% C 0 2 (bei A und B) ; 75-% H2 + 15% 0 2 + 10% N2 (bei C und D ). Bei B, D und E wurden nach 1-stdg. Laufzeit 3 /tMole Monojodacetat, bei E nach einer weiteren Stunde 6 /<Mole Methylenblau in

den Hauptraum herübergeholt.

10 F. H. B e r g m a n n , J. C. T o w n e u . R. H. B u r r i s , J. biol. Chemistry 230, 13 [1958].

11 B. A. M c F a d d e n , J. Bacteriol. 77, 339 [1959].12 H . H o l z e r , Angew. Chem. 66, 65 [1954].

Geschwindigkeit der durch C 0 2 erhöhten ^ -O x y ­dation (Kurve A) auf die Rate der Leerlauf-H2- Oxydation herab (Kurve B) ; die Hemmung der C 02-Fixierung, gemessen am Einbau radioaktiven Bicarbonats, beträgt 99,5 Prozent. Daß die beob­achteten Erscheinungen nicht auf einer teilweisen Hydrogenasehemmung beruhen, zeigt Kurve E: Die durch 10_3-m. MJ gehemmte Gasaufnahme (B) ließ sich durch Zusatz von 2 -10_3-m. MB1 enthemmen.

Die Wirkung von Monojodacetamid war der von MJ ähnlich. p-Chloromercuribenzoesäure (pCMBS) scheint Hydrogenase und die an Intermediärprozes­sen der C 0 2-Fixierung beteiligten Enzyme in etwa gleichem Maße zu hemmen; die durch pCMBS be­wirkte Hemmung ließ sich durch Entkoppeln mit MB1 nicht rückgängig machen. Natriumfluorid (10_2-m. und 10~3-ra.) erwies sich als wirkungslos.

Die Hemmungsanalysen unterstützen die Vorstel­lung, daß die die Leerlauf-H2-Oxydation überstei­gende in Gegenwart von C 0 2 ablaufende Knallgas­reaktion mit der C 0 2-Fixierung eng gekoppelt ist. Bemerkenswert erscheint auch der Befund, daß der vielfach zum Nachweis von Dehydrogenasen ver­wendete autoxydable Redoxfarbstoff M ethylenblau14, der auch die durch KCN gehemmte Atmung wieder­herstellt 15, als Entkoppler wirkt. Da Methylenblau die mit der H2-Oxydation normalerweise verknüpfte C 02-Fixierung völlig unterbindet, scheint es nicht nur im Nebenschluß der Atmungskette zwischen Flavinenzymen und Sauerstoff zu wirken, sondern zusätzlich die gesamte oxydative Phosphorylierung zu entkoppeln. Untersuchungen über die gegenüber Mitochondrien-Systemen verschiedene Giftempfind­lichkeit sowie über den Regulationsmechanismus werden fortgesetzt.

Mit Unterstützung durch die D e u t s c h e F o r ­s c h u n g s g e m e i n s c h a f t ausgeführt.

13 0 . K a n d l e r , J. L ie s e n k ö t t e r u . B. A. O a k s , Z. Naturforschg.16b, 50 [1961].

14 T . T h u n b e r g , Skand. Arch. Physiol. 35, 163 [1917].15 A. S z e n t -G y ö r g y i, Biochem. Z. 150, 195 [1924].