Prof Violeta Dopsaj 2009/10 1

1

Laboratorijske metode u hematologiji

Prof Violeta Dopsaj

4 Interpretacija rezultata krvne slike

2

Interpretacija rezultata krvne slike

Osnovne tri vrste elija: leukociti, eritrociti, trombocitiBrojMorfologija elija

Leukocitarna formula-normalan nalaz Krvni razmaz obojen metodom May-Grunwald Giemsa Leukocitarna formula odreena 3-part diff tehnologijom

(3 subpopulacije leukocita: neutrofili, mononukleusne elije i limfociti) Leukocitarna formula odreena 5-part diff tehnologijom

(5 subpopulacija leukocita: limfociti, monociti, neutrofili,eozinofili, bazofili)

3

Broj elija

EritrocitiDanas se broj Er odreuje iskljuivo na hematolokom brojau

LeukocitiNa hematolokom brojauMikroskopskom metodom u komori

TrombocitiNa hematolokom brojauMikroskopskom metodom u komori (Breckerr-Cronkitea-ova metoda)Brojanje trombocita u krvnom razmazu (Fonio metoda), moe se posmatrati veliina (veliki, dinovski, mali trombociti)

4

LEUKOCITI

Leukociti su elije sa jedrom

Odeljak leukocita podeljen u dve osnovne grupe: Fagociti: granulociti i monociti elije imunog sistema: T i B limfociti, NK elije

Osnovna klinika analiza:Ukupan broj leukocita (Ehrlich, 1878.g)Najvei broj leukocitoza i leukopenija su posledica nehematolokihpatofiziolokih procesa

Uz ukupan broj leukocita sledea analiza jeDiferencijalna krvna slika - leukocitarna formula

5

Tri odeljka leukocita: u kotanoj sri, perifernoj krvi i tkivuGranulociti nastaju u kotanoj sri tokom sazrevanja od 6-10 danaprolaze kroz mitotiki odeljak (do mijelocita) i postmitotiki odeljak(metamijelocit, tapiasti granulocit, segmentirani granulocit)U perifernoj krvi borave 6 12 sati

elije prethodnice monocita sazrevaju u kotanoj sri 3-5 dana,u perifernoj krvi se zadravaju 1-2 dana a zatim odlaze u tkiva-makrofage

U perifernij krvi se nalaze funkcionalno aktivne i krajnje diferencirane elije: granulociti i monociti

Segmentirani granulociti i monociti koji se transportuju u tkiva se ne vraaju u krvotok

6

Limfociti sazrevaju i diferenciraju se u:

primarnim limfoidnim organima (nezavisno od antigena) isekundarnim limfoidnim organima (zavisno od antigena)

Za razliku od granulocita mogu ponovo dospeti u perifernu krv (limfom)

Periferna krv je odeljak hematopoetskog sistema u kojem se nalazi manje od 50% ukupnih leukocita u organizmu

Ukupan broj leukocita bez leukocitarne formule ima mali diferencijano-dijagnostiku vrednost zbog cirkadijalnog ritma (najnii ujutru, najvii popodne) i influentnih faktora

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 2

7

Broj Le se menja u toku ivota:Na roenju neutrofilija,Od 10.dana do 5-7.godine ivota limfocitoza (do 60% Ly)

U reproduktivnom periodu ene imaju vie Le u odnosu na mukarceU menopauzi su leukociti niiFiziko vebanje poveava Le sa limfocitozom(limfociti se oslobaaju iz perifernih kapilara i jetre)

Leukocite poveavaju:Hladnoa, vruina, bol, povraanje, kofein, tein, unoenje hrane,puenje (do 12 x 109/L)

8

Emocionalna uznemirenost(intenzivno plakanje poveava Le do 45%)

U trudnoi blaga leukocitoza (do 15 x 109/L) sa neutrofilijom(do 7. meseca trudnoe)

Samo ako se poremeen ukupan broj Le povee sa:

1. Leukocitarnom formulom2. Klinikim stanjem pacijenta i3. Ponovi vie puta odreivanje ukupnog broja Le

Kliniar moe zakljuiti kakvi su patofizioloki procesidoveli do poremeaja broja Le

9

Histogram leukocita (3-part diff)

Region 1 35-100 fL: limfocitiRegion 2 100-150 fL: mononukleusne celijeRegion 3 150-450 fL: granulociti

Limfociti Mononukleari Granulociti

10

Na histogramu leukocita u regionu ispod 35 fL (R1) ne bi trebalo da se nalazi nita, ali ipak se mogu nai: dinovski Tr, agregati Tr, NRBC, nelizirani Er, krioglobulini, lipidne partikule iz parentaralne ishrane, i sl

Granice izneu regiona na 35, 90, 160 i 450 fL

R2-region izmeu limfo i mono:atipini limfociti, blasti, plazma elije, bazofilijaR3-region izmeu mono i granulocita:nezreli granulociti, blasti, abnormalne elije, eozinofilijaR4-visoki apsolutni broj neutrofilaRM-promene registrovane u vie regiona

11

Histogram leukocita (5-part diff)

LympMono

Eos

Neut

Baso

12

Normalna raspodela subpopulacija leukocita u 3D data plotu: 5-part diff

limfociti

monociti

neutrofili

eozinofili

bazofili

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 3

13

5 diff scaterplott

14

Intraindividualna Ukupna greka (%)varijacija (CV)

Hemoglobin 2.8 4.1Hct 2.8 4.1Eritrociti 3.2 4.4MCV 1.3 2.3MCHC 1.7 2.2RDW 3.5 4.6Leukociti 10.9 14.6Neutrofili 15.1 22.4Limfociti 10.4 16Monociti 17.8 27.9Eozinofili 21 37.1Bazofili 28 38.5Trombociti 9.1 13.4

15

Smernice za ispitivanje leukocita i leukocitnih parametara

Izraavanje rezultataBroj leukocita (x 109/L)Referentni interval (odrasli) 4 - 10 x 109/L

Leukocitarna formulaSvaka subpopulacija izraava se kao: a) relativan broj - procenat b) apsolutan broj - preraunat na ukupan broj leukocita (na pr neutrofili x 109/L)

apsolutan broj = ukupan broj Le (109) x % subpopulacijesubpopulacije 100leukocita

16

Leukocitarna formula: referentni intervali odrasli (Dacie)

Neutrofili 2.0 - 7.0 x 109/L (40-80%)Limfociti 1.0 - 3.0 x 109/L (20-40%)Monociti 0.2-1.0 x 109/L (2-10%)Eozinofili 0.02-0.5 x 109/L (1-6%)Bazofili 0.02-0.1 x 10 9/L (

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 4

19

Korak 4

Opisivanje izmenjene morfologije elija bele lozeReaktivni, atipini limfocitiPrisutne inkluzije u citoplazmiPrisutne toksine granulacije, vakuolizacija, Dohle-ova telaca

Kada nemamo hematoloki broja odredi se ukupan broj leukocita i leukocitarna formulaU leukocitarnoj formuli nakon May-Grunwald bojenja diferencira se 6 subpopulacija leukocita: neutrofili, limfociti, monociti, eozinofili, stapiasti neutrofili, bazofiliNa hematolokom brojau mogue je brzo, precizno i tano odrediti ukupan broj Le, i leukocitarnu formulu kao 3- ili 5-part diff diferencijaciju

20

Indikacije za mikroskopski pregled krvnog razmazaNa svaki Flaged uzorak treba obratiti panju i ukljuiti mogunost izrade krvnog razmaza, nakon provere uzorka

Abnormalna diferencijacija leukocita na hematolokom brojau(tek nakon provere preanalitike faze)

Zahtev za odreivanje udela nesegmentiranih neutrofila (tapovi, metamijelociti, skretanje ulevo)

Vrednosti leukocita manje od 1.5 i vee od 20.0 x 109/LNeslaganje izmeu broja eritrocita i eritrocitnih indeksa

Najbolje je da ukoliko postoji klinika sumnja lekar trai razmaz (bez obzira na normalan nalaz sa aparata)

21

Ispitivanje eritrocitnih parametara

Broj eritrocita (x 1012 /L)Hemoglobin (g/L)Hct (L/L, %)MCV (fL)MCH (pg)MCHC (g/L)RDW (%)Morfologija

22

Brojanje krvnih elija: eritrocita, trombocita, leukocitaEritrociti: broj eritrocita, morfologija eritrocita

Normalan eritrocit (discocyt)elektronska mikroskopija

Bikonkavna elija diskoidnog oblika, prenika 7-8 m, sastoji seod membrane i citoplazme (95% hemoglobin)Citoplazma se boji crveno, nema granula, centralni deo svetlije bojenema jedro, Goldijev aparat, lizozome, nema sposobnost sintezeproteina, ni RNK

Periferni tazmaz krvi zdrave osobe

23

Energija se dobija u ciklusu anaerobne glikolize (90-95%) i uheksozo-monofosfatnom antu (5-10%), nastaje ATP

Normalno 10% eritroblasta propada u kostnoj sriUkoliko je procenat vei radi se o neefektivnoj eritropoeziUsporena sinteza hemoglobina (na pr nema Fe) dovodi dopoveane mitoze eritroblasta i nastaju mikrociti (mali eritrociti)Krvarenje i hemoliza ubrzavaju eritropoezu, broj mitoza sesmanjuje a u cirkulaciju prelaze makrociti (veliki eritrociti) ivei broj retikulocita

ER ive u cirkulaciji oko 120 dana1% ER u cirkulaciji dnevno se raspadne i isto toliko stvoriu kostnoj sri u prisustvu inioca eritropoeze (Fe, B12, folna kis.)

24

Normalnu morfologiju imaju:normocitni eritrociti (imaju normalnu veliinu) inormohromni eritrociti (imaju normalan sadraj hemoglobina)

Fizioloke varijacije u morfologiji eritrocita:ER novoroeneta se ne opisuju kao makrociti jer je normalnoda su ER vei nego kod odraslihER kod trudnice ne opisuju se kao poikolociti i anizociti

Razliiti su stavovi laboratorija u opsivanju morfologije ERNaglasiti da su ER normocitni i normohromni?Ili naglasiti samo ako je morfologija ER abnormalna?

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 5

25

Hemoglobin

Hematokrit (hematokrit centrifuga)Hematokritna vrednost (hematoloski broja)

Hct (L/L) = MCV (fL) x broj eritrocita (1012/L)

Pravilo "trojke": Hgb (g/dL) x 3 = Hct 3 (0.03 L/L)Vai samo za normocitne normohromne eritrociteOdstupanje od pravila ukazuje na abnormalne eritrocite ilije prvi znak grekeAko je morfologija Er relativno normalna vai pravilo

OdreivanjeCijanmethemoglobinska metoda, spetrofotometrijskiDanas na aparatu reagens bez cijanida, sadri Na lauril sulfatCirkadijalni ritam (8% vii ujutru)

26

Primer 1Hgb = 12 g/dLHct = 36%Primenom pravila: 12 x 3 = Hct 36 %Prihvatljiva vrednost Hct 33 - 39 % (potvruje pravilo)

Primer 2Hgb = 9 g/dLHct = 32%Primenom pravila: 9 x 3 = Hct 27 %Prihvatljiva vrednost Hct 24 - 30 % ( ne potvruje pravilo)

Primer 3Hgb = 15 g/dLHct = 36%Primenom pravila: 15 x 3 = Hct 45 %Prihvatljiva vrednost Hct 42 - 48 % ( ne potvruje pravilo)

27

Ako se vrednost za Hct ne slae sa dobijenom treba napraviti razmazi traiti abnormalnost eritrocitaPrimer 2: naeni hipohromni Er, dobijena vrednost za Hct je tanaAko nisu Er hipohromni ispitati uzrok neslaganjaPrimer 3: neslaganje zbog jake lipemije, uraditi slepu probu analize

Treba uvek nai uzrok zato rezultat ne potvruje pravilo trojke

Uzroci greke u odreivanju hemoglobina Veliki broj Le i Tr daje lano visok Hgb Lipemija, uraditi slepu probu uzorka Prisustvo Hgb S rezistentnog na liziranje, razblaiti

uzorak destilovanom vodom da se smanji turbiditet

28

Eritrocitni indeksi

Eritrocitni endeksi omogucavaju klasifikaciju eritrocita prema: Veliini Sadraju hemoglobina

Prosena zapremina eritrocita MCV

MCV (fL) = Hct (L/L) broj eritrocita (1012/L)

Prosecna koliina hemoglobina u eritrocitu - MCH

MCH (pg) = Koncentracija hemoglobina (g/L)Broj eritrocita (1012/L)

Prosena koncentracija hemoglobina u eritrocitima - MCHC

MCHC (g/L) = Koncentracija hemoglobina (g/L)Hct (1)

29

HYPOCHROMIC RBC NORMAL RBC

NORMAL IRONIRON DEFICIENCY

MEGALOBLASTIC RBC

LOW B12 - FOLATE

LOW MCV

LOW MCH

LOW MCHC

HIGH MCV

HIGH MCH

NORMAL MCHC

30

RDWirina distribucije zapremine eritrocitaIndeks anizocitoze

RDW zavisi od vrste hematolokog brojaa (15.8 2.9 %)

RDW (%) = SD (irina histograma) x 100MCV (fL)

MCV nizak MCV normalan MCV visokRDW i talasemija Anemija hroninih bolesti Aplastina anemija normalan (heterozigoti)

Anemija zbogRDW deficijencije gvoa Bolesti jetre Deficijencija folatavisok Hemoglobin H HLL, HGL (perniciozna anemija)

S- talasemija Mjelofibroza Hemolizna anemija

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 6

31

Normohromni Er: MCHC 320 - 370 g/L

Hipohromni Er: MCHC manji od 320 g/LTalasemija i deficijencija Fe

Hiperhromni Er: MCHC vei od 37 g/LIzraz hiperhromni je pogrean jer eritrocit ne moe da sadri vie od 370 g/L hemoglobina

MCHC vei od 370 g/L je greka zbog: Sferocita koji imaju izmenjen oblik Er pa izgledaju prepunjeni Greke u odreivanju Hgb Prisustva hladnih aglutinina

32

RDW = RBC Distribution width (CV) %

RDW

RDW = Coeficient of variation of RBC volume

33

Smernice za ispitivanje eritrocita i eritrocitnih indeksaKorak 1Hgb i Hct, primeniti pravilo trojke

Korak 2MCV (klasifikacija prema zapremini Er)Normociti: Er u referentnom intervalu (aproksimativno 80-100 fL)Mikrociti i makrociti za klasifikaciju anemija

Korak 3MCHC (klasifikacija prema sadraju hemoglobina)Hipohromni eritrociti (MCHC ispod referentnog opsega)Normohromni eritrocitiPovean MCHC kod: sferocita, lipemije, ikterusa, zbog interferencije u odreibanju Hgb

34

Korak 4RDW (indeks anizocitoze ukazuje na stepen heterogenosti u volumenu Er)Znaajne su jedino poviene vrednostiMorfoloka evaluacija razmaza kod povienog RDWPovien RDW uvek posmatrati zajedno sa MCV

Korak 5Ispitivanje abnormalnosti eritrocita u krvnom razmazuVeliina (anizocitoza) Oblik (poikilocitoza)Inkluzije (Howell-Jolly telaca)Mlade elije eritrocitne loze Obojenost elija

35

Korak 6Broj eritrocita i MCHRBC se koristi u dijagnozi talasemija, kada je normalan ili poveanAko je Hgb nizak, postoji sumnja na talasemijuMCH treba da prati MCV (oblik i veliina)Kada MCH ne prati MCV treba ukljuiti MCHC (detektuje se neslaganje izmeu veliine i sadraja Hgb)

U ispitivanju RBC parametara ii sledeim redom:Hgb za potvrdu ili iskljuivanje anemijeMCV: veliina elijaMCHC: sadraj hemoglobinaRDW: anizocitozaMorfologija u razmazu u korelaciji sa numerikim vrednostima sa hematolokog brojaa

36

Glavna populacija eritrocita

Ostali eritrociti

Normalan histogram eritrocita

Er se broje iznad 35 fLU regionu 24-36 fL mogu se nai:Fragmenti eritrocita, citoplazma leukocita,veliki trombociti i agregati trombocita

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 7

37

MCV, MCH I MCHC upucuju na izgled eritrocita u razmazu ismanjuju potrebu za izradom krvnih razmaza

Megaloblastna anemijaAnemija u bolestima jetreAnemija u hroninom alkoholizmu

Hemolizne anemijeAnemija zbog akutnog krvarenjaMijeloftizna anemijaIzolovana aplazija crvene lozeAnemija hroninih bolesti*

Anemija u hroninoj bubrenoj insuficijencijiAnemija u endokrinim bolestima

Sideropenijska anemijaAnemija hronine bolesti*

TalasemijaAnemija kod trovanja olovom

Makrocitna anemijaMCV: 95-150 fLMCH: 30-50 pg

Normocitna normohromna anemijaMCV: 82-94 fLMCH: 25-30 pg

Mikrocitna hipohromna anemijaMCV: 50-80 fLMCH: 12-25 pg

Morfoloka klasifikacija anemija

38

Ispitivanje trombocita i trombocitnih indeksaBroj trombocita (x 109 /L)Srednji volumen trombocita (MPV) (fL)Morfologija

Trombociti su bezjedarni, diskoidni, bikonveksni fragmenticitoplazme megakariocita, veliine 2-3mJako osetljive elije, reaguju na minimalnu stimulaciju

Period sazrevanja u kostnoj sri 5 dana2/3 trombocita nalazi se u cirkulaciji, a ostatak u depou slezine.ivotni vek 7- 10 dana

Referentni interval (odrasli) 150 - 450 x 109/L

39

Smernice za ispitivanje trombocita

Korak 1Broj trombocita izvan refrentnog opsegaPovean broj Tr - trombocitoza (povean rizik za trombozu)Snien broj Tr - trombocitopenija (povean tizik za hemoragiju)

Broj Tr se posmatra zajedno sa brojem Le i Er

Pancitopenija - snien broj Le, Er, Tr (akutna leukemija ili aplastina anemija)Pancitoza - povean broj Le, Er, Tr (policitemija vera)

40

Korak 2MPV (veliina trombocita), analogno sa MCVIma znaaja kod hemato-onkolokih pacijenata kada postoji trombocitepenija a kostna sr kao odgovor produkuje mlae, vee Tr, pa je MPV povienZbog velike fizioloke varijacije u MPV kod zdravih osoba, kao i zbog promene oblika pri dodatku EDTA, ima ogranien znaajMPV prepoznaje abnormalno velike Tr

Korak 3Morfologija Tr (veliki Tr: 2x vei od normalnih, i dinovski trombociti: vie od 2x vei od normalnih), ili porediti sa ErAgregati trombocitaSatelitizam trombocita

41

Pojava satelitizma trombocita (eng platelet satellitosis) kod nekihpacijenata pedstavlja in vitro fenomen zbog stvaranja specifinih trombocitnih autoantitelaPrisustvo EDTA u in vitro uslovima dovodi do grupisanja trombocita oko neutrofila, to se registruje na hematolokom brojaukao pseudotrombocitopenija (lano snien broj Tr) i pseudoleukocitoza (lano povien broj Le), a sve kao posledicagrupisanja i agregacijeTr (eng platelet clumping) Agregate trombocita aparat broji kao leukocite

satelitizam trombocita delimina koagulacija uzorka 42

Tr se broje u opsegu 2-20 fL i nastaju histogrami raspodele veliinaDistribucija veliina koristi se za izradu log-normal kriveKriva se ekstrapolira od 0-70 fL, i konaan broj se dobija metodom fitovanja krive eliminiui interferirajue estice u zoni uma (na pr mikrocite)Srednja zapremina Tr (MPV), analogna MCV kod RBC, dobija se sa histograma Tr

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 8

43

Pseudotrombocitopenija:A - EDTA; B - citrat 44

SKRETANJE ULEVO/LEFT SHIFT

Suspect flag

WBC:Immature Granulocytes 1

Ukazuje na povlaenjeLe iz marginalnih prostora

45

Histogram leukocita kod reaktivne neutrofilije:povieni leukociti sa izrazitim "skretanjem ulevo"

46

Histogram eritrocita kod reaktivne neutrofilije:MCV normalanpovien RDW posledica heterogenosti veliine eritrocita izazvane transfuzijomsnien broj eritrocita

47

Histogram trombocita kod reaktivne neutrofilije

48

Skretanje ulevo sa 10% tapovaDijagnoza: Pneumonija (nije otkriven uzronik)Reaktivno skretanje ulevo sa marginalnom leukocitozomSuspektni alarm potie od poveanih tapova

Prof Violeta Dopsaj 2009/10 9

49

Laser Scatter

Vo

lu

m

e

o

ut

nd

C

c

.

A

Region A

tapiasti neutrofiliMetamijelocitiMegaloblastni Neutrofili

50Infektivna mononukleoza

Suspektni alarmBlastiAtipini limfociti

Definitivni alarmiLimfocitoza %Monocitoza %

51

Reaktivni Ly(virusne infekcije)

Sezary elije (abnormalni Ly pomereni u desno

Prolimfociti

Laser Scatter

Vo

lu

m

e

o

ut

nd

C

c

.

E

52

Dijagnoza: Abnormalna populacija limfo-monocitoidnih virocitaMali trombociti, suspektna imuna trombocitopenijaVirociti kod infektivne mononukleoze, citomegalovirusavirusnog hepatitisa

53