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Diagnóstico pré-natal

Prenatal diagnosis

1 Departamentode Genética Médica,Faculdade de CiênciasMédicas, Unicamp.Caixa Postal 1.17013001-970 Campinas [email protected]

Walter Pinto Júnior 1

Abstract Thi s art icle contains all the methods for pré-natal diagnosis of genetic and chromosomal abnormal i ti es, as well infecti ous dis- eases in pregnancy. The author discuss the dif-

ference among them and the new tools of mol - ecul ar biology appli ed i n these diagnoses. At the end there is a descript ion of the technique of pre-implantat ion diagnosis and i ts use in

vitro fert i li ty laborat ori es di stant as long as

2000 kil ometers one from the other.Key words Prenatal diagnosis, Pre- implantat ion diagnosis, Invasive methods, Screeni ng tests, Geneti c Counseling

Resumo O presente artigo apresenta uma des- crição de todos os métodos de diagnóstico pré- natal de anormalidades genéticas e cromossô- mi cas, bem como dos relat i vos a doenças in-

fecciosas na gravidez. O autor di scute as di fe- renças ent re eles, e as novas ferr amentas da bi ologia mol ecul ar que são apl icadas nesses di agnósticos. Ao fi nal éfei ta uma descrição da técnica de di agnóst ico pré-impl antação e de

seu uso in vitro em laboratóri os de fert il idade situados a mais de dois mi l qui lômetros um do outro.Palavras-chave Diagnóstico Pré-natal, Diag- nóstico pré-implantação, Métodos i nvasivos,

Testes de rastreamento, Aconselhamento gené- tico

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Identificação de famílias e gestantessob risco de gerar crianças comalterações genéticas

Apesar de existirem algumas doenças genéticas

que já podem ser tratadas com grande eficiên-cia, como é o caso de várias aminoacidopatias(fenilcetonúria, acidúria meti lmalônica etc.), dealterações do metabolismo dos carboidratos(galactosemia, diabetes etc.) ou de enzimope-nias (síndrome adreno-genital, doença de Gau-cher etc.), a maioria das doenças genéticas care-ce, ainda, de terapêutica específica. Por esse mo-tivo a genética, mais do que outras especialida-des médicas, tem, por enquanto, uma ação pre-dominantemente preventiva.

A identificação de problemas genéticos podeser estabelecida pelos antecedentes familiais, nos

quais, geralmente, já existe um relato anteri orde pacientes com doenças de origem genética.Assim, as seguintes situações anamnésticas po-dem ter peso importante para suspeitarmos queestamos diante de um casal merecedor de umestudo genético.• Parente próximo ou fi lho anterior do casalcom anomalias congênitas e/ou retardamentomental.• Casal que possui parentes com doença segu-ramente de origem genética.• Casal em que pelo menos um dos cônjugesé portador de uma doença genética ou de um

gene que possa causar uma doença genética.• Casal que refere parentes portadores dedoenças semelhantes, mas que tem dúvidas se éherdada ou não.• Casal com algum grau de parentesco con-sangüíneo próximo.• Casal pertencente a um mesmo grupo racialde risco.• Casal com esterilidade sem causa aparente.• Casal ou genitores do casal com história deabortamento habitual/natimortos.• Casal em que o marido possui mais de 55anos e/ou esposa, mais de 35 anos.• Casal em que pelo menos um dos cônjugesfoi ou está exposto a radiações.• Casal em que pelo menos um dos cônjugesfoi ou está exposto a produtos químicos diver-sos, inclusive o uso de drogas ou medicamentospara doenças crônicas.• Casal em que a esposa gestando tenha tidouma infecção aguda causada por toxoplasmo-se, rubéola, citomegalovirus ou parvovirose.• Casal em que na esposa gestando tenha sidoconstatado durante o exame ultra-sonográfico,

qualquer alteração anatômica.• Casal em que na esposa gestando tenha sidoconstatado alteração no teste de triagem bioquí-mica sugestivo de aberração cromossômica oude malformações do tubo neural.

• Casal com grande ansiedade de gerar crian-ça malformada, com retardo mental ou comcromossomopatia.

Antes de abordarmos esses tópicos, parecepertinente tecer algumas considerações, com fi-nalidade didática, a respeito dos diferentes tiposde doenças genéticas.

Por doença genética entende-se qualquer al-teração do patrimônio genético, o que abrangetodas as alterações gênicas presentes no indiví-duo que podem ser transmitidas a gerações fu-turas, bem como o aumento ou diminuição daquantidade de DNA, seja através de cromosso-

mos inteiros ou por frações dos mesmos, atravésde deleções, duplicações ou ainda, translocaçõesnão equilibradas.

Embora o total do DNA humano possa al-bergar cerca de 3.000.000 de genes, estima-seque o homem seja portador de apenas 50.000.Esses genes estão distribuídos em duas cópias,não obrigatoriamente idênticos nos 23 pares decromossomos, dois dos quais sexuais, represen-tados pela notação 46,XX (mulher) e 46,XY (ho-mem) e ainda pelo DNA mitocondrial transmiti-do apenas pela mulher. A distinção entre cadapar é feita, ainda, de acordo com a distribuição

de bandas ao longo dos cromossomos, o quetorna o seu número característico.

As não-disjunções que ocorrem na primeiradivisão meiótica são, talvez, as alterações genéti-cas mais freqüentes da espécie humana, sendoas perdas no primeiro trimestre de gestações(cerca de 50% a 70%) causadas por aberraçõescromossômicas. Mesmo entre todas as concep-ções a freqüência de alterações citogenéti cas éalta e com estimativas que variam de 20,6% nosprimeiros 15 dias (Plachot et al ., 1987) a 10,5%entre as detectáveis após o atraso menstrual(Beiguelman, 1982a). Isso não é de se estranhar,uma vez que alterações citogenéticas ovularesocorrem em 32% desses gametas (Plachot et al .,1987) e em 8% dos espermatozóides (Martin et

al., 1983).Se admitirmos que as não-disjunções afetam

com igual freqüência todos os pares cromossô-micos e tomarmos a monossomia do X comoexemplo, pode-se estimar que a freqüência deaberrações cromossômicas é responsável pelaeliminação de cerca de 60% de todas as concep-ções, reconhecidas ou não clinicamente. Aqui é

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interessante relembrar os dados de Hertig, queestima que cerca de 15% dos oócitos não são fer -ti lizados, 10 a 15% são segmentados, mas não im-

plantam, 70 a 75% implantam (pelo menos

58%) , mas apenas 42% têm viabi li dade sufi ciente

par a serem percebidas pela paci ente at ravés do atraso menstrual (Schlesselman, 1979). A dadosmuito similares chegaram Edmonds et al.,(1982) com dosagens precisas de B HCG capazde estabelecer o diagnóstico de gravidez em pe-ríodo tão precoce quanto 8 a 9 dias.

Um casal em que um dos cônjuges possuiessa translocação poderá gerar crianças cromos-somicamente normais, crianças com a mesmatranslocação 14/21 herdada de um dos cônjugese crianças que, além da translocação, têm doiscromossomos 21 livres. Essa última situação de-terminará um quadro completo de síndrome de

Down, indistinguível daquele em que existe tr is-somia livre do 21. Nesses casos é importanteaveriguar os parentes consangüíneos colateraisdos portadores da translocação equilibrada,uma vez que poderá haver recorrência dessa sín-drome em outros membros da famíl ia. Por essemotivo, sempre que um casal referir a presençade síndrome de Down na família é importantesaber se esse afetado realizou o exame de carió-tipo e qual foi o resultado. Se tal resultado mos-trar trissomia livre os familiares poderão ficartranqüilos, pois terão risco similar ao da popu-lação da sua faixa etária de gerar crianças com

essa cromossomopatia. Se desconhecermos oseu cariótipo, dever-se-á indicar o exame cro-mossômico do afetado, ou dos seus genitoresou, em último caso, do cônjuge que procura oobstetra e que é parente consangüíneo do afeta-do, a fim de afastar a hipótese de existência deuma eventual translocação.

Apesar de menos freqüentes, existem situa-ções em que a criança com síndrome de Downapresenta trissomia livre do 21 e um dos genito-res possui uma linhagem celular com a mesmatr issomia, isto é, ao lado de uma maioria de cé-lulas com cariótipo normal esse genitor ou ge-nitora possui células com a trissomia igual a deseu filho. O encontro de duas linhagens cromos-sômicas é chamado mosaicismo e pode ser res-ponsável pela recorrência de síndromes em ou-tros filhos desse casal, mas não em seus familia-res. Como o tecido estudado geralmente é o san-gue periférico, nunca se pode afi rmar a um casal

jovem com uma criança com síndrome deDown que ele está isento de risco de gerar ou-tra, uma vez que, ao nível de gônadas, poderáexisti r uma linhagem tr issômica. Por esse moti-

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vo é que, nesses casos, se recomenda o diagnós-tico pré-natal de futuras gestações.

Aconselhamento genético

O aconselhamento genético pode ser definidocomo um processo de comunicação sobre o ris-co de ocorrência ou recorrência famil ial de ano-malias genéticas, com as finalidades de fornecera indivíduos ou famíli as: (a) ampla compreen-são de todas as implicações relacionadas àsdoenças genéticas em discussão; (b) as opçõesque a medicina atual oferece para a terapêuticaou para a diminuição dos riscos de ocorrênciaou recorrência da doença genética em questão,isto é, para a sua profilaxia; e (c) eventual apoiopsicoterapêutico.

Nessa definição é fácil vislumbrar que uma

das metas prioritárias do aconselhamento gené-tico é ajudar famílias que estão ou que supõe es-tar sob risco de ocorrência ou recorrência de de-feitos genéticos, a tomar decisões racionaisquanto à procriação. O aconselhamento genéti-co é feito de modo não-diretivo com a finalida-de de defender o bem-estar de indivíduos ou defamíli as, ajudando-os a resolver problemas denatureza genética, tentando esclarecer-lhe dúvi-das e diminuindo ou evitando sofrimentos epreocupações. Ao contrário dos princípios eu-gênicos, os do aconselhamento genético visam,pois, primordialmente, à defesa dos interesses

dos indivíduos e famílias, e não os da sociedade(Beiguelman, 1982).

A biologia molecular vem trazendo umenorme benefício para o aconselhamento gené-tico pela precisão diagnóstica que ela propicia.Com o mapeamento do genoma humano e oconhecimento de suas interações e as mutaçõesmais freqüentes, será possível diagnosticar qual-quer uma das 6.000 doenças citadas por McKu-sick (1992). Por esse motivo, nenhum casal sobrisco de gerar uma criança com alguma anoma-lia genética deverá ser aconselhado, no momen-to, a métodos contraceptivos irreversíveis. Se es-se casal já tiver alguém afetado na famíli a, seráimportante que se tenha algum material dessecaso-índice, para que se possa determinar a mu-tação e tornar viável e mais fácil o diagnósticopré-natal ou pré-implantação.

Quando estamos diante de uma gestação,cujo produto conceptual faleceu no período pe-rinatal, seja por prematuridade ou não, com ousem malformações, é extremamente importanteo estabelecimento do diagnóstico da doençacausadora do óbito, para que se estabeleça um

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correto aconselhamento genético. Raras são assituações em que o feto chega a viver algumashoras e que pode ser atendido por um berçaris-ta com boa experiência em sindromologia. Mes-mo os casos com diagnóstico de certeza, deve-

rão ter uma amostra de seu material colhido econservado para diagnóstico molecular. Por essemotivo, enumeramos, a seguir, algumas condu-tas que são de grande ajuda para um diagnósti-co posterior.• Obtenção de sangue fetal com seringa hepa-rinizada. Esse sangue pode ser obtido por pun-ção do seio venoso ou cardíaco, logo após ou de-corridas algumas horas do óbito fetal, e deve serenviado na própria seringa que serviu para a co-leta para evitar contaminação. Tal sangue devechegar ao laboratório de citogenética em até 48horas. Manter refr igerado, mas não congelar.

• No caso de diagnóstico molecular (DNA) omaterial deve ser coletado com EDTA (tubo devacumtainer de tampa roxa). Esse material seconserva vários dias à temperatura ambiente, ouvários anos se congelado. O mesmo é verdadei-ro para biópsia de tecido ou órgão. Não deve sercolocado em formol para evitar a degradação doDNA ou heparina que interfere com a reaçãoem cadeia da polimerase (PCR).• Biópsia de rim ou pulmão (± 1cm3 em fras-co estéri l sem nenhum conservante) ou de fas-cia lata da musculatura abdominal ou da coxa.Manter refrigerado, mas não congelar se for pa-

ra cultura de células ou citogenética.• Amostra de plasma ou soro. Centrifugar emtubo descartável, e transferir o soro para umfrasco limpo, de preferência estéril. O soro podee deve ser congelado para conservação.• Fotos de corpo inteiro de frente, costas eperfil, além de foto detalhada do rosto.• Rx do esqueleto.• Necrópsia macroscópica e microscópica deórgãos internos, com descrição pormenorizada.

Se no hospital onde ocorreu a morte perina-tal houver o concurso de um geneticista ou deum berçarista especializado em sindromologia,ele deve ser consultado. Se não for possível apesquisa de todos os itens acima discriminados,deve-se tentar obter a maior parte deles paraque num futuro próximo os genitores possamter o aconselhamento genético mais apropriado.

Grupos raciais

Certos grupos humanos pertencentes a segmen-tos raciais geográficos ou religiosos isolados têmuma freqüência maior de determinados genes.Assim o gene da anemia falciforme é mui to co-

mum entre os negróides entre os quais, no Bra-sil, a freqüência de heterozigotos é da ordem de8% (Ramalho, 1986). A probabilidade de doisindivíduos negróides, não-aparentados, possuí-rem esse gene será, pois, igual a 0,08 x 0,08 =

0,0064 ou 6,4 por mil, ou seja, um entre cada150 casais de negróides terá um risco de 25% degerar uma criança com homozigose desse gene.Embora, no Brasil , tal situação tenda a diminuirpela crescente miscigenação, alguns grupos ra-ciais ainda mantêm uma tradição de casamentosomente entre seus pares. O quadro 1 chama aatenção sobre alguns desses grupos relacionan-do-os com as alterações gênicas mais freqüente-mente observadas e cujo diagnóstico de hetero-zigose pode ser, na maior parte das vezes, reali-zadas.

Casais com problemas de fertilidade

É interessante assinalar que o aumento da taxade abortos está posit ivamente correlacionado àidade materna, sendo tanto maior quanto maisprecoce for a idade gestacional. Os dados deGustavii (1984) permitem estabelecer, a parti rde abortos clinicamente detectados, o que se ob-serva na figura 1. Tal gráfico mostra, por coefi-ciente de correlação semelhante a 1, que no mo-mento da fecundação a porcentagem de abortosespontâneos pode atingir até 70% em mulherescom mais de 40 anos. Esse dado é de suma im-

portância para explicar o porquê do relativo in-sucesso de gestantes idosas, bem como os pou-cos resultados de fertilização assistida em mu-lheres de faixa etária beirando a menopausa,além, é claro, da baixa resposta hormonal à in-dução da ovulação.

Esse aumento da taxa de abortos com a ida-de está, também, positivamente correlacionadoao aumento das trissomias, cuja freqüência po-de aumentar cerca de vinte vezes após os 40anos (Hassold & Chiu, 1985).

Nos casais com abortos recorrentes comtranslocações deve-se tomar a cautela de anali-sar se tal translocação permite o nascimento dofeto com translocação não-equilibrada. Se per-mitir deve-se indicar o diagnóstico pré-natal omais precocemente possível, por células de vilo-sidades coriônicas ou por amniócitos obtidospor punção precoce de líquido amniótico. Noscasais com aberrações cromossômicas que, pro-vavelmente, não permitem continuidade natu-ral da gravidez e naqueles com cariótipo nor-mal, deve-se sugerir a punção amniótica por-que, se passar o período crítico que o casal abor-tou anteriormente, o feto deverá ter normalida-

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de funcional dos cromossomos. Nos casais comcariótipo normal deve-se evitar os exames pre-coces para evitar que o método de punção sejaum fator co-determinante do aborto.

Diagnóstico pré-natal de doençasgenéticas

O diagnóstico pré-natal de doenças genéticas éainda um procedimento relativamente caro ecresceu rapidamente devido à interação estreitado uso da ultra-sonografia e dos métodos labo-rator iais básicos da genética. Ambos propicia-

ram a invasão do ninho fetal, por meio da qualtornou-se possível obter material do produtogestacional e, assim, proceder a diagnósticos ca-da vez mais precisos. Com o aprimoramentodessas técnicas, a medicina pôde desenvolvermétodos de tratamento intra-útero e de corre-ções fetais, conduzindo a esse novo e promissorcampo, que foi denominado medicina fetal.

A tabela 1 dá uma idéia das indicações maisfreqüentes em nosso serviço na década de 1990para o diagnóstico pré-natal utilizando a pun-ção de vilosidades coriônicas, a amniocenteseprecoce e a amniocentese tradicional. Note-seque a indicação por idade é a mais freqüente detodas. Na última década, graças às facilidades dediagnóstico aumentaram bastante as indicaçõespela ultra-sonografia e para alterações gênicasfreqüentes, como siclemia, talassemia, fibrosecística, síndrome adreno-genital, distrofia mus-cular de Duchenne, entre outras. É mister assi-nalar a grande contribuição da biologia mole-cular, não só facilitando o diagnóstico dessas eoutras doenças gênicas, como também o diag-nóstico por DNA das doenças infectocontagio-

sas.As técnicas utilizadas para o diagnóstico

pré-natal podem ser reunidas em oi to grandesgrupos:• Diagnóstico ultra-sonográfico.• Estudos através do sangue materno.• Rastreamento bioquímico e biofísico (Trans-lucência Nucal)• Punção de vilosidades coriônicas.• Punção amniótica.• Cordocentese.• Fetoscopia.• Diagnóstico pré-implantação

Figura 1Correlação entre a idade materna e perda fetal em diferentessemanas da gestação de acordo com os dados extraídos deGustavii (1984).

Quadro 1Alguns grupos étnicos e alterações gênicas mais freqüentes encontradas nos mesmos.

Grupo étnico Alteração gênica

Afr icanos (negróides) Hemoglobinas S, C, persistência de hemoglobina fetal ,talassemia, deficiência de G-6 PDCaucasóides em geral Fibrose cística do pâncreasChineses Alfa-talassemia, deficiência de G-6 PDEsquimós Síndrome adreno-genitalIngleses, irlandeses, egípcios Defeitos de fusão do tubo neuralitalianos e gregos Beta-talassemia, deficiência de G-6 PD, febre fami lial

do mediterrâneoJaponeses AcatalasiaJudeus ashkenazi Doença de Tay-Sachs, doença de Niemann-PickSul-africanos (brancos) Porfiria variegada

0

10

%

14121086

< 30

30-34

35-39

> 40

14 semanas420

20

30

40

50

60

70

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Diagnóstico ultra-sonográfico

O avanço técnico dos aparelhos de ultra-sono-

grafia fornece hoje uma resolução extremamen-te refinada para o diagnóstico de anomalias fe-tais. Essa resolução permite que as medidas ana-tômicas fetais sejam determinadas a cada sema-na de gestação e, conseqüentemente, que se esti-me a idade fetal e se pesquise a presença de to-das as estruturas anatômicas (Elejalde e Elejal-de, 1986). Qualquer desarmonia de crescimentode órgãos, regiões fetais ou mesmo atraso no seudesenvolvimento são facilmente visualizados. Asmalformações fetais passaram a ter os seus si-nais específicos e, em menos de uma década, ault ra-sonografia fetal f icou tão minuciosa que

passou a demandar do médico que a executauma sistemática extremamente rigorosa (Pavaniet al ., 1981), (Hata & Deter, 1992). Vários aspec-tos fisiológicos são hoje parte dessa rotina, co-mo a presença de líquido no estômago e na be-xiga, que atestam a higidez do trato gastroesofá-gico e o funcionamento renal, respectivamente.A quantidade de líquido amniótico também fazparte dessa avaliação, por estar aumentado emlesões do trato gastroesofágico e diminuído nomau funcionamento do aparelho gênito-uriná-rio.

A visualização fetal considerada outrora, poralguns, como um luxo obstétrico é hoje parte darotina com que o médico conta para assegurar àsua paciente o bem-estar fetal. Para que essa se-gurança seja transmitida, é necessário que talexame seja feito em vários períodos da gravidez,de modo a permitir diferentes diagnósticos deacordo com a época do aparecimento de seusprimeiros sinais. Por exemplo, os defeitos de fu-são do tubo neural poderão ser detectados apartir da décima primeira semana de gestação,se for utilizado um transdutor vaginal; o funcio-

namento da bexiga entre dezoito e vinte sema-nas; o perfil dos lábios, que possibili tam o diag-nóstico de fendas labiais, a parti r da vigésima se-

mana; a defasagem do crescimento do fêmurnos diferentes nanismos, através de exames se-qüenciais, a partir de doze semanas; a hidroce-falia, a partir de quatorze semanas, e a microce-falia, por diferentes avaliações, dependendo daépoca e da etiologia para ela se manifestar (-Kurtz et al., 1980).

Não se pode admitir nos dias de hoje quesomente após o nascimento se diagnostiquemmalformações que poderiam ser detectadas du-rante a gestação pelo ultra-som, como, porexemplo, a ausência de dedos, de mãos ou até demembros. Exames ultra-sonográficos bem feitos

são capazes de diagnosticar grande parte dasmalformações e, por esse motivo, não é de estra-nhar que os programas de monitorização demalformações congênitas devam assinalar nospróximos anos decréscimo acentuado de nasci-mento de fetos com malformações múltiplas. Is-to porque é a ultra-sonografia que mais diag-nostica malformações congênitas. Crianças comanomalias graves como a anencefalia, grandesmielomeningoceles e alterações sérias da anato-mia fetal não chegarão, pois, a nascer porquegestações com essas alterações serão interrom-pidas eticamente em fases precoces.

A ultra-sonografia obstétrica é, indiscutivel-mente, aquela que mais diagnostica, em fre-qüência e em número, tanto doenças genéticasquanto não-genéticas e, por esse motivo, aliadoao seu baixo custo e à sua característica não in-vasiva, deve ser incentivada e priorizada nodiagnóstico pré-natal. Se bem feita e rotineira-mente indicada ela é capaz de detectar altera-ções em um de cada vinte ou vinte e cinco fetos,durante a gravidez. Do ponto de vista genético-clínico, em que vários casais são encaminhados

Tabela 1Indicações de diagnóstico pré-natal de 5.824 gestações.

Indicação V. C. Semanas < 14 Semanas > 15

Idade materna ou paterna avançada 952 (4,2) 497 (2,2) 1.968 (2,6)Filho ant. com cromoss. 50 12 84 (1,2)Alterações cromos. familial 5 2 10 (20)Herança ligada ao sexo 8 (12,5) 1 8 (25)Erro inato do metabolismo 16 (25) – 11 (18)Apreensão dos genitores 450 (1,6) 333 (1,5) 1.328 (1,4)Def. fusão do tubo neural 5 4 38Malf. detectada por u.s. 4 4 (50) 34 (17)Total 1490 853 3481

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por terem um fi lho anterior, nativivo ou nati-morto possuidor de uma ou várias malforma-ções indicadoras ou não de uma síndrome espe-cífica, o uso de minuciosos exames de ultra-so-nografia pode representar o único meio para as-

segurar que o filho seguinte não seja malforma-do.Uma outra grande aplicação da ultra-sono-

grafia diz respeito à investigação do efeito deagentes teratogênicos, como certos agentes quí-micos, que são causadores de redução de mem-bros, ou físicos, como a radiação, que pode cau-sar microcefalia, ou, ainda, biológicos, capazesde acarretar retardamento do crescimento intra-uterino, além de microcefalia. Muitas pacientesse esquecem da época exata da última mens-truação, mas têm documentado a época da ra-diação ou da ingestão de certo medicamento. A

ultra-sonografia ajuda a decifrar essa data e se oagente for clastogênico (como a radiação e de-terminadas drogas), e tiver atuado no períodoperi-concepcional estará também indicado o es-tudo cromossômico fetal.

Deve-se assinalar, ainda, que a detecção dequalquer alteração ultra-sonográfica do ninhofetal, em qualquer época da gestação, merece aindicação do cariótipo fetal, tendo em vista quede 15 a 30% desses casos mostram alguma alte-ração cromossômica (Palmer et al ., 1987). A ta-bela 2 é referente a 52 pacientes submetidas aamniocentese por apresentar alguma alteração

ultra-sonográfica. A indicação do método inva-

sivo a ser utili zado (biópsia de vilosidades co-riônicas, amniocentese ou cordocentese) depen-derá da fase da gestação em que foi detectada aalteração.

Alguns sinais anatômicos ultra-sonográficos

são suficientes, inclusive, para diagnosticar sín-dromes. Exemplos bastante significativos se re-ferem à síndrome de Turner. Assim, a presençado higroma cístico em feto do sexo femininotorna altamente possível esse diagnóstico. Sinaisimportantes como lábio-leporino associado àdiminuição das órbitas e presença de polidacti -lia impõe que se avente a hipótese da síndromede Patau. A falta de visualização do osso nasalna 12a semana de gestação ou um espessamentoda pele na nuca de fetos, associada ou não a al-terações da relação entre diâmetro biparietal etamanho do fêmur a partir da 15a semana cons-

titui associação sugestiva de que o feto pode serpossuidor da síndrome de Down (Benacerraf et al., 1985; Donnenfeld & Menutti , 1988). Deve-se chamar a atenção para o fato de que as sín-dromes que cursam com aumento do líquidoamniótico são mais fáceis de diagnosticar, quan-do comparadas àquelas em que o líquido am-niótico está diminuído, porque as imagens pelault ra-sonografia são muito mais nít idas na pri-meira e de difícil visualização na segunda.

O quadro 2 abaixo modificado de Weaver(1988) é apenas um exemplo de alterações quepodem fazer um ultra-sonografista suspeitar de

uma síndrome genética. A introdução do ultra-

Tabela 2Aberrações cromossômicas observadas em 52 gestações cujo diagnóstico pré-natal foi indicadoem decorrência de alterações fetais detectadas por ultra-sonografia.

Alterações pelo ultra-som Normais No Anormalidade citogenética

Poli-hidramnia por gemelaridade ou por diabete 11 0 –Outras poli-hidramnias 8 1 Síndrome de PatauÓligo-hidramnia 1 1 Isocromossomo 17qAtresia de Piloro 0 1 Síndrome de DownHidropsia fetal 2 0 –Malformação do tubo neural 7 0 –Malformações múltiplas 2 0 –Microcefalia 2 0 –Ventrículos dilatados 2 2 Síndrome de DownOnfalocele 2 1 Síndrome de EdwardsTumoração cervical 1 2 Síndrome de TurnerRetardo do crescimento intra-uterino 3 1 TriploidiaDois vasos umbilicais 2 0 –Total 43 9

(82,7%) (17,3%)Semanas de gestaçãox = 28,2 SD= 6,6

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som tridimensional e o aperfeiçoamento na vi-sualização da anatomia fetal e suas alterações fa-rá com que os ultra-sonografistas se voltem ca-da vez mais para a sindromologia ou que traba-lhem estreitamente com grupos de medicina fe-

tal, desenvolvendo refinamentos da avaliação ul-tra-sonográfica de sinais importantes para odiagnóstico de síndromes específicas.

Finalmente, não podemos deixar de men-cionar, novamente, as aplicações do ultra-somna detecção de alterações anatômicas em fetosoriundos de casamentos consangüíneos, uma vezque tais casais deverão ser considerados como derisco de gerar filhos com alterações anatômicas.Estudo do sangue materno

Antes de abordarmos a metodologia invasiva dediagnóstico pré-natal de alterações fetais, tece-

remos algumas considerações a respeito dodiagnóstico pré-natal com o uso do sangue ma-terno. As vantagens que advirão do desenvolvi-mento de técnicas que sirvam para o diagnósti-co de alterações fetais a partir do estudo do san-gue materno são indiscutíveis, pois propiciarãoa triagem em massa de muitas doenças genéti-cas.

Sabe-se que células fetais atravessam a pla-centa e podem ser encontradas na circulaçãomaterna (Schröder & De La Chapelle, 1972) eque tais células poderão ser concentradas ou se-

paradas por métodos imunológicos, com o uso,por exemplo, de anti-I fetal (Kan et al ., 1974). Aaplicação dos cicladores de temperatura para amultiplicação de genes com o uso da reação emcadeia da polimerase (PCR) é capaz de multipli-

car genes ou regiões específicas de genes mi-lhões de vezes no intervalo de algumas horas.Com isso, é de se esperar que em futuro bempróximo será possível o diagnóstico bioquímicode alterações de várias doenças genéticas e mes-mo de doenças infecto-contagiosas com o usode células fetais obtidas por simples punção ve-nosa da gestante (Simpson & Elias, 1993).

Cremos, também, que o maior obstáculo pa-ra a obtenção de células fetais será a incompati-bilidade materno-fetal no sistema ABO, uma vezque os antígenos desse sistema são encontradosnão apenas nas hemácias, mas também nas cé-

lulas de outros tecidos incluindo os leucócitos.Mesmo assim, será considerável o número de fe-tos compatíveis com sua mãe no sistema ABO eque permitirão a existência de células fetais nacirculação sangüínea materna. Diga-se de passa-gem, que os grupos sangüíneos constituem oprimeiro exemplo, no qual a dosagem de anti-corpos séricos no sangue materno permitiu odiagnósti co da constituição genética do gruposanguíneo fetal, tanto no sistema ABO, quantono sistema Rh ou Kell. Ao lado disso, váriosmarcadores protéicos e enzimáticos podem serconstatados no soro materno em micro-quanti-

dades, mas suficientes para serem detectadospor métodos bioquímicos.

A dosagem da alfa-fetoproteína no soro ma-terno (AFPSM) para a detecção dos defeitos defusão do tubo neural consti tui o melhor exem-plo dessa situação (Band et al ., 1977). O fecha-mento do tubo neural ocorre nas primeiras se-manas de gestação, mais precisamente até a ter-ceira e quarta semanas. Fatores do meio am-biente associados a uma predisposição genéticasão capazes de alterar o seu desenvolvimentopodendo originar uma série de malformaçõesdenominadas, genericamente, como defeitos defusão do tubo neural. De acordo com a época, aintensidade e as características de tais fatores,essas malformações poderão ser traduzidas emanomalias compatíveis com a vida como as me-ningo e mielomeningoceles, ou mais graves co-mo as encefaloceles e até anomalias invariavel-mente letais, como a anencefalia. Aquelas com-patíveis com a vida poderão condicionar debili-dade e incapacidade física e/ou mental para acriança e um grande dispêndio emocional, so-cial e econômico para a família.

Quadro 2

Sinais ultra-sonográficos importantes sugestivos de alteraçõesgenéticas e/ou síndrome fetais (Weaver, 1988).

Ascite Lábio leporinoAtresias MicrocefaliaBexiga-distensão MicroftalmiaBradicardia sinusal MielomeningoceleCistos Morte fetalContraturas congêni tas Oli go-hidramniaCordão umbilical, anormalidades OnfaloceleEncefaloceles Palato fendidoFêmur curto Pericárdio, efusãoFraturas Placenta, anomaliasGemelaridade, desordens da Pleura, efusões

Genitálias, defeitos cloacais PolidactiliaHematomas PterigiumHidramnia Radio, aplasiaHidrocefalia Retardo de crescimento

intra-uterinoHidronefrose Rins, ectopiaHidropsia fetal Rins multicísticosHidrotórax Taquicardia

supraventricularHidroureter TrombocitopeniaHipertelorismo ocular TumoresHipotelorismo ocular Ureteres, obstrução

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Em nosso meio o conjunto de defeitos de fu-são do tubo neural apresenta-se numa freqüên-cia de 1 em cada 700 nascidos vivos (Brunoni,1986), sendo importante assinalar que os casaisque já tiveram uma criança com defeito de fu-

são do tubo neural têm um risco de recorrênciade 3 a 5% em uma nova gravidez. Caso tenhamduas crianças afetadas, o risco de uma novaocorrência atinge 15%. Apesar de o ácido fólicoministrado a partir da concepção reduzir emtrês quartos o risco de recorrência dessa altera-ção (Wald et al ., 1991), tais casais devem ser sub-metidos a dosagem da AFPSM para o diagnósti-co de eventual recorrência. O mesmo é verda-deiro para casais de isolados genéticos ou de po-pulações com alto índice dessa doença, comoocorre na Irlanda do Norte (1%), na Alexandria(0,55%) e em Bombay (0,55%) (Crandall,

1978).Como a AFPSM aumenta progressivamenteno sangue materno a partir da sétima semana degestação, os valores obtidos devem ser relacio-nados ao tempo de gestação. A época ideal paraa realização da dosagem de AFPSM situa-se en-tre a 16a e 18a semanas de gestação e antes derealizá-la não pode ter havido manipulação ute-rina por punção ou qualquer procedimento in-vasivo. Se a dosagem da AFPSM for alta, esse ca-sal deve ter a indicação da realização de ultra-so-nografi a fetal diri gida à coluna vertebral fetal(vértebra por vértebra) e, mesmo que normal

ou duvidosa (dependendo da precisão do apare-lho empregado), se submeter à dosagem de alfa-fetoproteína no líquido amniótico (AFPLA).

Várias situações podem causar um aumentodo valor da AFPSM, tais como sub-estimativada idade gestacional, gestação múltipla, onfalo-cele, pré-eclampsia, infecções maternas etc., masnão devem excluir a pesquisa de alterações defusão do tubo neural ou a dosagem da AFPLA(Burton, 1988). Outra associação interessantediz respeito a baixos valores de AFPSM assinala-dos na síndrome de Down (Knight et al., 1988).

Testes de rastreamento

A despeito de ser sobejamente conhecida arelação de idade com aberrações cromossômi-cas, a realização de métodos invasivos em ges-tantes com mais de trinta e cinco anos foi capazde detectar apenas de 20 a 30% das crianças quenascem com síndrome de Down. Isto porque opercentual relativo de síndrome de Down emmulheres jovens multiplicado pelo número demulheres sob r isco suplanta aquele obtido em

mulheres com mais de trinta e cinco anos.A dosagem de Alfa-fetoproteína em gestan-

tes com fetos portadores de síndrome de Downpermitiu ver que havia uma associação dos bai-xos valores dessa substância nessas gestantes,

permitindo que se fizesse uma triagem das ges-tantes de maior ri sco (Cuckleet al ., 1987). Emseguida, com um grande banco de soros de pa-cientes que estavam gerando crianças normais ecrianças com síndrome de Down, pôde-se asso-ciar também os valores altos de ßhcg com a ge-ração de síndrome de Down (Chard et al .,1984). A partir dessas observações e da pesquisade outras substâncias produzidas pelo feto oudecorrentes deste, incorporou-se também o Es-triol livre como outra substância associada eque constitui o chamado triteste (Wald et al .,1988, 1992).

O tri teste (realizado entre quinze e vinte se-manas) detecta cerca de 65% das gestações comsíndrome de Down. Segundo experiência inter-nacional, serão considerados “fetos de risco parasíndrome de Down”, ou seja, rastreamento “ po-siti vo”, aqueles que na análise do soro maternomostrarem valores de AFPSM menores que 0,5MoM (múl tiplos da mediana), de estr iol li vremenores que 2,5 MoM e de gonadotrofina co-riônica maiores que 2,0 MoM. Além disso, esteteste ajuda a rastrear 98% das gestantes com de-feitos abertos do tubo neural e 60% dos defeitosabertos da parede abdominal.

O triteste é capaz também de rastrear outrasaberrações cromossômicas, como trissomia docromossomo 18 (aproximadamente 80%), tris-somia do cromossomo 13 (cerca de 30%) e mo-nossomia do cromossomo X (45,X) em 44%.

Um t ri teste “positi vo” não signif ica que foidiagnosticada uma aberração cromossômica. Omédico ou o geneticista clínico deverá discutircom o paciente os testes adicionais para deter-minar se a criança tem realmente uma doença eas outras explicações referentes ao teste positi-vo. A gestante pode ter uma idade gestacionalmaior do que pensava, pode estar gerando gê-meos ou, mais freqüentemente, os níveis dessasproteínas séricas são simples variações da nor-malidade. Os testes adicionais incluem um ul-tra-som morfológico, e um teste cromossômico(biópsia de vilo corial ou amniocentese), quepode diagnosticar com acuracidade e segurançase a criança é cromossomicamente normal.

A procura de um teste mais precoce levou ospesquisadores a desenvolverem um teste aplica-do no primeiro trimestre e as substâncias maisespecíficas relacionadas a ele foram o PAPP-A

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(Pregnancy Associated Plasma Protein-A) e oßhcg livre. As mulheres gestando uma criançacom síndrome de Down apresentam níveis maisbaixos de PAPP-A e mais elevados de ßhcg livre(Wald et al ., 1996). Para que esse teste atingisse

uma triagem de cerca de 68% das gestações comsíndrome de Down, o teste foi considerado po-sitivo quando o risco fosse igual ou superior a1/400. Se os valores desses dois testes forem as-sociados à medida ultra-sonográfica da regiãonucal conhecida como translucência nucal, osvalores combinados podem aumentar o poderde triagem para 80 a 95% (Wald e Hackshaw,1997).

Ainda assim sobraria um percentual deaberrações cromossômicas não detectado pelatriagem e que inclui a própria síndrome deDown. Somente um procedimento invasivo, ge-

ralmente a amniocentese, pode diagnosticar to-das as aberrações cromossômicas.Apesar de esses testes de triagem serem bas-

tante promissores, deve-se tomar cuidado na in-terpretação de seus valores, uma vez que essasdosagens devem ser corrigidas com relação aotempo de gravidez, à idade da gestante, ao gru-po racial, ao peso da paciente, a doenças crôni-cas como a diabetes materna, à gestação gemelaretc. Deve-se ainda chamar a atenção para a con-fusão que muitas pessoas fazem ao realizar essestestes, pois pensam que eles são uma alternativade substituição da amniocentese para pesquisa

de alterações cromossômicas associadas com aidade dos genitores ou com a história familiarde aberração cromossômica.

Translucência nucal

Nicolaides e colaboradores em 1992 chamarama atenção para a medida da translucência nucal(TN) em fetos de gestações entre 10-14 sema-nas, que poderia ser usada como triagem deaberrações cromossômicas. A partir desse traba-lho seguiram vários outros na própria Inglater-ra, Itália, Espanha, Brasil etc (Brambati et al .,1995; Comas et al ., 1995; Ximenes et al ., 1997).Desses trabalhos ficou claro que quanto maior amedida da TN, maior seria a probabilidade de apaciente estar gerando uma criança com umacromossomopatia. Como as cromossomopatiastambém aumentam com a idade materna, fre-qüências de medidas maiores de TN são encon-tradas em mulheres com mais de 35 anos. Como feto em posição sagital (como na medida ca-beça-nádegas), a medida da TN é feita medin-do-se a máxima espessura da translucência en-tre a pele e o tecido mole que cobre a espinha

cervical. A medida de 2,5mm di ferencia as mu-

lheres de risco maior daquelas com menor riscode estarem gerando uma criança com cromos-somopatia. Medidas entre 2,5 e 3,9mm aumen-tam o risco em 3 vezes; medidas entre 4,0 e4,9mm aumentam 18 vezes; entre 5,0 e 5,9mm

aumentam 28 vezes; e igual ou maior que6,0mm aumenta 36 vezes o risco esperado deacordo com a idade materna. É claro tambémque quanto maior a translucência maior a pro-babilidade de aborto espontâneo; medidas aci-ma de 5,0mm estão relacionadas a uma taxa de13% de aborto (Pandya et al ., 1995). Neste tipode rastreamento também é mister chamar aatenção que cerca de 3-4% das gestantes em ge-ral podem ser triadas como estando sob riscoaumentado, mas não significará que o feto é se-guramente anormal. O mesmo se diga em rela-ção às gestantes com medidas inferiores a

2,5mm que, embora com menor risco após atriagem, não estão isentas de estar gerando umacriança com cromossomopatia. Assim, pacien-tes com mais de 35 anos poderão mostrar a TNnormal e assim terão um maior sossego pararealizar a amniocentese após duas a quatro se-manas. Cabe ainda lembrar que a TN não é es-pecífi ca de cromossomopatia, podendo ser en-contrada em cardiopatias e em diversas síndro-mes como a de Noonam, Higroma Cístico etc.O uso da TN é capaz de detectar cerca de 50%das cardiopatias congênitas, sendo, assim, usadocomo rot ina para tranqüili zar casais que já tive-

ram uma criança com essa afecção.

Punção de vilosidades coriônicas

Apesar de a amniocentese ter sido a técnica maisamplamente utilizada para o diagnóstico pré-natal de anomalias genéticas, tanto ela quanto abiópsia fetal transvaginal começaram a ser de-senvolvidas na mesma década de 1960. Mohr(1968) iniciou essas biópsias em 63 pacientesutilizando um endoscópio. Nessa primeiraamostra, obteve 32 biópsias contendo vi losida-des coriônicas, mas não conseguiu os cariótipospelo insucesso das culturas. Já nessa época, rela-tavam poucas complicações maternas (Hahne-mann & Mohr, 1968, 1969). Num trabalho coo-perativo feito por esse grupo em 1974, os auto-res referem que, após a 12a semana, obtinhamalém do córion, o âmnion e havia muita perfu-ração de bolsa amniótica. Em 1975, um grupodo Hospital Tietung da China relatou o pr imei-ro estudo de determinação do sexo em umaamostra de 100 pacientes. Tanto esse estudoquanto os posteriores tiveram uma grande mar-gem de erro no diagnóstico de sexo, o que de-

sestimulou a aplicação da punção de vilosidades

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coriônicas em larga escala, a despeito da preco-cidade de sua realização e, conseqüentemente,das menores implicações psicológicas de seusresultados para as mães.

Posteriormente, Simoni et al . (1983) descre-

veram as primeiras amostras em que o índice desucesso era relativamente alto, o que estimulounumerosos centros a utilizar a punção de vilosi-dades coriônicas no diagnóstico pré-natal deanomalias genéticas.

À essa época, a amniocentese era realizadaentre a 14a e 16a semanas, sendo necessárias,ainda, mais duas a três semanas para que se con-cluísse ou não pela normalidade fetal. I sso por-que a maior parte do tempo era despendida nocultivo de células, tanto para a cariotipagemquanto para o diagnóstico enzimático ou mes-mo para estudos de biologia molecular. A pa-

dronização de uma técnica que podia ser aplica-da a partir da sétima semana de gestação veioao encontro da ansiedade natural de médicos epacientes, pois um resultado em fase tão preco-ce tornaria, nos casos alterados, mais fácil e me-nos agressiva a interrupção da gestação, tantodo ponto de vista técnico, quanto psicológico.

A técnica de biópsia aspirativa transcervicalconsiste basicamente na inserção intra-uterinade um cateter que tenha em seu interior ummandril que possa lhe dar a direção. O uso daultra-sonografia para orientação do cateter faci-lita sobremaneira o índice de sucesso. Esses ca-

teteres medem 21-25cm, com diâmetro varian-do entre 1 a 2,3mm. Em gestações de até 12 se-manas, a bolsa amniótica não preenche ainda aluz do útero. O córion começou a diferenciar ocórion frondoso, que irá constituir o local daplacenta. É a região de maior índice mitótico e,portanto, a área da qual será coletado o material.

Nunca é demais recomendar um exame bac-terioscópico na semana que antecede a punçãopara evitar possível infecção intra-uterina.

A punção de vilosidades por via transabdo-minal tem algumas vantagens em relação àtransvaginal, quais sejam: a) ela pode ser feitaem qualquer época após a décima semana degestação; b) supõe-se que seja de menor riscoquando comparada à transvaginal; c) não neces-sita de bacterioscopia prévia.

No dia da punção, com a gestante de bexigacheia, deve-se fazer uma minuciosa pesquisa daregião do córion frondoso e da implantação docordão umbilical. Esta região é, geralmente, on-de o córion frondoso é mais espesso. A região docórion a ser puncionada deve apresentar-se co-mo a mais espessa em um corte longitudinal da

placenta.

Contra-indicações

Existem algumas recomendações prévias para a

realização da biópsia aspirati va de vilosidadescoriôni cas (BVC) por via transvaginal (BVC).Uma delas, de grande importância, é o examebacteriológico do conteúdo vaginal prévio aoexame, que deve ser realizado cerca de 10 a 14dias antes, a fim de propiciar seu tratamento ca-so algum agente adventício seja constatado. Apresença de herpes simples também constituium obstáculo à sua reali zação. Out ro impedi-mento dessa via é encontrado nas pacientes queforam submetidas à conização pregressa. Essassituações podem ser contornadas pela realiza-ção de BVC por via abdominal, cujo risco de in-

fecção é semelhante àquele da amniocentese.Uma outra contra-indicação existe quando apaciente refere sangramentos anteriores ao exa-me ou quando a paciente já possui pelo menosdois abortamentos cuja etiologia é desconheci-da. Isso porque, se desconhecemos a sua origem,poderemos estar “ facil itando” a sua recorrência.Antes da ultra-sonografia que moni tor izará apunção (qualquer que seja a via), deve-se ter ocuidado de informar a paciente sobre a alta in-cidência de abortos espontâneos nessa fase, aqual aumenta muito com a idade materna (Fi-gura 1). Além disso, a punção de vilosidades co-

riônicas e sua análise permitem detectar algu-mas trissomias que não seriam observadas algu-mas semanas mais tarde. Com isso, poderemosestar realizando um exame que não seria neces-sário se aguardássemos algumas semanas, umavez que tais aberrações não permitiriam a so-brevivência fetal.

A imunização prévia no sistema Rh tambémé outro fator para a contra-indicação da BVCporque, indubitavelmente, essa biópsia induz àmistura de sangue materno e fetal (Warren et

al., 1985). Para casais com filhos anteriores por-tadores de malformações não devidas a altera-ções cromossômicas, mas para as quais há sus-peita de que possa haver recorrência (por exem-plo, malformações de membros, malformaçõescranianas, malformações múltiplas etc.) ou emrelação às quais se tem a certeza da participaçãode um componente genético (por exemplo, de-feitos de fusão do tubo neural, nanismo etc.)não existe razão para indicar a punção de vilosi-dades coriônicas, porque o risco de recorrênciadessas entidades é, em geral, superior àquele dasaberrações cromossômicas, a não ser, é claro,

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que estejamos fazendo o exame para pesquisacom determinada sonda de DNA. Deve ser ex-plicada à gestante a limitação desse método eque, em certas situações, essas punções poderãoalterar exames posteriores, como, por exemplo,

a dosagem de alfa-fetoproteína.Os casos de gemelaridade em que existe umfeto vivo ao lado de outro em reabsorção ou“ovo cego”, situação essa que pode ocorrer emcerca de uma de cada cinqüenta gestações, de-vem ser vistos com mui ta cautela, pois, diantede um resultado anormal, nunca seremos capa-zes de garantir que o resultado diz respeito aofeto vivo. Um feto sem batimentos cárdio-fetaispode manter por semanas vilosidades coriôni-cas vivas e dificilmente teremos a certeza de quenão houve uma “contaminação” com células doaborto retido (como já vimos, a taxa de aberra-

ções cromossômicas em abortos é muito alta).No caso de gêmeos, com placentas muito próxi-mas ou unidas, é válido o mesmo raciocínio enão devemos nos esquecer que o risco de duaspunções deve, possivelmente, dobrar.

O r isco de abortamento inerente à BVC foiestabelecido com o mínimo de viés por um es-tudo colaborativo do Canadá e sua estimativa éde 0,6 a 1,6% (Milner et al ., 1989). Tal r isco im-plica a perda do concepto por infecção, por rup-tura de membranas ou por outras causas. Deve-se assinalar que em nossa casuística pessoal aruptura de membranas ocorreu com uma fre-

qüência de cinco em mil, predominando esseacidente nas primeiras centenas coletadas. Amaioria delas, porém, prosseguiu sem intercor-rências e sem seqüelas para os fetos, devido à au-sência de infecção concomitante. Nas primeirassemanas, houve perda de quase todo o líquido,que se reconstituiu nas semanas subseqüentes.Duas delas, em que houve aspiração indesejadade líquido amniótico, permitiram o cultivo, comsucesso, de células amnióticas.

Foi descrito recentemente que a BVC reali-zada antes da nona semana pode provocar redu-ção de crescimento de membros, em cerca de0,5% dos casos (Mastroiacovo et al., 1991). Ape-sar de tal assunto ainda suscitar controvérsias, érecomendável não realizar a biópsia antes da dé-cima semana. Também nunca é demais reforçara indicação da globulina anti-D nas pacientesRh negativo que têm a possibilidade de gerarcrianças Rh posit ivo, a fim de assegurar o poten-cial reprodutivo dessas mulheres.

Quanto aos resultados, do ponto de vistatécnico, cremos ser aconselhável esclarecer al-guns pontos básicos às pacientes, antes da opção

da BVC, a fim de que seu consentimento sejaconsciente por ter conhecimento da precisão dométodo. Não é raro que na fase de mórula pos-sam ocorrer não-disjunções cromossômicas queprovoquem o aparecimento de mosaicismo (Ka-

lousek, 1985). Tal mosaicismo é encontradocom certa freqüência no nível placentário e po-de implicar cromossomos compatíveis com onascimento do feto, como ocorre com os cro-mossomos sexuais, o 13, o 18 e o 21. As altera-ções cromossômicas que não permitem a sobre-vida causam menos preocupação, mas tambémsão indicadores de uma futura punção amnióti -ca a fim de assegurar a normalidade cromossô-mica fetal. A maioria desses mosaicismos está as-sociada a gestações de crianças normais, mas is-so somente pode ser assegurado após a compro-vação dos resultados pela punção amniótica

e/ou cordocentese.Outro esclarecimento que também deve serdado às gestantes para que elas dêem consenti-mento consciente diz respeito à possibilidade dehaver resultados falsos. Esses resultados falsospodem ser divididos em falsamente positivos efalsamente negativos. No caso de resultados fal-samente positivos, o laboratório constatará umatrissomia ou outra aberração nas células anali-sadas, mas que não estão presentes no feto, oqual é normal. Isso ocorre em cerca de um porcento das vezes e, mesmo que o casal permitaconferir o resultado em células de tecido fetal,

raramente esse casal deseja que lhes seja trans-mitido o resultado. Quando a indicação dabiópsia de vilosidades coriônicas for devida àTranslucência Nucal aumentada, esses falsos re-sultados devem ser desconsiderados porqueexiste um sinal biofísico de peso associado aoresultado.

A situação mais conflitante é a do falso ne-gativo, em que as células analisadas se apresen-tam citogeneticamente normais, mas, ao nasci-mento, constatamos uma aberração cromossô-mica. Esta situação ocorre em um de cada mildiagnósticos (Hogge et al ., 1986 e Simoni et al.,1987). Outras situações intermediárias são facil-mente contornáveis, como ocorre, por exemplo,nos falsos positivos, em que a aberração encon-trada é incompatível com a sobrevida fetal atéaquela semana gestacional. Uma aberração des-sa ordem foi por nós detectada, já tendo sidodescrita, em relação à trissomia 16 (Simoni et al., 1985). O casal tinha sido puncionado na 12a

semana de gestação com um feto vivo e ativo eao laboratório foi constatado tratar-se, indubi-tavelmente, de trissomia do cromossomo 16.

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Como essa trissomia é incompatível com fetosmaiores que 1mm, e ocorre mais freqüentemen-te em “ ovos anembrionados”, suspeitamos demosaicismo confinado à placenta. A amniocen-tese confirmou a presença de feto normal com

46 cromossomos.O cultivo das células das vilosidades coriô-nicas também deve ser encarado com restriçãoquando apresentar um resultado di ferente da-quele que encontramos na preparação direta ouna cultura de curta duração. Isso porque nessasúltimas o cariótipo que analisamos é o de célu-las que já se encontram na fase natural e final dedivisão celular, devendo corresponder ao carió-tipo do tecido in situ , ao passo que no cultivopoderemos ter a diferenciação de células de de-terminada classe celular. Desse modo, a presen-ça de resultados diferentes oriundos de dois mé-

todos aplicados à coleta de um mesmo materialpor BVC deve, obrigatoriamente, ser inconclusi-vo e indicativo de punção amniótica.

Ao leitor poderia parecer que, com tantoscuidados técnicos, a biópsia aspirativa de vilosi-dades coriônicas poderia ou deveria ser coloca-da em segundo plano. Não é essa nossa opinião.Achamos que ela tem as suas vantagens e indi-cações de excelência comparadas aos outros mé-todos de obtenção de material fetal. Assim, nãose discute sua indicação nos casais de alto riscode gerar crianças com cromossomopatia, comoocorre nos fetos com translucência nucal au-

mentada, nas translocações, ou nos casais hete-rozigotos com risco de gestação de crianças comdeterminado erro inato do metabolismo ou ou-tras doenças genéticas recessivas ou dominantesem que já se tenha um diagnóstico por sondasde DNA. Nessas situações, o risco de recorrênciaou do aparecimento da alteração genética ultra-passa, geralmente, os 25%, e o custo/benefício aolado da enorme diminuição da ansiedade é ple-namente justificável. Como, a cada dia, a ultra-sonografia e os métodos de biologia molecularse tornam mais simpl ifi cados e mais abrangen-tes, a biópsia aspirativa de vilosidades coriôni-cas veio para ficar.

Amniocentese

A amniocentese realizada a part ir da 14a semanaé um dos métodos mais difundidos para a ob-tenção de material fetal com finalidade de diag-nóstico pré-natal de alterações genéticas, embo-ra, historicamente, ela tenha surgido na mesmaépoca que se desenvolveram os primeiros traba-lhos de coleta de vilosidades coriônicas. Isso se

deveu, provavelmente, à má visualização da áreapara sua obtenção, em uma época em que a re-solução dos aparelhos de ult ra-sonografia eramuito inferior quando comparada à de nossosdias (Nazareth et al ., 1981). Além disso, a segu-

rança e o baixo índice de complicações decor-rentes da amniocentese fizeram com que ela setornasse rotina na maior ia dos serviços (PintoJr.et al., 1987).

O risco de sérias complicações, incluindoperda fetal, varia nos diferentes centros de 0,2%a 0,5% (Golbus et al ., 1979). Essa variação deveser decorrente do método de monitoragem apli-cado à punção. Os bons serviços só executam oprocedimento de punção se realizado com todaa assepsia de um teatro operatório, incluindo ouso de material esterilizado e o revestimento dasonda de ultra-som com invólucro estéril uma

vez que ela acompanhará a introdução da agu-lha até o lago amniótico escolhido. Parece des-necessário acentuar que, previamente à punção,o feto deve ser minuciosamente avaliado em suaproporcionalidade através das medidas dos diâ-metros bi-parietal, occipitofrontal, torácico eabdominal, bem como o tamanho do fêmur. De-ve-se, também, analisar seus movimentos, osmembros, a coluna vertebral, o cérebro, coração,rins, estômago e, eventualmente, bexiga, núme-ro de vasos e implantação do cordão umbilical,além da hidramnia.

Esse minucioso exame tem a intenção de de-

tectar qualquer anormalidade fetal prévia à am-niocentese, a qual, se presente, deverá ser comu-nicada ao casal antes do procedimento. Ao ladodisso, esse exame prévio poderá determinar olocal ou os locais de maior facilidade para pun-ção por possuírem o maior lago amniótico, se-rem mais distantes do pólo cefálico e, preferen-cialmente, longe dos núcleos placentários. Separa realizar a punção houver necessidade detranspassar a placenta, isto não impl ica riscosmaiores (Crane & Kopta, 1984). O mais impor-tante é, realmente, essa monitorização de modoa dar a certeza do caminho a ser percorrido pelaagulha, o que implica menos probabili dade deobter líquido com sangue ao evitar que a agulhaatravesse a cavidade amniótica e puncione vasosou a placenta locali zada posteriormente. A mo-nitorização evita, também, que a agulha seja in-troduzida mais de uma vez, o que diminui apossibilidade de lesões fetais.

Mesmo tomando todos esses cuidados po-derá ocorrer a perda de líquido amniótico, abor-to ou, ainda, amnionite. Fica muito difícil expli-car a amnionite como decorrente de uma falha

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médica quando se tomam todos esses cuidados,a não ser que as luvas não estejam estéreis e aagulha seja tocada por elas previamente à pun-ção. Por esse motivo, a agulha só deve vir à mãodo puncionador através de seu canhão quando

já se conhecer exatamente o ponto em que elaserá introduzida. Após a aspiração de uma a trêsseringas de líquido amniótico, o mandri l nãodeve ser reintroduzido para retirada da agulha,uma vez que o mesmo ficou exposto ao ar poralguns minutos. Se houver necessidade de se lo-car a agulha por uma segunda vez, esta deve sertrocada. As seringas devem ser numeradas emordem crescente a fim de que o laboratório pos-sa diagnosticar mais facilmente o crescimentode células maternas misturadas às fetais. Quan-do isso ocorre, esse acontecimento é mais pro-vável nos tubos de cultivo oriundos da primeira

seringa. Procedendo com todo esse cuidado,acreditamos que, se ocorrer amnionite, ela podeser decorrente de bactérias oriundas do organis-mo materno e localizadas entre a pele e a bolsaamniótica.

A perda franca de líquido amniótico, que emnossa casuística ocorreu em cerca de 1 em cada1.000 punções, e a perda discreta, em 1/200 pun-ções, merecem uma consideração especial. Se apunção foi alta e a perda, visualizada pelo ultra-som, oriunda de um rompimento baixo, é por-que deve tratar-se de uma gravidez que já tinhaalgum comprometimento anterior, geralmente

por infecção ascendente e que, devido à intro-dução da agulha, houve um estímulo que pro-vocou a contração uterina. Essa contração pres-siona a bolsa em todos os sentidos e, naquele lo-cal onde já está acontecendo uma lesão por in-fecção, tem-se a ocorrência de perda aguda delíquido nas primeiras horas após a punção, mui-to freqüentemente acompanhada de amnionite.

Se, entretanto, a punção for alta e a perda seder pelo orifício puncionado, ocorrerá perdacrônica, discreta ou em jatos, e com tendência aparar com o repouso da paciente, a qual nãoapresentará febre. Ela deve ser seguida com con-troles contínuos de temperatura, pesquisa deodor vaginal e leucograma, podendo ainda so-frer cobertura antibiótica. Essas pacientes comperda de líquido assético geralmente prosse-guem a gravidez e o fluido amniótico se recupe-ra após duas ou três semanas, coincidente commaior funcionamento renal. Outras complica-ções menores são as lesões fetais que aparecemao nascimento como pequenas “covinhas” na re-gião tocada pela agulha. Se não monitorizadaspelo ultra-som, poderão ocorrer lesões graves,

dependendo da região atingida pela agulha, ten-do já sido descrita gangrena de membro e lesãode art iculação de joelho (Milunsky, 1979).

Alguns autores referem que a punção am-niótica não provoca aumento da taxa de imuni -

zação no sistema Rh (Taboret al., 1986), ao con-trário de outros, que mostram freqüência au-mentada de mulheres imunizadas quando sub-metidas à punção amniótica (Golbus et al .,1982). Esses últimos autores assinalam uma ta-xa de imunização da ordem de 2,1-5,2% maiorque a observada nas mulheres não submetidas aesse procedimento. A conduta mais precavidaparece ser a ministração de gamaglobulina Rhoa toda paciente Rh negativo com potencial degerar feto Rh positivo.

A punção com sangue é, em grande partedas vezes, decorrente das dificuldades de se atin-

gir o lago amniótico desejado. Ela é mais fre-qüente quando se introduz por duas vezes aagulha. Quando for um vaso da parede anteriordo útero, geralmente é somente a primeira se-ringa que se contamina com o mesmo. Quandoé da parede posterior, resultante da perfuraçãode vasos dessa região, pode-se notar pelo ultra-som o borbulhar para a cavidade amnióti ca. Aperfeita monitor ização da posição da ponta daagulha pode diminuir muito esse acontecimen-to.

Não é raro, após a introdução da agulha, vi-sualizarmos sua ponta no lago amniótico e não

obtermos líquido. Se nos detivermos mais à vi-sualização ultra-sonográfica poderemos notarque a agulha está empurrando a membrana am-niótica sem perfurá-la. Com uma simples retra-ção da agulha e nova introdução mais abruptaou com um movimento de rotação da mesmaobter-se-á o líquido desejado sem necessidadede nova locação. A seringa deixada repousadapor alguns minutos nos esclarecerá se o sanguefoi um resultado da punção ou se já se encon-trava no lí quido amniótico. Quando ele for de-vido à punção, o sangue sedimentará rapida-mente e o sobrenadante será amarelo límpido. Seo sangramento for antigo, o sobrenadante con-tinuará vermelho. Deve-se sempre adicionar al-gumas gotas de heparina para evitar sua coagu-lação na seringa, que só ocorre se o sangue fordevido à punção.

Como a probabilidade de crescimento celu-lar diminui nos líquidos com sangue, pode ha-ver necessidade de nova punção, o que deve seravisado à paciente. Na repetição, o líquido aindaestará sanguinolento mas, seguramente, commenos hemácias para atrapalhar o crescimento

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celular. Cerca de 95% das vezes o sangue conta-minante é de origem materna e, se devido àpunção, não trará conseqüências ao prognósticoda gestação.

O líquido meconial, que ocorreu em cerca

de 1,91% de nossa casuística, é associado a san-gramentos vaginais anteriores à punção ou àpunção anterior de vilosidades coriônicas. Suacor é, geralmente, marrom claro ou, mais rara-mente, marrom esverdeado. Seu reconhecimen-to é muito fácil no nível laboratorial por apre-sentar um grande sedimento. Quando tal líqui-do é posto em cultura, as micropartículas domecônio aderem fortemente ao fundo do tubo enão permitem a adesão de células vivas, quenormalmente já são poucas (o líquido amnióti-co na 16a semana contém cerca de 12.000 célu-las por ml, sendo em média apenas 6 vivas por

ml). Se tal l íquido apresentar níveis elevados dealfa-fetoproteína, o prognóstico é menos favo-rável e deve ser explicado à paciente. Por outrolado, a continuidade da gestação não implicapara seu nascituro prognóstico diferente de ou-tras gestações, uma vez que essas crianças nãoapresentarão seqüelas neuropsicomotoras comofoi demonstrado por Pinto em 1993.

Do ponto de vista laboratorial, os errosdiagnósticos são bem mais raros quando com-parados ao exame das vilosidades coriônicas. Asraras falhas descritas se referem à contaminaçãocom células maternas por laboratórios que não

tiveram o cuidado de separar as diferentes serin-gas, nem de analisar tais células empregandopolimorfismos de bandas Q e C. Outra técnicaque também deve ser aplicada é a análise in situ

que discrimina se um mosaicismo encontradooriginou-se in vitro ou se é um mosaicismo queocorre no feto.

Se o mosaicismo tem potencial de viabilida-de como ocorre com células trissômicas do cro-mossomo 21 (ou dos cromossomos 13, 18 e se-xuais), a apreensão pode ser tanto maior quantomaior a sua freqüência. Essa situação pode sercontornada pela indicação do uso da técnica doFISH (fluorescence in sit u hybridization) ou dacordocentese nos mosaicismos viáveis e de altafreqüência relativa. Uma das situações mais em-baraçosas é a presença de translocações aparen-temente equilibradas. Se presentes nos pais, ge-ralmente se atribui risco praticamente zero de ofeto ser anormal. No caso de cromossomos“marcadores”, presentes ou não nos genitores, asituação pode ser bem mais complicada, neces-sitando do emprego de citogenética molecular euma detalhada explanação aos genitores para

uma decisão definitiva. Uma ótima revisão podeser encontrada no art igo de Lill ian Hsu (1986).

Amniocentese precoce

A amniocentese precoce, definida como aquelarealizada com quatorze semanas ou menos degestação, passou a ser desenvolvida nestes últi-mos anos devido a vários fatores. Entre eles po-de-se citar a melhoria técnica e dos aparelhos deultra-sonografia, a proporção relativamente altade líquido em relação ao feto nessa fase de ges-tação, a obtenção de resultado mais precoce e,principalmente, devido a maior fidedignidadeque seus resultados apresentam quando compa-rados à punção de vilosidades coriônicas. Osproblemas que ela apresenta são o maior riscode comprometimento fetal, semelhante à pun-

ção de vilosidades coriônicas e as dificuldadestécnicas de crescimento celular na maioria doslaboratórios, devido à menor quantidade de lí -quido retirado, com menor quantidade de célu-las. Esse últ imo obstáculo pode ser contornadopor uma filtração das células durante a punção,concentrando-as em pequenos volumes. A pun-ção amniótica precoce pode ser realizada a par-tir da nona semana (Elejalde et al ., 1990), mas,preferencialmente, a partir da 13ª semana e umdos critérios muito importante para que hajasucesso no cultivo celular é que o feto possua adistância cabeça-nádegas superior a 37mm (-

Byrne et al ., 1991).

Cordocentese

A cordocentese foi desenvolvida por Daffos naFrança em 1983. Esse autor tinha como maiorpreocupação o diagnóstico de doenças infecto-contagiosas e, dada à liberdade de aborto nessepaís, em qualquer fase da gestação, o treinamen-to para obtenção de sangue de fetos comprome-tidos pôde ser rapidamente adquirido. Nessaépoca, a obtenção de sangue fetal por fetoscopiae visualização direta do cordão era difícil e tra-zia grande risco. Com a melhoria dos aparelhosde ult ra-sonografia e as facilidades terapêuticasde transfusão de fetos imunizados, nos quais erapossível controlar rapidamente a volemia e ohematócrito, a cordocentese passou a ser ummétodo invasivo de relativo baixo risco (1% emmãos experientes) e de ampla utilização. Dessemodo, ela serve não apenas para as situaçõesacima, como também para esclarecer os casosem que o resultado citogenético da amniocente-se não foi suficiente e, ainda, para a obtenção,

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em 72 horas, do diagnósti co citogenético fetaldas gestações que apresentam alguma anomaliacongênita detectada à ultra-sonografia (Quadro2).

A técnica consiste em um minucioso exame

ultra-sonográfico para a localização da região deimplantação do cordão na placenta, sendo essaregião, sempre que possível, a eleita para a cor-docentese. Deve-se sempre visualizar os vasosdo cordão no sentido longitudinal, o ponto emque a agulha deve penetrar na pele perpendicu-larmente ao cordão, medir essa distância e, após,locar a sonda do ultra-som de tal modo que sepossa ver a ponta da agulha “ tocando o cordão”.Esse toque deve ser feito dentro da cavidade am-niótica, de tal modo que, se não vier sangue, ha-verá a penetração de líquido amniótico.

Aliás, para a finalidade de diagnóstico cito-

genético deve-se sempre, antes da funiculocen-tese, coletar cerca de 20ml de líquido para ga-rantir a obtenção de cultura de células fetais.Quando a agulha tocar o cordão, faz-se um rá-pido movimento de introdução da ponta daagulha no mesmo e aspira-se para uma seringaheparinizada de 1 a 3ml. Uma gota desse sanguedeve ser transferida para um tubo contendoNaOH a 1/12N. Se essa solução adquirir umtom quase preto, é porque se trata de sanguematerno, uma vez que o sangue fetal deverámanter tom róseo. Se a região funicular for dedifícil acesso, deve-se procurar outra, em que o

cordão se apresente bem visualizado e poucomóvel para realizar esse procedimento. Comoessa técnica era mais amplamente aplicada paradetecção de doenças infecciosas fetais, o adven-to do uso da Reação em Cadeia da Polimerase(PCR) permitiu que essa detecção fosse feitamais precocemente com o uso do l íquido am-niótico. A única grande aplicação da cordocen-tese, atualmente, tem sido para fins de transfusãointra-uterina. Nesse procedimento, o feto deveser curarizado, a agulha deve ser firmemente lo-cada e a injeção de sangue deve ser acompanha-da pelo borbulhar dentro do vaso, monitor iza-do ao ultra-som.

Fetoscopia

A técnica de fetoscopia consiste na introduçãode um endoscópio transabdominal, rígido ouflexível, de 2 a 3mm, com a finalidade de pesqui-sar a anatomia fetal e de realizar uma biópsia depele ou a punção do cordão umbilical. Esse pro-cedimento invasivo requer bastante experiência,pois implica risco de perda fetal que oscila de 3

a 5%, além de complicações, como amniorrexiscrônica, parto prematuro, infecções e descola-mento de placenta. A fetoscopia deve ser utiliza-da para investigação anatômica em doenças quenão podem ser pesquisadas pela ultra-sonogra-

fia e cujo sinal anatômico é fundamental para oestabelecimento do diagnóstico sindrômico.A fetoscopia deve ser feita entre 15 e 18 se-

manas de gestação quando a proporção entre ofluido amniótico e o feto é maior, além do que,nessa fase esse fluido é, ainda, bastante límpido,permitindo melhor visão. Antes da introduçãoda cordocentese com o auxílio do ultra-som porDaffos, a fetoscopia foi mui to uti li zada para aobtenção de sangue de cordão, tanto na placacoriônica quanto em out ras regiões do cordãoumbilical. Nos tempos atuais, essa indicaçãotem sido abandonada, e a única, que parece per-

tinente, é aquela que visa ao diagnóstico de alte-rações dermatológicas ainda impossíveis de de-tecção por técnicas de biologia molecular.

Diagnóstico pré-implantação

Com o advento da micromanipulação de ga-metas e da inseminação do espermatozóidedentro do citoplasma do óvulo ( ICSI), está sen-do possível a reprodução de indivíduos comoligospermia severa. Nessa situação está a hi-poplasia ou agenesia do conduto deferente. Sa-

be-se que um bom percentual desses indiví-duos é heterozigoto ou mesmo homozigoto pa-ra uma ou duas mutações do gene da mucovis-cidose (fibrose cística do pâncreas). Como afreqüência de heterozigotos na população cau-casóide é relativamente alta (1/25) deve-se rea-lizar a pesquisa de mutações desse gene no ma-rido e, sendo encontrada uma mutação, a pes-quisa deve ser estendida à esposa. Se ambos fo-rem portadores de mutações, poderão realizaro diagnósti co pré-implantação com a biópsiade embrião. Essa biópsia é feita quando o em-brião atinge oito células, e tem sido realizadopor nós em diferentes diagnósticos. Nas doen-ças monogênicas uti li za-se a PCR dupla (a pri -meira com primers externos à mutação e a se-gunda com uma nested PCR), que é feita emmenos de 24 horas (Wells & Sherlock, 1998) ecom apenas uma única célula poderemos esta-belecer o diagnóstico do embrião! Nós já a uti-lizamos em fibrose cística e em talassemia.

A biópsia de embrião tem sido indicada pa-ra casais com qualquer tipo de translocaçãocromossômica, em que se usam sondas fluores-

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centes (FISH) que se hibridizam a regiões peri-teloméricas dos cromossomos envolvidos. Apresença de dois sinais de cada cor indi ca que oembrião é normal ou tem translocação equili-brada. O mesmo não é verdadeiro quando se

encontram três sinais de uma cor e um sinal deoutra cor. A mesma técnica de FISH (fluores-cence in situ hybridizati on) apli cada a regiõescentroméricas tem sido usada por nós paradiagnóstico de sexo ou mesmo para o diagnós-tico das trissomias mais freqüentes. Tanto atécnica da PCR para mutações gênicas, como ade FISH têm sido empregadas em embriõesmicromanipulados a uma distância superior a2.000km, sendo este laboratório o pioneiro nomundo em diagnósticos à distância.

Uma técnica bastante promissora é aquelaem que se amplifica o genoma de uma única

célula milhares de vezes em uma noite (Zhanget al ., 1992), e sua amplificação é aplicada á ummicro-array , permit indo o reconhecimento devárias mutações ou mesmo alterações cromos-sômicas em apenas um dia. Essas técnicas de-verão revolucionar o diagnóstico citogenético emolecular em futuro muito próximo.

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