Universit de Sherbrooke

pidmiologie molculaire des entrites Campylobacter en Estrie

ParSimon Lvesque

Programme de microbiologie

Thse prsente la Facult de mdecine et des sciences de la sant en vue de lobtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en microbiologie

Sherbrooke, Qubec, Canada Avril 2013

Membres du jury dvaluation Sophie Michaud, programme de microbiologie

Eric Frost, programme de microbiologie Antonio Conconi, programme de microbiologie

Vincent Burrus, dpartement de biologie, facult des sciences, Universit de Sherbrooke

Marcel Behr, Division of Infectious Diseases and Medical Microbiology,McGill University

Simon Lvesque, 2013

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Canada

Dans le cur de l homme, il y a une bactrie qui sommeille.

Bernard Weber

RSUM

pidmiologie molculaire des entrites Campylobacter en Estrie

ParSimon Lvesque

Programme de microbiologie

Thse prsente la Facult de mdecine et des sciences de la sant en vue de lobtention du diplme de philosophiae doctor (Ph.D.) en microbiologie, Facult de

mdecine et des sciences de la sant, Universit de Sherbrooke, Sherbrooke, Qubec,Canada, J1H 5N4

Le Campylobacter est la premire cause de gastro-entrites bactriennes dans les pays industrialiss. La grande majorit des cas sont des infections sporadiques dont la source est rarement identifie. Le Campylobacter fait partie de la flore intestinale normale dune large diversit danimaux et peut galement se retrouver dans leau. Le but de mon projet de recherche tait dtudier lpidmiologie clinique et molculaire des infections Campylobacter en Estrie afin de dterminer les principales sources dinfections sporadiques et de comparer les gnotypes des isolats de Campylobacter selon les diffrentes niches cologiques. Nous avons dtermin le profil de sensibilit aux antibiotiques d isolats de diffrentes sources. Nous avons observ un haut taux de rsistance lrythromycine et la ttracycline et un faible taux de rsistance la ciprofloxacine chez les isolats de poulet, pouvant reflter lutilisation de ces antibiotiques dans cet levage. Le fait que le taux de rsistance lrythromycine parmi les isolats humains soit significativement moins lev que chez les isolats de poulet suggrait limportance dautres sources de Campylobacter chez lhumain. Afin de dterminer quelle mthode de typage molculaire serait la mieux adapte pour notre devis de recherche, nous avons compar quatre mthodes (AFLP, MLST, typage du gne fla et EGCP). Seul le MLST a pu attribuer des isolats humains des niches cologiques particulires comme le poulet, le lait cru et leau. Afin doptimiser la technique de MLST, nous avons dvelopp un systme complmentaire bas sur le HRM, qui est beaucoup plus rapide et moins coteux que le MLST. Nous avons dmontr que le HRM a le potentiel de complmenter les mthodes danalyses bases sur du squenage pour ltude des mutations ponctuelles et de faciliter une vaste gamme dtudes bases sur des mthodes gnotypiques, telle la dtection de mutations ponctuelles qui confrent de la rsistance aux antibiotiques. Nous avons entrepris par la suite une tude cas-cas et un vaste projet disolement et de caractrisation molculaire de souches de Campylobacter en Estrie, afin de vritablement cerner les mcanismes de transmission de la bactrie et de comparer les sources dinfections sporadiques chez les cas acquis en rgions rurales vs urbaines. Nous avons confirm que le poulet tait responsable de la majorit des cas de campylobactrioses. Cependant, nos rsultats suggrent que la saisonnalit ainsi que le gradient urbain-rural de la campylobactriose sont dus lexposition aux souches bovines, particulirement chez le groupe dge des 15-34 ans via lexposition professionnelle. Par la dtermination des sources dinfections, nous avons tabli des pistes dinterventions utilisables par les autorits de sant publique, afin de diminuer lincidence de la campylobactriose au Qubec.

Mots cls : Campylobacter, MLST, pidmiologie molculaire, rsistance aux antibiotiques

SUMMARY

Molecular epidemiology of Campylobacter enteritidis in the Eastern Townships

BySimon Lvesque

Microbiology Program

Thesis presented at the Faculty o f medicine and health sciences for the obtention of doctoral degree philosophiae doctor (Ph.D.) in microbiology, Faculty of medicine and

health sciences, Universit de Sherbrooke, Sherbrooke, Qubec, Canada, J1H 5N4

Campylobacteriosis is the leading notifiable enteric disease in industrialised countries. It colonizes a wide range of animal which in turn spread the disease. The majority of campylobacteriosis cases are sporadic infections for which the source is rarely apparent. The main goal of my research project is to determine contamination sources of Campylobacter in the Eastern Townships, to identify the sources and routes of transmission and to establish the main sources of sporadic infections. We determined antimicrobial susceptibility profiles of Campylobacter isolates in order to predict which bacterial population will be resistant, caused by antimicrobial selective pressure administered to the host. High levels of resistance of chicken isolates to erythromycin and tetracycline, and low levels of resistance to ciprofloxacin reflect the use of the former antibiotics in animal husbandry. The fact that the erythromycin and tetracycline resistance levels were significantly lower among human isolates suggests that other transmission sources are important for human infection. In order to determine which molecular typing method will be the most relevant for our research design, we compared four typing methods (AFLP, MLST,/7a typing and PFGE). Only MLST has the potential to link isolates to a particular ecological niche, such as chicken, raw milk and water. In order to optimize MLST, we developed a complementary system based on HRM. We demonstrated that HRM has the potential to complement the analysis methods based on sequencing for SNP and facilitate a wide range of studies based on genotypic methods. We have subsequently undertaken a major project of isolation and molecular characterization of Campylobacter in the Eastern Townships, in order to truly understand the mechanisms of transmission of the bacteria and determine the source of sporadic cases. We confirmed that chicken was responsible for the majority of cases of campylobacteriosis. However, we have shown that the urban-rural gradient of campylobacteriosis in the Eastern Townships could be explained by exposure to bovine, especially for the 15-34 year old age group through occupational exposure. By the identification of infection sources, we proposed courses of action that could be used by public health authorities to reduce the incidence of campylobacteriosis in Quebec.

Keywords: Campylobacter, MLST, molecular epidemiology, antimicrobial resistance

V

TABLE DES MATIRES

RSUM....................................................................................................................III

SUMMARY.............................................................................................................. IV

TABLE DES MATIRES...........................................................................................V

LISTE DES ILLUSTRATIONS..............................................................................VII

LISTE DES SIGLES, ABRVIATIONS ET SYMBOLES................................ VIII

INTRODUCTION........................................................................................................ 9

1.1 Historique du Campylobacter..................................................................................9

1.2 Microbiologie et aspects cliniques des infections

Campylobacter......................................................................................................10

1.3 pidmiologie clinique et cologie du Campylobacter....................................... 13

1.3.1 Les poulets........................................................................................................14

1.3.2 Les bovins.........................................................................................................15

1.3.3 Les oiseaux sauvages.......................................................................................16

1.3.4 Les animaux de compagnies........................................................................... 17

1.3.5 Leau................................................................................................................. 17

1.4 La rsistance aux antibiotiques.............................................................................. 19

1.4.1 Les fluoroquinolones...................................................................................... 20

1.4.2 Les macrolides.................................................................................................21

1.4.3 Les ttracyclines..............................................................................................22

1.5 Lpidmiologie molculaire et les diffrentes mthodes...................................23

1.5.1 EGCP................................................................................................................24

1.5.2 AFLP.................................................................................................................26

VI

1.5.3 Typage du flagelle..............................................................................................28

1.5.4 M LST................................................................................................................... 29

1.6 Objectifs de recherche...............................................................................................31

CHAPITRE 1 .................................................................................................................. 32

CHAPITRE 2 .................................................................................................................. 58

CHAPITRE 3 .................................................................................................................. 91

CHAPITRE 4 ................................................................................................................. 119

CHAPITRE 5 ................................................................................................................. 149

DISCUSSION.................................................................................................................208

7.1 Distribution de la rsistance aux antibiotiques des isolats de

C. jejuni obtenus des diffrentes niches cologiques......................................... 208

7.2 pidmiologie molculaire des souches de Campylobacter...............................214

7.3 Dveloppement dun systme plus performant pour

effectuer le M LST...................................................................................................218

7.4 Analyse du Campylobacter dans leau................................................................... 220

7.5 Les sources de la campylobactriose..................................................................... 223

CONCLUSION............................................................................................................. 228

REMERCIEMENTS..................................................................................................... 230

RFRENCES...............................................................................................................233

ANNEXE 246

VII

LISTE DES ILLUSTRATIONS

Liste des figures

Figure 1 : Modle de transmission du C. jejuni................................................................. 14

Figure 2 : Schmatisation de la mthode dEGCP........................................................... 26

Figure 3 : Schmatisation de la mthode dAFLP.............................................................28

VIII

LISTE DES SIGLES, ABRVIATIONS ET SYMBOLES

ADN : Acide dsoxyribonuclique

AFLP : Amplifiedfragment-length polymorphism

CC : Complexe clonal ou Clonal complex

CMI : Concentration minimale inhibitrice

CVNC : Cellules viable mais non cultivables

EGCP : lectrophorse sur gel en champ puis

HRM : High-resolution melting

MADO : Maladie dclaration obligatoire

MAPAQ : Ministre de lagriculture, des pcheries et de lalimentation du Qubec

MLEE : Multi-locus enzyme electrophoresis

MLST : Multi-locus sequence typing

MRC : Municipalit rgionale de comt

PCR : Polymerase chain reaction

PCR-RFLP : PCR-restriction fragment length polymorphism

PFGE : Pulsed-field gel electrophoresis

SGB : Syndrome de Guillain-Barr

SNP : Single nucleotide polymorphisms

ST : Sequence type

SVR : Short variable repeat

Tm : Temprature de fusion ou melting temperature

UFC : Unit formant des colonies

9

INTRODUCTION

1.1 Historique du Campylobacter

Le Campylobacter fut dcrit pour la premire fois en 1886 par nul autre que

Theodore Escherich qui observa une bactrie de forme spirale dans le colon dun

enfant dcd dune maladie nomme lpoque cholera infantum (Skirrow et

Butzler, 2000). Il fut cependant incapable de cultiver ce microorganisme. Il fallut

attendre jusquen 1906 pour que John McFadyean et Stewart Stockman isolent pour la

premire fois en culture pure un microorganisme vibrio provenant de mucus utrin

dune brebis gestante dans un troupeau prsentant un taux d avortement de 33%. En

1919, Theobald Smith et Marian Taylor risolrent le mme microorganisme lors dun

avortement chez un bovin et le nommrent Vibrio fetus (Skirrow, 2006). Deux autres

microorganismes furent subsquemment isols en 1931 (Vibrio jejuni, isol du

jjunum dun bovin) et en 1944 (Vibrio coli, isol chez le porc). Ce nest quen 1973,

suite des travaux dun groupe franais, que ces microorganismes furent reconnus

comme un groupe de bactrie distinct et renomms Campylobacter. D la grande

difficult isoler le microorganisme, les premiers isolements de Campylobacter dans

les fces humaines eurent lieu au dbut des annes 1970 et avec lavnement dun

milieu de culture slectif pour le Campylobacter, le milieu Skirrow. La communaut

scientifique prit alors vritablement conscience de limportance du Campylobacter

comme tant la cause la plus frquente dentrites bactriennes acquises en

communaut dans le monde (Engberg, 2006).

10

1.2 Microbiologie et aspects cliniques des infections Campylobacter

Le Campylobacter est un petit btonnet incurv ou en forme de S de 0,2

0,8 pm de large par 0,5 5 pm de long. Cette bactrie Gram ngatif, non sporulante,

une mobilit en tire bouchon par un seul flagelle polaire nu ou par un flagelle chaque

extrmit (Vandamme, 2000). Ce genre bactrien est considr comme fastidieux,

entre autres, pour son systme respiratoire microarophile ncessitant entre 3 15%

doxygne pour crotre (Macfaddin, 2000). La temprature optimale de croissance se

situe entre 30-37C, sauf pour les Campylobacter thermophiliques (. jejuni, C. coli et

C. lari) qui poussent mieux 42C (On, 2005). Le genre Campylobacter compte

maintenant 23 espces et 8 sous-espces, dont 7 identifies durant les 4 dernires

annes (Debruyne et a l, 2009). De ce nombre, une dizaine despces et sous-espces

ont t associes avec des maladies chez les animaux ou encore chez lhumain

(Chaban et al., 2009).

Le Campylobacter est lagent bactrien causant le plus de diarrhes dans le

monde et reprsente lui seul environ 10% de tous les cas dentrites (EYLES et al.,

2003). En 2004 au Canada, le taux de campylobactriose tait de 30,22 par 100 000

habitants, ce qui en faisait la quatrime maladie dclaration obligatoire (MADO) en

importance (Agence de sant publique du Canada, 2009). En 2009 au Qubec, 2025

cas de campylobactriose taient dclars, ce qui est plus important que tous les cas de

Salmonelle, Shigelle, Yersinia enterocolitica et Escherichia coli 0157:H7 runis

(Mnard, 2006, MSSS, 2010). Il a t rcemment avanc que ce nombre de cas serait

substantiellement sous-valu et que pour chaque cas de campylobactriose dclar au

11

Canada chaque anne, il y aurait de 23 49 cas additionnels non dclars (Thomas et

al., 2006).

Aprs une priode dincubation de 3 5 jours, les principaux symptmes de la

campylobactriose sont des crampes abdominales, suivies de diarrhes qui peuvent

parfois tre sanglantes. Les autres symptmes rencontrs sont la fivre, les nauses, les

vomissements et les maux de tte (Engberg, 2006). La majorit des patients gurissent

deux-mmes au bout de quelques jours, mais jusqu 20% peuvent avoir une diarrhe

prolonge ou encore des complications suite linfection et avoir besoin dun

traitement aux antibiotiques (Skirrow et Blaser, 2000). Les antibiotiques

habituellement utiliss sont les macrolides, les fluoroquinolones et plus rarement la

ttracycline. La principale complication dune infection Campylobacter est le

dveloppement dun syndrome de Guillain Barr (SGB) dans environ 1 cas dinfection

sur 2000. Le SGB se manifeste par une polyneuropathie dmylinisante svre

caractrise par une attaque auto-immune de la myline du systme nerveux

priphrique (Allos et al., 1998).

La dose infectieuse de C. jejuni est relativement faible chez lhumain. Dans

une tude sur des volontaires, la dose infectieuse fut estime 800 organismes (Black

et al., 1988) et Robinson rapporta sa propre exprience suite lingestion de 500

organismes (Robinson, 1981). Cependant, la relation dose-rponse fut rcemment mise

jour base sur deux pidmies de campylobactriose dues la consommation de lait

cru chez des enfants. Les auteurs de cette tude ont suggr que la probabilit de

dvelopper la maladie en ingurgitant de petites doses infectieuses tait de 36 fois

suprieures questime prcdemment (Teunis et al., 2005). La rpartition de

12

lincidence de la maladie selon lge dmontre une distribution unique avec des pics

dincidence chez les 0-4 ans et chez les 15-24 ans. Le premier pic sexplique

probablement par lincidence dune premire infection chez le jeune enfant ou

consquemment aux diagnostics plus frquents dus au fait que les parents ont tendance

consulter un mdecin plus rapidement lorsque leur enfant est malade. Le deuxime

pic sexplique cependant difficilement, mais plusieurs lattribuent au deuxime

sevrage (i.e. le dpart des jeunes de chez leurs parents) qui amnerait des dficiences

au niveau de lhygine alimentaire chez ce groupe dge (Friedman et al., 2000).

Dans la plupart des pays dvelopps, les cas de campylobactriose prsentent

une distribution saisonnire avec une incidence plus leve dans les mois les plus

chauds (Friedman et al., 2000), ce qui correspond au Canada avec lt et le dbut de

lautomne. Une tude rcente effectue au Manitoba a soulev des variations

gographiques du Campylobacter associant les plus hauts taux de campylobactriose

avec les rgions o la densit animale et lagriculture taient les plus fortes. Cette

diffrence entre les milieux urbains et ruraux tait encore plus vidente chez les 0 4

ans. Dans ce groupe d'ge, les garons vivant en milieu rural dveloppaient 7,3 fois

plus de campylobactriose que ceux vivant en milieu urbain, et cette diffrence tait

aussi observable chez les filles avec 6,95 fois plus de cas en milieu rural quen milieu

urbain (Green et a l, 2006). En Estrie, des variations gographiques ont galement t

observes lors dune tude cas-tmoins effectue en 2001-2002 o la MRC dAsbestos

prsentait un risque de campylobactriose 2,4 fois plus lev que dans le reste de

lEstrie (Michaud et a l . , 2004).

13

1.3 pidmiologie clinique et cologie du Campylobacter

Lpidmiologie du Campylobacter nest pas encore compltement comprise,

mais les sources majeures de contamination sont maintenant connues (FIGURE 1).

Cependant, la majorit des infections sont des cas sporadiques dont la source est

rarement identifie (Thomas et a l, 2006). Le Campylobacter fait partie de la flore

intestinale normale dune large diversit danimaux domestiques, dlevages et

sauvages. Parmi les animaux levs pour la consommation, on retrouve surtout du C.

jejuni chez les bovins, les poulets et les dindons, tandis que C. coli se retrouve en

majorit chez le porc. La viande peut devenir contamine par du Campylobacter suite

un contact fcal durant le processus dabattage. Le Campylobacter peut survivre aux

diffrentes procdures auxquelles les poulets sont soumis dans les abattoirs et usines

de transformation avant dtre mis en vente sur le march. Le taux de contamination

de la viande varie beaucoup selon les pays, mais en gnral le buf et le porc ont de

faibles taux comparativement au poulet qui affiche les plus hauts taux de

contamination (Engberg, 2006, Moore et al., 2005), possiblement d des techniques

dabattage et de refroidissement diffrentes des carcasses. Lutilisation deau en

grande quantit tout au long du processus dabatage des poulets contribuerait

galement la dispersion et la survie du Campylobacter (Jacobs-Reitsma, 2000).

14

HUMAIN HUMAIN

POULET POULET

BOVINS

EAU

ANIMAUX DE COMPAGNIEOISEAUX SAUVAGES

FIGURE 1. Modle de transmission du C. jejuni. Adaptation du modle propos en 1999 par Friedman et al. (Friedman et al., 2000), Lintensit de la flche corrle avec limportance de la transmission.

1.3.1 Les poulets. La colonisation intestinale des poulets par le Campylobacter

se fait assez tt dans la vie de lanimal et il demeure habituellement asymptomatique

jusqu son abattage (Gibbens et al., 2001), maintenant un niveau de Campylobacter

d au moins 1010 UFC par g de contenu intestinal (Shreeve et al., 2000). La

transmission horizontale du Campylobacter travers llevage se fait principalement

via la contamination de la nourriture et de leau par des matires fcales et par la

tendance des poulets adopter un comportement coprophage. Il a t rapport que

linsertion dun poulet contamin au Campylobacter dans un levage sans

15

Campylobacter menait la contamination de tous les poulets de llevage en 3 jours

(Shanket et al., 1990).

Le poulet est considr par la majorit de la communaut scientifique comme

tant le rservoir principal de Campylobacter. Sa manipulation et le fait de le

consommer mal cuit sont des facteurs de risque importants (Wilson et al., 2008). Une

tude effectue en 2008 en Angleterre estimait que le poulet tait la source de 56,5%

des cas humains de campylobactriose (Wilson et a l, 2008). La crise de la dioxine

survenue en 1999 en Belgique fut un excellent contexte pour lestimation du nombre

de campylobactrioses attribuable au poulet. En effet, lors de cette crise, le

gouvernement de Belgique ordonna larrt de la vente de poulet sur son territoire et la

destruction de tous les produits contenant du poulet. Les autorits de sant publique

constatrent une diminution de 40% des cas de campylobactriose et les auteurs de

ltude attriburent donc cette proportion de cas au poulet (Vellinga et Van Loock,

2002). Au Danemark, les autorits ont instaur un vaste plan de contrle du

Campylobacter dans lindustrie du poulet. Suite des diminutions importantes du

Campylobacter dans les levages de poulet et au retrait de la vente des poulets frais

contamins, la diminution des cas de campylobactriose humaine ne fut que de 12 %

(Rosenquist et al., 2009). Ltude cas-tmoins estrienne de 2000-2001 avait dmontr

que seulement 28% des cas explicables par leur modle taient associs la

consommation de poulet (Michaud et al., 2004).

1.3.2 Les bovins. Le bovin est galement un grand rservoir naturel du

Campylobacter. Plusieurs auteurs ont dmontr que le tractus intestinal des bovins

pouvait tre colonis par une varit despces de Campylobacter, principalement C.

16

jejuni, C. fetus, C. hyointestinalis et C. lanienae (Atabay et Cory, 1998, Guevremont et

al., 2008, Inglis et al., 2006). Les bovins sont habituellement des porteurs

asymptomatiques, cependant certaines espces peuvent tre pathognes. C. fetus

subs. fetus est reconnu pour causer des avortements chez les vaches et C. fetus subsp.

veneralis est responsable dinfertilit chez les taureaux (Atabay et Cory, 1998). Les

autres espces ont dj t relies des entrites chez les veaux et quelques cas de

mammites C. jejuni ont dj t rapports (Gudmundson et Chirino-Trejo, 1993). Le

lait cru contamin est reconnu comme une source de campylobactriose humaine et est

lune des rares sources de contamination relies des pidmies. La contamination du

lait cru se fait habituellement par des matires fcales bovines, mais une

contamination directe de bactries dans le lait lors dune mammite C. jejuni a dj

t rapporte (Orr et al., 1995). Plusieurs pidmies bien documentes sont rapportes

dans la littrature (Blaser et al., 1983, Evans et al., 1996, Finch et Blake, 1985,

Komblatt et al., 1985; Wood et al., 1992). La plus grande pidmie de

campylobactriose documente ce jour impliqua 2500 enfants infects par du lait

lcole au Royaume-Uni en 1979 (Jones et al., 1981). En Estrie, les donnes les plus

rcentes ont dmontr que 18% des cas de campylobactriose pouvaient tre expliqus

par la consommation de lait cru (Michaud et al., 2004). Cependant, il a t avanc que

la consommation frquente de lait cru pouvait amener une certaine immunit contre

Campylobacter (Friedman et al., 2000).

1.3.3 Les oiseaux sauvages. Les oiseaux sauvages (golands, canards, oie,

bemaches, moineaux, etc.) sont reconnus par plusieurs tudes comme un rservoir de

Campylobacter (Kinzelman et al., 2008, Quessy et Messier, 1992, Wahlstrom et al.,

2003). ma connaissance, des cas de contamination par contact direct entre un oiseau

17

sauvage et un humain nont jamais t rapports. Limplication des oiseaux sauvages

se situe surtout au niveau de la contamination de leau et des plages par leurs

excrments qui contiennent du Campylobacter (Kinzelman et a i, 2008). Le goland

est notamment reconnu pour tre le rservoir principal du C. lari (Matsuda et a i,

2004, Wheelan et al., 1988).

1.3.4 Les animaux de compagnies. Les animaux de compagnie pour leur part

ont t associs comme facteur de risque de dvelopper une campylobactriose et ce

principalement chez les jeunes enfants (Salfield et Pugh, 1987, Tenkate et Stafford,

2001). Il est prouv que les chats et les chiens en sant peuvent tre des porteurs

asymptomatiques et quils sont les rservoirs principaux du C. upsaliensis (Chaban et

al., 2009, Moreno et al., 1993). Une moins bonne hygine et un contact plus troit que

normalement avec les animaux domestiques peuvent en partie expliquer le risque

accru de campylobactriose chez les jeunes enfants.

1.3.5 L eau. La contribution de leau comme cas dinfections sporadiques

varie beaucoup travers le monde, mais plusieurs tudes ont dmontr limportance

de ce mode de contamination via leau potable ou leau de baignade (Friedman et al.,

2000). Selon certains auteurs, leau pourrait tre le plus important rservoir de

Campylobacter, non seulement pour son potentiel dinfection chez lhumain, mais

aussi pour son potentiel de transmission de la bactrie pour les animaux dlevage, les

animaux et oiseaux sauvages et les animaux de compagnie (Miller et Mandrell, 2005).

Le Campylobacter a t isol dans une multitude de sources deau diffrentes, allant

des estuaires marins (Hernandez et a i, 1996) leau de rivire et leau potable (St-

Pierre et a i, 2009). Il a galement t dmontr que le Campylobacter peut survivre

18

dans les biofilms forms dans les tuyaux daqueducs (Lehtola et a l, 2006) et aussi

dans lenvironnement aquatique (Buswell et a l, 1998). Une tude effectue en Sude

a dmontr que le risque de campylobactrioses augmentait avec la longueur des

tuyaux desservant leau potable (Nygard et al., 2004). Il a galement t dmontr

quenviron 20% de leau potable produite tait perdue par des fuites le long du

systme de distribution. Durant des priodes de plus faibles pressions, ces points de

fuite peuvent devenir des portes dentre pour la contamination bactrienne. Le risque

de contamination croise augmente particulirement lorsque les tuyaux deau potable

sont adjacents aux tuyaux dgout, ce qui est rgulirement le cas pour des

considrations pratiques lors de la construction des rseaux.

Les principaux modes de contamination de leau environnementale sont : (i) la

contamination par les excrments des oiseaux sauvages (principalement les golands

et les oiseaux migrateurs), (ii) le lessivage des terres agricoles suite lpandage des

lisiers, (iii) les eaux uses provenant des fermes, sites dlevages et abattoirs et (iv) la

contamination par les systmes deau use des municipalits (Miller et Mandrell,

2005). Pour leau potable ou pour leau de baignade des plages publiques, aucun test

de dpistage nest prsentement disponible pour le Campylobacter. En fait, les

laboratoires de rfrences pour la qualit de leau se fient la prsence des coliformes

fcaux (principalement E. coli) pour certifier la qualit de leau de consommation et de

baignade (Centre d'expertise en analyse environnementale du Qubec, 2005). Nous

avons dmontr labsence de corrlation entre les coliformes fcaux et le

Campylobacter dans leau, tant au niveau qualitatif que quantitatif (St-Pierre et a l,

2009). galement, une tude conduite au Qubec a suggr que 35% des

gastroentrites seraient attribuables leau potable, malgr que les diffrents points de

19

production rpondaient aux nonnes (Payment et al., 1991). Il est donc ncessaire de

rvaluer les critres et les protocoles pour la surveillance de la qualit de leau de

consommation et de leau des fins rcratives. Plusieurs problmes se posent

cependant : le Campylobacter est un organisme fastidieux, aucun protocole de

dtection standardis nest disponible, tant par culture que par PCR en temps rel et un

dbat persiste toujours sur lexistence des colonies viables, mais non cultivables

(CVNC) et sur leur pouvoir infectieux.

1.4 La rsistance aux antibiotiques

Comme mentionn prcdemment, pour la majorit des cas, la

campylobactriose est une maladie que le systme immunitaire russit combattre

efficacement. Un traitement aux antibiotiques est donc habituellement rserv pour les

cas svres, les infections systmiques, les individus immunosupprims et les groupes

risque (Skirrow et Blaser, 2000). Cependant, lutilisation dun traitement aux

antibiotiques peut tre problmatique dans certains pays dus lmergence de la

rsistance. Depuis les annes 1990, la rsistance la ttracycline, aux

fluoroquinolones et un peu plus tard aux macrolides a clairement augment, tant dans

les pays en dveloppement que dans les pays industrialiss (Engberg et al., 2004,

Gaudreau et Gilbert, 1997, Gibrel et Taylor, 2006, Gupta et al., 2004).

Consquemment, la rsistance aux antibiotiques chez le Campylobacter acquis via

lalimentation est maintenant reconnue comme un problme mergeant en sant

publique (Engberg et al., 2004). La rsistance peut apparaitre durant le traitement dun

patient, mais il est bien reconnu que lutilisation des antibiotiques dans le milieu

20

vtrinaire contribue laugmentation des souches rsistantes infectant lhumain

(Lindmark, 2004).

1.4.1 Les fluoroquinolones. Les fluoroquinolones sont des agents actifs contre

la plupart des pathognes causant des entrites bactriennes (Nachamkin et al., 2000).

Les fluoroquinolones sont des molcules chimiquement modifies partir de lacide

nalidixique, une quinolone. Cette classe dantibiotiques cible deux enzymes

essentielles dans la rplication bactrienne : lADN gyrase (lADN topoisomrase de

type II) et lADN topoisomrase IV, inhibant la croissance bactrienne (Taylor et

Tracz, 2005). Ces deux enzymes sont emprisonns dans un complexe par les

fluoroquinolones, empchant la rplication de lADN et empoisonnant la cellule.

Lantibiotique le plus utilis dans cette classe est la ciprofloxacine. La rsistance une

fluoroquinolone ou lacide nalidixique procure habituellement une rsistance croise

aux autres fluoroquinolones (Trieber et Taylor, 2000).

La rsistance aux fluoroquinolones est principalement obtenue par une

mutation dans la squence dADN codant pour la sous-unit gyrA le lADN gyrase

(Drlica, 1999). Les mutations ponctuelles Thr-96, Asp-90 ou encore Ala-70 dans le

gne gyrA peuvent mener la rsistance. La mutation Thr-96 est la mutation la plus

frquente et est celle qui confre les plus hauts niveaux de rsistance (CMI > 16-64

pg/ml) (Taylor et Tracz, 2005). Un autre mcanisme de rsistance de la bactrie, mais

moins important pour la rsistance aux fluoroquinolones, est Feflux de lantibiotique

hors de la cellule via une pompe. Lopron cmeABC code pour une pompe deflux

ciblant plusieurs antibiotiques dont les fluoroquinolones. Il a t dmontr que le fait

de perturber le fonctionnement de la pompe CmeABC augmentait laccumulation

21

intracellulaire de ciprofloxacine (Lin et a i, 2002). La ciprofloxacine est lun des

antibiotiques les plus utilis dans le monde, tant en mdecine humaine quen mdecine

vtrinaire pour des raisons mdicales, mais aussi comme facteur de croissance (Acar

et Goldstein, 1997). Laugmentation des niveaux de rsistance aux fluoroquinolones

concide avec le dbut de son utilisation dans le monde animal, particulirement pour

llevage du poulet (Smith et al., 1999). Il a t dmontr chez des poulets porteurs de

Campylobacter sensible aux fluoroquinolones que des bactries rsistantes pouvaient

tre isoles seulement 24h aprs ladministration de lantibiotique (McDermott et a i,

2002).

1.4.2 Les macrolides. Les macrolides, dont fait partie lrythromycine, sont

considrs comme des antibiotiques de premier choix contre les entrites

Campylobacter. Lrythromycine est un agent bactriostatique qui inhibe la synthse

des protines. Il lie de faon rversible la sous-unit 50S du ribosome bactrien 70S et

cause la dissociation du peptidyl-tRNA, qui arrte le cycle dlongation de la synthse

protique ltape de transpeptidation (Nakajima, 1999; Taylor et Tracz, 2005;

Trieber et Taylor, 2000). La rsistance du Campylobacter aux macrolides est due la

modification de la cible des macrolides sur le ribosome. La mutation ponctuelle

A2075G dans les trois copies du gne codant pour lARN ribosomal 23S est

responsable des hauts niveaux (CMI > 128 pg/ml) de rsistance aux macrolides (Payot

et al., 2006). Il a t observ dans certaines souches que les trois copies nont pas

ncessairement besoin de possder la mutation pour confrer la rsistance la souche

(Gibreel et al., 2005). Une autre mutation, moins frquente, a t rapporte pour des

taux plus faibles de rsistance (A2074T) (Vacher et a i, 2005). Il a cependant t

dmontr que cette mutation ntait pas porte sur les trois copies du gne 23 S et

22

quelle tait moins stable aprs plusieurs passages en culture que la mutation A2075G

(Gibreel et a l, 2005). La pompe defflux CmeABC jouerait aussi un rle non

seulement dans la rsistance intrinsque aux macrolides de la bactrie, mais aussi dans

lacquisition de faible niveau de rsistance (Payot et a l, 2004). La rsistance

Prythromycine chez les isolats cliniques nest pas encore un problme majeur en

Amrique du Nord, mais lapparition de taux de plus en plus levs chez les humains

et les animaux en Europe et en Asie est proccupante (Pezzotti et a l, 2003, Pigrau et

a l, 1997). Lutilisation de lrythromycine comme facteur de croissance dans

llevage de poulet et comme outil de prvention thrapeutique dans plusieurs autres

types dlevages au Canada a galement de quoi inquiter (Health Canada, 2002).

1.4.3 Les ttracyclines. Les ttracyclines sont un groupe dantibiotiques

large spectre et ont t utilises contre un grand nombre de pathognes humains. La

ttracycline est un inhibiteur de la synthse protique qui agit au niveau du ribosome

bactrien. Une fois transporte lintrieur de la bactrie par transport actif, la

ttracycline se lie de faon rversible la sous-unit 30S du ribosome bactrien 70S et

prvient lassociation de Paminoacyl-tRNA avec le site A du ribosome. Ceci entrane

larrt de ltape d longation de la synthse protique (Taylor et Tracz, 2005). La

rsistance la ttracycline est module par plusieurs gnes tet, transfrables entre

genres bactriens, qui agissent sur leflux de lantibiotique et sur la protection

ribosomale. Pour C. jejuni, la rsistance est principalement module par le gne tetO

qui est port sur un plasmide transmissible. La protine TetO protge le ribosome de

laction de lantibiotique en dplaant la ttracycline de son site actif sur le ribosome

(Connell et a l, 2002, Taylor et Tracz, 2005). La trs grande prvalence de la

rsistance la ttracycline est galement due son utilisation dans le milieu animal

23

comme facteur de croissance et comme outil thrapeutique pour le contrle des

infections animales (McEwen et Fedorka-Cray, 2002). Cependant, le fait que la

rsistance la ttracycline soit porte sur un plasmide augmente sa distribution, non

seulement travers les souches de Campylobacter, mais aussi travers des diffrentes

espces et genres bactriens (Taylor et Tracz, 2005).

1.5 Lpidmiologie molculaire et les diffrentes mthodes

Lexpression pidmiologie molculaire est apparue dans la littrature

scientifique au dbut des annes 70. Suivant lpidmiologie traditionnelle, puis

lpidmiologie clinique, lpidmiologie molculaire ajoute un nouveau niveau

dinformation, intgrant des donnes dinvestigations molculaires et cellulaires aux

donnes traditionnelles de prvalence, dincidence et de facteur de risque (Kehoe et

al., 2010). Lpidmiologie molculaire est un outil essentiel pour lanalyse des

bactries pathognes obtenues durant linvestigation dclosions ou dpidmies ou

encore pour le suivi de population bactrienne. La question ultime en typage

molculaire est la suivante : Est-ce que ces deux isolats bactriens sont identiques ou

diffrents? . Par contre, une dfinition plus rigoureuse serait la suivante : Utilisant

une mthode molculaire bien dfinie, est-ce que les gnotypes de ces deux isolats

sont suffisamment similaires pour conclure quils reprsentent la mme souche, ou

suffisamment diffrents pour quils reprsentent deux souches diffrentes ? (Clinical

and laboratory standards institute, 2007).

Les techniques dpidmiologie molculaire sont donc bases sur la variation

gntique des isolats bactriens. Les principales sources de variations gntiques sont

24

les mutations (insertions et dltions) et la recombinaison. Une large varit de

technique de typage molculaire a t dveloppe au fil des ans pour rpondre ces

questions. Cependant, aucune technique de typage molculaire ne peut dtecter toutes

les variations gntiques entre deux bactries, mis part le squenage complet des

gnomes bactriens. Les techniques prsentes ici sont les plus utilises dans

lpidmiologie molculaire du Campylobacter.

1.5.1 EGCP. LEGCP (ou pulsed field gel electrophoresis [PFGE] en anglais)

est la mthode la plus rpandue et la plus utilise pour le typage molculaire des

bactries pathognes (Tenover et al., 1997). Cette technique danalyse du gnome

entier est base sur la sparation dun nombre limit de fragments (

25

llectrophorse en champ puis. Les profils de restriction obtenus sont appels

gnotypes, pulsovars ou encore macrorestriction profile (Wassenaar et Newell, 2000).

Cette mthode est trs largement utilise, non seulement pour le

Campylobacter, mais galement pour le Escherichia coli 0157 :H7, Listeria

monocytogenes, Yersinia pestis, les Salmonelles et les Shigelles via le rseau

PULSENET. (Center for disease control and prevention, 2009). Cest une mthode qui

offre un excellent pouvoir de discrimination et qui peut dtecter jusqu 90% des

rarrangements chromosomiques obtenus par recombinaison lorsquils altrent la taille

des fragments de plus de 5%. Cette mthode est cependant beaucoup moins sensible

aux mutations ponctuelles, qui reprsentent environ 0,01 0,05% des changements de

profils gnotypiques par EGCP (Clinical and laboratory standards institute, 2007). De

plus, cette mthode est fastidieuse, variable entre laboratoires, trs dispendieuse en

quipement de dpart et environ 5% des souches peuvent tre non-typables, dpendant

des espces (Spratt, 1999).

26

Suspension bactrienne

^ Suspension mlange avec agarose

n n n n n Fabrication des carottes d agarose^ Lyse cellulaire et lavages

| | | | | ADN gnomique dans les carottes d agarose

^ Digestion enzymatique

lectrophorse en champ puis

Coloration et prise de photo du gel

Analyse des donnes

FIGURE 2. Schmatisation de la mthode d EGCP. Inspir du schma du rseau PulseNet. (Center for disease control and prevention, 2009).

1.5.2 AFLP. LAFLP est une technique utilise tant pour les tudes

phylogntiques que pour le typage molculaire. Cette mthode est base sur la

digestion de lADN gnomique complet de la bactrie avec deux enzymes de

restriction de frquence de coupure de lADN diffrente (habituellement un enzyme

reconnaissant un site de 4 paires de base et un autre de 6 paires de base) (Wassenaar et

Newell, 2000). Le protocole complet est illustr dans la Figure 3. Des adaptateurs

oligonuclotidiques spcifiques sont par la suite utiliss pour lier les fragments digrs

et restaurer des bouts francs aux fragments dADN digrs. Ces adaptateurs sont

construits de manire ne pas restaurer les sites de restriction, permettant ltape de

digestion et de ligation des adaptateurs dans la mme raction. Une premire

amplification par PCR (appele pr-amplification) est faite avec des amorces couvrant

ladaptateur et le site de restriction, de manire ce que seuls des fragments flanqus

des deux sites de restrictions soient amplifis. Une seconde amplification (appele

amplification finale) est faite cette fois-ci avec une extension dun nuclotide au bout

3 des deux amorces. Cette amplification se veut donc slective sur le nombre de

fragments amplifis. galement, une des deux amorces est habituellement fluorescente

pour permettre la dtection des fragments dans un squenceur automatique, ce qui

amliore grandement la qualit des rsultats comparativement la migration des

profils sur un gel de polyacrylamide (Klena et Konkel, 2005). Cette technique permet

donc la sparation dune cinquantaine de fragments, un nuclotide prs, entre 50 et

500 paires de base (Duim et al., 1999). Cette mthode a pour principal avantage dtre

aussi discriminante que le PFGE, dtre plus rapide, moins coteuse et moins

fastidieuse et davoir un processus automatis danalyse des rsultats (Islam et al.,

2009, Schouls el al., 2003).

28

5 -----------------------AAGCTT3 -----------------------TTCGAA

Digestion enzymatique

GCGCCGCG

35

H ind lllH hal

AGCTTA

Ligation des adaptateurs

GCGC

A daptateur H ind lll A daptateur H hal

Pr-amplification

Amplification finale

G CTTCGAA

GCTTCGAA

Amorce H ind lll Amorce H hal

GCGCGC

6- F AM - Amorce H in d lll A - Amorce H hal

YAnalyse des donnes

FIGURE 3. Schmatisation de la mthode dAFLP. Inspir du protocole d Applied Biosystems (Applied biosystems, 2005).

1.5.3 Typage du flagelle. Le locus des gnes du flagelle de C. jejuni contient

deux gnes (JlaA et flaB) qui sont en tandem et spars par environ 170 nuclotides.

D au fait que ces gnes possdent des rgions hautement conserves et dautres plus

variables, ces gnes sont appropris pour le typage molculaire (Meinersmann et a l,

29

1997). Cette variabilit, particulirement pour le gne flaA, a t utilise pour dautres

mthodes de typage molculaire bases sur des profils de digestion enzymatique, tel le

PCR-RFLP (Nachamkin et a l, 1993). Cependant, les mthodes de typages bases sur

le squenage ont plusieurs avantages comparativement aux mthodes bases sur

lanalyse de fragments de digestion enzymatique, dont labsence de variabilit inter

laboratoire et dambigiiit des rsultats obtenus. Une base de donnes internationale a

dailleurs t cre pour le partage, lanalyse et la comparaison des profils de

squenage (http://pubmlst.org/campylobacter/). La portion squence du gne flaA

correspond la rgion SVR du gne (approximativement entre les nuclotides 450

600 du gne). Lanalyse des squences de la rgion SVR permet de crer des arbres

phylogntiques ayant de meilleurs taux de discrimination que ceux produits avec la

squence complte du gne, en plus dtre plus simples produire, car une seule paire

damorces est ncessaire pour lamplification de ce fragment (Meinersmann et al.,

1997).

1.5.4 MLST. La premire technique utilise pour ltude gntique des

populations bactriennes fut le MLEE. Cette technique, base sur la dtection de

variations dans plusieurs loci, permettait de mesurer la variabilit lintrieur de ces

diffrents loci et dtablir le degr de diversit gntique dune population bactrienne

afin didentifier des regroupements clonaux de bactries (Dingle et Maiden, 2005). Le

mme principe fut appliqu pour le MLST, mais au lieu danalyser la mobilit

lectrophortique denzymes du mtabolisme bactrien, la comparaison de squences

dADN de gnes mtaboliques fut linnovation de cette mthode. Par lutilisation de

squences, le MLST venait surmonter les lacunes du MLEE, soit la difficult de

comparer les donnes entre les laboratoires et le fait que seuls les changements

http://pubmlst.org/campylobacter/

30

affectant les profils de migration taient dtects (Maiden et a l, 1998). De ce fait, le

MLST devint la mthode de rfrence pour lanalyse des populations gntiques

bactriennes (Dingle et al., 2002). Pour C. jejuni, un systme MLST fut dvelopp au

dbut des annes 2000, bas sur le squenage denviron 500 paires de base de 7 gnes

mtaboliques de la bactrie. Suite au squenage des gnes, les squences sont

compares sur une base de donnes internationale (http://pubmlst.org/campylobacter/)

afin de leur attribuer un numro dallle. La combinaison des 7 numros dallle (un

pour chaque gne squenc) forme le profil alllique ou sequence type (ST). Par la

suite, les diffrents ST sont compars entre eux et regroups en complexes clonaux

(CC). Chaque complexe clonal est form disolats partageant 4 allles ou plus avec le

profil alllique du gnotype central. Le gnotype central est lanctre commun de qui

tous les membres du complexe clonal sont issus. Les avantages de cette mthode sont

le haut pouvoir de discrimination, sa reproductibilit, labsence dambigit

dinterprtation des rsultats, la facilit de comparaison des donnes entre laboratoires

et dchange de rsultats via internet (Dingle et al., 2001). Le MLST a permis

d observer que C. jejuni tait gntiquement trs diversifi et avait une population

faiblement clonale, notamment d de nombreux changes gntiques intra et inter

espce (Dingle et a l, 2001, Djordjevic et al., 2007, Meinersmann et al., 1997). Le

MLST est la seule mthode de typage molculaire dont certains gnotypes (complexes

clonaux) ont t relis des rgions gographiques particulires (Duim et al., 2003,

McTavish et a l, 2008) ou encore des niches cologiques particulires, tels les

oiseaux sauvages, le sable de plage, leau, les poulets, les porcs, les bovins ou les

moutons (Carter et a l, 2009, Colles et al., 2003, Dingle et a l, 2001, Manning et a l,

2003, McTavish et a l, 2009).

http://pubmlst.org/campylobacter/

31

1.6 Objectifs de recherche

Mes objectifs de recherche taient les suivants :

1) tudier les niveaux et la distribution de la rsistance aux antibiotiques des

isolats de C. jejuni obtenus des diffrentes niches cologiques afin de

dterminer les niveaux de rsistances des isolats de PEstrie et de

dterminer la provenance des isolats humains rsistants.

2) Vrifier si les niveaux de rsistance aux antibiotiques lintrieur dune

niche cologique en particulier sont attribuables des gnotypes bien

prcis.

3) Dterminer si les rsultats des diffrentes mthodes de typage molculaire

pour le Campylobacter sont comparables.

4) Dvelopper un systme plus performant pour effectuer le MLST.

5) Dterminer si la contamination de leau en Estrie par du Campylobacter est

principalement due aux levages de bovins ou une autre source et si leau

est une source significative de campylobactrioses.

6) Vrifier lhypothse selon laquelle les sources dinfection Campylobacter

seraient diffrentes en milieu rural quen milieu urbain.

7) Analyser les diffrents gnotypes des isolats de Campylobacter obtenus des

diffrentes niches cologiques et comparer la variabilit des gnotypes en

circulation chez lhumain.

32

CHAPITRE 1

AVANT-PROPOS DE LARTICLE

Titre

Comparison of antimicrobial resistance of Campylobacter jejuni isolated from

humans, chickens, raw milk and environmental water in Quebec

Auteurs

Simon Lvesque, Eric Frost et Sophie Michaud.

tat de larticle ce iour

Publi dans la revue Journal of Food Protection, Vol. 70, No. 3, 2007, Pages

729-735.

Le formulaire Autorisation dintgration dun article crit en collaboration un

mmoire ou une thse a t sign par chaque co-auteure ou co-auteur conformment

la Directive relative au dpt des essais, des mmoires et des thses de

lUniversit de Sherbrooke.

33

RSUME DE LARTICLE

Cette tude avait pour but la comparaison des profils de rsistance

lrythromycine, la ciprofloxacine et la ttracycline parmi 384 isolats de

Campylobacter jejuni isols chez lhumain (245), de poulets frais entiers achets dans

les piceries (56), du lait cru (33) et de leau environnementale (41), obtenus entre

2000 et 2003 au Qubec. La rsistance la ciprofloxacine fut significativement plus

frquente pour les isolats humains acquis ltranger par rapport ceux acquis

localement (50% versus 5,9% ; p

34

transmission de ces isolats lhumain. Des tudes additionnelles sont ncessaires pour

suivre la tendance des taux de rsistances aux antibiotiques des isolats de C. jejuni

obtenus de la nourriture, de lenvironnement et chez les humains, aussi bien que le

suivi de lutilisation des antibiotiques dans le milieu vtrinaire.

Contribution de ltudiant

Jai contribu totalement lobtention et lanalyse de tous les rsultats dcrits

dans larticle. Jai galement crit entirement la premire bauche du manuscrit et

particip la correction avant publication.

35

COMPARISON OF ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF

CAMPYLOBACTER JEJUNI ISOLATED FROM HUMANS,

CHICKENS, RAW MILK AND ENVIRONMENTAL WATER IN

QUEBEC

Simon Lvesque, Eric Frost, Ph.D., Sophie Michaud, M.D., M.P.H.

Department of Microbiology and Infectious Diseases, Facult de Mdecine de

lUniversit de Sherbrooke, Qubec, Canada.

Corresponding author: Sophie Michaud, M.D., M.P.H., C.S.P.Q.,

F.R.C.P.C.

Department of Microbiology and Infectious

Diseases

Facult de Mdecine de l'Universit de

Sherbrooke

3001,12e avenue Nord

Sherbrooke, Qubec J1H5N4

Phone: (819) 564-5321

Fax:(819)564-5392

E-mail:

Running head: Antimicrobial resistance of Campylobacter jejuni

Key words: Campylobacter, antimicrobial resistance, humans, chickens, raw

milk, water, quinolones, macrolides, tetracycline.

W ord count (text): 3109

mailto:Sophie.Michaud@USherbrooke.ca

36

ABSTRACT

This study compares the occurrence of antimicrobial resistance to

erythromycin, ciprofloxacin and tetracycline among 384 Campylobacter jejuni isolates

from humans (245), fresh whole retail chickens (56), raw milk (33), and

environmental water (41), collected between 2000 and 2003 in Qubec, Canada.

Resistance to ciprofloxacin was significantly more frequent in human isolates acquired

abroad than in those acquired locally (50% versus 5.9%; p

37

Campylobacter jejuni is the leading reported cause of bacterial gastroenteritis

in developed countries (3), but knowledge of the epidemiology of this organism is still

developing. Most clinical cases appear as isolated, sporadic infections for which the

source is rarely apparent. In addition to gastroenteritis, C. jejuni can cause post-

infectious manifestations, including Guillain-Barr syndrome, an acute, immune-

mediated disorder considered to be the most serious secondary complication (46).

Campylobacter colonizes a wide range of hosts, including domestic animals

and wild birds, and thus a substantial burden of Campylobacter is excreted via animal

fecal material (3). Transmission to humans occurs by ingestion of contaminated foods

of animal origin or contaminated water, and by direct contact with infected animals. In

general, the occurrence of human Campylobacter gastroenteritis has been largely

attributed to the consumption of contaminated food animal products, especially

poultry, because of the high prevalence of Campylobacter in these animals (2). A

growing body of evidence, however, suggests that other vehicles such as

environmental water, and unpasteurized milk may be important sources of these

organisms, but the relative contributions of these and other potential sources, such as

domestic pets, and wild birds to human infection are currently not known (42).

Most cases of enteritis are self-limited and do not require treatment;

antimicrobial therapy is indicated in case of severe and prolonged gastroenteritis,

septicaemia or other invasive manifestations, as well as for immune-suppressed

patients. Macrolides and fluoroquinolones are considered the first- and second-line

drugs for treatment of complicated Campylobacter infections; tetracycline is used as an

alternative agent. However, since the 1990s, resistance to tetracycline,

fluoroquinolones and, to a lesser extent, macrolides, has clearly increased both in

developed and developing countries (11, 17, 21, 25), and antimicrobial resistance in

Campylobacter from food animals is now recognized as an emerging public health

problem (11), Resistance may arise during treatment o f humans, but it is also believed

that the use o f these antibiotics in the veterinary field contributes to increased

resistance among strains infecting humans (37). As Campylobacter may be transferred

from animals to humans via food or water, the emergence of multidrug resistance to

fluoroquinolones and macrolides in Campylobacter strains from the food chain has

raised concerns that the treatment o f human infections will be compromised.

Comparison of the distribution of antimicrobial resistance of Campylobacter

isolates from different sources could help understand the source of transmission of

antimicrobial-resistant Campylobacter to humans. C jejuni antimicrobial resistance

profiles have rarely been studied in environmental water (37) or in cattle (1, 4, 13, 35,

52, 57), and relatively few data exist on the antimicrobial resistance of human (16, 17,

22, 28) and chicken (29, 34, 35) isolates in Canada. This study compares the

occurrence of antimicrobial resistance to erythromycin, ciprofloxacin and tetracycline

among 384 C. jejuni isolates from humans (254), fresh whole retail chickens (56), raw

milk (33), and environmental water (41), collected between 2000 and 2003 in Qubec.

39

MATERIALS AND METHODS

Human isolates originated from fecal samples of clinical cases of diarrhoea

submitted to the Eastern Townships hospital microbiology laboratories between 2000

and 2003 (153 in 2000-2001, 32 in 2002, and 69 in 2003). For subjects with recurrent

infections, only the first C. jejuni isolate was included in the study. Human isolates

were considered to be acquired internationally if the subject had travelled abroad

during the entire 10-day period before the onset of symptoms. Isolates for which this

information was not available were excluded from the study. The 18 international

isolates were acquired in France (3), Mexico (2), Peru (2), Spain (1), Tunisia (1),

Eastern Europe (1), Dominican Republic (1), Chad (1), Bolivia (1), Indonesia (1),

Togo or France or Holland (1), Mexico or Africa (1), Bolivia or Argentina (1) and one

isolate was from an unspecified origin.

The raw milk isolates were cultured in Qubec province in 2000-2001; they

were graciously provided to us by the Ministre de l'Agriculture, des Pcheries et de

l'Alimentation du Qubec (MAPAQ). The chicken isolates were cultured from fresh

whole retail chickens purchased in grocery stores in the Eastern Townships (37

isolates in 2000-2001 and 19 in 2003) (42, 43). The water isolates were obtained from

river and tributary water samples collected in the Eastern Townships between May 13

and August 12, 2003 (36). In brief, each sample represented about 500 ml of water

collected in a sterile Nalgene bottle that was transported on ice, held at 4C and tested

within 24 h. The water was filtered through a sterile 0.45 pm membrane filter; some

samples required pre-filtration with a 1.5 pm membrane. The filters were transferred

into a Whirl-Pak bag containing 100 ml of Park-Sanders enrichment broth with 0.5 ml

of Supplement A (0.2% vancomycin and 0.2% trimethoprim lactate) and 5 ml of

Supplement B (0.064% sodium cefoperazone in brucella broth) (9), incubated for 4 h

at 37C in a microaerobic atmosphere, and then at 42C for an additional 44 h. One ml

of the suspension was transferred into a second Park-Sanders broth (10 ml) and

incubated at 42C for 24 h in a microaerobic atmosphere. Then, 100 pi of the final

enrichment broth was plated on Karmali agar and incubated in a microaerobic

atmosphere at 42C for 48 h. Plates that were negative for Campylobacter at that time

were re-incubated for an additional 24 h. Isolates were identified to the species level

by routine phenotyping methods (45), and by two PCR methods (9, 14). Only C. jejuni

isolates were included in the study. The hippurate gene was detected by PCR in all

included isolates; hippurate-negative Campylobacter in which hippuricase gene could

be detected by polymerase chain reaction were identified as C. jejuni (58).

Agar dilution antimicrobial susceptibility tests were performed with

ciprofloxacin (INC Biomedicals, inc., Aurora, Oh), erythromycin and tetracycline

(Sigma Chemical CO., St. Louis, Mo), according to CLSI standards (49). The

concentrations of the antibiotics tested were 0.06-256 pg/ml, and a control plate

without antibiotic was inoculated at the beginning and at the end of the procedure.

Inocula were prepared from overnight growth on blood agar plates by suspending each

culture in Mueller-Hinton broth (Quelab laboratories inc., Montreal, Qc) at a density

adjusted to a 0.5 McFarland turbidity standard. A final inoculum of about 104 CFU

was delivered with a 1-mm Cathra replicator onto Mueller-Hinton agar plates

supplemented with 5% defibrinated sheep blood (Oxoid inc., Nepean, On). Plates were

incubated in a microaerobic atmosphere at 42C for 24 h. The breakpoints used for

Campylobacter resistance were: ciprofloxacin, > 4 mg/L; erythromycin, > 8 mg/L; and

tetracycline, > 16 mg/L (18). Of note, although the CLSI recently proposed a

breakpoint of 32 mg/L for erythromycin (7) we chose to use the prior commonly-used

41

breakpoint of 8 mg/L for erythromycin to compare our results with previous studies

more easily.

C. jejuni ATCC 33560, one local C. jejuni isolate (001B-34)and one local C.

coli isolate (001 A-18) were used as control strains (26). The 001 A-18 isolate was

resistant tetracycline and erythromycin and (MICs of 128 mg/L and >256 mg/L,

respectively), and susceptible to ciprofloxacin (MIC of 0.12 mg/L). The 001B-34

isolate was resistant to ciprofloxacin, erythromycin and tetracycline, with MICs o f 64

mg/L, >256 mg/L and >256 mg/L, respectively.

Data were analyzed with Statistix for Windows version 7.1 (Analytical

Software, Tallahassee, FI.) using Chi-square and Fishers exact two-tailed tests and a

significance level of 5%.

42

RESULTS

Among the 384 isolates tested, 25 (6.5%) were resistant to ciprofloxacin, 16

(4.2%) were resistant to erythromycin, and 155 (40.4%) were resistant to tetracycline

(Figure 1). Twenty (5.2%) isolates, all from humans or chickens, were resistant to two

of the three antibiotics: 10 were resistant to both ciprofloxacin and tetracycline, and 10

were resistant to both erythromycin and tetracycline. No human isolate was resistant to

both ciprofloxacin and erythromycin, but one chicken isolate was resistant to all three

antimicrobial agents.

43

Ciprofloxacin.

0,06 0,12 0,25 0,5 1

1A

Human local [= 3 Human international Chicken esa Raw milk

Water

4 8 16MIC values

32 64 128 256 >256

Erythromycin80-1

70-

60-

$ 50-

40-*o* 30-

20-

10-

64 128 256 >2560,06 0,12 0,25 0,5 2 8 16 324MIC values

Tetracycline80- .

70-

60-

.8 40-'o

IQ -

128 256 >256MIC values

FIGURE 1. MIC histograms of three antimicrobials for 384 C. jejuni isolates. Thevertical lines represent the resistance breakpoint for each antimicrobial.

44

Resistance to ciprofloxacin was significantly more frequent in human isolates

acquired abroad than in those acquired locally (50% versus 5.9%; p256 03-1MIC (ragftei) t 1 1 1 1MIC (ragfliter) 2 2 2 >256 2

Utlracyeliie rsistait isoMesf*) m (3) 4531(107) 44.4 (8) 58.91(33) 9 .11(3)MIC range (agU er) 0.06-64 0.12->256 0.25->256 O.I2->256 0.12-128MIC (rag/Uler) 0.25 0.5 0.5 64 025MIC (rag/Uler) 0.5 256 256 256 4

* MIC for 50% of strafes tested. MIC for 9 01 of strains tested.

45

Between 2000-2001 and 2002-2003, the ciprofloxacin resistance rate remained

stable among chicken (2.7% versus 0%) and human isolates acquired locally (5.0%

versus 6.1%). Erythromycin resistance rates went from 10.8% in 2000-2001 to 26.3%

in 2003 among chicken isolates (p= 0.27). The prevalence of erythromycin resistance

remained stable in human isolates acquired locally (2.8% in 2000-2001 versus 3.0% in

2002-2003). Finally, the rates of tetracycline resistance went from 36.2% in 2000-

2001 to 42.4% in 2002-2003 (p=0.18) among human isolates acquired locally, and

from 45.9% in 2000-2001 to 84.2% in 2003 among chicken isolates (p=0.57).

Four human and four chicken erythromycin-resistant isolates from our study

have been further characterized (20), and all showed an A-+G transition at position

2059 of the 23 S rRNA gene, except for one human isolate which exhibited an A-+G

transition at position 2058.

A subset of isolates from the present study, 149 locally-acquired human

isolates and 37 chicken isolates, were typed by PFGE in a previous study, in which we

found that 46% of chicken isolates had genotypes similar to those of 22% human

isolates (43). Among the 60 human and 17 chicken tetracycline-resistant isolates

analyzed, 42 isolates were distributed among 21 clusters (Dice coefficient > 90%)

containing 70 isolates. Of the 4 human and the 4 chicken erythromycin-resistant

isolates tested, 5 isolates were distributed among 3 clusters containing 14 isolates.

Finally, among the 7 ciprofloxacin-resistant isolates tested (one from chicken and 6

from humans), 2 isolates belonged to 2 clusters containing a total o f 7 isolates. The

remaining isolates had unique PFGE profiles.

46

DISCUSSION

It is estimated that there are more than 2,000,000 infections, 13,000

hospitalizations and 100 deaths caused by Campylobacter each year in the United

States (41), and that 18% of these infections are caused by strains resistant to at least

one antimicrobial agent (5). NARMS (National Antimicrobial Resistance Monitoring

System) has documented an increased proportion of human infections with

ciprofloxacin-resistant C. jejuni between 1989 and 2003 (48): no isolates resistant to

ciprofloxacin were identified in 1989-1990, 12% were resistant in 1997, 21% in 2002,

and 17% in 2003. Resistance to tetracycline was already 42% in 1989-1990 and has

slightly decreased to 38% in 2003. Resistance to erythromycin has remained low at

3% or less.

In Qubec, the resistance rate to ciprofloxacin for C. jejuni human clinical

isolates was 0% in 1985-1986, 3.5% in 1992-1993, and 12.7% in 1995-1997 (17).

During the same period, resistance to tetracycline went from 19.1% in 1985-1986,

40.7% in 1992-1993 and 55.7% in 1995-1997, and no erythromycin-resistant isolates

were reported. Another study of 23 human C. jejuni isolates collected in 1998-1999 in

Qubec showed resistance rates of 9% for ciprofloxacin, 9% for erythromycin and

39% for tetracycline (24); of note, no distinction was made between locally- and

internationally-acquired isolates in these two studies. Then, between 1999 and 2001,

Gaudreau and Gilbert reported that 9%, 6% and 58% of 109 locally-acquired C. jejuni

human clinical isolates were resistant to ciprofloxacin, erythromycin, and tetracycline,

respectively (16). In our study, we report lower rates of resistance to ciprofloxacin

(5.9%), erythromycin (3.0%) and tetracycline (45.3%), suggesting that from 2000 to

2003 in Qubec, antimicrobial resistance has remained stable among locally-acquired

C. jejuni human clinical isolates, and might even have decreased.

47

In our study, 50% of human isolates acquired abroad were resistant to

ciprofloxacin; this should be taken into account when empirically treating returning

travellers. Several other studies have reported high ciprofloxacin resistance rate among

C. jejuni isolates acquired internationally (6, 12, 16, 27, 33, 53, 60) among patients

returning from Southern Asia (84.6%) and Southern Europe (65.1%), and more

particularly from Thailand (81.3%), India (71.1%), and Spain (62.5%) (12, 31).

Macrolides are the antimicrobials of choice in this setting, but high erythromycin

resistance rates have also been reported among human Campylobacter spp. isolates

from India (15.8%) and Spain (10.0%) (31).

Fluoroquinolone-resistant organisms have been reported to be associated with

more severe disease, including diarrhoea of 2 to 5 days longer than that of persons

with ciprofloxacin-susceptible infection, even in the absence of ciprofloxacin

treatment and independently o f foreign travel (12, 25, 44, 50, 59, 61). These results

suggest that the virulence of resistant organisms may differ from that of susceptible

strains. This hypothesis is further supported by the recent finding of enhanced in vivo

fitness of fluoroquinolone-resistant C. jejuni in chickens, in the absence of antibiotic

selection pressure (38).

Some investigators suggest that resistance in C. jejuni and C. coli is driven by

use of antibiotics for treating human infections rather than by veterinary use. Although

induction of macrolide resistance during treatment has been reported infrequently (15),

induction of fluoroquinolone resistance during treatment has been reported in as many

as 28% of patients infected with a susceptible strain (11, 47). However, the treated

patient is unlikely to be a source of quinolone-resistant Campylobacter for other

people, because person-to-person transmission of Campylobacter is not considered

epidemiologically important (12).

48

On the other hand, the emergence of quinolone-resistant Campylobacter

isolated from humans and chickens seems to have coincided with the introduction of

quinolones in veterinary medicine in the US and in different European countries (10,

25, 54-56, 59, 63, 64) and their absence in countries like Australia where they are not

licensed (62). It has been described that treatment with enrofloxacin of broiler

chickens infected with quinolone-susceptible C. jejuni does not eradicate the organism

but rather rapidly selects for quinolone resistance in C. jejuni (23, 32, 39, 40).

In Canada, licensing of the veterinary use of fluoroquinolones in 1987 was

withdrawn in 1997 (11). However, erythromycin, chlortetracycline and

oxytetracycline are registered for use as growth promoters in broilers in Canada and in

disease prevention and therapy in many breeds such as swine, sheep, turkey and cattle

(30); little data regarding the frequency and average duration of use of these drugs are

available. Our study showed almost no fluoroquinolone resistance among chicken

(1.8%) and raw milk (0%) isolates collected from 2000 to 2003 in Qubec. A prior

study of 180 chicken boilers C. jejuni isolates collected between 1998 and 1999 in

Qubec also showed resistance rates of 1% for ciprofloxacin, 7% for erythromycin and

66% for tetracycline (24). The high resistance rate to erythromycin and tetracycline,

and the low resistance rate to ciprofloxacin among chicken isolates may reflect the

veterinary use of these particular antimicrobial agents. Although the differences were

not statistically significant, the trend for an increased resistance rate for erythromycin

and tetracycline among chicken isolates is worrisome and should be monitored

closely. On the other hand, the significantly lower erythromycin resistance among

human isolates from domestically-acquired infections in our study may reflect the fact

that there are several other important sources for human infection in addition to

chicken (1).

49

Additional data from Alberta showed no erythromycin resistance among 101

chicken C. jejuni isolates collected during 2001 (20). In Ontario, about 3% of 332

chicken C. jejuni isolates from 1998 to 2001 were resistant to erythromycin (35). In

contrast, Health Canada reported a 22.3% erythromycin resistance rate among 94 retail

chicken Campylobacter spp. isolates from Qubec Province, compared with 9.0% in

78 isolates from Ontario (p=0.02) (29); however, rates were not calculated for C.

jejuni isolates specifically. These data suggest that erythromycin resistance among

chicken isolates might be more prevalent in Qubec than in other provinces in Canada.

This hypothesis should be verified by further studies. However, in order to monitor

trends in antimicrobial resistance among Campylobacter, isolates should be

differentiated to the species level, especially if any conclusions regarding zoonotic

spread of resistance are to be made.

We are concerned about the high erythromycin resistance rate observed among

our chicken isolates, for medical reasons. Since poultry is suspected to be the primary

source of C. jejuni infections for humans, erythromycin resistance in chicken isolates

might eventually translate into an increase of the C. jejuni erythromycin resistance rate

in humans. The finding of a C. jejuni chicken isolate resistant to all three drugs used

for treatment in humans is also worrisome. This finding suggests that cases of

campylobacteriosis acquired from undercooked or mishandled retail chicken may not

respond to empirical therapy. Therefore, the use of in vitro susceptibility testing of

Campylobacter may take on greater importance in ensuring rapid and appropriate

management of patients in food-borne campylobacteriosis (19). The possibility that

resistant bacteria or resistance genes may be transferred from animals to humans

should also be studied very closely.

50

To our knowledge, only one prior study has evaluated antimicrobial resistance

of C. jejuni isolates from water samples, and only 9 isolates were tested (37): among

these 9 isolates, one was resistant to tetracycline and none was resistant to

ciprofloxacin or erythromycin. Few other studies have evaluated C. jejuni isolates

from cattle, with resistance rates ranging from 5.1-25.0% for fluoroquinolones, 2.9-

8.3% for erythromycin, and 0-39% for tetracycline (I, 4, 51).

We provide the first study of antimicrobial resistance for C. jejuni isolates

collected from humans, retail chickens, raw milk and environmental water in Canada,

and the largest study of water isolates. However, our study has some limitations. It

was difficult to test the hypothesis and interpret data on sources of transmission of

antimicrobial resistant isolates when using isolates collected in different locations and

time frame. Detailed background information such as the history of antibiotic usage in

the dairy bams and poultry farms was not available for the C. jejuni isolates from milk

and chicken in this study.

Finally, when adding the antimicrobial resistance data available to the PFGE

results on a subset of human and chicken isolates, it was difficult to draw any

additional conclusion on the putative source of antimicrobial resistance other than the

distribution of antimicrobial resistant isolates is very heterogeneous. PFGE is not

suitable for determining the population genetics of bacterial species, which is better

studied by methods like multilocus sequence typing (MLST) (8). A MLST study of

these isolates is currently underway, and should help better understand the

transmission of antimicrobial resistance among these isolates. Nevertheless, additional

studies are needed to monitor trends in antimicrobial resistance among food,

environment and human C. jejuni isolates, as well as antibiotic use in animals. MLST

combined with geographical and time distribution analyses of isolates from different

51

sources collected from a well-defined region would provide new insights on the

epidemiology of this infection.

52

ACKNOWLEDGMENTS

The study was funded by the Centre de Recherche Clinique du Centre

Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. We thank Gatan Lamontagne and Marie

Nadeau from the MAPAQ for providing the raw milk isolates. We also thank the

Canadian Infectious Disease Society (CIDS) for the Safe Drinking Water/CFID

Studentship Award (S.L.).

53

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