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1993, 59(9):2830.Appl. Environ. Microbiol.C J Lobb, S H Ghaffari, J R Hayman and D T ThompsonEdwardsiella ictaluri strains.Plasmid and serological differences between

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A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , S e p t . 1 9 9 3 , p . 2 8 3 0 - 2 8 3 60 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 3 / 0 9 2 8 3 0 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 3 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

P l a s m i d a n d S e r o l o g i c a l D i f f e r e n c e s b e t w e e nE d w a r d s i e l l a i c t a l u r i S t r a i n sCRAIG J . LOBB,* SEYED H . GHAFFARI, J . RUSSELL HAYMAN,

AND D E X T E R T . THOMPSOND e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f M i s s i s s i p p i M e d i c a l C e n t e r ,J a c k s o n , M i s s i s s i p p i 3 9 2 1 6 - 4 5 0 5

R e c e i v e d 2 5 J a n u a r y 1 9 9 3 / A c c e p t e d 1 1 J u n e 1 9 9 3S e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t i s o l a t e s o f E d w a r d s i e l l a i c t a l u r i o b t a i n e d f r o m i n f e c t e d c h a n n e l c a t f i s h i n t h e

s o u t h e a s t e r n U n i t e d S t a t e s h a r b o r two c r y p t i c p l a s m i d s , d e s i g n a t e d pCL1 ( 5 . 7 k b ) a n d pCL2 ( 4 . 9 k b ) . T h e s ei s o l a t e s appear t o b e s e r o l o g i c a l l y h o m o g e n e o u s . To e x t e n d t h e s e s t u d i e s , we f o c u s e d o ur a n a l y s e s o n twoi s o l a t e s o f n o n i c t a l u r i d o r i g i n . P l a s m i d a n a l y s e s o f a d a n i o i s o l a t e s h o w e d t h a t i t h a r b o r e d p l a s m i d s w h i c h weres i m i l a r i f n o t i d e n t i c a l t o pCL1 and p C L 2 . T h i s s t r a i n was a l s o s e r o l o g i c a l l y i n d i s t i n g u i s h a b l e from t h o s ei s o l a t e d f r o m c h a n n e l c a t f i s h . I n c o n t r a s t , a green k n i f e f i s h ( G N F ) i s o l a t e h a r b o r e d f o u r p l a s m i d s w i t h r e l a t i v em o b i l i t i e s o f 6 . 0 , 5 . 7 , 4 . 1 , a n d 3 . 1 k b . S o u t h e r n b l o t a n a l y s e s i n d i c a t e d t h a t o n l y t h e 5 . 7 - and 4 . 1 - k b p l a s m i d ss t r o n g l y h y b r i d i z e d u n d e r h i g h - s t r i n g e n c y c o n d i t i o n s t o p r o b e s s p e c i f i c f o r pCL1 and p C L 2 , r e s p e c t i v e l y . TheGNF i s o l a t e s h o w e d m i n i m a l r e a c t i v i t y when r e a c t e d w i t h p o l y c l o n a l a n t i s e r u m p r e p a r e d a g a i n s t a c h a n n e lc a t f i s h i s o l a t e . H o w e v e r , p o l y c l o n a l a n t i s e r u m t o t h e GNF i s o l a t e s t r o n g l y r e a c t e d w i t h t h e GNF i s o l a t e i n b o t hs u r f a c e f l u o r e s c e n c e a n d a g g l u t i n a t i o n r e a c t i o n s . S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s e s o f c e l l l y s a t e s s h o w e d t h a t t h e p r o t e i n b a n d i n g p a t t e r n s o f t h e s t r a i n s c o m p a r e d were s i m i l a r . H o w e v e r ,W e s t e r n b l o t s o f p r o t e i n a s e K - d i g e s t e d c e l l e x t r a c t s s h o w e d t h a t 0a n t i g e n o f t h e GNF i s o l a t e was a n t i g e n i c a l l yd i s t i n c t f r o m t h e 0 n t i g e n o f t h e o t h e r i s o l a t e s . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h a t t h e r e are d i f f e r e n t s e r o t y p e s o f E .i c t a l u r i a n d s u g g e s t t h a t p l a s m i d a n d s e r o l o g i c a l a n a l y s e s o f f u t u r e i s o l a t e s o f E . i c t a l u r i ca n b e u s e d t o d e t e r m i n ew h e t h e r s t r u c t u r a l l y d i s t i n c t s t r a i n s are e m e r g i n g i n m a j o r c h a n n e l c a t f i s h a q u a c u l t u r e areas.

E d w a r d s i e l l a i c t a l u r i was f i r s t i d e n t i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e di n 1 9 8 1 ( 4 ) a n d ca n b e r e a d i l y d i s t i n g u i s h e d f r o m t h e morecommon member o f t h e genus, E. t a r d a, by b i o c h e m i c a la n a l y s e s ( 1 5 ) . E . i ct a l u n i s t h e b a c t e r i a l p a t h o g e n r e s p o n s i -b l e f o r e n t e r i c s e p t i c e m i a o f c a t f i s h ( E S C ) ( 3 ) . E SC h a s b e e nv i e w e d as an a c u t e s e p t i c e m i a t h a t ca n progress r a p i d l y i na p p a r e n t l y h e a l t h y , f a s t - g r o w i n g c a t f i s h a n d ca n r e s u l t i ne x t e n s i v e m o r t a l i t y . E SC h a s become a s i g n i f i c a n t p r o b l e mi n t h e a q u a c u l t u r e o f c h a n n e l c a t f i s h i n t h e s o u t h e a s t e r nU n i t e d S t a t e s .The i nc id en ce o f d is ea se - a ss o ci at e d m o r t a l i t y occursw it h i n t he o p t i m u m t e m p e r a t u r e range f o r i n v i t r o g r o w t h o ft he b ac te ri a ( 2 2 t o 2 8 C ) . When t h e b a c t e r i u m i s i s o l a t e df r o m k i d n e y , b r a i n , b l o o d , e t c . , i t g e n e r a l l y r e q u i r e s 4 8 h a t3 0 C t o f o r m t y p i c a l c o l o n i e s a p p r o x i m a t e l y 2 mm i n d i a m -e t e r . T h i s r e l a t i v e l y s l o w r a t e o f g r o w t h i n i t i a t e d o ur e a r l i e rs t u d i e s t o d e t e r m i n e th e p l a s m i d p r o f i l e o f d i f f e r e n t i s o l a t e so f E . i c t a l u r i o b t a i n e d f r o m i n f e c t e d c h a n n e l c a t f i s h r a i s e d i nt h e s o u t h e a s t e r n U n i t e d S t a t e s ( 7 ) . The a n a l y s e s s h o w e dt h a t t w o p l a s m i d s , d e s i g n a t e d pCL1 ( 5 . 7 k b ) a n d pCL2 ( 4 . 9k b ) , were b o t h p r e s e n t i n e a c h o f t h e E . i c t a l u r i s t r a i n se x a m i n e d . The t w o p l a s m i d s were i s o l a t e d a n d mapped w i t hv a r i o u s r e s t r i c t i o n enzymes. T h e s e a n a l y s es i n di ca te d t h a tt h e r e s t r i c t i o n maps o f t h e t w o p l a s m i d s were d i s t i n c t ; t h i sa p p a r e n t l a c k o f h o m o l o g y was f u r t h e r s u p p o r t e d by t h ei n a b i l i t y t o v i s u a l i z e p o s s i b l e c o i n t e g r a t e s t r u c t u r e s whenp l a s m i d p o o l s were a n a l y z e d by agarose e l e c t r o p h o r e s i s .T h e s e a n a l y s e s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t p l a s m i d a n a l y s i s s h o u l db e an e f f e c t i v e m e t h o d f o r r a p i d l y i d e n t i f y i n g i s o l a t e s o f E .i c t a l u n f r o m c h a n n e l c a t f i s h c u l t u r e d i n t h e s o u t h e as t e r n

U n i t e d S t a t e s . S i n c e t h i s r e p o r t o t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v ec o n f i r m e d t h e s e r e s u l t s ( 8 , 1 0 ) .S t r a i n s o f E . i c t a l u r i i s o l a t e d f r o m i n f e c t e d c a t f i s h h a v eb e e n shown t o b e h o m o g e n e o u s when a n a l y z e d i n a b a t t e r yo f b i o c h e m i c a l t e s t s ( 1 4 ) . I n a d d i t i o n , s e r o l o g i c a l a n a l y s e su s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t d i f f e r e n ti s o l a t e s o f E . i c t a l u r i appear t o b e s e r o l o g i c a l l y h o m o g e -neous ( 9 ) . T h i s g e n e r a l c o n c l u s i o n h a s l e d t o s t u d i e s d i r e c t e dt o w a r d v a c c i n a t i o n a p p r o a c h e s t o c o n t r o l E SC i n c u l t u r e dc h a n n e l c a t f i s h . H o w e v e r , t h e r e h a v e now b e e n s e v e r a lr e p o r t s o f E . i c t a l u r i i n f e c t i n g o t h e r f i s h b e s i d e s c h a n n e lc a t f i s h . We f o c u s e d o ur a n a l y s e s on t w o o f t h e s e i s o l a t e s .The f i r s t i s o l a t e was f r o m an i n f e c t e d d a n i o ( D a n i o d e v a r i o )w h i c h was c u l t u r e d i n t h e s o u t h e a s t e r n U n i t e d S t a t e s ( 1 4 ) .The s e c o n d i s o l a t e was f r o m an i n f e c t e d S o u t h A m e r i c a ngreen k n i f e f i s h (GNF) ( E i g e m a n n i a v i r e s c e n s ) t h a t wasm a i n t a i n e d i n l a b o r a t o r i e s i n La J o l l a , C a l i f . ( 4 a ) . T h i s s t r a i nwas r e c o v e r e d i n pure c u l t u r e f r o m t h e k i d n e y s o f f i s h d y i n gf r o m an a c u t e g r a m - n e g a t i v e b a c t e r e m i a . E a r l i e r s t u d i e s h a di n d i c a t e d t h a t t h e p l a s m i d p r o f i l e o f t h e GNF i s o l a t e wasa p p a r e n t l y d i s t i n c t , b e a r i n g p l a s m i d s o f d i f f e r e n t r e l a t i v em o b i l i t i e s . The p l a s m i d p r o f i l e o f t h e d a n i o i s o l a t e , h o w e v e r ,was s i m i l a r t o t h e p r o f i l e s o f i s o l a t e s r e c o v e r e d f r o m i n f e c t e dc h a n n e l c a t f i s h ( 8 , 1 1 ) . T h i s a p p a r e n t d i f f e r e n c e i n p l a s m i dp r o f i l e s s u g g e s t e d t h a t a d d i t i o n a l s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e s b e -tween E . i c t a l u n s t r a i n s m i g h t e x i s t . T h e s e s t u d i e s h a v e l e dt o t h i s r e p o r t , w h i c h r e a f f i r m s t h e v a l u e o f p l a s m i d a n a l y s i si n c h a r a c t e r i z i n g E . i c t a l u r i i s o l a t e s a n d , e q u a ll y i m po r ta n t,e s t a b l i s h e s t h a t t h e r e are d i f f e r e n t s e r o t y p e s o f E . i c t a l u r i .

M A T E R I A L S AND METHODSB a c t e r i a l s t r a i n s a n d c u l t u r e c o n d i t i o n s . T h e i s o l a t e s o f E .i c t a l u r i r e c o v e r e d f r o m i n f e c t e d c h a n n e l c a t f i s h ( I c t a l u r u sC o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

2 8 3 0

V o l . 5 9 , N o . 9

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PLASMID AND SE R O L O G I C A L D IFFE R E NCES IN E . ICTALURI 2 8 3 1p u nc ta tu s ) w e r e i d e n t i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d e a r l i e r ( 7 ) . T h es t r a i n s a r e d e s i g n a t e d S 8 5 - 1 3 7 7 , S 8 5 - 1 3 8 1 , AL 8 4 - 1 4 2 , a n dAL 8 4 - 1 8 7 . T h e t y p e s t r a i n ATCC 3 3 2 0 2 , o r i g i n a l l y i s o l a t e di n G e o r g i a f r o m a n i n f e c t e d c h a n n e l c a t f i s h , was o b t a i n e df r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l ec ti o n , R o c k v i l l e , Md.T h e d a n i o a n d GNF i s o l a t e s o f E . i c t a l u r i w e r e o b t a i n e df r o m J a m e s B e r t o l i n i a n d w e r e d e s i g n a t e d 1 0 . 1 5 a n d 1 0 . 1 6 ,r e s p e c t i v e l y , i n a n e a r l i e r s t u d y ( 1 ) . B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r -i s t i c s o f t h e d a n i o a n d GNF s t r a i n s w e r e r e p o r t e d ( 1 ) , a n ds e p a r a t e a n a l y s e s c o n f i r m e d t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s es t r a i n s a s E . i c t a l u r i . C h a r a c t e r i s t i c n e g a t i v e b i o c h e m i c a lr e a c t i o n s i n c l u d e d i n d o l e , m o t i l i t y a t 3 7 C , H2S p r o d u c t i o no n t r i p l e s u g a r i r o n m e d i u m , m a l o n a t e u t i l i z a t i o n , Simmonsc i t r a t e , V o g e s - P r o s k a u e r , u r e a s e , l a c t o s e , a d o n i t o l , d u l c i t o l ,s o r b i t o l , a r a b i n o s e , a n d a r g i n i n e d i h y d r o l a s e . P r i o r t o a n a l -y s i s , t h e c e l l s w e r e r e c o v e r e d f r o m f r o z e n s to c k s m a i n t a i n e da t - 7 0 C a n d c u l t u r e d a t 3 0 C i n b r a i n h e a r t i n f u s i o n medium( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) .P la s m id a n d h y b r i d i z a t i o n a n a l y s e s . T h e m e t h o d s u s e d t oo b t a i n p l a s m i d p o o l s f r o m t h e E . i c t a l u r i i s o l a t e s u s e d i n t h i sr e p o r t , a s w e l l a s t h e a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s c o n d i t i o n su s e d , w e r e i d e n t i c a l t o t h o s e r e p o r t e d e a r l i e r ( 7 ) . F o r h y b r i d -i z a t i o n a n a l y s e s , pCL1 a n d pCL2 w e r e f i r s t r e s o l v e d b ya g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , a n d t h e s u p e r c o i l e d p l a s m i d sw e r e s e p a r a t e l y r e c o v e r e d f r o m i n d i v i d u a l g e l s l i c e s b ye l e c t r o e l u t i o n . To e n s u r e p u r i t y , t h e p l a s m i d s w e r e s u b -j e c t e d t o a s ec o n d r o u n d o f p u r i f i c a t i o n , i n w h i c h t h es u p e r c o i l e d p l a s m i d s w e r e l i n e a r i z e d w i t h E c o R I , s e p a r a t e db y e l e c t r o p h o r e s i s , a n d s u b s e q u e n t l y e l e c t r o e l u t e d f r o ma g a r o s e g e l s . T h e p u r i f i e d p l a s m i d s w e r e r a d i o l a b e l e d t o as p e c i f i c a c t i v i t y o f a b o u t 1 x 1 0 9 c p m / , u g b y u s i n g a r a n d o mh e x a m e r c o m m e r c i a l k i t ( A m e r s h a m , A r l i n g t o n H e i g h t s ,I l l . ) . T h e m e t h o d s u s e d f o r S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s a n d t h eh i g h - s t r i n g e n c y h y b r i d i z a t i o n c o n d i t i o n s u s e d f o l l o w e d p r o -c e d u r e s d e s c r i b e d i n d e t a i l e l s e w h e r e ( 2 ) .A n t i g e n i c a n a l y s e s a n d i m m u n o a s s a y s . M u r i n e p o l y c l o n a la n t i s e r a w e r e p r e p a r e d t o i s o l a t e S 8 5 - 1 3 7 7 a s w e l l a s t o t h eGNF i s o l a t e o f E . i c t a l u r i b y t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e .B a c t e r i a w e r e i n o c u l a t e d f r o m f r o z e n s t o c k s i n t o 5 m l o fb r a i n h e a r t i n f u s i o n medium a n d g r o w n f o r 1 5 h a t a b o u t3 0 C . T h e p e l l e t e d c e l l s were w a s h e d t h r e e t i m e s i n s t e r i l e0 . 1 3 5 M N a C l a t 4 C , a n d t h e c e l l p e l l e t w as r e s u s p e n d e d i n1 0 m l o f t h e s a l i n e s o l u t i o n . S i x BALB/c m i c e , o b t a i n e d f r o ma c o l o n y m a i n t a i n e d a t t h e D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y o ft h e U n i v e r s i t y o f M i s s i s s i p p i M e d i c a l C e n t e r , were e a c hi n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h a t o t a l o f 0 . 2 m l o f t h e c e l ls u s p e n s i o n . T h e m i c e were b o o s t e d t h r e e t i m e s w i t h f r e s h l yc u l t u r e d c e l l s p r e p a r e d i n t h e same manner a t w e e k l yi n t e r v a l s . C o n c o m i t a n t w i t h t h e l a s t i n j e c t i o n t h e a n i m a l sw e r e i n j e c t e d w i t h 0 . 5 m l o f p r i s t a n e ( 2 , 6 , 1 0 , 1 4 - t e t r a e t h y l -p e n t a d e c a n e ; S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) , a n da s c i t i c f l u i d was i n d u c e d w i t h t h e S P 2 / 0 m u r i n e m y e l o m a l i n ea s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 5 ) . A s c i t i c f l u i d w as c l a r i f i e d b yc e n t r i f u g a t i o n , a n d t h e s u p e r n a t a n t w as f r o z e n a t - 2 0 Cu n t i l u s e d .T h e a g g l u t i n a t i o n t i t e r o f e a c h p o l y c l o n a l a n t i s e r u m w asd e t e r m i n e d i n 9 6 - w e l l m i c r o t i t e r p l a t e s ( F l o w L a b o r a t o r i e s ,M c L e a n , V a . ) b y u s i n g f r e s h l y c u l t u r e d b a c t e r i a . B r i e f l y ,1 5 - h c u l t u r e s o f E . i c t a l u r i i s o l a t e s were w a s h e d t h r e e t i m e si n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) a n d s t a n d a r d i z e d t o ano p t i c a l d e n s i t y a t 5 5 0 nm b e t w e e n 0 . 9 5 a n d 1 . 0 . T h e p o l y -c l o n a l a n t i s e r u m w as s e r i a l l y d i l u t e d t w o f o l d i n t h e m i c r o t i -t e r p l a t e s , a n d a n e q u a l amount o f t h e w a s h e d b a c t e r i a w asa d d e d . The p l a t e s were a g i t a t e d a n d k e p t a t 4 C o v e r n i g h t .A g g l u t i n a t i o n t i t e r s were e x p r e s s e d a s t h e r e c i p r o c a l o f t h e

l a s t l o g 2 d i l u t i o n o f a n t i s e r u m w h i c h y i e l d e d p o s i t i v e a g g l u -t i n a t i o n .I n d i r e c t f l u o r e s c e n t - a n t i b o d y a n a l y s i s o f E . i c t a l u n i i s o -l a t e s u s e d b o t h t h e a n t i - S 8 5 - 1 3 7 7 a n t i s e r u m a n d t h e a n t i -GNF i s o l a t e a n t i s e r u m . B r i e f l y , f r e s h c u l t u r e s o f b a c t e r i awere p r e p a r e d a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d 1 0 0 - , u l a l i q u o t s o fw a s h e d c e l l s were r e a c t e d w i t h a n e q u a l amount o f a n t i -serum t h a t h a d b e e n d i l u t e d 1 0 - f o l d i n P B S . A f t e r a 2 0 - m i ni n c u b a t i o n a t 4 C th e c e l l s were w a s h e d a n d r e a c t e d f o r a na d d i t i o n a l 2 0 m i n w i t h f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( F I T C ) -c o n j u g a t e d r a b b i t a n t i - m o u s e i m m u n o g l o b u l i n G ( I g G ) ( A c -c u r a t e C h e m i c a l , W e s t b u r y , N . Y . ) . The c e l l s were w a s h e da n d e x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l y , a n d t h e r e l a t i v e f l u o r e s c e n ti n t e n s i t y o f t h e c e l l s w as d e t e r m i n e d q u a l i t a t i v e l y a s c o n -t r a s t e d w i t h b a c t e r i a t h a t h a d n o t b e e n r e a c t e d w i t h t h ep r i m a r y a n t i s e r a .S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e -s i s ( S D S - P A G E ) w as d o n e b y s t a n d a r d p r o c e d u r e s a s r e -p o r t e d i n d e t a i l e l s e w h e r e ( 6 ) . C e l l l y s a t e s o f th e E . i c t a l u n is t r a i n s were p r e p a r e d f r o m f r e s h c u l t u r e s a s d e s c r i b e da b o v e . T w o m i l l i l i t e r s o f b a c t e r i a , s t a n d a r d i z e d t o an o p t i c a ld e n s i t y a t 6 0 0 nm o f 0 . 3 , w as p e l l e t e d i n a m i c r o c e n t r i f u g et u b e a n d w a s h e d i n T r i s - b u f f e r e d s a l i n e , a n d 2 0 0 , u l o fSDS-PAGE s a m p l e b u f f e r w as a d d e d . T h e c e l l s were h e a t e da t 1 0 0 C f o r 2 m i n , a n d a n y i n s o l u b l e m a t t e r w as r e m o v e dw i t h a s t e r i l e t o o t h p i c k . S a m p l e s o f c e l l l y s a t e s were a n a -l y z e d d i r e c t l y b y SDS-PAGE o r , a l t e r n a t i v e l y , i n c u b a t e d f o r1 h a t 6 0 C w i t h 5 0 , u g o f p r o t e i n a s e K ( S i g m a ) p r i o r t oSDS-PAGE a n a l y s i s . W e s t e r n b l o t t i n g ( i m m u n o b l o t t i n g ) o fr e p l i c a t e l y s a t e s w as p e r f o r m e d b y s t a n d a r d m e t h o d s ( 1 3 )u s i n g 1 : 1 0 0 d i l u t i o n s o f p r i m a r y p o l y c l o n a l a n t i s e r u m a n dd e v e l o p e d w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e - c o n j u g a t e d g o a t a n t i -m ou s e I g G ( P r o m e g a , M a d i s o n , W i s . ) .

RESULTSP l a s m i d p r o f i l e o f d i f f e r e n t E . i c t a l u r i i s o l a t e s . P l a s m i dDNA w as p r e p a r e d f r o m th e GNF a n d d a n i o i s o l a t e s o f E .i c t a l u n i a n d c o m p a r e d w i t h p l a s m i d DNA p r e p a r e d f r o m

r e p r e s e n t a t i v e i s o l a t e s o f E . i c t a l u r i r e c o v e r e d f r o m i n f e c t e dc h a n n e l c a t f i s h ( F i g . l a , l a n e s A t h r o u g h G ) . Each o f t h ec h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e s h a d p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o h a r b o rb o t h p C L 1 ( 5 . 7 k b ) a n d p C L 2 ( 4 . 9 k b ) ( 7 ) . The p l a s m i dp r o f i l e o f th e d a n i o i s o l a t e w as i d e n t i c a l t o t h e p l a s m i dp r o f i l e o f t h e c h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e s ; t w o p l a s m i d s , s i m i l a ri n s i z e t o p C L l a n d p C L 2 , were o b s e r v e d . T h e p l a s m i dp r o f i l e o f t h e GNF i s o l a t e , h o w e v e r , w as d i s t i n c t . T h e GNFi s o l a t e c o n t a i n e d f o u r p l a s m i d s ; t h e r e l a t i v e m o b i l i t i e s o ft h e s e p l a s m i d s were 6 . 0 , 5 . 7 , 4 . 1 , a n d 3 . 1 k b , a s j u d g e d b yi n t e r p o l a t i o n f r o m t h e r e f e r e n c e p l a s m i d l a d d e r . O n l y t h eGNF 5 . 7 - k b p l a s m i d h a d a m o b i l i t y s i m i l a r t o t h a t o f o ne o ft h e known p l a s m i d s ( p C L 1 ) .To d e t e r m i n e t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e p l a s m i d s i n t h e GNFa n d d a n i o i s o l a t e s t o p C L 1 a n d p C L 2 , as w e l l a s t o r e s o l v eq u e s t i o n s r e g a r d i n g t h e p o t e n t i a l s i m i l a r i t y o f p C L 1 a n dp C L 2 , p C L 1 a n d p C L 2 were s e p a r a t e l y p u r i f i e d f r o m a g a r -o s e g e l s a n d r a d i o l a b e l e d t o t h e sa me s p e c i f i c a c t i v i t y . T h er a d i o l a b e l e d p C L 1 a n d p C L 2 p r o b e s were t h e n h y b r i d i z e ds e p a r a t e l y t o r e p l i c a t e S o u t h e r n b l o t s c o n t a i n i n g t h e p l a s m i dDNA f r o m t h e E . i c t a l u r i i s o l a t e s . I n a d d i t i o n , p l a s m i d p o o l so f p C L 1 a n d p C L 2 d e r i v e d f r o m s t r a i n S 8 5 - 1 3 7 7 werer e s t r i c t e d w i t h e n z y m e s p r e d i c t e d f r o m t h e p r e v i o u s l y d e -r i v e d r e s t r i c t i o n maps t o y i e l d f r a g m e n t s f o r s p e c i f i c r e g i o n so f b o t h p l a s m i d s . H y b r i d i z a t i o n a n a l y s e s s h o w e d t h a t p C L 1o r p C L 2 d i d n o t c r o s s - h y b r i d i z e w i t h o ne a n o t h e r , no r d i dt h e p r o b e s c r o s s - h y b r i d i z e w i t h th e b a c t e r i a l c h r o m o s o m e

V O L . 5 9 , 1 9 9 3

7/28/2019 2830.fullictaluri

4/8

2 8 3 2 L O B B E T AL .

bABCD E FGH I J;$~~~~~itf0.0_ j E E . t ~ ~ ~ ~ ~ . i t O , 0 C A BC D Ei * ~

X h o I05p C L 1. a "

- 4 . 0 { l"

a g o

e

4.0 1D u_

pCL2 _, N&S1.5 M. E Ec o R I

30'

F I G . 1 . P l a s m i d p r o f i l e a n d S o u t h e r n b l o t a na ly s es o f d i f f e r e n t s t r a i n s o f E . i c t a l u r i h y b ri d i z ed w i t h p r o b e s s p e c i f i c f o r pCL1 a n d p C L 2 .( a ) Lane M l , p l a s m i d l a d d e r ( t h e s i z e s o f t h e r e f e r e n c e p l a s m i d s [ i n k i l o b a s e p a i r s ] are i n d i c a t e d on t h e l e f t ) ; l a n e s A t o G , p l a s m i d s d e t e c t e di n E . i c t a l u r i ATCC 3 3 2 0 2 , S 8 5 - 1 3 8 1 , S 8 5 - 1 3 7 7 , A L8 4 - 1 4 2 , a n d A L 8 4 - 1 8 7 , d a n i o i s o l a t e 1 0 . 1 5 , a n d GNF i s o l a t e 1 0 . 1 6 , r e s p e c t i v e l y ; l a n e s Ht o J , p l a s m i d s o f ATCC 3 3 2 0 2 r e s t r i c t e d w i t h Eco R V p l u s BamHI ( l a n e H ) , B g l I ( l a n e I ) , a n d EcoRI ( l a n e J ) , r e s p e c t i v e l y ; l a n e M2, P s t I d i g e s to f l a m b d a DNA ( t h e s i z e s o f t h e s t a n d a r d l i n e a r f r a g m e n t s [ i n k i l o b a s e p a i r s ] are i n d i c a t e d on t h e r i g h t ) . The g e l was s t a i n e d w i t h e t h i d i u mb r o m i d e . ( b ) R e p l i c a t e S o u t h e r n b l o t o f t h e g e l d e p i c t e d i n p a n e l a h y br i di z ed w i th p C L 2 . ( c ) R e p l i c a t e S o u t h e r n b l o t o f t h e g e l d e p i c t e d i np a n e l a h y b r i d i z e d w i t h p C L 1 . Th e l a n e s i n p a n e l s b a n d c c o n t a i n e d t h e same p r e p a r a t i o n s as t h e c o r r e s p o n d i n g l a n e s i n p a n e l a . S o u t h e r nb l o t h y b r i d i z a t i o n was p e r f o r m e d u n d e r h i g h - s t r i n g e n c y c o n d i t i o n s ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . ( d a n d e ) R e s t r i c t i o n maps o f pCL1 a n dp C L 2 , r e s p e c t i v e l y , as d e t e r m i n e d p r e v i o u s l y b y L obb a n d R h o a d e s ( 7 ) .

( F i g . l b a n d c ) . The s u p e r c o i l e d a n d l i n e a r i z e d p l a s m i d s , asw e l l as t h e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s d e r i v e d f r o m e i t h e r pCLla n d p C L 2 , h y b r i d i z e d o n l y w i t h p r o b e s d e r i v e d f r o m t h er e s p e c t i v e p l a s m i d .I n a d d i t i o n , pCLl a n d pCL2 p r o b e s h y b r i d i z e d t o t h e 5 . 7 -a n d 4 . 9 - k b p l a s m i d s , r e s p e c t i v e l y , o f t h e d a n i o i s o l a t e .B e c a u s e t h e s e d a n i o p l a s m i d s h a v e t h e same r e l a t i v e m o b i l -i t y as pCL1 a n d pCL2 a n d h y b r i d i z e d w i t h p r o b e s s p e c i f i cf o r pCL1 a n d p C L 2 , r e s p e c t i v e l y , u n d e r s t r i n g e n t h y b r i d i z a -t i o n c o n d i t i o n s , i t seems h i g h l y p r o b a b l y t h a t t h e s e p l a s m i d sare very s i m i l a r t o pCL1 a n d p C L 2 . The GNF i s o l a t e , w h i c hc o n t a i n e d f o u r p l a s m i d s o f d i f f e r e n t m o b i l i t i e s , was a l s of o u n d t o h a v e t w o p l a s m i d s which s h a r e d s i m i l a r i t y t o pCLl

a n d p C L 2 . The GNF 5 . 7 - k b p l a s m i d h y b r i d i z e d t o p r o b e sd e r i v e d f r o m p C L 1 , a n d t h e GNF 4 . 1 - k b p l a s m i d h y b r i d i z e dt o p r o b e s d e r i v e d f r o m p C L 2 . T h e s e r e s u l t s are c o n s i s t e n tw i t h t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e r e i s a h i g h d e g r e e o f s i m i l a r i t yb e t w e e n pCL1 a n d t h e GNF 5 . 7 - k b p l a s m i d , as w e l l as a h i g hd e g r e e o f s i m i l a r i t y between pCL2 and t h e GNF 4 . 1 - k bp l a s m i d . The GNF 6 . 0 - a n d 3 . 1 - k b p l a s m i d s d i d no t s t r o n g l yh y b r i d i z e t o p r o b e s d e r i v e d from e i t h e r pCL1 o r p C L 2 .The GNF i s o l a t e h a r b o r s t wo o t h e r p l a s m i d s b e s i d e s t h o s es i m i l a r t o pCL1 and p C L 2 . I t was i m p o r t a n t t o d e t e r m i n ew h e t h e r t h e 6 . 0 - and 3 . 1 - k b GNF p l a s m i d s , which d i d n o ts t r o n g l y h y b r i d i z e w i t h p r o b e s d e r i v e d from e i t h e r pCL1 orp C L 2 , were p r o b a b l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r . P l a s m i d

a

1 4 . 21 2 . 11 0 . 1

FGH I J

4 .

1 1 . 5

4 .7

2 . 82 . 5

2 .01 . 7

1 . 12 .

0 . 8

A P P L . E N v I R O N . M I C R O B I O L .

7/28/2019 2830.fullictaluri

5/8

PLASMID AND SERO L OGICAL DIFFERENCES IN E . ICTALURI 2 8 3 3T A B L E 1 . A g g l u t i n a t i o n t i t e r s a n d r e l a t i v e f l u o r e s c e n t i n t e n s i t i e so f i s o l a t e s o f E . i c t a l u r i r e a c t e d w i t h t w o a n t i s e r a

A n t i - S 8 5 - 1 3 7 7 A n t i - G N F s t r a i n 1 0 . 1 6a n t i s e r u m a n t i s e r u mE . i c t a l u r ii s o l a t e A g g l t t F l u o r e s - A g g l t i n t F l u o r e s -~ - ~ u m a i o n c e n t i n - c e n t i n -t i t e r a t e n s i t y b t i t e r a t e n s i t y "A TCC 3 3 2 0 2 6 4 +++ 4 +S 8 5 - 1 3 7 7 1 2 8 +++ 4 +D a n i o s t r a i n 1 0 . 1 5 6 4 +++ 4 +GNF s t r a i n 1 0 . 1 6 4 + > 4 , 0 9 6 +++

a A g g l u t i n a t i o n t i t e r r e p o r t e d a s t h e r e c i p r o c a l o f t h e h i g h e s t d i l u t i o n o fa n t i s e r u m a b l e t o c a u s e a g g l u t i n a t i o n o f b a c t e r i a l c e l l s a s d e t e r m i n e d i nm i c r o t i t e r p l a t e a s s a y s ( s e e M a t e r i a l s a n d M e th o d s ) .b T h e f l u o r e s c e n t i n t e n s i t y o f t h e b a c t e r i a l c e l l s was s c o r e d a f t e r r e a c t i o nw i t h t h e p r i m a r y a n t i s e r u m a n d r a b b i t a n t i - m o u s e F I T C - c o n j u g a t e d i m m u n o -g l o b u l i n G . R e l a t i v e i n t e n s i t y w a s s c o r ed w i th + , a s c o n t r a s t e d w i t h n e g a t i v ec o n t r o l s , w h i c h w e r e d e v e l o p e d w i t h o u t t h e p r i m a r y a n t i s e r u m .

-1-1.1F I G . 2 . R e s t r i c t i o n a n a l y s i s o f t h e p l a s m i d s i n t h e GNF i s o l a t e o f

E . i c t a l u n . Lane M, P s t I d i g e s t o f l a m b d a DNA ( t h e s i z e s o f t h es t a n d a r d f r a g m e n t s [ i n k i l o b a s e p a i r s ] are i n d i c a t e d on t h e r i g h t ) ;l a n e A , u n d i g e s t e d p l a s m i d DNA ( t h e l o c a t i o n s o f t h e f o ur p l a s m i d sare i n d i c a t e d on t h e l e f t w i t h a r r o w s ) ; l a n e s A t o G , p l a s m i d DNAf o l l o w i n g d i g e s t i o n w i t h r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s H i n d I l l , S a l I l ,S s t I I , X h o I , BamHI, E c o R I , a n d C l a I , r e s p e c t i v e l y .

p o o l s o f t h e GNF i s o l a t e were r e s t r i c t e d e i t h e r w i t h enzymesw h i c h d i d n o t h a v e s i t e s i n pCL1 o r pCL2 o r w i t h enzymesw h i c h c u t t h e s e r e f e r e n c e p l a s m i d s o n l y once. From t h e s ea n a l y s e s , i t appears t h a t t h e GNF 6 . 0 - a n d 3 . 1 - k b p l a s m i d sare d i s t i n c t f r o m o ne a n o t h e r . Of t h e seven enzymes u s e d f o rr e s t r i c t i o n a n a l y s e s shown i n F i g . 2 , S a l l was t h e o n l yenzyme which r e s t r i c t e d t h e GNF 3 . 1 - k b p l a s m i d . H o w e v e r ,t h e same seven enzymes y i e l d e d a d i f f e r e n t r e s t r i c t i o np r o f i l e f o r t h e 6 . 0 - k b p l a s m i d . T h i s p l a s m i d d i d n o t c o n t a i n aS a l I r e s t r i c t i o n s i t e b u t had s i n g l e s i t e s f o r EcoRI a n d C l a Ia n d a t l e a s t t w o r e s t r i c t i o n s i t e s f o r BamHI. T h e r e f o r e , t h e r eare a t l e a s t f i v e d i f f e r e n c e s i n t h e r e s t r i c t i o n s i t e s o f t h e 6 . 0 -a n d 3 . 1 - k b p l a s m i d s . These r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e GNF 6 . 0 -a n d 3 . 1 - k b p l a s m i d s are p r o b a b l y d i s t i n c t from e a c h o t h e r .T h e s e r e s u l t s , c o u p l e d w i t h t h e h y b r i d i z a t i o n r e s u l t s d e -s c r i b e d a b o v e , i n d i c a t e t ha t E . i c t a l u n i i s o l a t e s may h a r b o ra d d i t i o n a l s m a l l p l a s m i d s which are n o t s i m i l a r t o pCL1 andp C L 2 .S e r o l o g i c a l a n a l y s i s . P o l y c l o n a l a n t i s e r u m t o t h e GNFi s o l a t e as w e l l as p o l y c l o n a l a n t i s e r u m t o a c h a n n e l c a t f i s hi s o l a t e ( S 8 5 - 1 3 7 7 ) were p r e p a r e d t o d e t e r m i n e whether t h e s ei s o l a t e s were s e r o l o g i c a l l y d i f f e r e n t . C o m p a r a t i v e a n a l y s e su s i n g e i t h e r m i c r o t i t e r a g g l u t i n a t i o n assays o r f l u o r e s c e n t -a n t i b o d y a n a l y s e s i n d i c a t e d t h a t t h e GNF i s o l a t e a p p e a r e dt o be a n t i g e n i c a l l y d i s t i n c t from t h e s e o t h e r E . i c t a l u n is t r a i n s ( T a b l e 1 ) . The anti-GNF i s o l a t e a n t i s e r u m r e a c t e ds t r o n g l y o n l y a g a i n s t t h e GNF i s o l a t e ; t h e s e r o l o g i c a l reac-t i o n s w i t h t h e o t h e r i s o l a t e s were m a r g i n a l . I n c o n t r a s t , t h ea n t i s e r u m made t o i s o l a t e S 8 5 - 1 3 7 7 s t r o n g l y c r o s s - r e a c t e dw i t h t h e t y p e s t r a i n ATCC 3 3 2 0 2 , as w e l l as o t h e r E . i c t a l u r i

i s o l a t e s r e c o v e r e d f r o m i n f e c t e d c h a n n e l c a t f i s h . I n a d d i t i o n ,t h i s a n t i s e r u m s t r o n g l y r e a c t e d a g ai ns t t he d a n i o i s o l a t e .H o w e v e r , t h e a n t i - S 8 5 - 1 3 7 7 a n t i s e r u m gave o n l y a m a r g i n a lr e a c t i o n when r e a c t e d w i t h t h e GNF i s o l a t e . T h e s e a n a l y s e si n d i c a t e t h a t t h e GNF i s o l a t e appears s e r o l o g i c a l l y d i s t i n c tf r o m t h e s e o t h e r E . i c t a l u n i s o l a t e s .S t r u c t u r a l a n d a n t i g e n i c a n a l y s i s o f E . i c t a l u r i i s o l a t e s . Tod e t e r m i n e w h e t h e r t h e s e r o l o g i c a l d i f f e r e n c e o b s e r v e d b e -tween t h e GNF i s o l a t e a n d t h e o t h e r E . i c t a l u r i s t r a i n s c o u l db e d e f i n e d , S D S - s o l u b i l i z e d c e l l l y s a t e s were a n a l y z e d b ySDS-PAGE. C e l l l y s a t e s s t a i n e d w i t h C o m a s s i e b r i l l i a n t b l u eshowed t h a t t h e c h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e s as w e l l as t h e d a n i oi s o l a t e h a d s i m i l a r p r o t e i n p r o f i l e s . The p o s i t i o n s o f t h es t a i n e d b a n d s as w e l l as t h e i r r e l a t i v e i n t e n s i t i e s were verys i m i l a r . The GNF i s o l a t e a l s o h a d an e s s e n t i a l l y s i m i l a rp r o t e i n p r o f i l e , w it h o n l y a f e w m i n o r s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e sa p p a r e n t ( F i g . 3 A ) .I d e n t i c a l a l i q u o t s o f t h e l y s a t e s u s e d a b o v e were a l s oa n a l y z e d i n W e s t e r n b l o t s u s i n g t h e t w o d i f f e r e n t a n t i - E .i c t a l u n i a n t i s e r a ( F i g . 3B a n d C ) . W e s t e r n b l o t s d e v e l o p e dw i t h t h e a n t i - S 8 5 - 1 3 7 7 a n t i s e r u m showed t h a t t h e a n t i g e n i cp r o f i l e o f t h e d a n i o l y s a t e was very s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e dw i t h t h e o t h e r t w o E . i c t a l u r i s t r a i n s o b t a i n e d f r o m i n f e c t e dc h a n n e l c a t f i s h . I n c o n t r a s t , t h e a n t i g e n i c p r o f i l e o f t h e GNFl y s a t e w h i c h r e a c t e d w i t h t h i s a n t i s e r u m was somewhatd i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e s e o t h e r s t r a i n s . The a n t i - S 8 5 - 1 3 7 7a n t i s e r u m d i d n o t d e te ct t he same number o f b a n d s , no r d i dt h e s e b a n d s e x h i b i t t h e same r e l a t i v e s t a i n i n g i n t e n s i t y ast h o s e d e r i v e d f r o m t h e d a n i o o r c h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e s . Theg e n e r a l c o n c l u s i o n t h a t t h e a n t i g e n i c p r o f i l e o f t h e GNFi s o l a t e was d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t he s e o t h e r i s o l a t e s wass u p p o r t e d when l y s a t e s f r o m t h e s e s t r a i n s were r e a c t e d w i t ht h e a n t i s e r u m d e r i v e d t o t h e GNF i s o l a t e . With t h i s a n t i -serum m u l t i p l e b a n d s were o b s e r v e d i n t h e l y s a t e o f t h eGNF i s o l a t e , b u t many o f t h e bands i n t h e o t h e r s t r a i n se i t h e r were n o t r e a c t i v e o r r e a c t e d w i t h l e s s s t a i n i n g i n t e n -s i t y t h a n t h o s e f r o m t h e GNF i s o l a t e . There were, h o w e v e r ,some p r o t e i n s which a p p e a r e d t o be a n t i g e n i c a l l y s i m i l a r i ne a c h o f t h e s e s t r a i n s . As j u d g e d b y t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y o ft h e s t a i n i n g r e a c t i o n w i t h b o t h a n t i s e r a , as w e l l as t h ei d en ti c al r el a ti v e m o b i l i t y o f t h e r e a c t i v e p r o t e i n s , t h r e ep r o t e i n s , e x h i b i t i n g r e l a t i v e m o l e c u l a r m a s s e s o f 9 7 , 4 3 , and3 7 k D a , appear t o b e a n t i g e n i c a l l y s i m i l a r i n each o f t h e s ei s o l a t e s .P r o t e i n a s e K - t r e a t e d l y s a t e s were a l s o examined i n West-ern b l o t s u s i n g t h e s e t w o d i f f e r e n t a n t i s e r a ( F i g . 3 D and E ) .

- 4 . 7

- 2 . 8

- 2 . 1- 1 . 7

V O L . 5 9 , 1 9 9 3

7/28/2019 2830.fullictaluri

6/8

2 8 3 4 L O B B E T AL .

A. M 1 2 3 4

- , 4 i I r te t*4y#i-

B 1 2 3 4 C D

F I G . 3 . SDS-PAGE a n d W e s t e r n b l o t a n a l y s e s o f f o u r s t r a i n s o f E . i c t a l u n . ( A ) Commassie b r i l l i a n t b l u e - s t a i n e d SDS-PAGE g e l ofr e d u c e d c e l l l y s a t e s . Lane M c o n ta i ne d m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s (a m i x t u r e o f m y o s i n , P - g a l a c t o s i d a s e , p h o s p h o r y l a s e b , bovine albumin,eg g a l b u m i n , a n d c a r b o n i c a n h y d r a s e ) . T h e masses o f t h e s e s t a n d a r d s ( i n k i l o d a l t o n s ) ar e i n d i c a t e d on t h e l e f t . I n a l l p a n e l s l a n e s 1 through4 c o n t a i n e d c e l l l y s a t e s o f E . i c ta l u n GNF s t r a i n 1 0 . 1 6 , d a n i o s t r a i n 1 0 . 1 5 , s t r a i n S 8 5 - 1 3 7 7 , a n d type s t r a i n ATCC 3 3 2 0 2 , r e s p e c t i v e l y . ( B andC ) W e s t e r n b l o t s o f c e l l l y s a t e s o f E . i c t a l u r i s t r a i n s r e a c t e d w i t h a n t i - G N F s t r a i n 1 0 . 1 6 and a n t i - S 8 5 - 1 3 7 7 a n t i s e r a , r e s p e c t i v e l y . ( D and E)W e s t e r n b l o t s o f p ro t e in a se K - t r e at e d c e l l l y s a t e s o f E . i c t a l u r i s t r a i n s r e a c t e d w i t h anti-GNF s t r a i n 1 0 . 1 6 and a n t i - S 8 5 - 1 3 7 7 a n t i s e r a ,r e s p e c t i v e l y .

T h e s e r e a c t i o n s c l e a r l y d i s t i n g u i s h e d t h e GNF i s o l a t e f r o mt he o t h e r s t r a i n s . The a n t i - G N F E . i c t a l u n i a n t i s e r u m r e a c t e dw i t h t h e l i p o p o l y s a c c h a r i d e ( L P S ) l a d d e r o f th e GNF i s o l a t ea n d n o t w i t h t h e LPS l a d d e r o f t h e o t h e r s t r a i n s . Theconverse r e a c t i o n was o b s e r v e d when t h e s e s t r a i n s werer e a c t e d w i t h t h e a n ti - S 8 5 - 1 3 7 7 a n ti s e r u m. T h e s e r e s u l t s arec o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e 0 n t i g e n o f t h e GNFi s o l a t e i s a n t i g e n i c a l l y d i s t i n c t f r o m t h e 0a n t i g e n o f t h e s eo t h e r i s o l a t e s a n d h e n c e p r o b a b l y a c c o u n t s f o r t h e m a j o rs e r o l o g i c a l d i f f e r e n c e s o b s e r v e d i n t h e a g g l u t i n a t i o n a n df l u o r e s c e n t - a n t i b o d y a n a l y s e s .

DISCUSSIONThe GNF i s o l a t e o f E . i c t a l u r i h a s a d i f f e r e n t p l a s m i dp r o f i l e a n d i s s e r o l o g i c a l l y d i s t i n c t f r o m s t r a i n s o f E . i c t a l u n ir o u t i n e l y i s o l a t e d f r o m i n f e c t e d c h a n n e l c a t f i s h . I t wasp r e v i o u s l y shown t h a t E . i c t a l u r i s t r a i n s i s o l a t e d f r o m i n -f e c t e d c a t f i s h i n t h e s o u t h e a s t e r n U n i t e d S t a t e s c o n t a i n e dt w o d i f f e r e n t s m a l l p l as m id s , d e s ig n a te d pCL1 and p C L 2 .C o m p a r i s o n s o f t h e r e s t r i c t i o n m a p s o f t h es e p l a s m i d s , asw e l l as t h e i n a b i l i t y t o d e t e c t p o s s i b l e c o i n t e g r a t e s t r u c t u r e si n p l a s m i d p o o l s , s u g g e s t e d t h a t p a r t i a l h o m o l o g y o f t h e s ep l a s m i d s was u n l i k e l y . T h u s , on t h e b a s i s o f t h e c o n s i s t e n c yo f d e t e c t i n g b o t h p l a s m i d s i n c h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e s , i t wass u g g e s t e d t h a t t h e s e p l a s m i d s s h o u l d be v a l u a b l e t o o l s i n t h ep r e s u m p t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f t h i s b a c t e r i u m from i n f e c t e dc h a n n e l c a t f i s h . T h e s e f i n d i n g s h a v e b e e n c o n f i r m e d by o t h e ri n v e s t i g a t o r s ( 8 , 1 0 ) .The us e o f h y br id i za ti o n a n al y s e s i n which p l a s m i d -s p e c i f i c p r o b e s are u s e d t o d e t e c t E . i c t a l u r i h a s o b v i o u sp o t e n t i a l , as r e l a t e d e a r l i e r ( 7 ) . Because o f t h i s p o t e n t i a l , i t

was i m p o r t a n t t o ensure t h a t pCL1 a n d pCL2 d i d n o tc r o s s - h y b r i d i z e w i t h e a c h o t h e r . A n o t h e r s t u d y i n d i c a t e dt h a t t h e s e t w o p l a s m i d s c r o s s - h y b r i d i z e d ( 1 1 ) , a l t h o u g h as u b s e q u e n t s t u d y by t h i s group i n d i c a t e d t h a t pCL1 d i d n o tc r o s s - h y b r i d i z e w i t h pCL2 ( 1 0 ) . To r e s o l v e t h i s q u e s t i o n ,pCL1 a n d pCL2 were t w i c e p u r i f i e d f r o m agarose g e l s a n du s e d as p r o b e s i n h y br i d iz a ti o n a n al y s e s. T h e s e s t u d i e sc l e a r l y showed t h a t t h e s e p r o b e s do n o t c r o s s - h y b r i d i z e w i t he a c h o t h e r a n d d o n o t c r o s s - h y b r i d i z e w i t h t h e b a c t e r i a lchromosome.P l a s m i d a n a l y s i s o f t h e i s o l a t e s o f E . i c t a l u n f r o m t h ed a n i o a n d t h e GNF s u p p o r t t h e e v i d e n c e o f Newton e t a l . ( 8 )a n d R e i d a n d B o y l e ( 1 0 ) t h a t t h e GNF i s o l a t e c o n t a i n e dp l a s m i d s which are d i f f e r e n t i n s i z e f r o m t h o s e f o u n d i ne i t h e r t h e d a n i o i s o l a t e o r t h e E . i c t a l u n s t r a i n s r o u t i n e l yi s o l a t e d f r o m c h a n n e l c a t f i s h . B o t h o f t h es e e a r l i e r i n v e s t i -g a t i o n s showed t h a t t h e GNF i s o l a t e c o n t a i n e d t h r e e p l a s -m i d s w h i c h h a d m o l e c u l a r s i z e s o f a b o u t 5 . 6 , 4 . 0 , a n d 3 . 0 k b .R e i d a n d B o y l e ( 1 0 ) showed t h a t t h e 5 . 6 - k b p l a s m i d cross-h y b r i d i z e d w i t h p r o b e s d e r i v e d from pCL1 and t he 4 . 0 - k bp l a s m i d h y b r i d i z e d w i t h p r o b e s d e r i v e d from b o t h pCL1 andp C L 2 . P l a s m i d p r o f i l e s o f t h e GNF i s o l a t e i n t h e s t u d i e s o fb o t h R e i d a n d B o y l e and Newton e t a l . , h o w e v e r , d i d n o tappear t o r e f l e c t t he 6 . 0 - k b p l a s m i d which was i d e n t i f i e d i nt h i s s t u d y . T h i s d i f f e r e n c e m i g h t r e f l e c t s e v e r a l p o s s i b i l i t i e s ,i n c l u d i n g c o m i g r a t i o n o f t h e 6 . 0 - and 5 . 7 - k b p l a s m i d s i nt h e s e e a r l i e r s t u d i e s , t h e l o s s o f t h e 6 . 0 - k b p l a s m i d fromt h e s e c u l t u r e s , o r even i n t e g r a t i o n o f t h e 6 . 0 - k b p l a s m i d i n t ot h e chromosome. I t i s n o t c le ar which o f t h e s e p o s s i b i l i t i e sm i g h t b e c o r r e c t . H o w e v e r , t h i s s t u d y sh o ws t h a t t h e GNFs t r a i n c o n t a i n s t w o p l a s m i d s i n a d d i t i o n t o p l a s m i d s s i m i l a rt o pCL1 a n d p C L 2 . The 6 . 0 - and 3 . 1 - k b GNF p l a s m i d s have

2 0 5 -1 1 69 7 -66-

4 5 -

2 9 -

E 1 2 3 4A P P L . E N v I R O N . M I C R O B I O L .

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PLASMID AND SERO L OGICAL DIFFERENCES IN E. ICTALURI 2 8 3 5d i f f e r e n t r e s t r i c t i o n p a t t e r n s , a n d n e i t h e r s t r o n g l y h y b r i d i z e sw i t h p r o b e s d e r i v e d f r o m e i t h e r pCL1 o r p C L 2 . I n c o n t r a s t ,t h e GNF 5 . 7 - k b p l a s m i d h y br i di z ed w i th p r o b e s d e r i v e df r o m p C L 1 , w h e r e a s t h e GNF 4 . 1 - k b p l a s m i d h y b r i d i z e dw i th p ro b e s d e r i v e d f r o m p C L 2 . B e c a u s e h i g h - s t r i n g e n c yh y b ri d i z a ti o n c o n d i t io n s w e r e u s e d i n t h e s e a n a l y s e s , t h e s ep l a s m i d s s h a re c o n s i d er a bl e s e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t h pCL1a n d p C L 2 , r e s p e c t i v e l y .

T h e p o s s i b i l i t y t h a t s t r a i n s o f E . i c t a l u r i may l o s e p l a s m i d sd u r i n g c e l l c u l t u r e i s o f p o t e n t i a l c o n c e r n , a l t h o u g h e a r l i e r i nv i t r o a t t e m p t s t o c u r e pCL1 a n d pCL2 f r o m E . i c t a l u r ip r o v e d d i f f i c u l t ( 7 ) . S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t a s t r a i n o f E .i c t a l u n i s o l a t e d i n M a r y l a n d f r o m w h i t e c a t f i s h h a d a 4 . 0 - k bp l a s m i d w h i c h , b y h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s , w a s p r o b a b l ys i m i l a r t o p C L 2 . H o w e v e r , t h i s s t r a i n a p p a r e n t l y l a c k e d a5 . 7 - k b ( p C L 1 - l i k e ) p l a s m i d , a n d f u r t h e r m o r e , h y b r i d i z a t i o na n a l y s e s s u g g e s t e d t h a t t h i s p l a s m i d was n o t i n t e g r a t e d i n t ot h e c h r o m o s o m e ( 1 0 ) . W h e t h e r t h i s s t r a i n may h a v e l o s t ap l a s m i d s i m i l a r t o pCL1 i s n o t k n o w n , b u t t h e s e o b s e r v a -t i o n s s e e m t o c a u t i o n t h a t p l a s m i d a n a l y s e s s h o u l d b ec o n d u c t e d w i t h s t r a i n s b ef o r e e x te n si v e c e l l p a s s a g e .E a r l i e r s t u d i e s h a d s h o w n t h a t d i f f e r e n t i s o l a t e s o f E .i c t a l u n a p p e a r t o b e b i o c h e m i c a l l y h o m o g e n e o u s ( 1 5 ) . S e r o -l o g i c a l s t u d i e s h a v e a l s o c o n c l u d e d t h a t d i f f e r e n t s t r a i n s o fE . i c t a l u r i a p p e a r t o b e s e r o l o g i c a l l y h o m o g e n e o u s . P l u m ba n d K l e s i u s ( 9 ) d e r i v e d s e v e n h y b r i d o m a c e l l l i n e s f r o m m i c ei m m u n i z e d w i t h E . i c t a l u n i t y p e s t r a i n ATCC 3 3 2 0 2 . T h e i ra n a l y s e s s u g g e s t e d t h a t a l t h o u g h n o t a l l m o n o c l o n a l a n t i b o d -i e s r e a c t e d u n i f o r m l y a g a i n s t a l l i s o l a t e s , t h e r e w e r e c o n -s e r v e d a n t i g e n s i n a l l o f t h e s t r a i n s a n a l y z e d . B e r t o l i n i e t a l .( 1 ) h a v e a l s o d o n e s e r o l o g i c a l a s s e s s m e n t s o n d i f f e r e n ts t r a i n s o f E . i c t a l u r i . In t h e i r a n a l y s e s t h e y c o m p a r e d a na n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t a c h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e w i t h a na n t i s e r u m r a i s e d a g a i n s t t h e GNF i s o l a t e . I n b o t h c a s e s ,a n t i s e r u m was p r e p a r e d f r o m r a b b i t s t h a t were i m m u n i z e dw i t h f o r m a l i n - k i l l e d c e l l s . B e r t o l i n i e t a l . s h o w e d t h a t t h e r ew e r e a n t i g e n s w h i c h w e r e a p p a r e n t l y s p e c i f i c t o t h e GNFi s o l a t e b u t c o n c l u d e d t h a t t h e r e w as i n s u f f i c i e n t e v i d e n c e t os u g g e s t t h a t t h e GNF i s o l a t e r e p r e s e n t e d a d i f f e r e n t s e r o -t y p e . I n th e p r e s e n t s t u d y m u r i n e p o l y c l o n a l a n t i s e r a o b -t a i n e d f r o m m i c e i m m u n i z e d w i t h l i v e E . i c t a l u r i f r o m ac h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e o r t h e GNF i s o l a t e were c o m p a r e d .By b o t h a g g l u t i n a t i o n r e a c t i o n s a n d t h e f l u o r e s c e n t - a n t i b o d yt ec h ni q u es , t he GNF i s o l a t e w as j u d g e d t o b e s e r o l o g i c a l l yd i s t i n c t .C o m p a r a t i v e SDS-PAGE a n a l y s e s o f c e l l l y s a t e s i n d i c a t et h a t t h e c h a n n e l c a t f i s h i s o l a t e s a n d th e d a n i o a n d GNFi s o l a t e s h a v e s i m i l a r p r o t e i n p r o f i l e s , a s j u d g e d b y t h er e l a t i v e s t a i n i n g p a t t e r n o f s i m i l a r - s i z e d b a n d s . H o w e v e r ,when r e p l i c a t e W e s t e r n b l o t s w e r e r e a c t e d w i t h t h e s e t w od i f f e r e n t a n t i s e r a , t h e a n t i g e n i c p r o f i l e s were d i f f e r e n t . I t i sa l s o i n t e r e s t i n g t h a t t h e r e were s e v e r a l p r o t e i n s w h i c h werej u d g e d t o b e s i m i l a r i n t h e i r a n t i g e n i c r e a c t i o n s w i t h b o t ha n t i s e r a . A l t h o u g h a t t h i s p o i n t l i t t l e i s known r e g a r d i n g t h es t r u c t u r a l p r o t e i n s o f E . i c t a l u r i , p r o t e i n s w i t h r e l a t i v em o l e c u l a r m a s s e s o f 9 7 , 4 3 , a n d 3 7 kDa a p p e a r e d t o s t a i nw it h e qu al i n t e n s i t y w i t h b o t h a n t i s e r a . T h i s o b s e r v a t i o ns u g g e s t s t h a t t h e s e p r o t e i n s a r e m a j o r a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t swhen l i v e w h o l e c e l l s a r e u s e d f o r i m m u n i z a t i o n .W e s t e r n b l o t s o f p r o t e i n a s e K - t r e a t e d l y s a t e s i n d i c a t e t h a tt h e 0 a n t i g e n o f th e GNF i s o l a t e i s a n t i g e n i c a l l y d i f f e r e n tf r o m th e 0 a n t i g e n o f th e o t h e r s t r a i n s o f E . i c t a l u r ie x a m i n e d i n t h i s r e p o r t . S t u d i e s w i t h th e more commonmember o f th e g e n u s , E . t a r d a , h a v e shown t h a t t h e r e a r ed i f f e r e n t 0 - s p e c i f i c c h a i n s i n d i f f e r e n t i s o l a t e s . T h i s f i n d i n gh a s r e s u l t e d i n t h e s e r o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f d i f f e r e n t

0 - a n t i g e n s i n t h i s s p e c i e s ( 1 2 ) . T h e p r e s e n t s t u d y w o u l di n d i c a t e t h a t E . i c t a l u r i m ay a l s o b e c l a s s i f i e d i n t o d i f f e r e n ts e r o t y p e s . W h e t h e r t h e d i v e r s i t y o f 0 a n t i g e n s r e p r e s e n t e di n E . t a r d a w i l l b e r e f l e c t e d a s more s e r o l o g i c a l a n a l y s e s a r ep e r f o r m e d w i t h a d d i t i o n a l i s o l a t e s o f E . i c t a l u n i must a w a i tf u r t h e r s t u d i e s .I n c o n c l u s i o n , t h i s s t u d y h a s i d e n t i f i e d a s t r a i n o f E .i c t a l u r i i s o l a t e d f r o m a n i n f e c t e d GNF w h i c h h a s a d i f f e r e n tp l a s m i d p r o f i l e a n d i s a n t i g e n i c a l l y d i s t i n c t f r o m i s o l a t e s o fE . i c t a l u n i r e c o v e r e d f r o m c h a n n e l c a t f i s h i n t he s o u th e as t -e r n U n i t e d S t a t e s . O f th e f o u r p l a s m i d s i d e n t i f i e d i n th e GNFs t r a i n , o n l y t h e 5 . 7 - k b p l a s m i d w as s i m i l a r i n s i z e t o o ne o ft h e c h a r a c t e r i z e d p l a s m i d s ( p C L 1 ) . H y b r i d i z a t i o n a n a l y s e s ,h o w e v e r , s h o w e d t h a t t h e 5 . 7 - k b p l a s m i d a n d t h e 4 . 1 - k bp l a s m i d s h a r e d s i g n i f i c a n t s i m i l a r i t y t o p C L 1 a n d p C L 2 ,r e s p e c t i v e l y . T h e s e r o l o g i c a l d i f f e r e n c e s o b s e r v e d b e t w e e nt h e GNF i s o l a t e a n d t h e o t h e r E . i c t a l u n i i s o l a t e s e x a m i n e dwere d e t e r m i n e d b y W e s t e r n b l o t t i n g t o r e f l e c t s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s i n t h e 0 a n t i g e n s o f t he s e t w o s e r o l o g i c a l g r o u p s .T h e s e c o m b i n e d r e s u l t s s u g g e s t t h a t i s o l a t e s o f E . i c t a l u r iw h i c h h a v e p l a s m i d p r o f i l e s d i f f e r e n t f r o m t h o s e s t r a i n st y p i c a l l y i s o l a t e d f r o m c h a n n e l c a t f i s h s h o u l d b e e x a m i n e d t od e t e r m i n e w h e t h e r t h e y a r e s e r o l o g i c a l d i f f e r e n t f r o m knowni s o l a t e s . I t may b e p o s s i b l e t h a t th e c r y p t i c p l a s m i d s o f E .i c t a l u r i m ay m e d i a t e c h a n g e s i n t h e 0 a n t i g e n . I f news e r o t y p e s o f E . i c t a l u r i p r o v e t o b e v i r u l e n t i n c h a l l e n g ee x p e r i m e n t s w i t h c h a n n e l c a t f i s h , t h e s e s t r a i n s m ay b e c o m eo f s i g n i f i c a n t e c o n o m i c c o n c e r n i f t h e y a r e i n t r o d u c e d i n t om a j o r c h a n n e l c a t f i s h a q u a c u l t u r e a r e a s .

ACKN O W L E DG M E N TSO u r a p p r e c i a t i o n i s e x t e n d e d t o J i m B e r t o l i n i f o r p r o v i d i n g t h ed a n i o a n d GNF i s o l a t e s o f E. i c t a l u r i u s e d i n t h i s s t u d y .T h i s i n v e s t i g a t i o n w as s u p p o r t e d b y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e g r a n tA I 2 3 0 5 2 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h .

REFERENCES1 . B e r t o l i n i , J . M . , R . C . C i p r i a n o , S . W. P y l e , a n d J . J . A .M c L a u g h l i n . 1 9 9 0 . S e r o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n o f t h e f i s h p a t h o g e n

E d w a r d s i e l l a i c t a l u r i , cause o f e n t e r i c s e p t i c e m i a o f c a t f i s h . J .W i l d . D i s . 2 6 : 2 4 6 - 2 5 2 .2 . G h a f f a r i , S . H . , a n d C . J . L o b b . 1 9 8 9 . N u c l e o t i d e s e q u e n c e o fc h a n n e l c a t f i s h h e a v y c h a i n cDNA a n d g e n o m i c b l o t a n a l y s e s .I m p l i c a t i o n s f o r t h e p h y l o g e n y o f I g h e a v y c h a i n s . J . I m m u n o l .1 4 3 : 2 7 3 0 - 2 7 3 9 .3 . H a w k e , J . P . 1 9 7 9 . A b a c t e r i u m a s s o c i a t e d w i t h d i s e a s e o f p o n dc u l t u r e d c h a n n e l c a t f i s h , I c t a l u r u s p u n c t a t u s . J . F i s h . R e s .B o a r d C a n . 3 6 : 1 5 0 8 - 1 5 1 2 .4 . H a w k e , J . P . , A . C . M c W h o r t e r , A . G . S t e i g e r w a l t , a n d D . J .B r e n n e r . 1 9 8 1 . E d w a r d s i e l l a i c t a l u r i s p . n o v . , t h e c a u s a t i v ea g e n t o f e n t e r i c s e p t i c e m i a o f c a t f i s h . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l .3 1 : 3 9 6 - 4 0 0 .4 a . K e n t , M. L . , a n d J . M. L y o n s . 1 9 8 2 . R e p o r t . F i s h H e a l t h News2 : i i .5 . L o b b , C . J . , a n d L . W. C l e m . 1 9 8 2 . F i s h l y m p h o c y t e s d i f f e r i nt h e e x p r e s s i o n o f s u r f a c e i m m u n o g l o b u l i n . D e v . C o m p . I m m u -n o l . 6 : 4 7 3 - 4 7 9 .6 . L o b b , C . J . , a n d L . W. C l e m . 1 9 8 3 . D i s t i n c t i v e s u b p o p u l a t i o n so f c a t f i s h serum a n t i b o d y a n d i m m u n o g l o b u l i n . M o l . I m m u n o l .2 0 : 8 1 1 - 8 1 8 .7 . L o b b , C . J . , a n d M. R h o a d e s . 1 9 8 7 . R a p i d p l a s m i d a n a l y s i s f o rt h e i d e n t i f i c a t i o n o f E d w a r d s i e l l a i c t a l u r i f r o m i n f e c t e d c h a n n e lc a t f i s h ( I c t a l u r u s p u n c t a t u s ) . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 3 :1 2 6 7 - 1 2 7 2 .8 . N e w t o n , J . C . , R . C . B i r d , W. T . B l e v i n s , G . R . W i l t , a n d L . G .W i l t . 1 9 8 8 . I s o l a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n , a n d m o l e c u l a r c l o n i n g o fc r y p t i c p l a s m i d s f r o m E d w a r d s i e l l a i c t a l u i . Am . J . V e t . R e s .4 9 : 1 8 5 6 - 1 8 6 0 .9 . P l u m b , J . A . , a n d P . K l e s i u s . 1 9 8 8 . An a s s e s s m e n t o f t h e

V O L . 5 9 , 1 9 9 3

7/28/2019 2830.fullictaluri

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2 8 3 6 L O B B E T AL . A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .a n t i g e n i c h o m o g e n e i t y o f E d w a r d s i e l l a i c t a l u r i u s i n g m o n o c l o -n a l a n t i b o d y . J . F i s h D i s . 1 1 : 4 9 9 - 5 0 9 .1 0 . R e i d , W. S . , a n d J . A . B o y l e . 1 9 8 9 . P l a s m i d h o m o l o g i e s i nE d w a r d s i e l l a i c t a l u n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 3 2 5 3 - 3 2 5 5 .1 1 . S p e y e r e r , P . D . , a n d J . A . B o y l e . 1 9 8 7 . T h e p l a s m i d p r o f i l e o fE d w a r d s i e l l a i c t a l u r i . J . F i s h D i s . 1 0 : 4 6 1 - 4 6 9 .1 2 . T a m u r a , K . , R . S a k a z a k i , A . C . M c W h o r t e r , a n d Y . K o s a k o .1 9 8 8 . E d wa r ds i e ll a t ar d a s e r o t y p i n g s c h e m e f o r i n t e r n a t i o n a lu s e . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 6 : 2 3 4 3 - 2 3 4 6 .1 3 . T o w b i n , H . , T . S t a e h e l i n , a n d J . G o r d o n . 1 9 7 9 . E l e c t r o p h o r e t i c

t r a n s f e r o f p r o t e i n s f r o m p o l y a c r y l a m i d e g e l s t o n i t r o c e l l u l o s es h e e t s : p r o c e d u r e a n d some a p p l i c a t i o n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 7 6 : 4 3 5 0 - 4 3 5 4 .1 4 . W a l t m a n , W. D . , E . B . S h o t t s , a n d V . S . B l a z e r . 1 9 8 5 . R e c o v e r yo f E d w a r d s i e l l a i c t a l u r i f r o m d a n i o ( D a n i o d e v a r i o ) . A q u a c u l -t u r e 4 6 : 6 3 - 6 6 .1 5 . W a l t m a n , W. D . , E . B . S h o t t s , a n d T . C . H s u . 1 9 8 6 . B i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s o f E d w a r d s i e l l a i c t a l u n i . A p p l . E nv i r o n . M i cr o -b i o l . 5 1 : 1 0 1 - 1 0 4 .