วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร
Standard Methodsfor Food Analysis
เลมท 3
Volume III
กรมวทยาศาสตรการแพทยDepartment of Medical Sciences
กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสขwww.dmsc.moph.go.th
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3 Standard Methods for Food Analysis Volum
e III
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3Standard Methods for Food Analysis, Volume IIIรหส : DMScBQSF-201502-A
พมพครงท 1 : สงหาคม 2558 จานวน 1,000 เลม
ISBN: 978-616-11-2608-7
สงวนลขสทธ
จดพมพเผยแพรโดย
กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข อ.เมอง จ.นนทบร
http://www.dmsc.moph.go.th/dmsc/home.php
โทรศพท/โทรสาร 0 2951 1021
http://dmsc2.dmsc.moph.go.th/webroot/BQSF/Index_Main.htm
พมพท
โรงพมพสานกงานพระพทธศาสนาแหงชาต
ทอย 314-316 ถนนบารงเมอง ปอมปราบฯ กรงเทพมหานคร 10100
โทรศพท 0-2223-3351, 0-2223-5548
โทรสาร 0-2621-2910, 0-2621-2911
คาปรารภ
การพฒนาวธวเคราะหใหเปนวธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหของประเทศ มความ
สาคญตอการกากบดแลคณภาพตามกฎหมาย ซงเปนบทบาทหนงของการเปนหองปฏบตการอางอง
ของชาต และเปนการแสดงความโปรงใสในการดาเนนงาน สามารถสรางความเขมแขงในการ
ควบคมคณภาพมาตรฐานของผลตภณฑสขภาพ ในกรณทเกดปญหาดานคณภาพและความปลอดภย
ของผลตภณฑดงกลาว จะตองใชผลการตรวจวเคราะหซงใชวธมาตรฐานของประเทศในการตดสน
ทงน เพอลดปญหาการโตแยงทางกฎหมายเรองผลการตรวจวเคราะห
สานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร เปนหนวยงานในสงกดกรมวทยาศาสตรการแพทย
กระทรวงสาธารณสข มอานาจหนาทในการกาหนดและพฒนาคณภาพ มาตรฐาน และวธการตรวจ
วเคราะหและเปนหองปฏบตการอางองดานอาหาร ผลการตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการสามารถ
นาไปใชในการควบคมคณภาพ และความปลอดภยใหเปนไปตามกฎหมายและเปนหลกฐานทางคด
รวมทงมความนาเชอถอ ตลอดจนการยอมรบทงในระดบประเทศและนานาชาต และเมอมการเขาส
ประชาคมอาเซยน ในปลายป 2558 จะมการนาเขาและสงออกอาหารมากขน จงจาเปนตองมมาตรฐาน
ดานการตรวจวเคราะหทดไวรองรบ ดงนน สานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร จงไดจดทาหนงสอ
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหารขน โดยดาเนนการจดทาตอเนองมาแลวจานวน 2 เลม เลมน
เปนเลมท 3 มการเพมเตมวธวเคราะหทงดานเคม จลชววทยา และชวโมเลกล และพฒนาใหเปนผลงาน
เชงนวตกรรมของกรมวทยาศาสตรการแพทย เพอใหหนวยงานในสงกดกรมวทยาศาสตรการแพทย
หองปฏบตการภาครฐ สถาบนการศกษา ตลอดจนผประกอบการและบรษทเอกชน สามารถนาไปใช
ในการอางอง ควบคมคณภาพและความปลอดภยของอาหาร เปนประโยชนในการสงเสรมเศรษฐกจ
ดานอาหาร การคมครองผบรโภค การแกไขปญหาสาธารณสขของประเทศ และการสรางเสรมสขภาพ
ทดแกประชาชนตอไป
(นายแพทยอภชย มงคล)
อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย
7 กรกฎาคม 2558
สารบญ
หนา
วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 9
นยามและคายอ 11
รหสวธ 13
DMSc F 1042: การวดคาความเปนกรด-ดางของนา 15
DMSc F 1043: การวเคราะหปรมาณฟลออไรด คลอไรด 21
ไนเตรท และซลเฟตในนา
DMSc F 1044: การวเคราะหปรมาณตะกวในนา 27
DMSc F 1045: การวเคราะหปรมาณเหลก แคดเมยม โครเมยม 31
ทองแดง แมงกานส นกเกล สงกะส และเงนในนา
DMSc F 1046: การวเคราะหปรมาณสารหนในนา 35
DMSc F 1047: การวเคราะหปรมาณใยอาหารทงหมดในอาหาร 39
โดย Enzymatic-Gravimetric Method
DMSc F 1048: การตรวจวเคราะหปรมาณกรดนาสมในนาสมสายช 45
โดยวธ Titration
DMSc F 1049: การตรวจวเคราะหความเปนกรดในซอสบางชนด 49
โดยวธ Titration
DMSc F 1050: การวเคราะหคาของกรดในนามนและไขมน 53
DMSc F 1051: การวเคราะห Phenolic Antioxidants ในนามน, 57
ไขมน และเนย
DMSc F 1052: การวเคราะหสารโพลารในนามนและไขมน, 63
โดยวธคอลมนโครมาโทกราฟ
DMSc F 1053: การวเคราะหปรมาณสารเคมปองกนกาจดศตรพช 69
กลมคารบาเมตในผกผลไม
DMSc F 1054: การวเคราะหปรมาณ 3-chloro-1, 2- propanediol 77
(3-MCPD) ในอาหารและสวนผสมอาหาร
วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 85
นยามและคายอ 87
รหสวธ 87
DMSc F 2015: วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms 89
และ E. coli ในนา และนาแขงโดยวธ MPN
DMSc F 2016: วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms 119
และ E. coli ในอาหาร
DMSc F 2017: วธตรวจวเคราะห Clostridium botulinum ในอาหาร 151
DMSc F 2018: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท 161
ชนดทมความเปนกรดตา
DMSc F 2019: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท 177
ชนดทมความเปนกรด
วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 191
รหสวธ 193
DMSc F 4001: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบ 195
ของพชดดแปรพนธกรรมดวยวธ CTAB พนฐาน
DMSc F 4002: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบ 201
ของพชดดแปรพนธกรรมดวยวธ Basic silica method
DMSc F 4003: Qualitative endogenous gene testing: lectin 207
(by means of Polymerase Chain Reaction)
DMSc F 4004: Qualitative endogenous gene testing: the chloroplast 215
trnL intron(by means of Polymerase Chain Reaction)
DMSc F 4005: Qualitative endogenous gene testing: Invertase 223
(by means of Polymerase Chain Reaction)
DMSc F 4006: Qualitative endogenous gene testing: hmgA 231
(by means of real-time Polymerase Chain Reaction)
หนา
หนา
DMSc F4007: Screening method for the detection of genetically 239
modified plant DNA: CaMV-35S promoter
(by means of Polymerase Chain Reaction)
DMSc F 4008: Screening method for the detection of genetically 247
modified plant DNA : NOS-terminator
(by means of Polymerase Chain Reaction)
DMSc F 4009: Screening method for the detection of genetically 255
modified plant DNA: nptII
(by means of Polymerase Chain Reaction)
ภาคผนวก
รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 1 263
รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 2 265
วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหาร
ของกรมวทยาศาสตรการแพทย
คณะผจดทา
1. นางสาวจารวรรณลมสจจะสกล ผอานวยการสานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร
2. นางกนกพรอธสข ผเชยวชาญเฉพาะดานมาตรฐานของอาหาร
(นกวทยาศาสตรการแพทย)
3. นางนภาภรณลกษณสมยา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
4. นางสาวสวรรณธรภาพธรรมกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
5. นางกญญาพกสน นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
6. นางสาวปษยาแสงวรฬห นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
7. นางสาวจตผกาสนทดรบ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
8. นางสาวอรณดนดล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
9. นางสาวกรรณกาจตตยศรา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
11
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
Abbreviation Word/คาเตม
AAS Atomic absorption spectrometer
Ac acetyl, CH3CO-
diam. diameter
FAAS Flame atomic absorption spectrophotometer
g gram
g gravity in centrifuging
GC Gas Chromatograph
GFAAS Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer
HPLC High performance liquid chromatograph
hr hour
id inner diameter or dimension
นยามและคายอ(DefinitionandAbbreviation)
1. “H2O”หมายถงนากลน(distilledwater)ยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ
2. สารเคม(reagents)ทงหมดเปนreagentgradeยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ
3. กรดและดางหมายถงกรดและดางทมความเขมขนดงในตารางยกเวนทกาหนดไวเฉพาะ
ในวธนนๆ
ความเขมขน
Sulfuric acid 95.0-98.0% H2SO4
Hydrochloric acid 36.5-38.0% HCl
Nitric acid 69.0-71.0% HNO3
Fuming nitric acid ≥ 90% HNO3
Acetic acid ≥ 99.7% CH3COOH
Hydrobromic acid 47.0-49.0% HBr
Ammonium hydroxide 28-30% NH3
Phosphoric acid ≥ 85% H3PO4
4. การใชสญลกษณ(ตวเลข+ตวเลข)หลงชอของสารเคมเชนHCl(1+2)หมายถงสารผสม
ระหวางHCl1หนวยปรมาตรกบH2O2หนวยปรมาตร
5. คายอทใชและคาเตมแสดงในตาราง
12
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
Abbreviation Word/คาเตม
kg kilogramL literLC Liquid Chromatographm Meter, milli – as prefixM MolarMe Methyl, CH3-
MeOH Methanol, CH3OHmg milligrammin minuteml millilitermm millimeterMS Mass spectrometerMW molecularweightMΩ megaohmN Normalng nanogram-OAc acetate-OCN cyanateod outer diameter or dimensionppm part per millionppb part per billionv/v Volumeper volumew/v Weightpervolumew/w Weightperweightwt Weightµg Microgram (10-6g)µL Microliter (10-6L)µm Micron, micrometer (10-6m)/ per% percent> more than< less than≥ equal to and more than
≤ equal to and less than
13
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย
DMScF1042 นาดม คาความเปนกรด-ดาง I 15
นาแขง
นาใชในการผลตอาหาร
นาประปา
นาบาดาล
นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย
DMScF1043 นาดม ฟลออไรดคลอไรดไนเตรท I 21
นาแขง และซลเฟต
นาใชในการผลตอาหาร
นาประปา
นาบาดาล
นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย
DMScF1044 นาดม ตะกว I 27
นาแขง
นาใชในการผลตอาหาร
นาประปา
นาบาดาล
นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย
DMScF1045 นาดม เหลกแคดเมยมโครเมยม I 31
นาแขง ทองแดงแมงกานสนกเกล
นาใชในการผลตอาหาร สงกะสและเงน
นาประปา
นาบาดาล
นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย
Method รหสวธ ชนดอาหาร สารทตองการวด หนา Type
14
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
DMScF1046 นาดม สารหน I 35
นาแขง
นาใชในการผลตอาหาร
นาประปา
นาบาดาล
นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย
DMScF1047 อาหาร ใยอาหารทงหมด I 39
DMScF1048 นาสมสายช กรดนาสม I 45
DMScF1049 ซอส ความเปนกรด I 49
DMScF1050 นามนและไขมน คาของกรด I 53
DMScF1051 นามนไขมนและเนย PhenolicAntioxidants I 57
DMScF1052 นามนและไขมน สารโพลาร I 63
DMScF1053 ผกผลไม สารเคมปองกนกาจดศตรพช II 69
กลมคารบาเมต
DMScF1054 อาหาร 3-chloro-1,2-propanediol II 77
(3-MCPD)
Method รหสวธ ชนดอาหาร สารทตองการวด หนา Type
15
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชวดคาความเปนกรด-ดาง(pHvalue)ของนาหรอสารละลายทเปนaqueoussolution
2. เอกสารอางอง(Reference)
Rice EW, Baird RB, Eaton AD, Clesceri LS, editors. Standard methods for the examination
ofwater andwastewater. 22nd ed. Washington DC: American Public Health Association;
2012. p. 4-91 to 4-96.
3. หลกการ(Principle)
การวด pHคอการวดสภาพความเปนกรดหรอเปนดางของสารละลายทมนาเปนตวทาละลาย
(aqueous solution) โดยการวดความตางศกยทเกดขน (potential) ระหวางอเลกโทรดอางอง
(reference electrode) กบอเลกโทรดตรวจวด (sensing electrode) อเลกโทรดจะเปลยน
ความตางศกยท เกดจากไฮโดรเจนอออน (ion potential) ใหเปนความตางศกยไฟฟา
(electronicpotential)แลวขยายใหสงขน
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 pH meter
4.2 Combination pH electrode
4.3 ขวดพลาสตก
5. สารเคม(Reagent)
5.1 สารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH4.00,7.00และ10.00
5.2 สารละลาย3MKCl
DMScF1042: การวดคาความเปนกรด-ดางของนา
pHvalueofwater
16
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 ตวอยางนา:สมตวอยางและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
6.2 ตวอยางนาแขง:สมตวอยางปลอยใหละลายทอณหภมหองและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
6.3 บรรจนาทผสมเปนเนอเดยวกนลงในขวดพลาสตกตวอยางละ 2 ขวด วด pH ไดทนท
เมออณหภมเทากบ25± 1C
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 สรางcalibrationcurveทpH4.0,7.0และpH7.0,10.0บนทกคาslope
7.2 จมelectrodeในขวดท1กวนเบาๆทงไวประมาณ1นาทยกelectrodeขนซบใหแหง
7.3 จมelectrodeในขวดท2อานคาpHโดยกดreadรอจนเครองอานคา(หยดนง)
7.4 ลางelectrodeดวยนากลนซบใหแหงดวยกระดาษเนอนม
7.5 ในกรณทคาไมหยดนงใหเตรยมตวอยางใหม 4 ขวด จม electrode ในขวดท 1, 2, 3
และ4และอานคาของขวดท4
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
รายงานคาความเปนกรด-ดางทศนยม1ตาแหนง
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 ตรวจสอบaccuracyโดยวดสารละลายบฟเฟอรจากdifference sourceความแตกตางจาก
คาจรงไมเกน0.1pHunit
9.2 วด 2ซา (duplicate)ทก 10ตวอยาง (กรณนอยกวา 10ตวอยาง ใหวด duplicate 1ชด)
โดยวดแบบrandomเพอตรวจสอบคาprecisionโดยคาprecisionไมเกน0.1pHunit
9.3 ตวอยางทผลการวดไมอยในเกณฑมาตรฐานตองทาการวดซาโดยนาตวอยางใหมมาวด
(new portion) เพอยนยนผลโดยคา precisionตองไมเกน 0.1 pH unit รายงานคาแรก
ถาเกน0.1ใหcalibrateเครองใหมและใชตวอยางใหม
17
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
10. รายละเอยดอน
อ างองจากแนวทางการตรวจสอบและสอบเทยบเครองมอวทยาศาสตรเพอการรบรอง
หองปฏบตการทดสอบตามมาตรฐาน ISO/IEC17025: 2005สานกมาตรฐานหองปฏบตการ
กรมวทยาศาสตรการแพทยมกราคม2557หนา56-58
10.1 การตรวจสอบทกครงทใชงาน–การตรวจสภาพของ electrode เกณฑยอมรบ relative
slope ≥95%โดย 10.1.1 ปรบเครองใหพรอมทางานดวยworkingstandardbuffer7.0และ4.0
10.1.2 วดคา Potential และอณหภมของสารละลายworking standard buffer 4.0
และ7.0
10.1.3 คานวณคาmeasuresslopeและrelativeslope
potential difference Measured slope = pH difference
Measured slope × 100 Relative slope = Theoretical slope
Theoreticalslopeท25C=59.13mV/pH
ตวอยางการคานวณ
Workingstandardbuffer(value) Readvalue
Temperature(C) mV
Relativeslope=[(175-5)/3]× 100 = 95.18%
59.6
4.01 25 175.00
7.00 25 5.00
18
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
10.2 การบารงรกษา
10.2.1 เลอกชนดelectrodeใหเหมาะสมกบตวอยาง
10.2.2 วธลางelectrodeใหแชในสารละลาย0.1MHClหรอ0.1MHNO3 นาน30min
และเกบโดยแชในสารละลาย3MKCl
10.2.3 กรณใชelectrodeใหมทไมเคยใชงานใหปฏบตดงน
10.2.3.1 แชelectrodeในH2Oทงไว24hr
10.2.3.2 เปดเครองทงไวประมาณ5-10minหรอตามทกาหนดในคมอ
10.2.3.3 ตดตง electrode ลางใหสะอาดดวย H2O และซบใหแหงดวย
กระดาษนม ตงอณหภมตามทกาหนดบนขวดสารละลาย buffer
ทเลอกใช
10.2.3.4 จมelectrodeในสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH7.0กรณใชเครอง
ทมprobeวดอณหภมใหจมprobeนนในสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรดวย
10.2.3.5 ปรบปมปรบเทยบ(calibrate)ใหไดคาpH7.0
10.2.3.6 ลาง electrode ใหสะอาดดวยH2Oและซบใหแหงดวยกระดาษนม
จมelectrodeในสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH4.0หรอpH9.0
ปรบปมslopeใหไดคาpHตามคาของสารละลายมาตรฐานบฟเฟอร
ทเลอกใช
10.2.3.7 ตรวจซาอกครงโดยเปลยนสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรใหม
10.2.4 ขอควรระวงในการใชelectrodeเพอยดอายการใชงาน
10.2.4.1 กรณหยดใชงานชวคราวในระยะสนสามารถแชelectrodeในH2O
หรอสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH4.0ใหกดปมstandbyและ
รกษาระดบสารละลายเกลอภายในใหสงกวาระดบนาขางนอกสวน
การเกบ electrode ในระยะยาวควรเกบโดยแชในสารละลายชนด
เดยวกบทบรรจในelectrode
10.2.4.2 ระวงไมใหมฟองอากาศในelectrodeถาพบฟองอากาศใหเขยาแรงๆ
ตามแนวดงของ electrode เพอไลฟองอากาศนนออกทางดานบน
หรอเปลยนสารละลายทบรรจในelectrodeใหม
10.2.4.3 คา pH แกวงตลอดเวลา แสดงวาอาจมคราบไขมนหรอโปรตน
เคลอบทผว electrode ใหเชดออกเบา ๆ ดวยสลหรอผาน มชบ
acetoneหรอalcoholและแชelectrodeในH2Oทงไวสกคร
19
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
10.2.4.4 หามทาความสะอาดelectrodeในอางนาความถสง(ultrasonicbath)
เพราะแรงสนสะเทอนจะทาลายโครงสรางภายในของelectrode
10.2.4.5 ควรเปลยนสารละลายKClบอยๆ เพอปองกนผลจากการรบกวน
ดวยสารปนอน ๆ จงควรเลอกใช KCl ทมความบรสทธสงมาก
ในกรณทพบวามสารอนเจอปนมากควรใชลางH2Oภายในelectrode
หลายๆครง
10.2.4.6 เปดชองระบายอากาศตอนบนelectrode เมอวด pHและปดชองน
เมอเลกใชงาน
10.2.4.7 ขวดสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรเมอเลกใชแลวควรปดขวดใหแนน
เพอปองกนไมใหสมผสกบกาซคารบอนไดออกไซด และปองกน
เชอรา หากพบวามราขนหามใชเดดขาด นอกจากนสารละลาย
มาตรฐานบฟเฟอรทใชแลวหรอเทออกจากขวดแลวหามเทกลบ
ลงในขวดอก
21
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชวเคราะหปรมาณฟลออไรด (Fluoride;F-) คลอไรด (Chloride;Cl-)ไนเตรท (Nitrate;NO3-)
และซลเฟต(Sulfate;SO42-)ในนาดมนาแขงนาแรนาใชในการผลตอาหารนาประปานาบาดาล
และนาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสยโดยIonChromatograph(IC)
2. เอกสารอางอง(Reference)
Rice EW, Baird RB, Eaton AD, Clesceri LS, editors. Standard methods for the examination
ofwater andwastewater. 22nd ed. Washington DC: American Public Health Association;
2012. p. 4-5 to 4-7.
3. หลกการ(Principle)
ตวอยางนาซงผานการกรองอนภาคทใหญกวา0.45µmเมอนามาฉดเขาไปในเครองICสารละลาย
eluentจะพาตวอยางเขาไปในcolumnเกดการแลกเปลยนไอออนภายในcolumnไอออนแตละ
ชนดจะถกแยกจากกนตามความสามารถในการแลกเปลยนไอออนจากนนจะออกจาก column
เขาส suppressor เพอลดคา background เปนการชวยปรบใหสามารถตรวจวดคาการนาไฟฟาท
เกดจากไอออนทสนใจไดดขนขณะทคาการนาไฟฟาทเกดจากeluentจะลดลงใน suppressor
ไอออนทแยกออกมาจะมสภาพเปนกรดเมอผานเขาไปในเครองตรวจวดคาการนาไฟฟาจะเกด
สญญาณซงจะถกเปลยนเปนchromatogramคานวณหาปรมาณของไอออนแตละชนดโดยเทยบ
กบกราฟมาตรฐาน
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g
4.2 Ionchromatograph-conductivitydetector
4.3 Ultrasonic bath
4.4 Beaker
DMScF1043: การวเคราะหปรมาณฟลออไรดคลอไรดไนเตรทและซลเฟต
ในนา
Determination of fluoride, chloride, nitrate and sulfate
inwater
22
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.5 Micropipetteขนาด50,100,200,500และ1,000µl
4.6 Membranefilterขนาด0.45µm
4.7 Volumetricflaskขนาด10,50mlและ1L
4.8 Syringeพลาสตกขนาด10ml
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดไมตากวาระดบ AR grade และนา (H2O) ทใชเปนนาปราศจากไอออน
(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm
5.1 สารมาตรฐาน(Standards)
5.1.1 สารละลายมาตรฐานF- 1,000 mg/L
5.1.2 สารละลายมาตรฐานCl- 1,000 mg/L
5.1.3 สารละลายมาตรฐานNO3- 1,000 mg/L
5.1.4 สารละลายมาตรฐานSO42- 1,000 mg/L
5.1.5 intermediate standard solution F- 100 mg/L: ปเปตสารละลายมาตรฐาน
F- ตงตนปรมาตร1mlลงในvolumetricflaskขนาด10mlเจอจางและปรบปรมาตร
ดวยH2O
5.1.6 workingstandardsolution:
5.1.6.1 workingstandardsolutionF- ความเขมขน0.4,0.8,1.2และ1.6mg/L:
ปเปตintermediatestandardsolutionF- 100mg/Lปรมาตร200,400,600
และ800µlตามลาดบลงในvolumetric flaskขนาด50ml เจอจางและ
ปรบปรมาตรดวยH2O
5.1.6.2 working standard solutionCl-ความเขมขน 1.0, 10, 20และ 40mg/L:
ปเปต intermediate standard solutionCl- 1,000mg/Lปรมาตร50, 500,
1,000และ2,000µlตามลาดบลงในvolumetricflaskขนาด50mlเจอจาง
และปรบปรมาตรดวยH2O
5.1.6.3 workingstandardsolutionNO3- ความเขมขน0.23,0.9,1.8และ2.7mg/
L:ปเปตintermediatestandardsolutionNO3-1,000mg/Lปรมาตร50,200,
400และ600µlตามลาดบลงในvolumetricflaskขนาด50mlเจอจาง
และปรบปรมาตรดวยH2O
23
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.1.6.4 workingstandardsolutionSO42- ความเขมขน1.0,10,20และ40mg/L:
ปเปตintermediatestandardsolutionSO42- 1,000mg/Lปรมาตร50,500,
1,000และ2,000µlตามลาดบลงในvolumetricflaskขนาด50mlเจอจาง
และปรบปรมาตรดวยH2O
สามารถปเปตปรมาตรสารละลายมาตรฐานลงในvolumetric flask ใหไดชวงความเขมขนอน
ทครอบคลมความเขมขนทตองการวเคราะห
5.2 eluent 12 mM NaOH: ปเปต 50% w/w NaOH 630 µl ลงใน volumetric flask
ขนาด1 L เจอจางดวยH2Oปรบปรมาตรและdegasในultrasonicbathกอนนาไปใช
(เตรยมใหมทกครงทใชงาน)สามารถเลอกeluentชนดอนๆใหเหมาะสมกบชนดcolumn
ทเลอกใชเชนสารละลายผสมsodiumbicarbonate-sodiumcarbonate
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 ตวอยางนา:สมตวอยางและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
6.2 ตวอยางนาแขง:สมตวอยางปลอยใหละลายทอณหภมหองและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
6.3 เทตวอยางทเปนเนอเดยวกนใส beaker ดดดวย syringe กรองผานmembrane filter
ขนาด0.45µmลงในหลอดพลาสตกของเครองฉดตวอยางอตโนมตแลวฉดเขาเครองIC
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 สภาวะเครองIC
detector:totalconductivity<10µS
column: anion-exchange (analytical 4 ×250mm,guard450mm)
eluent: 12 mM NaOH
injectionvolume:50µl
flowrate:1ml/min
เตรยมความพรอมของเครอง ICให eluent ไหลผาน columnรอเครองทางานตามสภาวะ
กาหนดbaselineคงทประมาณ30นาท
24
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2 ทดสอบsystemsuitabilityของเครองกอนใชงาน
ฉดสารละลายมาตรฐาน(mixedsolution)5ซาทความเขมขน1ระดบของF-, Cl- , NO3-
(คานวณเปนN)และSO42- เทากบ2,20,1.8และ20mg/Lตามลาดบหรอความเขมขน
ท เหมาะสมกบการใชงาน ตรวจวดคาการนาไฟฟาของแตละไอออน แสดงเปน
chromatogram คานวณ%RSD ของ retention time และ peak area เกณฑยอมรบ
<1.0และ<2.5%ตามลาดบ
7.3 สรางกราฟมาตรฐาน(calibrationcurve)
7.3.1 ฉดblank(นา)ตรวจวดคาการนาไฟฟาของblankเพอตรวจสอบการปนเปอน
7.3.2 ฉดworking standard solutionตรวจวดคาการนาไฟฟาของสารละลายมาตรฐาน
แตละไอออนแสดงเปนchromatogram
7.3.3 สรางกราฟมาตรฐานของแตละไอออนให peak area อยบนแกน yความเขมขน
ของสารละลายมาตรฐานอยบนแกน x คานวณคาสมประสทธการตดสนใจ
(correlationofdetermination;R2)เกณฑยอมรบ>0.995
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) 8.1 ปรมาณแตละไอออนจากสตร
C(mg/L) = A× RF × D
เมอ A = peakarea
RF(responsefactor) = ความเขมขนสารมาตรฐาน/peakareaสารมาตรฐาน
D = dilution factor
8.2 รายงานปรมาณแตละไอออนในหนวยมลลกรมตอลตร(mg/L)เลขนยสาคญ2ตาแหนง
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults) 9.1 วเคราะหcontrolsampleและplotลงในqualitycontrolchart
9.2 ทกชดตวอยาง(ชดละไมเกน10ตวอยาง)วเคราะห2ซา(duplicate)คาRPDตองไมเกน5%
25
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ไอออน ปรมาณไอออน(mg/L) %recovery %RSD
F- 0.20 - 1.6 91 - 102 1.1 - 4.2
Cl- 1.0 - 40 94 - 102 0.4 - 2.6
NO3-คานวณเปนN 0.23-2.3 96-107 0.7-3.1
SO42- 1.0 - 40 98 - 103 0.4 - 3.5
10. รายละเอยดอน ขอมลRecoveryและrepeatability
27
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชวเคราะหปรมาณตะกว(Lead;Pb)ในนาดมนาแขงนาแรนาใชในการผลตอาหารนาประปา
นาบาดาล และนาจากแหลงตาง ๆ ยกเวนนาเสย โดย graphite furnace atomic absorption
spectrometer(GFAAS)
2. เอกสารอางอง(Reference)
Rice EW, Baird RB, Eaton AD, Clesceri LS, editors. Standard methods for the examination
ofwaterandwastewater22nd ed. Washington DC: American Public Health Association; 2012.
p. 3-28 to 3-33
3. หลกการ(Principle)
เทคนคGFAAS เปนการวดแรธาตทมปรมาณนอยมาก (ระดบ ppb) โดยการใหความรอน
จากกระแสไฟฟา (electrothermal) แก graphite furnaceซงทนความรอนไดสงมาก การให
ความรอนม3ระดบ(หรอมากกวา)ระดบแรกเปนการทาใหตวอยางนาบนgraphiteระเหยแหง
ระดบท2ความรอนทสงขนจะทาลายorganicmatterและสารอนๆระดบท3ความรอนทสงกวา
ระดบท2จะทาใหธาตกลายเปนอะตอมไดอยางสมบรณและการabsorbแสงจะดขน
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 GFAAS
4.2 Hotplateชนดปรบความรอนได
4.3 Beakerขนาด10,25และ50ml
4.4 Measuringpipetteขนาด1ml
4.5 Micropipetteขนาด2-50µLพรอมtip
4.6 Volumetricflaskขนาด10และ100ml
4.7 Volumetricpipetteขนาด10ml
DMScF1044: การวเคราะหปรมาณตะกวในนา
Determinationofleadinwater
28
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดไมตากวาระดบAR grade และนา (H2O) ทใชเปนนาทปราศจากไอออน
(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ - cm
5.1 สารมาตรฐาน(Standards)
5.1.1 สารละลายมาตรฐานPb1,000mg/L
5.1.2 Intermediate standard solution 5mg/L: เตรยมโดยเจอจางสารละลายมาตรฐาน
Pb1,000mg/L200เทาดวยH2O
5.1.3 Working standard solution: ใหไดชวงความเขมขน 5, 10, 12, 15และ20µg/L
(เตรยมstandard1จดโดยใชIntermediatestandardsolutionเครองจะautomix)
5.2 HNO365%(w/w)
5.3 HNO30.5%:เจอจางHNO365%(w/w)0.5mlดวยH2Oปรบปรมาตรเปน100ml
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 ตวอยางนา:สมตวอยางและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
6.2 ตวอยางนาแขง:สมตวอยางปลอยใหละลายทอณหภมหองและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 ปเปตตวอยาง10mlใสในbeakerขนาด25ml
7.2 เตม 0.05mlHNO3 65% (w/w) (ประมาณ2หยด) digestบน hot plate ในตดดควน
(ระวงอยาใหเดอด)จนปรมาตรลดลงเหลอประมาณ5mlทงใหเยนถายสารละลายตวอยาง
ลงในvolumetricflaskขนาด10mlลางbeakerดวยH2Oรวมนาลางในvolumetricflask
ทาเชนนหลายๆครงปรบปรมาตรดวยH2Oและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
7.3 วเคราะหblankและspikedsampleควบคกบการวเคราะหตวอยาง
7.4 วดปรมาณPbดวยGFAAS
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) คานวณปรมาณPbจากสตร
C = (C0 – CB)× F
เมอ C = ความเขมขนPbในตวอยาง(mg/L)
C0 = ความเขมขนPbในสารละลายตวอยาง(mg/L)
CB = ความเขมขนPbในสารละลายmethodblank(mg/L)
F = dilution factor
29
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 กอนสรางกราฟมาตรฐานตองทา sensitivity checkของเครอง โดยใชworking standard
solutionตามทคมอของเครองกาหนด
9.2 ตรวจสอบการdriftของเครอง โดยการวดworking standard solution 1จดหลงการวด
ตวอยางทก10-12ตวอยาง
9.3 วเคราะหblankทกครงททาการวเคราะห
9.4 วเคราะหblankspikedเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑการยอมรบ
(ตามตาราง)
QCชนดตางๆ เกณฑการยอมรบ
check standard 90 - 110%
spikedsample ใชcontrolchartในการควบคมคณภาพ
duplicate analysis % RPD ≤ 28
10. รายละเอยดอน
เกบรกษาตวอยางใชHNO3 ใหpH<2
31
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชวเคราะหปรมาณโลหะเหลก(Iron;Fe)แคดเมยม(Cadmium;Cd)โครเมยม(Chromium;Cr)
ทองแดง (Copper;Cu)แมงกานส (Manganese;Mn)นกเกล (Nickel;Ni)สงกะส (Zinc;Zn)
และเงน (Silver;Ag) ในนาดมนาแขงนาแรนาใชในการผลตอาหารนาประปานาบาดาล
และนาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสยโดยflameatomicabsorptionspectrometer(FAAS)
2. เอกสารอางอง(References)
Rice EW, Baird RB, Eaton AD, Clesceri LS, editors. Standard methods for the examination of
waterandwastewater22nd ed. Washington DC: American Public Health Association; 2012.
p. 3-25 to 3-28.
3. หลกการ(Principle)
เทคนคAASในการหาปรมาณโลหะและแรธาตอาศยหลกการใชความรอนไปทาใหสารประกอบ
โลหะและแรธาตเปลยนเปนอะตอม (atomization) อะตอมเหลานจะดดกลนแสง (absorb)
ทความยาวคลนทเหมาะสมโดยคาabsorbanceจะเปนสดสวนโดยตรงกบจานวนอะตอม
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 Flame Atomic Absorption Spectrometer
4.2 Hotplateชนดปรบความรอนได
4.3 Beakerขนาด50,250ml
4.4 Measuringpipetteขนาด2,10ml
4.5 Micropipetteขนาด5-50,50,100,200,500µlพรอมtip
DMScF1045: การวเคราะหปรมาณเหลกแคดเมยมโครเมยมทองแดง
แมงกานสนกเกลสงกะสและเงนในนา
Determinationofiron,cadmium,chromium,copper,
manganese,nickel,zincandsilverinwater
32
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.6 Volumetricflaskขนาด25,50,100และ1,000ml
4.7 Volumetricpipetteขนาด100ml
4.8 กระดาษกรองNo.1ขนาด70mm
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดเปนAR gradeหรอเทยบเทาและนา (H2O)ทใชเปนนาทปราศจากไอออน
(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm
5.1 HNO365%(w/w)
5.2 HNO31%:เจอจางHNO365%(w/w)10mlดวยH2Oปรบปรมาตรเปน1L
5.3 สารมาตรฐาน(Standards)
5.3.1 สารละลายมาตรฐานFe1,000mg/L
5.3.2 สารละลายมาตรฐานCd1,000mg/L
5.3.3 สารละลายมาตรฐานCr1,000mg/L
5.3.4 สารละลายมาตรฐานCu1,000mg/L
5.3.5 สารละลายมาตรฐานMn1,000mg/L
5.3.6 สารละลายมาตรฐานNi1,000mg/L
5.3.7 สารละลายมาตรฐานZn1,000mg/L
5.3.8 สารละลายมาตรฐานAg1,000mg/L
5.3.9 Intermediate standardsolution100mg/L: เตรยมโดยเจอจางสารละลายมาตรฐาน
แตละชนด10เทาดวยH2O
5.3.10Working standard solution (mg/L) เจอจาง intermediate standard solution Fe,
Cd,Cr,Cu,Mn,Ni,ZnและAgดวยHNO31%ปรบปรมาตรเปน50mlใหไดชวง
ความเขมขนทครอบคลมความเขมขนทตองการวด(ตามตาราง)
standardsolution ความเขมขนของ ปรมาตรของ workingstandardsolution(mg/L) intermediatestandardsolution(µl)
Fe 0.05,0.1,0.2,0.4และ0.8 25,50,100,200และ400
Cd,Mn 0.02,0.05,0.1,0.2และ0.4 25,50,100,150และ200
Cr,Cu,Ni,Zn,Ag 0.05,0.1,0.2,0.3และ0.4 25,50,100,150และ200
33
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 ตวอยางนา:สมตวอยางและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
6.2 ตวอยางนาแขง:สมตวอยางปลอยใหละลายทอณหภมหองและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 ปเปตตวอยางมา200mlใสในbeakerขนาด250ml
7.2 เตม 2.0mlHNO3 65% (w/w) digest บน hot plate ในตดดควน (ระวงอยาใหเดอด)
จนปรมาตรลดลงเหลอประมาณ10ml
7.3 ทงใหเยน ถายสารละลายตวอยาง ลงใน volumetric flask ขนาด 25ml ลาง beaker
ดวยH2Oหลายๆครงรวมนาลางในvolumetricflaskปรบปรมาตรและเขยาผสมใหเปน
เนอเดยวกน(ถาตวอยางมตะกอนตองกรองกอน)
7.4 วเคราะหblankและspikedsampleควบคกบการวเคราะหตวอยาง
7.5 วดปรมาณFe,Cd,Cr,Cu,Mn,Ni,ZnและAgดวยFAAS
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
คานวณปรมาณโลหะจากสตร
C = (C0 – CB)× F
เมอ C = ความเขมขนของโลหะในตวอยาง(mg/L)
C0 = ความเขมขนของโลหะในสารละลายตวอยาง(mg/L)
CB = ความเขมขนของโลหะในสารละลายmethodblank(mg/L)
F = dilution factor
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftheresults)
9.1 กอนสรางกราฟมาตรฐานตองทา sensitivity checkของเครอง โดยใชworking standard
solutionตามทคมอของเครองกาหนด
9.2 ตรวจสอบการdriftของเครอง โดยการวดworking standard solution 1จดหลงการวด
ตวอยางทก10-12ตวอยาง
9.3 วเคราะหblankทกครงททาการวเคราะห
9.4 วเคราะหblankspikedเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑการยอมรบ
(ตามตาราง)
34
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
10. รายละเอยดอน
เกบรกษาตวอยางใชHNO3ใหpH<2
QCชนดตางๆ เกณฑการยอมรบ
checkstandard within+20%spikedsample ใชcontrolchartในการควบคมคณภาพduplicate analysis % RPD ≤ 20
35
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชวเคราะหปรมาณสารหน (Arsenic;As) ในนาดมนาแขงนาแร นาใชในการผลตอาหาร
นาประปานาบาดาลและนาจากแหลงตางๆ ยกเวนนาเสย โดย hydride generation atomic
absorptionspectrometer(HGAAS)
2. เอกสารอางอง(Reference)
Rice EW, Baird RB, Eaton AD, Clesceri LS, editors. Standard methods for the examination
ofwaterandwastewater22nd ed. Washington DC: American Public Health Association; 2012.
p. 3-38 to 3-39.
3. หลกการ(Principle)
สารหนทอยในรปAs3+ในนาเมอทาปฏกรยากบsodiumborohydride(NaBH4)ในสภาวะทเปน
กรดออนจะเปลยนเปนสารประกอบไฮไดรดซงอยในรปของแกส (AsH3) แกสนจะถกแกส
อารกอนพาไปยงquartzcellทรอนเกดการแตกตวจนไดอะตอมอสระอะตอมเหลานจะดดกลน
แสงและถกวดปรมาณโดยเครองAASสารหนทอยในรปAs5+ตองเปลยนใหเปนAs3+ดวยKI
และascorbicacidกอนทาปฏกรยากบNaBH4
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 HGAAS
4.2 Hotplateชนดปรบความรอนได
4.3 Beakerขนาด10,50,250ml
4.4 Micropipetteขนาด2-50,20-100µlพรอมtip
4.5 Volumetricflaskขนาด25,50,100,1000ml
4.6 Volumetricpipetteขนาด25ml
4.7 ขวดแกวสชาหรอvolumetricflaskสชา
DMScF1046: การวเคราะหปรมาณสารหนในนา
Determinationofarsenicinwater
36
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดเปน AR grade หรอเทยบเทา และ H2O ทใชเปนนาทปราศจากไอออน
(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm
5.1 HCl37%(w/w)
5.2 1.5%HCl:เจอจางHCl37%(w/w)15mlปรบปรมาตรเปน1L
5.3 3% sodium borohydride solution (NaBH4):ละลาย3gใน1%NaOH100ml
5.4 สารละลายผสมของ5%KIและ5%ascorbicacid:ละลายKI2.5gและascorbicacid
2.5 g ใน volumetric flaskขนาด 50ml เกบใสขวดสชาหรอทมด (เตรยมใหมทกครง
กอนใช)
5.5 สารมาตรฐาน(standards)
5.5.1 สารละลายมาตรฐานAs1,000mg/L
5.5.2 Intermediate standard solution 5mg/L: เตรยมโดยเจอจางสารละลายมาตรฐาน
As1,000mg/L200เทาดวยH2O
5.5.3 Working standard solution: 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0และ4.0mg/L เตรยมโดยปเปต
intermediate standard solution 5mg/Lปรมาตร 0, 10, 20, 40, 60 และ 80 µl
ตามลาดบใสvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวย1.5%HCl
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 ตวอยางนา:สมตวอยางและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
6.2 ตวอยางนาแขง:สมตวอยางปลอยใหละลายทอณหภมหองและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 ปเปตตวอยาง25mlใสbeakerขนาด50mlระเหยบนhotplateในตดดควน(ระวงอยา
ใหเดอด)ใหเหลอประมาณ10mlถายใสในvolumertricflaskขนาด25ml
7.2 เตมHCl37%(w/w)1ml
7.3 เตมสารละลายผสมของ5%KIและ5%ascorbicacid1ml เกบไวในทมดหรอขวดสชา
อยางนอย30minเพอรดวซAs5+เปนAs3+ปรบปรมาตรดวยH2O
7.4 วเคราะหblankและspikedsampleควบคกบการวเคราะหตวอยาง
7.5 วดปรมาณสารหนดวยHGAAS
37
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
คานวณปรมาณAsจากสตร
C = (C0 – CB)× F
เมอ C = ความเขมขนAsในตวอยาง(mg/L)
C0 = ความเขมขนAsในสารละลายตวอยาง(mg/L)
CB = ความเขมขนของAsในสารละลายmethodblank(mg/L)
F = dilution factor
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftheresults)
9.1 กอนสรางกราฟมาตรฐานตองทา sensitivity checkของเครอง โดยใชworking standard
solutionตามทคมอของเครองกาหนด
9.2 ตรวจสอบการdriftของเครอง โดยการวดworking standard solution 1จดหลงการวด
ตวอยางทก10-12ตวอยาง
9.3 วเคราะห blankทกครงททาการวเคราะห กรณตวอยางมมาก วเคราะห 5%ของจานวน
ตวอยาง
9.4 วเคราะหblankspikedเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑการยอมรบ
(ตามตาราง)
QCชนดตางๆ เกณฑการยอมรบ
check standard 90 - 110 %
spikesample ใชcontrolchartในการควบคมคณภาพ
duplicate analysis % RPD ≤ 28
10.รายละเอยดอน
เกบรกษาตวอยางใชHNO3ใหไดpH<2
39
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชวเคราะหปรมาณใยอาหารทงหมดในอาหารโดยenzymatic–gravimetricmethod
2. เอกสารอางอง(References)
AOAC Official Method 985.29 Total Dietary Fiber in Foods. Codex-Adopted-AOAC Method
3. หลกการ(Principle)
ตวอยางอาหารแหง 2ชด (portion) ถามปรมาณไขมนมากกวา 10% ใหสกดไขมนออกกอน
นามา gelatinizeดวยTermamyl (heat stableα-amylase)หลงจากนนนามายอยดวยเอนไซม
protease และ amyloglucosidase เพอกาจดโปรตนและแปง เตม ethanol เพอตกตะกอน
solubledietaryfiberกรองและลางตะกอนทไดหลงจากทาตะกอนใหแหงชงนาหนกนาตวอยาง
ชดท1มาวเคราะหปรมาณโปรตนตวอยางชดท2นามาวเคราะหปรมาณเถาปรมาณใยอาหาร
ทงหมดคอนาหนกตะกอนทเหลอหลงจากทหกนาหนกโปรตนและเถาออก
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g
4.2 ตอบสญญากาศ(vacuumoven)
4.3 ตอบรอน(hotairoven)
4.4 ระบบสญญากาศ(vacuumsource)พรอมชดกรองสารละลายตวอยางและภาชนะสาหรบ
ใสและยอยตวอยาง(digestionflask)
4.5 เครองบดหรอปนตวอยาง
4.6 อางนารอนชนดนาเดอด (boilingwater bath)และชนดควบคมอณหภมแบบมระบบเขยา
(thermostatshakingwaterbath)ซงสามารถปรบตงอณหภมไดท60C
DMScF1047: การวเคราะหปรมาณใยอาหารทงหมดในอาหาร
โดยEnzymatic-GravimetricMethod
Determinationoftotaldietaryfiberinfoods
byEnzymatic-GravimetricMethod
40
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.7 pH meter
4.8 เตาเผา(mufflefurnace)
4.9 FrittedCrucibleขนาด30mlทาดวย borosilicate glass ทฐานม filter PorosityNo. 2
(Pyrex No. 32940, coarse, ASTM 40-60 µmหรอTecatorpartNo.1000-1001standard
crucibleหรอเทยบเทา) กอนใชงานใหทาความสะอาด และเผาท 525 C เปนเวลา 1 hr
ทงใหเยนลงประมาณ 130 Cหรอตากวา แช crucible ในนา และฉดลางดวยนากลน
ทงใหแหง
4.10 โถดดความชนพรอมสารดดความชน(desiccatorwithdesiccant)
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและนา(H2O)ทใชเปนนาปราศจากไอออน(deionized
water)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm
5.1 Acetone
5.2 98%Ethanol(v/v)(technicalgrade)
5.3 8%Ethanol:เตมH2O207mlลงในvolumetricflaskขนาด1Lปรบปรมาตรดวย95%
ethanol ผสมใหเขากน (อาจเตรยมโดยผสมH2Oและ 95% ethanol ในอตราสวน 1:4
โดยปรมาตร)
5.4 Phosphatebuffer0.08M,pH6.0:ชงsodiumphosphatedibasic,anhydrous(Na2HPO4)
1.400 g (หรอ dihydrate 1.753 g) และ sodium phosphatemonobasicmonohydrate
(NaH2PO4.H2O)9.68g(หรอdihydrate10.94g)ละลายดวยH2O700mlแลวปรบปรมาตร
เปน1LตรวจสอบคาpHดวยpHmeterเกบในขวดสชาและไวในตเยน
5.6 HCl0.325M:เจอจาง1MHCl325mlดวยH2Oปรบปรมาตรเปน1L
5.7 NaOH0.275M:ชงNaOH11gละลายดวยH2Oปรบปรมาตรเปน1L
5.8 Celite,acid-washed
5.9 เอนไซม3ชนดไดแก
5.9.1 Termamyl solution (heat stable α-amylase)เกบในตเยน
5.9.2 Proteaseเกบในตเยน
5.9.3 Amyloglucosidaseเกบในตเยน
หรออาจใชชดเอนไซมทง3ชนด(SigmaChemicalCo.,KitNo.TDF-100หรอเทยบเทา)
เกบในตเยน
41
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 เตรยมตวอยางใหเปนเนอเดยวกนโดยการบดตวอยางโดยใช cyclonemillหรอmotar
(ครกบด)แรงผานตะแกรงขนาด0.3-0.5mm
6.2 ชงตวอยาง 30 gอบในตอบสญญากาศทอณหภม 70 C เวลา 18 ± 2 hr เกบในภาชนะ
ทมฝาปดและเกบในdesiccatorจนกวาจะนามาวเคราะหหาปรมาณใยอาหาร
6.3 ชงตวอยางทอบแลวมา0.5-1gจานวน2ชดในภาชนะยอยตวอยาง(digestionflask)แตละ
ชดควรมนาหนกตางกนไมเกน20mg(ตวอยางทมไขมนมากกวา10%และตวอยางอาหาร
ผสม(mixeddiet)ใหสกดไขมนออกโดยใชpetroleumetherสกด3ครงครงละ25ml)
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
ทกครงทวเคราะหตวอยางใหทา blank2 ชดควบคไปดวยทกครงเพอตรวจวดปรมาณ residue
ในreagentซงมผลตอคาdietaryfiberในตวอยาง
7.1 ชง celite ประมาณ 0.5 g จดบนทกนาหนกทแนนอน (ทศนยม 4 ตาแหนง) ใสใน
frittedcrucibleทเตรยมไวอบในตอบรอนทอณหภม130 Cจนไดนาหนกคงท(ประมาณ
2hr)ทงใหเยนในdesiccatorชงและบนทกนาหนก
7.2 เตมphosphatebufferpH6.0(ทงไวทอณหภมหองกอนนามาใช)50mlลงในdigestion
flaskปรบpHของสารละลายตวอยางเปน6.0±0.2เขยาเบาๆใหตวอยางกระจายสมาเสมอ
7.3 เตมTermamyl solution (heat stable α - amylase) 0.1ml (100µl)แลวปด flaskดวย
aluminium foil
7.4 บมตวอยางโดยนา digestion flaskตงในอางนาเดอดเปนเวลา 15min โดยเรมจบเวลา
เมออณหภมของสารละลายในdigestionflaskถง95-100C(โดยปกตจะใชเวลาในการบม
ทงหมดไมเกน30minในระหวางการบมใหเปดระบบเขยา digestion flask เบาๆทกๆ
5 min
7.5 ทงให digestion flask เยนลงจนถงอณหภมหอง และนามาปรบ pH ใหเปน 7.5± 0.2
โดยเตมสารละลาย0.275NNaOH10ml
7.6 เตมprotease5mgแตเนองจากproteaseทใชมลกษณะเปนผงและมกจะตดอยท spatula
ดงนนจงเตรยมเปนสารละลายโดยชงprotease50mgใสในphosphatebuffer1mlแลว
จงปเปตมา 0.1ml ใสในdigestion flaskฉดลางตวอยางทตดอยขางภาชนะดวยนากลน
ปดflaskดวยaluminiumfoil
42
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.7 บมตวอยางในอางนารอนควบคมอณหภมแบบมระบบเขยาตอเนอง ทอณหภม 60 C
เปนเวลา30min(เรมจบเวลาเมออณหภมของสารละลายขางในdigestionflaskถง60 C)
เปดระบบเขยาตอเนองตลอดระยะเวลาในการบม
7.8 ทงใหสารละลายตวอยางใน digestion flask เยนลงถงอณหภมหอง ปรบ pH ใหอย
ระหวาง4-4.6โดยเตม0.325MHClประมาณ10ml
7.9 เตมสารละลาย amyloglucosidase 0.3mlฉดลางตวอยางทตดอยขางภาชนะดวยนากลน
แลวปดflaskดวยaluminiumfoil
7.10 บมตวอยางในอางนารอนควบคมอณหภมแบบมระบบเขยาตอเนองทอณหภม 60 C เปน
เวลา30min(เรมจบเวลาเมออณหภมของสารละลายในdigestionflaskถงอณหภม60C)
เปดระบบเขยาตอเนองตลอดระยะเวลาในการบม
7.11 เตม95%ethanolซงอนไวแลวท60Cปรมาตร280mlหรอประมาณ4เทาของปรมาตร
ของสารละลายตวอยาง (วดปรมาตรกอนนาไปอนท 60 C) ใสในdigestion flaskทงให
ตกตะกอนทอณหภมหอง1hr
7.12 นาcrucibleและceliteทชงไวแลวในขอ7.1มาทาใหceliteเรยบตดกบฐานของcrucible
ดวย78%ethanol10mlโดยใชขวดฉด(washbottle)ลงบนceliteเปดระบบกรองสญญากาศ
7.13 กรองสารละลายตวอยางใน digestion flaskทผานการตกตะกอนแลวในขอ 7.11ลงใน
crucibleทเตรยมไวในขอ7.12ลางตะกอนดวย78%ethanol3ครงครงละ20ml,95%
ethanol2ครงครงละ10mlและacetone2ครงครงละ10mlครงแรกของการลางใหฉด
ลางดานขางของdigestionflaskเพอใหresidueทตดอยลงไปในcrucibleใหหมด
7.14 อบ crucibleทม celite และresidueทไดจากขอ 7.13 ในตอบรอนอณหภม 105 Cหรอ
ในตอบสญญากาศอณหภม 70 Cคางคน (ประมาณ18hr)แลวทงใหเยนในdesiccator
ชงและบนทกนาหนก
7.15 นา residueชดทหนงมาหาปรมาณโปรตนทเหลอจากการยอยดวยเอนไซม (indigestible
protein)โดยขดทงceliteและresidueใสลงในหลอดยอยตวอยางขนาด250mlแลววเคราะห
หาปรมาณโปรตนในresidueโดยวธKjeldahl
7.16 นา residueชดทสองหาปรมาณเถาโดยนามาเผาในเตาเผา (muffle furnace)ทอณหภม
525 C เปนเวลา5hrแลวทงให crucible เยนลงตากวา 250 Cแลวจงนาออกจากเตาเผา
ทงใหเยนในdesiccatorชงนาหนก(ทศนยม4ตาแหนง)
43
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8. การคานวณและรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) การหาคาBlank
B = Blank(g)=RB-PB-AB
เมอ RB = คาเฉลยของนาหนกresidueของblank2ชด(g)
PB = นาหนกของโปรตนในresidueของblankชดทนามาหาโปรตน(g)
AB = นาหนกของเถาในresidueของblankชดทนามาหาเถา(g)
TotalDietaryFiber,%=[(R-P-A–B)×100]/W เมอ R = คาเฉลยของนาหนกresidueของตวอยาง2ชด(g)
P = นาหนกโปรตนในresidueของตวอยางชดทนามาหาโปรตน(g)
A = นาหนกเถาในresidueของตวอยางชดทนามาหาเถา(g)
B = นาหนกblank(g)
W = คาเฉลยของนาหนกตวอยาง 2 ชด (คานวณเปนนาหนกตวอยางทยง
ไมอบแหง)(g)
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(AssuringtheQualityofTestResults) 9.1 วเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง
9.2 ทดสอบความบรสทธของเอนไซม(enzymepurity)โดยทดสอบประสทธภาพของเอนไซม
ทกlotของเอนไซมหรอทก6เดอนโดยใชตวอยางดงแสดงในตาราง
Test samples for enzyme purity
Citrus pectin Pectinase 0.1 95-100Stractan(larchgum) Hemicellulase 0.1 95-100Wheat starch Amylase 1.0 0-1Corn starch Amylase 1.0 0-2Casein Protease 0.3 0-2β-Glucan(barleygum)a β-Glucanase 0.1 95-100
aSigmaChemicalCo.orMegazymeInternationalIreland,Ltd.
Testsample Activitytested Testportionweight,g Expectedrecovery,%
10. รายละเอยดอน
ไมฉดลาง acetoneลงในdigestion flask ซงทาดวยพลาสตก เพราะ acetoneมฤทธกดกรอน
พลาสตกจะทาใหภาชนะเสยหายได
45
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชเปนวธตรวจวเคราะหปรมาณกรดนาสมในนาสมสายช
2. เอกสารอางอง(Reference)
AOACOfficialMethod930.35Vinegars(1)J.TotalAcidsandK.NonvolatileAcids
3. หลกการ(Principle)
ปรมาณกรดนาสม หาไดโดยไทเทรตโดยตรงกบสารละลายมาตรฐาน NaOH โดยใช
phenolphthaleinเปนindicator
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 เครองPotentiometer
4.1.1 Compact titrator: 716 DMS titrino
4.1.2 Magneticswing-outstirrer:728Stirrer
4.1.3 Electrode: combined pH glass electrode
4.1.4 Exchange unit
4.2 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g
4.3 อางนารอน(waterbath)
4.4 Beakerขนาด10และ100ml
4.5 Buretteขนาด50ml
4.6 Cylinderขนาด100ml
4.7 Erlenmeyerflaskขนาด125และ250ml
4.8 ถวยระเหย(evaporatingdish)ขนาดความจประมาณ200ml
4.9 Pipetteขนาด10,25และ50ml
4.10 Volumetricflaskขนาด100,250และ1,000ml
DMScF1048: การตรวจวเคราะหปรมาณกรดนาสมในนาสมสายช
โดยวธTitration
Determinationofaceticacidinvinegarbytitration
46
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดเปนARgradeหรอเทยบเทาหรอดกวาและนา(H2O)ทใชเปนนากลนปราศจาก
กาซคารบอนไดออกไซด
5.1 1MNaOH:ชงNaOH40gลงในbeakerขนาด100mlละลายดวยH2Oแลวถายลงใน
volumetricflaskขนาด1000mlและปรบปรมาตรดวยH2O
5.2 0.5MNaOH:ปเปต1MNaOH50mlลงในvolumetricflaskขนาด100mlแลวปรบ
ปรมาตรดวยH2O
5.3 0.1MNaOH:ปเปต1MNaOH25mlลงในvolumetricflaskขนาด250mlแลวปรบ
ปรมาตรดวยH2O
5.4 Potassiumhydrogenphthalate(KHC8H4O4),KHP:primarystandard(ทาใหแหงทอณหภม
105Cนาน2hr)
5.5 95% Ethanol
5.6 PhenolphthaleinTS:ชงphenolphthalein1gลงในbeakerขนาด10mlละลายดวย95%
ethanolแลวถายลงในvolumetricflaskขนาด100mlและปรบปรมาตรดวย95%ethanol
5.7 สารละลายมาตรฐาน1MNaOH
Standardization: ชง KHP 5 g (ทราบนาหนกแนนอน,W) ลงใน Erlenmeyer flask
ขนาด125mlเตมH2O75mlเขยาใหละลายแลวไทเทรตดวย1MNaOHโดยใชเครอง
potentiometerหรอหยดphenolphthaleinTS1-2หยดแลวไทเทรตโดยใชburetteขนาด
50mlจนถงจดยตจะไดสารละลายสชมพออนบนทกปรมาตรทใช(V)
W × 1000 NaOH(M)= V × 204.223
เมอ W = นาหนกของKHP(g)
V = ปรมาตรของNaOHทใช(ml)
5.8 StandardbufferpH4,7และ10
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample) สมตวอยางประมาณ2 - 3หนวยบรรจ เทผสมลงในภาชนะทสะอาดใหไดตวอยางประมาณ
200mlเขยาใหเปนเนอเดยวกน
47
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedures) 7.1 ตรวจสอบเครองpotentiometerกอนใชงาน
7.1.1 ทาการตรวจสอบelectrodeโดยใชstandardbuffer4,7และ10
7.1.2 ลางelectrodeประมาณ2-3ครงดวยนากลน
7.1.3 จมelectrodeลงในนากลนใหอานคาไดประมาณpH6
7.2 Total acids
7.2.1 ปเปตตวอยาง10mlลงในErlenmeyerflaskขนาด125ml
7.2.2 เตมH2O40mlหยดphenolphthaleinTSประมาณ2 - 3หยดแลวไทเทรตดวย
0.5MNaOHโดยใชburetteขนาด50mlจนถงจดยต(บนทกปรมาตรทใชเปนV1)
7.3 Nonvolatile acids
7.3.1 ปเปตตวอยาง10mlลงในevaporateddishขนาด200ml
7.3.2 ตงทงไวใหแหงบนwaterbath
7.3.3 เตมH2Oประมาณ5-10ml แลวตงทงไวใหแหงบนwaterbathดาเนนการซาอก
อยางนอย5ครง
7.3.4 ละลาย residue ดวยH2Oประมาณ 200ml แลวถายลงใน Erlenmeyer flask
ขนาด250mlหยดphenolphthaleinTSประมาณ2-3หยด
7.3.5 ไทเทรตดวย0.1MNaOH(บนทกปรมาตรทใชเปนV2)
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) 8.1 กรณนาสมสายชเทยม
ปรมาณกรดนาสม(g/100ml)คานวณไดจากTotalacids=V1xmolarityofNaOHx0.6
8.2 กรณนาสมสายชหมกหรอกลน
ปรมาณกรดนาสม(g/100ml)คานวณไดจากTotalacids–Nonvolatileacids
Nonvolatileacids(g/100ml)=V2× molarity of NaOH × 0.6
8.3 การรายงานผล
รายงานผลปรมาณกรดนาสมในหนวยg/100mlทศนยม1ตาแหนง
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทาการวเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง
49
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชเปนวธตรวจวเคราะหความเปนกรดในซอสบางชนด(ซอสพรกซอสมะเขอเทศซอสมะละกอ
หรอซอสแปง)
2. เอกสารอางอง(Reference)
AOACOfficialMethod 942.15Acidity (Titratable) of Fruit ProductsB.GlassElectrode
Method
3. หลกการ(Principle)
ความเปนกรดหาไดโดยไทเทรตโดยตรงกบสารละลายมาตรฐาน NaOH โดยใชเครอง
potentiometer
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 เครองPotentiometer
4.1.1 Compact titrator: 716 DMS titrino
4.1.2 Magneticswing-outstirrer:728Stirrer
4.1.3 Electrode: combined pH glass electrode
4.1.4 Exchange unit
4.2 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g
4.3 Beakerขนาด10และ100ml
4.4 Buretteขนาด50ml
4.5 Cylinderขนาด100ml
4.6 Erlenmeyerflaskขนาด125ml
4.7 Pipetteขนาด10,25และ50ml
4.8 Volumetricflaskขนาด100,250และ1,000ml
DMScF1049: การตรวจวเคราะหความเปนกรดในซอสบางชนด
โดยวธTitration
Determinationofacidityinsaucebytitration
50
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดเปนARgradeหรอเทยบเทาหรอดกวาและนา(H2O)ทใชเปนนากลนปราศจาก
กาซคารบอนไดออกไซด
5.1 1MNaOH:ชงNaOH40gลงในbeakerขนาด100mlละลายดวยH2Oแลวถายลงใน
volumetricflaskขนาด1000mlและปรบปรมาตรดวยH2O
5.2 0.5MNaOH:ปเปต1MNaOH50mlลงในvolumetricflaskขนาด100mlแลวปรบ
ปรมาตรดวยH2O
5.3 Potassiumhydrogenphthalate(KHC8H4O4)KHP:primarystandard(ทาใหแหงทอณหภม
105Cนาน2hr)
5.4 95% Ethanol
5.5 PhenolphthaleinTS:ชงphenolphthalein1gลงในbeakerขนาด10mlละลายดวย95%
95% ethanol แลวถายลงใน volumetric flask ขนาด 100ml และปรบปรมาตรดวย
ethanol 95%
5.6 สารละลายมาตรฐาน1Msodiumhydroxide
Standardization:ชงKHP5g (ทราบนาหนกแนนอน,W)ลงในerlenmeyer flaskขนาด
125ml เตมH2O 75ml เขยาใหละลาย แลวไทเทรตดวย 1MNaOH โดยใชเครอง
potentiometerหรอหยด phenolphthalein TS 1 - 2หยดแลวไทเทรตโดยใช burette
ขนาด50mlจนถงจดยตจะไดสารละลายสชมพออนบนทกปรมาตรทใช(V)
W × 1000 NaOH(M)= V × 204.223
เมอ W = นาหนกของKHP(g)
V = ปรมาตรของNaOHทใช(ml)
5.7 StandardbufferpH4,7และ10
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
สมตวอยางประมาณ2 - 3หนวยบรรจ เทผสมลงในภาชนะทสะอาดใหไดตวอยางประมาณ
200mlคนหรอกวนจนตวอยางเปนเนอเดยวกน
51
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedures)
7.1 ตรวจสอบเครองpotentiometerกอนใชงาน
7.1.1 ทาการตรวจสอบelectrodeโดยใชstandardbuffer4,7และ10
7.1.2 ลางelectrodeประมาณ2-3ครงดวยH2O
7.1.3 จมelectrodeลงในH2OใหอานคาไดประมาณpH6
7.2 ชงตวอยางประมาณ5-20gลงในerlenmeyerflaskขนาด125ml
7.3 เตมH2O50mlพรอมเปดเครองmagneticswing-outstirrer เพอทาการกวนตวอยางดวย
ความเรวปานกลาง
7.4 จมelectrode(4.1.3)ลงในตวอยาง
7.5 ทาการไทเทรตอยางเรวโดยการสงใหเครองปลอย0.1MNaOHเพอใหอานคาไดประมาณ
pH6
7.6 คอยๆปลอย0.1MNaOHอยางชาๆจนไดประมาณpH7
7.7 ทาการไทเทรตตอจนถงจดยตไดpHประมาณ8.1±0.2
7.8 บนทกปรมาตรทใช(V1)
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
V1 × molarity of NaOH × 0.006 × 100 8.1 ความเปนกรดคานวณเปนกรดอะซตก(%)= Weightofsample(g)× 0.1
8.2 การรายงานผล
รายงานผลความเปนกรดคานวณเปนกรดอะซตก หนวยรอยละโดยนาหนกทศนยม
1ตาแหนง
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 ทาการตรวจสอบ electrodeทกครงทใชงาน โดยวดคาmeasured slope แลวคานวณ
หาคาrelativeslopeซงคาrelativeslopeทคานวณไดตองไมนอยกวา95%
9.2 ทาการวเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง
53
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชเปนวธวเคราะหคาของกรดในนามนและไขมนทมาจากพชและสตวและผลตภณฑจากนามน
และไขมนแตไมรวมถงไข(waxes)
2. เอกสารอางอง(Reference)
AOCSOfficialMethodCd 3d-63 (Reapproved 2009),Acid value,OfficialMethods and
RecommendedPractices of theAmericanOilChemist Society (AOCS), 6th Edition 2009,
Commercial Fats and Oils: Section C.
3. หลกการ(Principle)
คาของกรด(acidvalue)หมายถงจานวนมลลกรมของpotassiumhydroxide(KOH)ททาปฏกรยา
เปนกลางพอดกบกรดอสระ (free acids) ในตวอยางนาหนก1กรมโดยจะตองไมมกรดอสระ
อนๆนอกเหนอจากกรดไขมน (fatty acids) คาของกรดอาจจะแสดงใหอยในรปของรอยละ
กรดไขมนอสระ(%freefattyacids)ดวยการแปลงดวยแฟคเตอรทเหมาะสม
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g
4.2 Buretteขนาด10mlความละเอยดของสเกล0.02ml
4.3 Cylinderขนาด250,500และ1,000ml
4.4 Erlenmeyerflaskขนาด250ml
4.5 Pipetteขนาด5ml
4.6 Volumetricflaskขนาด100และ1L
4.7 ขวดใสสารสชาขนาด2.5และ4L
DMScF1050: การวเคราะหคาของกรดในนามนและไขมน
DeterminationofAcidValueinOilsandFats
54
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดเปนARgrade หรอเทยบเทาหรอดกวา และนา (H2O)ทใชเปนนาปราศจาก
ไอออน(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm
5.1 สารละลายผสมtoluene:isopropylalcoholอตราสวน1:1(v/v)
5.2 1% phenolphthalein indicator: ละลาย phenolphthalein 1 g ดวย isopropyl alcohol
ปรบปรมาตรเปน100ml
5.3 สารละลายมาตรฐาน0.1MalcoholicKOH:ละลายKOHนาหนกประมาณ7gดวยH2O
20mlคนใหละลายถายลงvolumetricflaskปรบปรมาตรครบ1Lดวย95%ethanol
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
สมตวอยางนามนโดยควาภาชนะบรรจนามนขน-ลงหลายครงจนเปนเนอเดยวกนตวอยางไขมน
สมตวอยางแลวนาไปอนรอนอณหภมประมาณ40-50 Cในเวลาสนๆทาใหเปนเนอเดยวกน
รอใหเยนทอณหภมหองจงทาการวเคราะห
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 เตม phenolphthalein indicator 2mlลงในสารละลายผสม toluene: isopropyl alcohol
125mlทาใหเปนกลางดวย0.1MalcoholicKOHจนสารละลายเปนสชมพออน
7.2 ชงตวอยางใหไดนาหนกทแนนอน(ตามตารางขางลาง)ลงในflaskโดยเรมตนชงนาหนก
ท 20g เนองจากโดยปกตนามนและไขมนจะมคาของกรดทนอยคอมคาในชวง 0 - 1.0
แตถาหากมคาทเกนใหเลอกชงนาหนกตวอยางตามชวงคาของกรดนนๆ
0-1.0 20 0.05
1.1-4.0 10 0.02
4.1-15.0 2.5 0.01
15.1-75.0 0.5 0.001
>75 0.1 0.0002
Acidvalue นาหนกตวอยาง(±10%),g ความแมนของนาหนก,±g
7.3 เทสารผสม(7.1)ทงหมดลงในflaskตวอยาง(7.2)แกวงจนสารละลายเปนเนอเดยวกน
7.4 ไตเตรทดวย0.1MalcoholicKOHจนสารละลายเปลยนเปนสชมพออน ≥ 30secบนทก
ปรมาตร0.1MalcoholicKOHทใช
55
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.5 blankใชสารผสม(7.1)125ml
7.6 วเคราะหตวอยางละ2ซาหากมขอสงสยในผลการตรวจวเคราะหใหทาการตรวจวเคราะห
ซาทนทเพอการยนยนผล
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresult)
8.1 การคานวณ
(A-B)× M × 56.1 คาของกรด(มลลกรมโพแทสเซยมไฮดรอกไซดตอกรม)= W
M = ความเขมขนทแนนอนของสารละลายมาตรฐาน0.1MalcoholicKOH(M)
A = ปรมาตรของ0.1MalcoholicKOHทใชในการไตเตรทสารละลายตวอยาง(ml)
B = ปรมาตรของ0.1MalcoholicKOHทใชในการไตเตรทblank(ml)
W = นาหนกของตวอยาง(g)
56.1 = กรมตอโมลของKOH
8.2 รายงานปรมาณคาของกรดดวยคาเฉลยของการวเคราะห2ซาในหนวยมลลกรมโพแทสเซยม
ไฮดรอกไซดตอกรมทศนยม2ตาแหนง
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresult)
วเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง
10. รายละเอยดอน
การรายงานคาในรปของกรดไขมนอสระ(freefattyacids)ในรปของ%lauric,%oleicหรอ
%palmitic acid ใหคานวณโดยการหารคาของกรดทไดดวยแฟคเตอร 2.81, 1.99หรอ 2.19
ตามลาดบ
57
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชเปนวธตรวจวเคราะหปรมาณphenolic antioxidants ไดแก propyl gallate (PG), butylated
hydroxyanisol(BHA),butylatedhydroxytoluene(BHT),tert-butylhydroquinone(TBHQ),2,4,
5-trihydroxybutyrophenone (THBP), nordihydroguaiaretic acid (NDGA), 2,6-di-tert-butyl-
4-hydromethylphenol,(Ionox-100),octylgallate(OG)และdodecylgallate(DG)ในนามนไข
มนและเนยโดยเครองHPLC
2. เอกสารอางอง(Reference)
AOAC Official Method 983.15 Phenolic Antioxidants in Oils, Fats, and Butter Oil Liquid
Chromatographic Method.
3. หลกการ(Principle)
Phenolicantioxidantsถกสกดจากนามนหรอไขมนดวยacetonitrileจากนนระเหยสารทสกดได
ใหเกอบแหงแลวปรบปรมาตรดวยสารผสมของacetonitrileและ2-propanolตรวจวดปรมาณ
โดยเครองHPLC
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
4.1 HPLC-UVdetectorหรอdiodearraydetector
4.2 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.001กรมและ0.0001กรม
4.3 Rotary evaporator
4.4 Shaker
4.5 ชดกรองสารละลาย(solventclarificationkit)และชดกรองตวอยาง(sampleclarificationkit):
membranefilter(Nylon,0.45µm,dia.47mm),syringefilter(Nylon,0.45µm,dia.13mm)
4.6 Beakerขนาด10และ50ml
DMScF1051: การวเคราะหPhenolicAntioxidantsในนามน,ไขมนและเนย
DeterminationofPhenolicAntioxidantsinOils,Fatsand
ButterOil
58
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.7 Cylinderขนาด50,250และ500ml
4.8 Graduatedtubeขนาด10ml
4.9 Glass dropper
4.10Micropipetteขนาด10–100µl,100–1000µlและ1-5ml
4.11 Luer-locksyringeขนาด10ml
4.12 Roundbottomflaskขนาด500ml
4.13 Separatoryfunnelขนาด125,250,500และ1L
4.14 Volumetricflaskขนาด5,10,20และ1L
4.15 Volumetricpipetteขนาด50ml
(rinseเครองแกวดวยchloroform,acetoneและmethanolตามลาดบ)
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดเปนAR grade ยกเวนทระบไว และนา (H2O)ทใชเปนนาปราศจากไอออน
(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm
5.1 Acetone
5.2 Acetonitrile
5.3 Acetonitrile HPLC grade
5.4 Chloroform
5.5 Glacial acetic acid HPLC grade
5.6 n-Hexane
5.7 Methanol
5.8 Methanol HPLC grade
5.9 2-Propanol HPLC grade
5.10 H2O HPLC grade
5.11 Saturated acetonitrile: เตม n-hexane 100mlลงใน separatory funnel ขนาด 1Lทม
acetonitrile600mlเขยาอยางแรง2minตงทงไวใหแยกชนใชชนลาง(saturatedacetonitrile)
5.12 Saturated n-hexane: เตม acetonitrileARgrade 25mlลงใน separatory funnelขนาด
250mlทมn-hexane150mlเขยาอยางแรง2minตงทงไวใหแยกชนใชชนบน(saturated
n-hexane)
5.13 สารละลายผสมacetonitrile+2-propanol(1+1):ปเปตacetonitrileHPLCgrade50ml
ลงในvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวย2-propanolHPLCgrade
59
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.14 5% acetic acid (mobile phase):ปเปต glacial acetic acidHPLCgrade 50mlลงใน
volumetric flask ขนาด 1 L ปรบปรมาตรดวย H2OHPLC grade แลวกรองผาน
membrane filter
5.15 สารมาตรฐาน:purity≥ 95%
5.15.1 Stock standard solution (1,000 µg/ml): ชงสารมาตรฐานแตละชนด 0.1000 g
แยกใส beaker ขนาด10ml ถายใส volumetric flask ขนาด 10ml ละลายและ
ปรบปรมาตรดวยacetonitrile+2-propanol(1+1)
5.15.2 Intermediatemixstandardsolution(100µg/ml):ปเปต2mlของstockstandard
solution ใส volumetric flaskขนาด 20mlปรบปรมาตรดวย acetonitrile + 2
-propanol(1+1)
5.15.3 Working standard solution (0.5, 1, 5, 30และ 50µg/ml):ปเปต 25, 50, 250,
1,500และ2,500µlของintermediatemixstandardsolutionแยกใสvolumetric
flaskขนาด5mlปรบปรมาตรดวยacetonitrile+2-propanol(1+1)
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
-
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 ชงตวอยาง5.000±0.005gในbeakerขนาด50mlถายใสseparatoryfunnelขนาด125ml
โดยลางbeakerดวยsaturatedn-hexaneปรมาตร20ml(ไขมนหรอเนยใหละลายทอณหภม
ประมาณ40Cกอนนาไปชง)สกดดวยsaturatedacetonitrile50ml(เขยาอยางแรง2min)
ตงทงไวใหแยกชนไขชนacetonitrile(ชนลาง)ลงในseparatoryfunnelขนาด250ml
7.2 สกดซาดวย saturated acetonitrile 50mlอก 2ครง เกบ acetonitrile รวมใน separatory
funnelเดมตงทงไวใหแยกชนไขชนนามนทอาจจะมเหลอ(ชนลาง)ทงแลวถายacetonitrile
ลงในroundbottomflask
7.3 ระเหยลดปรมาตร acetonitrile ดวยเครอง rotary evaporator ทอณหภมไมเกน 40 C
จนเหลอประมาณ2-3ml(ไมควรใชเวลาเกน15minและกรณวเคราะหTBHQตองระวง
ไมระเหยจนแหง)
7.4 ใช glass dropper ถาย acetonitrile ทเหลอลงใน graduated tube ขนาด 10ml ลาง
roundbottomflaskดวยacetonitrileถายลงรวมในtubeจนได5mlลางซาดวย2-propanol
จนครบปรมาตร10mlผสมใหเขากนแลวกรองดวยsyringefilter
60
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.5 ฉดworking standard solution เขาเครองHPLCสรางกราฟมาตรฐานระหวางpeakarea
และความเขมขนของสารมาตรฐาน
7.6 นาสารละลายตวอยางจากขอ 7.4 ฉดเขาเครอง HPLC แลวหาปรมาณโดยอานจาก
กราฟมาตรฐาน
7.7 สภาวะเครองHPLC
Column:reversephaseC18(5µm,4.6× 250mm)หรอเทยบเทา Detector: UV 280 nm
Flowrate:1.50ml/min
Injectionvolume:20µl
MobilephaseแบบGradient
0 15 15 70 10 50 50 0 15 50 50 0 17 15 15 70 24 15 15 70
Time Acetonitrile Methanol 5% acetic acid (min) (%) (%) (%)
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 การคานวณปรมาณphenolic antioxidants (PG,BHA,BHT, TBHQTHBP,NDGA,
Ionox-100,OGและDG)
Co × 10 × D Cs(mg/kg) = Wt
เมอ Co = ความเขมขนของphenolicantioxidantsทอานจากกราฟมาตรฐาน(µg/ml)
Wt = นาหนกตวอยาง(g)
D = dilution factor
8.2 รายงานปรมาณphenolicantioxidants(PG,BHA,BHT,TBHQTHBP,NDGA,Ionox-100,
OGและDG)ทพบในหนวยมลลกรมตอกโลกรม(mg/kg)ทศนยม2ตาแหนง
61
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 ตรวจสอบความพรอมของเครองHPLC (system suitability) โดยฉดสารมาตรฐานความ
เขมขน 5 µg/ml อยางนอย 5ซา คานวณคา% relative standard deviation (%RSD)
ของRetentiontime(RT)ไมเกน2และ%RSDของpeakareaไมเกน2.5
9.2 ฉดสารมาตรฐานอยางนอย3ระดบความเขมขนเพอเตรยมกราฟมาตรฐานคาr2 ≥ 0.995
9.3 ฉดสารมาตรฐานความเขมขน5µg/mlคนทก10ตวอยางความเขมขนทอานไดไมควรเกน
5%จากความเขมขนของสารมาตรฐานขอ9.1
9.4 วเคราะหตวอยาง 2ซา และblank sample ทเตมสารมาตรฐาน10mg/kg2ซาคานวณ
คา%recoveryอยในชวง80–110%และ%RPDไมเกน15%
63
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชวเคราะหปรมาณสารโพลารในนามนและไขมนทมาจากพชและสตวรวมทงนามนและไขมน
ปรงอาหารทผานการทอด
2. เอกสารอางอง(Reference)
AOCSOfficialMethodCd20-91 (Reapproved 2009):DeterminationofPolarCompounds
in Frying Fats. Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemist
Society(AOCS),6th Edition 2009, Commercial Fats and Oils: Section C.
3. หลกการ(Principle)
นามนและไขมนปรงอาหารทผานการทอดเมอนามาวเคราะหดวยเทคนคคอลมนโครมาโทกราฟ
จะถกแยกออกเปนสารโพลาร(polarcompounds)และสารนอนโพลาร(non-polarcompounds)
และสารนอนโพลารจะถกชะออกจากคอลมนปรมาณสารโพลารคานวณไดจากนาหนกทแตกตาง
กนระหวางนาหนกตวอยางเรมตนลบดวยนาหนกสารนอนโพลารทถกชะออกจากคอลมน
4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus) 4.1 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g
4.2 เครองชงทมความละเอยด0.1หรอ0.01g
4.3 ตอบรอน(hotairoven)
4.4 อางนารอน(waterbath)
4.5 เครองระเหยสญญากาศ(vacuumrotaryevaporator)
4.6 Beakerขนาด10,100และ500ml
4.7 Chromatographic glasscolumnขนาด 21mm id, ความยาวประมาณ450mmพรอม
teflonstopcockและground-glassjoint
DMScF1052: การวเคราะหสารโพลารในนามนและไขมนโดยวธคอลมน
โครมาโทกราฟ
DeterminationofPolarCompoundsinOilsandFatsby
ColumnChromatography
64
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.8 Cylinderขนาด100,500และ1L
4.9 Desiccatorwithsilicagel
4.10Dropping funnel ขนาด 100หรอ 250ml, ground-glass joint ขนาดทสามารถตอกบ
columnได
4.11Flatbottomflaskขนาด250ml,groundneck
4.12Glassfunnelขนาด3.5cmdiam.และ8cmdiam.
4.13Glassrodความยาวประมาณ60cm
4.14 Porcelaindishขนาด20cmdiam.
4.15Roundbottomflaskขนาด250ml,groundjointหรอflaskอนใชในการเตรยมsilicagel
4.16Separatingfunnelขนาด250ml
4.17Volumetricpipetteขนาด20และ50ml
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดเปนAR grade ยกเวนทระบไว และนา (H2O)ทใชเปนนาปราศจากไอออน
(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity≥ 18 MΩ-cm
5.1 Lightpetroleumether(bp40-60C)
5.2 Diethyl ether
5.3 Elutionsolvent:ผสมpetroleumetherและdiethyletherอตราสวน87/13(v/v)
5.4 Seasand(purifiedbyacidandcalcined)
5.5 Silicagel 60ขนาดparticle size 0.063 - 0.200mm (70 - 230meshASTM),MerckN
7734หรอเทยบเทา
5.6 Nitrogen(99.0-99.8%)หรอดกวา
5.7 Cottonwoolหรอสาลบรสทธ
5.8 Hydrophobic filter paper
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
ตวอยางนามนหลงการสมและผสมใหเขากนหากพบสงเจอปนใหกรองออกกอนตวอยางทม
นาเจอปนอยใหกรองโดยใช hydrophobic filter paper และตวอยางทอยในรปของแขงหรอ
กงแขงกงเหลวใหอนรอนพอหลอมเปนเนอเดยวกนทอณหภมประมาณ40 - 50 C รอใหเยนท
อณหภมหองกอนชงนาหนก
65
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedures)
7.1 การเตรยมsilicagel(5%H2O):นาsilicagelใสลงในporcelaindishนาไปอบในตอบรอน
ทอณหภมประมาณ160 C เปนเวลาไมนอยกวา4hr เพอ activate silicagelกอนใชงาน
จากนนรอsilicagelใหเยนลงทอณหภมหองในdesiccatorแลวปรบsilicagelใหมความชน
รอยละ5โดยชงsilicagel152gลงในflaskเตมH2O8gแลวเขยาใหเขากนอยางทวถง
เปนเวลาประมาณ30min
7.2 การเตรยมคอลมน
7.2.1 เตม elution solventประมาณ30mlลงในคอลมนทเตรยมไว โดยปด stopcock
แลวนาสาลอดปลายคอลมนโดยใชแทงแกวยาวชวยดนสาลและไลฟองอากาศ
7.2.2 ชง silica gel (5%H2O)25 gลงในbeakerขนาด100 ml เตม elution solvent
ประมาณ80mlเตรยมใหเปนslurry
7.2.3 เปด stopcockของคอลมนคอยๆ เท silica gel slurryลงในคอลมน ให elution
solventออกมาใหเหลอระดบเหนอsilicagelประมาณ10cm
7.2.4 เตม sea sandประมาณ 4 g ลงในคอลมนแลวเปดให elution solvent ออกมา
จนเหลออยเหนอชนของseasandเลกนอย
7.3 การวเคราะห
7.3.1 ชงตวอยางนาหนก2.4-2.6±0.001gลงในvolumetricflaskขนาด50mlละลาย
ดวยelutionsolvent20mlแลวปรบปรมาตรใหครบเขยาใหเปนเนอเดยวกน
7.3.2 ปเปตสารละลายตวอยาง ปรมาตร 20ml ลงในคอลมน โดยระวงผวหนาของ
คอลมนไมใหเกดการฟงกระจาย
7.3.3 นาFlatbottomflaskขนาด250mlทอบแหงท103 ± 2Cเปนเวลา1hrทาใหเยน
ในdesiccatorและชงนาหนกแลววางรองรบปลายคอลมน
7.3.4 เปดstopcockมอตราการไหลประมาณ2.1-2.5ml/minใหเหลอสารละลายตวอยาง
อยเหนอผวหนาคอลมนเลกนอยและไมใหsilicagelแหง
7.3.5 เทelutionsolventปรมาตร150mlลงในdroppingfunnelแลวตอเขากบground
jointดานบนของคอลมนแลวคอยๆเปดstopcockใหelutionsolventหยดลงใน
คอลมนเพอเปนตวชะสารนอนโพลารใหไหลออกจากคอลมนลงไปรวมอยใน
flaskโดยใหอตราการไหลออกจากคอลมนอยในชวงประมาณ2.1-2.5ml/minหรอ
ใชเวลาในการชะรวมประมาณ60-70min
7.3.6 หลงการชะเสรจใหลางสารทตดอยภายนอกปลายคอลมนดวย elution solvent
อกประมาณ 20ml เกบรวมใน flask เดม (ถาตองการวเคราะหสารโพลารทถก
66
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ดดซบบน silica gel ในคอลมนสามารถชะออกดวย diethyl etherดวยปรมาตร
150mlลงในflaskอกใบหนงแลวดาเนนการเชนเดยวกบการทาในสารนอนโพลาร
ขนตอนนเปนการทดสอบประสทธภาพการแยกสวนของคอลมน)
7.3.7 นาflaskไประเหยelutionsolventออกดวยvacuumrotaryevaporatorทอณหภม
ของอางนาประมาณ 45 C หรอระเหยในอางนารอนทอณหภมประมาณ 60 C
ในตดดควนจากนนเปาไลตวทาละลายทเหลออยดวยแกสไนโตรเจนเชดภายนอก
flaskใหแหงแลวนาไปอบในตอบรอนทอณหภม103 ± 2Cเปนเวลา2hrทงใหเยน
ในdesiccatorแลวชงนาหนกอบซาเปนเวลา1hrจนนาหนกคงท(ไมเกน0.001g)
นาคาทนอยกวาไปคานวณหาปรมาณสารโพลาร
7.3.8 วเคราะหตวอยางละ1ซาถาผลการตรวจวเคราะหนาสงสยใหวเคราะหอก1ซา
7.3.9 วเคราะห blank ดาเนนการวเคราะหเชนเดยวกบตวอยาง โดยไมมตวอยาง
คาความแตกตางระหวาง flask เปลากบ flask+ residuesตองมคาตางกนไมเกน
+0.0005gหากเกนจะตองทบทวนสารเคมทใชในการวเคราะหทงหมด(คาblank
ทไดไมตองนาไปใชในการคานวณ)
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 การคานวณ
m - m1 × 100 สารโพลาร(g/100g) = m
m = นาหนกตวอยางในสารละลายตวอยาง20mlทloadลงในคอลมน(g)
m1 =สารnon-polarทชะออกจากคอลมน(g)
8.2 การรายงานผล
รายงานผลปรมาณสารโพลารในหนวยกรมตอ100กรม(g/100g)ดวยทศนยม1ตาแหนง
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
-
67
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
10. รายละเอยดอน
ขอมลPrecisionปรากฏในตารางท1และ2
ตารางท1ResultsofanIUPACcollaborativestudyonthedeterminationofpolarcompounds.
Number of laboratories accepted 9 9 8 8Number of results accepted 18 18 16 16Meanofthelaboratoryvalues(%m/m) 8.00 7.30 11.50 25.90
RepeatabilityStandard deviation, sr 0.36 0.33 0.23 0.52Relative standard deviation, RSDr % 4.5 4.5 2.0 2.0Repeatability value, 2.8 × sr 1.02 0.94 0.66 1.47
ReproducibilityStandard deviation, sR 0.37 0.39 0.48 0.77Relative standard deviation, RSDR % 4.6 5.3 4.2 3.0Reproducibility value, 2.8 × sR 1.04 1.09 1.35 2.17
TestSample 1 2 3 4
TestSample 1 2 3 4 5
Number of laboratories accepted 13 13 11 14 10 Number of results accepted 26 26 22 28 20Meanofthelaboratoryvalues(%m/m) 16.01 22.28 11.74 32.06 20.80
RepeatabilityStandard deviation, sr 0.27 0.29 0.34 0.33 0.14 Relative standard deviation, RSDr % 1.7 1.3 2.9 1.0 0.7Repeatability value, 2.8 × sr 0.74 0.81 0.95 0.92 0.38
Reproducibility Standard deviation, sR 1.04 1.29 0.56 1.66 0.61Relative standard deviation, RSDR % 6.5 5.8 4.8 5.2 3.0Reproducibility value, 2.8 × sR 2.92 3.61 1.58 1.64 1.72
ตารางท2Resultsofa2,000collaborativestudyonthedeterminationofpolarcompounds.
69
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชในการวเคราะหสารเคมปองกนกาจดศตรพชกลมคารบาเมตตกคางในผกและผลไมทมปรมาณ
นาในตวอยางมากกวารอยละ75และครอบคลมสารกลมคารบาเมตไดแกaldicarb,bufencarb,
carbaryl,carbofuran,methiocarb,methomyl,oxamylและอนพนธของสารเหลาน(metabolites)
2. เอกสารอางอง(Reference)
AOACOfficialMethod985.23N-MethylcarbamateInsecticideandMetaboliteResidues
3. หลกการ(Principle)
สารเคมปองกนกาจดศตรพชกลมคารบาเมตทตกคางในผกและผลไมถกสกดออกจากตวอยาง
โดยปนกบsolventทเหมาะสมแลวทาใหสารบรสทธโดยใชเทคนคliquid–liquidpartitionและ
Nuchar-CelitecolumnchromatographyหลงจากนนตรวจวดชนดและปรมาณดวยHPLC,in-line
post-columnderivatizationและfluorescencedetector
4. เครองมอ(Apparatus)
4.1 เครองชงทมความละเอยด0.01gหรอ0.001g
4.2 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001gหรอ0.00001g
4.3 เครองบดปนความเรวสง(homogenizer)
4.4 ชดเครองระเหยสญญากาศ(vacuumrotaryevaporator)
4.5 Hot air oven
4.6 Hotplatewithmagneticstirrer
4.7 Muffle furnace
4.8 HPLC-fluorescence detector
DMScF1053: การวเคราะหปรมาณสารเคมปองกนกาจดศตรพช
กลมคารบาเมตในผกผลไม
Determinationofcarbamatepesticideresiduesinvegetables
andfruits
70
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.9 Post-column derivatization instrument
4.10 อปกรณ
4.10.1 Beakerขนาด2L
4.10.2 Büchner funnel, porcelain, 13 cm diameter
4.10.3 Chromatographic column 22 mm. id. × 300 mm., teflon stopcock, coarse
porosity fritted disc
4.10.4 Cylinderขนาด100,250,500ml
4.10.5 Filterflaskขนาด1L
4.10.6 Filter membrane PTFE 13 mm, 0.20 µm
4.10.7 Glassfunnelขนาด75mmid
4.10.8 GlassstopperedErlenmeyerflaskขนาด250ml
4.10.9 Glasssyringeขนาด10ml
4.10.10 Round-bottomflask500ml,1Lและ2L
4.10.11 Separatory funnel 250, 500 ml
4.10.12Vialทมscrewcapขนาด8ml
4.10.13 กระดาษกรองWhatmanNo.1เสนผานศนยกลาง125mmหรอเทยบเทา
5. สารเคม(Reagent)
สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeยกเวนทระบไวและนา(H2O)ทใชเปนนาปราศจาก
ไอออน(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity≥ 18 MΩ-cm
5.1 Acetonitrile (CH3CN)HPLCgrade
5.2 Dichlorodimethylsilane
5.3 Hydrochloricacid(HCl)
5.4 Isopropanol
5.5 Methanol(MeOH)HPLCgrade
5.6 Methylene chloride (CH2Cl2)HPLCgrade
5.7 Petroleum ether HPLC grade
5.8 Sodiumchloride(NaCl)
5.9 Toluene HPLC grade
5.10 Sodium sulfate (Na2SO4)anhydrous,granularเผาทอณหภม600 Cอยางนอย3hrแลว
เกบในภาชนะแกวสชาปดสนท
71
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.11 Charcoal:ชงcharcoal100gใสในbeakerขนาด2L เตมHCl700mlปดดวยกระจก
นาฬกาตมนาน1hr(ขณะตมใชmagneticbarกวนสารตลอดเวลา)เตมนากลนอก700ml
ตมตอไปอก 30minปลอยทงใหเยน ลางตะกอนดวยนากลนจนเปนกลางลางตอดวย
MeOH500mlตามดวยCH2Cl2500mlปลอยทงไวจนแหงในhood เกบใสในขวดแกว
แลวนาไปอบทอณหภม 120 C นาน 4 hr หลงจากนนปลอยใหเยนใน desiccator
เมอนาออกจากdesiccatorปดฝาใหสนทไวใชงานตอไป
5.12 Silanizedcelite:ชงcelite545นาหนก150gใสในbeakerขนาด2LเตมHCl:H2O(1:1)
ปรมาตร 1 L ปดดวยกระจกนาฬกา ตมจนกระทงเดอด (ขณะตมใช magnetic bar
กวนสารตลอดเวลา)หลงจากเดอดแลวตมตออก10minปลอยทงใหเยนลางตะกอนดวย
H2Oจนเปนกลาง ลางตอดวยMeOH 500ml ตามดวยCH2Cl2 500mlปลอยทงไว
จนแหงในhoodเกบใสในขวดแกวอบทอณหภม120Cคางคน(มากกวา12hr)แลวปลอย
ใหเยนในdesiccatorนาไปเตมdichloromethylsilane 3ml ในhood เขยาใหเขากนนาน
15min(ในขณะเขยาใหเปดฝาเปนชวงเพอลดแรงดนภายในขวด)ตงทงไวทอณหภมนาน
4 hr แลวเตมMeOH 500ml คนใหเขากน ตงทงไว 15min นาตะกอนไปลางดวย
isopropanolจนเปนกลางปลอยทงไวจนแหงในhoodเกบใสขวดแกวอบทอณหภม105C
นาน 2 hrหลงจากนนปลอยใหเยนในdesiccator เมอนาออกจากdesiccatorปดฝาให
สนทไวใชงานตอไป
5.13 Sodiumhydroxide (NaOH) solution 0.05N: เตรยม supernateNaOHโดยใชNaOH
1สวนละลายดวยH2Oทตมไล carbondioxideแลว 1สวน เกบในขวดแกวทมฝาปด
ตงทงไวประมาณ10 วน เพอให sodium carbonateตกตะกอนจนหมดจากนนเตรยม
5NNaOHโดยปเปตสวนใส27mlใสในvolumetric flask100ml เตมH2O จนครบ
ปรมาตรแลวผสมใหเขากนแลวเตรยม0.05NNaOHโดยปเปตของ5NNaOH10ml
ใสในvolumetricflask1LเตมH2Oจนครบปรมาตรแลวผสมใหเขากน
5.14 Sodiumboratebuffersolution0.05M:ชงsodiumtetraboratedecahydrate19.1gละลาย
ดวยH2O500mlใสในvolumetricflask1Lใชultrasonicbathชวยในการละลายแลวเตม
H2Oจนครบปรมาตรผสมใหเขากน
5.15 Reaction solution: ชง o-phthalaldehyde 100mg ละลายดวยMeOH 10ml ใสใน
volumetric flask 1 Lทม 0.05M sodium borate buffer solutionประมาณ 500ml
เตม 2-mercaptoethanol 1mlปรบปรมาตรใหครบดวย 0.05M sodium borate buffer
solutionผสมใหเขากน
72
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 นาตวอยางผก-ผลไม1kgมาบดปนใหละเอยดดวยเครองบดปนทเหมาะสมเชนblender,
rotary cutter
6.2 เกบตวอยางทบดปนแลวทอณหภมตากวา-15Cเมอไมไดวเคราะหทนท
6.3 นาตวอยางมาวางไวจนถงอณหภมหองกอนทาการวเคราะห
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การสกด : ชงตวอยางผกและผลไมทบดละเอยดแลว 150 g ใสใน beaker ขนาด 1 L
เตมMeOH300mlนาไปปนดวยเครองบดปนความเรวสงนาน2minกรอง(vacuumfilter)
ผานBüchnerfunnelทมกระดาษกรองNo.1เกบfiltrateในsuctionflaskขนาด1Lคานวณ
ปรมาตรสารละลายจากตวอยางผกและผลไมดงน
ปรมาตรของตวอยาง100g
= H2O(ml)ในตวอยาง100g+200mlMeOH–10mlcontractionfactor
ตวงสารละลายทกรองไดปรมาตรเทากบตวอยาง 100 g (ตามทคานวณได) ใสลงใน
round-bottom flask ขนาด 2 L เตม H2O จนครบ 100ml นาไประเหยดวยเครอง
ระเหยสญญากาศจนปรมาตรของสารละลายเหลอประมาณ75ml
7.2 liquid – liquid partition
7.2.1 นาสารละลายทไดจากการระเหยใสในseparatoryfunnelขนาด500mlเตมNaCl
15gเขยาจนละลายหมดเตมCH3CN75mlเขยา30secแลวตงทงไวจนแยกชน
7.2.2 ถายชนนา (ชนลาง) ใสใน separatory funnelขนาด250ml เตมCH3CN 50 ml
เขยา20secตงทงไวจนแยกชนแลวทงชนนา(ชนลาง)
7.2.3 เตม20%NaClsolution25mlในseparatory funnelขนาด500ml (7.2.1) เขยา
20 sec แลวตงทงไวจนแยกชน ถายชนนา (ชนลาง) ลงใน separatory funnel
ขนาด250ml(7.2.2)เขยา20secแลวตงทงไวจนแยกชนแลวทงชนนาไป
7.2.4 เตมpetroleumether100mlลงในseparatoryfunnelขนาด500ml(7.2.3) เขยา
20secแลวตงทงไวจนแยกชนแยกชนลาง(ชนCH3CN)ใสในseparatoryfunnel
ขนาด500mlใบท2
7.2.5 นาชนCH3CNในseparatoryfunnelขนาด250ml(7.2.3)สกดซากบpetroleum
ether(7.2.4)เขยา20secแลวตงทงไวจนแยกชนแยกชนลาง(ชนของacetonitrile)
รวมใสใน separatory funnel ขนาด 500ml ใบท 2 สวนชน petroleum ether
เตม CH3CN 10ml เขยา 20 sec ตงทงไวใหแยกชน แยกชนลางซงเปนชน
CH3CNรวมใสในseparatoryfunnelขนาด500mlใบท2
73
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2.6 เตม 2%NaCl solution 50ml และCH2Cl2 100ml ลงใน separatory funnel
ขนาด500mlใบท2เขยา20secตงทงไวจนแยกชน
7.2.7 ไขชน solvent (ชนลาง) ลงในErlenmeyer flask ขนาด 500ml เตมNa2SO4
anhydrous ทละนอย ๆ แกวงเบา ๆ จนเหนวา Na2SO4 เปนผงรวนไมจบกน
เปนกอนแลวกรองสารละลายผานกระดาษกรองทม Na2SO4 อยเลกนอยลงใน
round-bottomflaskขนาด1L
7.2.8 ลางชนนา (ชนบน)จาก 7.2.7ดวยCH2Cl2 25ml 2ครง โดยแกวงเบาๆ ระวง
อยาใหเกด emulsion ระหวางการลาง แลวไขชนลางลงใน Erlenmeyer flask
ขนาด500mlทาเชนเดยวกบ7.2.7
7.2.9 นาสารละลายทกรองได ซงรวมอยใน round-bottom flaskขนาด 1L ไประเหย
ดวยเครองระเหยสญญากาศจนเกอบแหง เตมCH2Cl2 10ml เพอดาเนนการตอ
ในขอ7.3การทาใหบรสทธ
7.3 การทาใหบรสทธ
7.3.1 เตรยม chromatographic columnทม round-bottom flaskขนาด500ml รองรบ
ตอกบvacuumaspirator
7.3.2 ใส silanized celite 0.5 g ใน chromatographic column เคาะขาง column เบาๆ
ให packingmaterialมผวหนาเรยบแลวใส charcoal-celitemixture (1+ 4) 5 g
เคาะขาง column เบา ๆ ใหมผวหนาเรยบ เปด stopcock แรงดดจาก vacuum
aspiratorจะทาใหpackingmaterialแนนสมาเสมอ
7.3.3 ลาง(prewash)columnดวยtoluene–CH3CN(1+3)50mlเมอprewashsolution
เหลออยเหนอ packingmaterialประมาณ 0.5 cmปด stopcockปลด vacuum
aspiratorออกทงeluateแลวตอvacuumaspiratorและเปลยนround-bottomflask
500mlรองรบeluateใบใหม
7.3.4 ผานสารสกดทไดจากขอ 7.2.9ปรบอตราการไหลประมาณ5ml/min ใชCH2Cl2
10mlrinseลางround-bottomflaskทใสสารละลายตวอยางแลวถายลงในcolumn
รอจนsolutionอยเหนอผวหนาpackingmaterialเลกนอยจงเตมtoluene–aceto
nitrile(1+3)25mlและ100mlตามลาดบ
7.3.5 นา eluate ไประเหยดวยเครองระเหยสญญากาศจนเกอบแหง เตมMeOH10ml
ระเหยตอไปจนแหงแลวเตมMeOHอก5ml เพอละลายสารทเหลอทงหมดทนท
แลวกรองผาน syringe filter PTFE, 13mm, 0.20µm ใสใน vial ขนาด 8ml
สาหรบการตรวจวดชนดและปรมาณตอไป
74
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4 การหาปรมาณดวยHPLC
สภาวะของเครอง HPLC, post-column derivatization และ fluorescence detector
(สภาวะของเครองมอสามารถเปลยนแปลงไดตามความเหมาะสม)
Mobile phase: programmable HPLC gradient system
เวลา(min) H2O(%) CH3CN(%)
0 88 12
30 30 70
35-45 88 12
Flowrate:mobilephase1.0ml/min,reactionsolution0.3ml/min
Analyticalcolumn:ZorbaxC8 5 µm, size 25 cm × 4.6mmidหรอเทยบเทา Guard column: C8 5 µm
Columnoventemperature:35C
Reactortemperature:100C
Injectionvolume:10µl
Fluorescencedetector:Excitationwavelength345nmและEmissionwavelength455nm
ปรบความไว(sensitivity)ของการตรวจวเคราะหโดยฉดสารมาตรฐานcarbofuran10ngใหได
ความสง50× 5% full scale deflection
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 การคานวณ
ในการคานวณใชวธเทยบกบสารมาตรฐานซงพนทของสารมาตรฐานและพนทของสาร
ทพบในตวอยางตองมความแตกตางกนไมเกน ± 25% และคานวณปรมาณทพบ
โดยใชสตรดงน
พนทใตpeakสารทพบในตวอยาง× ความเขมขนของสารมาตรฐาน(µg/ml)ปรมาณทพบ(mg/kg)= พนทใตpeakของสารมาตรฐาน× ความเขมขนของตวอยาง(g/ml)
8.2 การรายงานผล(Testreport)
รายงานปรมาณทตรวจพบหนวยเปนมลลกรมตอกโลกรม(mg/kg)ทศนยม2ตาแหนง
75
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 วเคราะหspikedsampleอยางนอย10%ของตวอยางทระดบ5เทาLOQ
9.2 วเคราะห2ซา(duplicate)อยางนอย10%ของตวอยาง
10. รายละเอยดอน
10.1 %recoveryของการวเคราะหspikedsampleตองอยในเกณฑยอมรบ70-120%
10.2 ในการวเคราะห2ซา(duplicate)คาRPDตองไมเกน20%
77
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชเปนวธวเคราะหปรมาณ3-chloro-1,2-propanediol(3-monochloropropane-1,2-diol;3-MCPD)
ในผลตภณฑอาหาร hydrolyzed vegetable protein (HVP) ซอสถวเหลองซปกอนซปผง
มอลตสกดไสกรอกปลาเนยแขงแปงธญพชขนมปงและผลตภณฑอนๆ
2. เอกสารอางอง(References)
AOAC Official Methods of Analysis 2000.01 Determination of 3-chloro-1, 2-propanediol
(3-MCPD)infoodsandfoodingredients
3. หลกการ(Principle)
เตม 3-Chloro-1, 2-propanediol-d5 (3-MCPD-d5) ทใชเปน internal standardลงในตวอยาง
แลวเตมสารละลายเกลอ ปนผสมใหเปนเนอเดยวกนแลวเตมExtrelutTM20ml refill pack
ลงในสารละลายตวอยางคลกใหเขากนแลวบรรจลงในคอลมนแกวชะสารnonpolarออกจาก
ตวอยางดวยสารละลายผสม hexane-diethyl ether และชะสาร 3-MCPDและ 3-MCPD-d5
ในตวอยางดวย diethyl ether ลดปรมาณสารละลายในสารสกดทได แลวนามา derivatize
และวเคราะหหาปรมาณ3-MCPDดวยGaschromatograph–massspectrometer(GC/MS)
4. เครองมอ(Apparatus)
4.1 เครองชงทมความละเอยด0.01g
4.2 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g
4.3 GC/MS
4.4 เครองใหความรอน(aluminumblockheater)
4.5 เครองหมนเหวยง(centrifuge)
DMScF1054: การวเคราะหปรมาณ3-chloro-1,2-propanediol(3-MCPD)
ในอาหารและสวนผสมอาหาร
Determination of 3-chloro-1, 2-propanediol (3-MCPD)
infoodsandfoodingredients
78
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.6 เครองระเหย(rotaryevaporator)
4.7 เครองผสมสาร(vortexshaker)
4.8 Ultrasonic bath
4.9 อปกรณ
4.9.1 Beakerขนาด250ml
4.9.2 Glass chromatography tube: 40 ×2cmidwithsinteredglassdiskandtap
4.9.3 Gas-tightsyringeขนาด1ml
4.9.4 กระดาษกรองWhatmanNo.4หรอเทยบเทา
4.9.5 Volumetricflaskขนาด10,25และ100ml
5. สารเคม(Reagents)
สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeยกเวนทระบไวและนา(H2O)ทใชเปนนาปราศจาก
ไอออน(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity≥ 18 MΩ-cm
5.1 สารมาตรฐาน3-chloro-1,2-propanediol(3-MCPD)
5.2 สารมาตรฐาน3-chloro-1, 2-propanediol-d5 (3-MCPD-d5) –Minimum98% isotopic
purity
5.3 Diethylether,Glass-distilledgradeหรอเทยบเทา
5.4 Hexane,Glass-distilledgradeหรอเทยบเทา
5.5 สารละลายผสมdiethyl ether- hexane (1+9) –ผสมdiethyl ether 100mlกบ hexane
900mlเขยาใหเขากน
5.6 ExtrelutTM 20 mL refill packs
5.7 Ethyl acetate
5.8 Heptafluorobutyrylimidazole
5.9 Sodium sulfate (Na2SO4)
5.10 สารละลาย5Msodiumchloride(NaCl)-ชงNaCl290gละลายในH2Oแลวถายลงใน
volumetricflaskขนาด1LปรบปรมาตรดวยH2O
5.11 2, 2, 4-trimethylpentane
79
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
6.1 ตวอยางทเปนของเหลว เทผสมลงในภาชนะทสะอาดคนหรอกวนจนตวอยางเปน
เนอเดยวกน
6.2 ตวอยางทเปนของแหงเชนซปกอนธญพชขนมปงเนยแขงเนอสตวและผลตภณฑอนๆ
บดใหละเอยดเปนเนอเดยวกน
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน3-MCPD
7.1.1 Stock standard solution 1000 µg/ml- ชงสารมาตรฐาน25mgลงในvolumetric
flaskขนาด25mlละลายและปรบปรมาตรดวยethylacetate
7.1.2 Intermediate standard solution 100µg/ml -ปเปต stock standard solution 1ml
ลงในvolumetricflaskขนาด10mlปรบปรมาตรดวยethylacetate
7.1.3 Spiking standard solution 2 µg/ml–ปเปตintermediatestandardsolution0.2ml
ลงในvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวยethylacetate
7.2 การเตรยมสารละลายมาตรฐานinternalstandard3-MCPD-d5
7.2.1 Stock standard solution 1,000 µg/ml- ชง 3-MCPD-d525mgลงในvolumetric
flaskขนาด25mlละลายและปรบปรมาตรดวยethylacetate
7.2.2 Working standard solution 10 µg/ml - ปเปต stock standard solution 1ml
ลงในvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวยethylacetate
7.3 การเตรยมcalibrationstandard3-MCPDความเขมขน0.00,0.05,0.10,0.50,1.00และ
2.00 µg/mL -ปเปต intermediate standard solution 0, 12.5, 25, 125, 250และ500µl
ลงในvolumetricflaskขนาด25mlปรบปรมาตรดวย2,2,4trimethylpentane
7.4 การเตรยมตวอยางทดสอบ
7.4.1 Hydrolyzed vegetable protein (HVP)และซอสปรงรส -ชงตวอยาง 8± 0.01 g
เตม 3-MCPD-d5 ความเขมขน 10µg/mlปรมาตร 100µl และเตม 5MNaCl
ลงในตวอยางจนไดนาหนก20gนาไปเขยาในเครองultrasonicbathนาน10min
80
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4.2 ซปกอน ซปผง มอลตสกด - ชงตวอยางซปกอน ซปผง 5 ± 0.01 g ตวอยาง
มอลตสกด10±0.01g)เตม3-MCPD-d5 ความเขมขน10µg/mlปรมาตร100µl
และเตม 5MNaC l ลงในตวอยางจนไดนาหนก 20 g นาไปเขยาในเครอง
ultrasonicbathนาน10min
7.4.3 เนอสตวและผลตภณฑเนยแขง - ชงตวอยาง 20 ± 0.01g เตม 3-MCPD-d5
ความเขมขน10µg/mlปรมาตร100µl และเตม 5MNaClลงในตวอยางจนได
นาหนก 70 gปนตวอยางใหเปนเนอเดยวกน แลว centrifuge ท 3,500 rpmนาน
20minแลวชงสารละลายตวอยางสวนใส20gใสในbeakerขนาด250ml
7.4.4 แปงธญพชและขนมปง-ชงตวอยาง10±0.01gเตม3-MCPD-d5 ความเขมขน
10 µg/mlปรมาตร 100µl และเตม 5MNaClลงในตวอยางจนไดนาหนก 40 g
คนตวอยางใหเปนเนอเดยวกนแลวนาไปเขยาในเครองultrasonicbathนาน15min
ปดฝาและแชทงไวนาน12-15hr
7.5 การเตรยมblanksolution–ชงสารละลาย5MNaCl20gเตม3-MCPD-d5ความเขมขน
10µg/mlปรมาตร100µlแลวนาไปเขยาในเครองultrasonicbathนาน10นาท
7.6 สารสกด(testextract)-นาสารละลายตวอยาง20gทเตรยมไว(7.4)และblanksolution
(7.5) เตมExtrelutTM refill packs ใชชอนคนใหเขากนแลวบรรจลงในคอลมนแกวท
เตรยมไว และปดทบชนบนดวยNa2SO4สงประมาณ1 cmตงทงไว 15-20minแลวชะ
nonpolarcomponentออกจากตวอยางดวยสารละลายผสมdiethylether-hexane80mlทง
สารละลายทไดแลวชะ3-MCPDดวยdiethylether250mlโดยปลอยใหสารไหลออกจาก
คอลมนดวยอตราเรวประมาณ8ml/minลงในvolumetric flaskขนาด250mlแลวเตม
Na2SO4 ประมาณ15gเขยาและตงทงไว10-15minกรองผานกระดาษกรองลงในขวดระเหย
นาตวอยางไประเหยทอณหภม35Cจนปรมาณสารสกดเหลอประมาณ5mlดดสารละลาย
ตวอยางใส volumetric flaskขนาด10mlปรบปรมาตรดวยdiethyl ether เตมNa2SO4
ปรมาณเลกนอยลงในสารละลายตวอยางตงทงไว 5-10 min ใช gas-tight syringe
ดดสารละลายตวอยาง 1ml ใสใน vial ขนาด 4ml ระเหยใหแหงดวยแกสไนโตรเจน
ทอณหภมไมเกน30C
81
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.7 Derivatization(สารตวอยาง)-ทนททสารละลายตวอยางแหงเตม2,2,4-trimethylpentane
1mlและheptafluorobutyrylimidazole50µlปดฝาvialแลวเขยาดวยvortexshakerแลว
นาไปใหความรอนทอณหภม70Cนาน20minโดยใชheatingblockแลวตงทงไวใหเยน
ทอณหภมหองจากนนเตมH2Oลงในสารละลายตวอยาง1mlเขยาดวยvortexshakerและ
ตงทงไว30secเพอใหเกดการแยกชนดดชนH2OทงเตมH2Oอก1mlทาซาในขนตอน
เดมอกครง ดดชน 2, 2, 4-trimethylpentane ลงใน vial ขนาด 2ml และเตมNa2SO4
ปรมาณเลกนอยเขยาแลวตงทงไว2-5minดดสารละลายใสvialขนาด2mlนาไปฉดเขา
เครองมอGC/MS
7.8 Derivatization (calibration standard solution)–ปเปต calibration standard 3-MCPD
ความเขมขน 0.00, 0.05, 0.10, 0.50, 1.00 และ 2.00µg/mLความเขมขนละ 100µl
ใสใน vial ขนาด 4ml เตม 2, 2, 4 trimethylpentane 900µl เตม internal standard
3-MCPD-d5 (10 µg/ml)ปรมาตร10µlจะไดสารละลายทมความเขมขน0,5,10,50,100
และ200ng/mlตามลาดบทาปฏกรยาderivatizationเชนเดยวกบสารตวอยาง(7.7)
7.9 สภาวะเครองมอGC/MS
GC parameter
GC column: DB 5 MS, 30 m × 0.25 mm id, 0.25 µmfilmthicknessหรอเทยบเทา
Carriergas:He1.0ml/minconstantflow
Temperatureprogram:50Chold1min,2C/min-90Cand270Chold10min
Inlettemperature:270C
Injectionvolume:1µl/ splitless
MS parameters
GCInterfacetemperature:270C
Operationmode:selectedionmonitoring(SIM)
Ion(m/z):257(3-MCPD-d5),453,291,289,275และ253(3-MCPD)
82
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresult)
8.1 การคานวณ
(A × 10)/(A' ×C) 3-MCPD(mg/kg)= นาหนกตวอยาง(g)
A = พนทใตพค3-MCPDderivative,
A' = พนทใตพค3-MCPD-d5derivative
C = slopeของcalibrationline
8.2 รายงานผลทดสอบ(Testreport)
รายงานปรมาณ3-MCPDทพบในหนวยมลลกรมตอกโลกรม(mg/kg)ทศนยม2ตาแหนง
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 วเคราะหblankควบคกบตวอยางทกครงททาการวเคราะห
9.2 วเคราะหspikedmatrixเพอประเมน%recoveryทระดบความเขมขน0.04mg/kgทกครง
ททาการวเคราะหโดย% recovery ตองอยในเกณฑยอมรบ 80 – 110%หรอวเคราะห
duplicate sampleโดยวเคราะหcontrol sampleทมความเขมขนของ3-MCPDอยในชวง
0.03-0.05mg/kg เปอรเซนตความแตกตางสมพทธ (%RPD) ของผลวเคราะหมเกณฑ
การยอมรบคานวณจากสตร
Repeatability Limit, r = t∞ *√n * σr, t ∞ = 1.96, n = 2, σr=SDทระดบLOQ
100 % RPD = r , χ=คาLOQ χ
83
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
A,HVP 0.029 10(2) 0.002 7.5 0.004 12.8 0.5
B,Maltextract 0.055 11(1) 0.003 4.9 0.007 13.3 0.5
C1&C2, 0.043 11(1) 0.004 8.9 0.008 18.6 0.7
Souppowder
D,Breadcrumbs 0.030 12(0) 0.003 8.4 0.006 20.8 0.8
E,Salami 0.016 12(0) 0.002 11.6 0.006 38.6 1.3
F,Cheesealternative 0.043 11(1) 0.005 10.6 0.010 22.3 0.9
a Each value is the number of laboratories retained after elimination of outliers; each value in parentheses is the number of laboratories removed as outliers.
χ, No.of Sr, mg/ RSDr, SR, RSDR, SampleID HORRAT mg/kg labsa kg % mg/kg %
10. รายละเอยดอน
ขอมลInterlaboratorystudyresultsปรากฏในตาราง
ตารางแสดงInterlaboratorystudyresultsforthedeterminationof3-chloro-1,2-propanediol
in foods and food ingredients
วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหาร
ของกรมวทยาศาสตรการแพทย
วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหาร
ของกรมวทยาศาสตรการแพทย
คณะผจดทา
1. นางสาวจารวรรณลมสจจะสกล ผอานวยการสานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร
2. นายทนงพนธสจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
3. นางลดาพรรณแสงคลาย นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
4. นางดวงดาววงศสมมาตร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
5. นางสาวอรารตนวฒกรภณฑ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
6. นางอชฌาสจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
7. นางลดาวลยจงสมานกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
8. นางสาวอารณศรพรหม นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
9. นางสาวมณฑนาพนธบวหลวง นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
10. นายสมภพวฒนมณ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
11. นางสาวกรณาตรสมทธ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
12. นางสาวณฐกานตตยศวาพร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
13. นางปยมาศแจมศร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
87
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
นยามและคายอ(DefinitionandAbbreviation)
1. อาหารหมายถงอาหารทคนสามารถบรโภคไดและใหหมายความรวมถงเครองดมยกเวน
ทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ
2. นาหมายถงนาสาหรบอปโภคและบรโภครวมทงนาในสงแวดลอมแตไมรวมนาเสย
3. Dilutionหมายถงการเจอจางของตวอยาง
4. นากรองหมายถงนาทมคณสมบตเทยบเทานากลนหรอdeionizedwater
5. คายอทใชและคาเตมแสดงในตาราง
Abbreviation Word/คาเตม
CFU colony forming unit
MPN most probable number
AnO2 anaerobic condition
O2 aerobic condition
วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย
Method รหสวธ ชนดอาหาร รายการ หนา Type
DMScF2015 นาและนาแขง Coliforms,FecalcoliformsและE. coli I 89
DMScF2016 อาหาร Coliforms,FecalcoliformsและE. coli I 119
DMScF2017 อาหาร Clostridium botulinum I 151
DMScF2018 อาหาร จลนทรยเจรญท35Cและ5C I 161
ทมความเปนกรดตา รวมทงClostridium botulinum
DMScF2019 อาหาร จลนทรยเจรญท30Cและ55C I 177
ทมความเปนกรด รวมทงยสตและรา
89
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
วธนใชในการตรวจวเคราะหแบคทเรยกลมcoliformsกลมfecalcoliformsและE. coli ในนา
และนาแขงครอบคลมการตรวจหา(detection)และการตรวจปรมาณ(enumeration)
2. เอกสารอางอง(Reference)
American PublicHealthAssociation (APHA). StandardMethod for the Examination of
WaterandWastewater.22nd ed. Washington DC; 2012. p. 9-65 – 9-74, 9-76, 9-105 – 9-109.
3. นยามศพทและคายอ(Termsandabbreviation)
E. coli = Escherichia coli
4. หลกการ(Principle)
แบคทเรยในกลม coliforms เปนแบคทเรยแกรมลบรปทอน ไมสรางสปอร เจรญไดในทม
ออกซเจนและไมมออกซเจน(facultativeanaerobe)สามารถใชนาตาลแลคโตส(lactose)เกดกรด
และสรางกาซทอณหภม35Cภายใน48ชวโมงพบทวไปในสงแวดลอมและในระบบทางเดน
อาหารของคนและสตวสวนfecalcoliformsหรอ thermotolerantcoliforms เปนกลมยอยของ
แบคทเรยกลม coliformsพบมากในระบบทางเดนอาหารของคนและสตว สามารถใชนาตาล
แลคโตส (lactose) เกดกรดและสรางกาซทอณหภม 44.5 ถง 45.5 Cภายใน 24-48 ชวโมง
สาหรบE. coli เปนแบคทเรยชนดหนงในกลม fecal coliformsนยมใชเปนจลนทรยบงช
สขลกษณะการผลตอาหารและนาดม
การตรวจดวยวธMPNหรอmultipletubefermentationtechniqueเปนการวเคราะหปรมาณของ
เชอcoliformsโดยอาศยความสามารถในการยอยสารอาหารใหเกดกรดและกาซในหลอดทดลอง
จากนนนาจานวนหลอดทใหผลบวกไปอานคาในตารางMPN (MPN index)ซงแสดงปรมาณ
DMScF2015: วธตรวจวเคราะหColiforms,FecalcoliformsและE. coli
ในนาและนาแขงโดยวธMPN
Analyticalmethod ofColiforms, Fecal coliforms and
E. coli inwaterandicebyMPNtechnique
90
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
coliformsทตรวจพบในตวอยางคาในตารางMPNเปนคาจากการทดลองและคานวณผลดวยวธ
ทางสถตบงบอกปรมาณcoliformsทมโอกาสตรวจพบไดในนา
4.1 การตรวจcoliformsและfecalcoliformsแบงเปน3ขนตอนดงน
4.1.1 การตรวจสอบเบองตน (presumptive phase) เปนขนตอนเพอแยก coliforms
ออกจากแบคทเรยชนดอนทไมสามารถใชนาตาลแลคโตสได โดยนาตวอยางใส
ในหลอดทดลองพรอมหลอดดกกาซซงบรรจอาหารเลยงเชอชนดเหลวทมนาตาล
แลคโตสเปนองคประกอบบมเพาะเชอตามวธทกาหนดแลวนาหลอดทเกดกาซ
ไปตรวจยนยน
4.1.2 การตรวจสอบยนยน (confirmed phase) เปนการยนยนการตรวจพบ coliforms
และ fecal coliforms โดยถายเชอจากหลอดทเกดกาซลงในอาหารเลยงเชอเฉพาะ
ชนดเหลวบมเพาะเชอตามวธทกาหนดแลวอานผลตามจานวนหลอดทเกดกาซ
ในตารางMPN
4.1.3 การตรวจขนสมบรณ (completed phase)ทดสอบขนตอนนในกรณผลในขนการ
ตรวจสอบยนยนไมชดเจนหรอสาหรบการควบคมคณภาพผลวเคราะห (quality
control)หรอกรณอนๆตามทกาหนด
4.2 การตรวจหา E. coliในทนตรวจได2วธคอ
4.2.1 การใชFluorogenicsubstrateเปนการตรวจหาE. coli ทมเอนไซมβ-glucuronidase
ซงสามารถยอย substrate 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)ทาให
เกดการเรองแสงสฟา(brightbluefluorescence)ภายใน24± 2ชวโมงเมอสอง
ภายใตแสงUVความยาวคลน365-366นาโนเมตร
4.2.2 การตรวจยนยนทางชวเคม
5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents):ภาคผนวก1
5.1 อาหารเลยงเชอ
5.1.1 Basal medium for lysine and ornithine decarboxylase tests
5.1.2 Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth
5.1.3 Buffered glucose broth
5.1.4 Carbohydrateutilizationbroth(lactose,sorbitol,cellobiose)
5.1.5 EC medium
91
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.1.6 EC-MUG medium
5.1.7 Lauryltryptosebrothความเขมขน1เทาและ2เทา
5.1.8 LES Endo agar
5.1.9 MacConkey agar
5.1.10Nutrientagar(NA)
5.1.11 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)broth 5.1.12 Semi-solid medium for motility test
5.1.13 Simmons’ citrate agar
5.1.14Trypticsoyagar(TSA)
5.1.15 Tryptophan broth
5.1.16สารละลายสาหรบเจอจาง(diluent)ไดแกBufferedwaterหรอ0.1%peptonewater
5.2 สารเคม
5.2.1 Gram stain reagents
5.2.2 Kovac’sreagent
5.2.3 Methyl red indicator solution
5.2.4 Mineral oil
5.2.5 Naphtholsolution(5%)
5.2.6 Oxidase reagent
5.2.7 Potassium hydroxide solution, 7N
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 เครองมอ
6.1.1 เครองนงทาลายเชอ(autoclave)121±3C
6.1.2 เครองชง(balance)
6.1.3 ตอบเพาะเชอ(incubator)35±0.5Cและ25±0.5C
6.1.4 กลองจลทรรศน(microscope)
6.1.5 เครองวดความเปนกรด-เบส(pH-meter)
6.1.6 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)44.5±0.2C
6.1.7 UVlampความยาวคลน365-366นาโนเมตร
92
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6.2 อปกรณ
6.2.1 หลอดดกกาซ(Durhamtube)
6.2.2 ขวดรปชมพ(flask)หรอขวดแกวฝาเกลยว
6.2.3 แผนกระจก(glassslide)
6.2.4 หวง(เสนผานศนยกลาง3.0-3.5มลลเมตร)และเขมเขยเชอ(loopandneedle)
6.2.5 จานเพาะเชอ(petridish)
6.2.6 ปเปต(pipette)
6.2.7 หลอดทดลอง(testtube)
6.2.8 ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)
6.2.9 กระดาษกรองWhatmanNo.1
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การสมตวอยาง(Sampling)
7.1.1 ในกรณทตวอยางเปนนา เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทตวอยาง
จากแตละภาชนะปรมาตรเทา ๆกน ใสในภาชนะปราศจากเชอไมนอยกวา 100
มลลลตรหรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ(ตวอยางเรมตน)
7.1.2 ในกรณทตวอยางเปนนาแขงสมตวอยางจากแตละภาชนะบรรจใสรวมกนในภาชนะ
ปราศจากเชอทาตวอยางใหละลายจนหมดสมใหไดตวอยางไมนอยกวา100มลลลตร
หรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ(ตวอยางเรมตน)
7.2 การตรวจปรมาณcoliforms(enumeration)หรอtotalcoliformsโดยวธMPN(ภาคผนวก2)
7.2.1 การตรวจสอบเบองตน(presumptivephase)
7.2.1.1 ตวอยางทมการปนเปอนจลนทรยตา:ภาคผนวก3ตารางท1
เขยาขวดตวอยางใหเขากนอยางนอย 25 ครง แลวปเปตตวอยางเรมตน
ลงใน lauryl tryptose brothความเขมขน 2 เทาหลอดละ10มลลลตร
จานวน10หลอด
7.2.1.2 ตวอยางทมการปนเปอนจลนทรยสง:ภาคผนวก3ตารางท2
เขยาขวดตวอยางใหเขากนอยางนอย 25 ครง แลวปเปตตวอยางเรมตน
ลงใน lauryl tryptose broth ความเขมขน2 เทาหลอดละ10มลลลตร
93
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
จานวน 5หลอดและปเปตตวอยางเรมตน 1 และ 0.1มลลลตร ลงใน
lauryltryptosebrothความเขมขน1เทาปรมาตรละ5หลอดอาจเจอจาง
ความเขมขนของตวอยางมากขนตามตองการ ขนอยกบชนดของตวอยาง
และวตถประสงคของการวเคราะห
7.2.1.3 นา lauryl tryptose broth จากขอ 7.2.1.1 หรอ 7.2.1.2 บมท 35 C
24±2ชวโมง
ผลบวก : มการเจรญของเชอและเกดกาซในหลอดดกกาซ
ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซ
coliformsใหผลบวก
หลอดทใหผลบวกนาไปทดสอบตอตามขอ 7.2.2สวนหลอดทใหผลลบ
บมตออกจนครบ48±3ชวโมงแลวอานผลอกครง
สาหรบตวอยางนาดม (drinkingwater) เมอบมจนครบ 48 ± 3ชวโมง
ถาพบวาหลอด lauryl tryptose brothมการเจรญของเชอ และไมเกดกาซ
ในหลอดดกกาซใหทดสอบยนยนตอตามขอ7.2.2
7.2.2 การตรวจสอบยนยน(confirmedphase)
7.2.2.1 เขยาหลอดlauryltryptosebrothทใหผลบวกถายเชอ1loopหรอมากกวา
จากแตละหลอดลงในBGLBbrothหลอดตอหลอด
7.2.2.2 บมท35C48±3ชวโมง
ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซ
ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซ
coliformsใหผลบวก
บนทกผลและคานวณตามขอ8
การตรวจวเคราะห coliforms โดยทวไปตรวจสอบถงขนยนยนกเพยงพอยกเวน
ในกรณทสงสยหรอดาเนนการควบคมคณภาพจงจะตรวจสอบถงขนสมบรณ
7.2.3 การตรวจขนสมบรณ(completedphase)
7.2.3.1 ถายเชอ 1 loop จากขอ 7.2.2.2 ทใหผลบวก ขดบนMacConkey agar
หรอLESEndoagar
94
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2.3.2 บมท35C24±2ชวโมง
โคโลนทมลกษณะเฉพาะคอ
MacConkeyagarโคโลนมสแดงอาจมโซนขนลอมรอบ
LESEndoagarโคโลนมสชมพจนถงแดงเขมและมmetallicsheen
7.2.3.3 เลอกโคโลนทมลกษณะเฉพาะ 1 โคโลนหรอมากกวาจากแตละจาน
เพาะเชอ ถาไมมโคโลนทมลกษณะเฉพาะ ใหเลอกโคโลนทมลกษณะ
ใกลเคยงโคโลนทมลกษณะเฉพาะมากทสด(mostlikely)จานวน2โคโลน
หรอมากกวาใสในlauryltryptosebrothความเขมขน1เทาและNAslant
7.2.3.4 นาlauryltryptosebrothบมท35C24±2ชวโมงถาไมเกดกาซในหลอด
ดกกาซใหบมตอจนครบ48±3ชวโมงสาหรบNAslantบมท35C18-24
ชวโมงนาไปยอมสแกรมถาเปนตวอยางนาดมไมตองยอมสแกรมเพราะ
แบคทเรยแกรมบวกและแบคทเรยสรางสปอรมกไมเจรญในขนตอนตรวจ
คดแยกเบองตน
สรปผลพบ coliforms เมอหลอด lauryl tryptose broth เกดกาซในหลอดดกกาซ
ภายใน48±3ชวโมงและพบวาเปนแบคทเรยแกรมลบรปทอนไมสรางสปอร
7.3 การตรวจปรมาณ (enumeration) fecal coliforms โดยวธ MPN: ภาคผนวก 2
เขยาหลอด lauryl tryptose brothทใหผลบวกจากขอ 7.2.1.3หรอหลอดBGLBbroth
ทใหผลบวกจากขอ 7.2.2.2 ถายเชอจากแตละหลอด 1 loopลงในECmediumหลอด
ตอหลอดนาไปบมท44.5C24±2ชวโมงภายใน30นาทหลงจากการถายเชอ
ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซและมการเจรญของเชอ
ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซและไมมการเจรญของ
เชอหรอเจรญนอยถามการเจรญมากแตไมเกดกาซ
ใหใชอาหารเลยงเชออนสาหรบการหาfecalcoliforms
อกหนงชนด
fecalcoliformsใหผลบวก
บนทกผลและคานวณตามขอ8
95
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4 การตรวจ E. coli ตรวจได2วธคอ
7.4.1 วธท1การใชfluorogenicsubstrate
7.4.1.1 เขยาหลอดlauryl tryptosebrothทใหผลบวกจากขอ7.2.1.3ถายเชอจาก
แตละหลอด1loopหรอมากกวาลงในEC-MUGmediumหลอดตอหลอด
7.4.1.2 บมท 44.5 C 24± 2ชวโมงภายใน30นาทหลงจากการถายเชอสองด
การเรองแสงของอาหารเลยงเชอภายใตแสงUV
ผลบวก : พบการเรองแสงสฟา(brightbluefluorescence)
ผลลบ : ไมพบการเรองแสงสฟา
E. coliใหผลบวก
บนทกผลและคานวณตามขอ8
7.4.2 วธท2การตรวจยนยนทางชวเคม
7.4.2.1 ถายเชอ 1 loopจากหลอดECmedium ในขอ 7.3ทใหผลบวกขดบน
จานเพาะเชอMacConkeyagarหรอLESEndoagar
7.4.2.2 บมท35C24±2ชวโมง
โคโลนทมลกษณะเฉพาะคอ
MacConkeyagarโคโลนมสแดงอาจมโซนขนลอมรอบ
LESEndoagarโคโลนมสชมพจนถงแดงเขมและมmetallicsheen
7.4.2.3 เลอกโคโลนทมลกษณะเฉพาะขดบนNAslantบมท35C18-24ชวโมง
เพอใชทดสอบปฏกรยาทางชวเคมดงตอไปน
การใชนาตาลlactose,sorbitolและcellobiose
เขยเชอ1loopลงในcarbohydrateutilizationbroth(lactose,sorbitol
และcellobiose)บมท35C24-48ชวโมง
ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสสมแดงเปนสเหลอง
ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส
E. coliใหผลlactoseและsorbitolเปนบวกcellobioseเปนลบ
96
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
การทดสอบ ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) hydrolysis
เขยเชอ1loopลงในONPGbrothบมท35C24ชวโมงเปรยบเทยบ
ผลกบONPGbrothทไมเตมเชอหรอเตมเชอทใหผลลบ
ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนเปนสเหลอง
ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส
E. coli ใหผลบวก
กรณใชชดทดสอบและแผนONPGdiscสาเรจรปใหทาตามคาแนะนา
ของผผลต
การทดสอบindole
เขยเชอลงใน tryptophan broth บมท 35 C 24 ± 2 ชวโมงเตม
Kovac’sreagent0.2–0.3มลลลตรเขยาเบาๆตงทงไวประมาณ10นาท
แลวอานผล
ผลบวก : เกดชนสแดงเขมบนผวหนาของอาหารเลยงเชอ
ผลลบ : เกดสเหลองหรอสสมบนผวหนาของอาหารเลยงเชอ
E. coliใหผลบวก
การทดสอบmethylred
เขยเชอลงในbufferedglucosebroth10มลลลตรบมท35C5วน
นา culture 5มลลลตรหยดmethyl red indicator solutionจานวน
5หยดอานผลทนท
ผลบวก : อาหารเลยงเชอมสแดง
ผลลบ : อาหารเลยงเชอมสเหลอง
เชอสวนใหญอานผลไดเมอบมครบ 48 ชวโมง (ตองไมนอยกวา
48ชวโมง)ถาผลเปนลบใหบมcultureสวนทเหลอตอจนครบ5วน
ทดสอบปฏกรยาและอานผลถาผลทดสอบท 48ชวโมงหรอท 5 วน
ใหผลเปนทนาสงสย(mixedshade)ใหเตรยมสารละลายเชออก2ชด
และบมท22-25Cแบงทดสอบปฏกรยาเมอบมครบ2,3,4และ5วน
E. coli ใหผลบวก
97
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
การทดสอบVoges-Proskauer
เขยเชอลงใน tryptophan brothบมท 35 C 48 ชวโมงนา culture
1มลลลตรใสในหลอดทดลอง เตม naphthol solution0.6มลลลตร
และKOH0.2มลลลตรเขยาใหเขากนหลงเตมสารละลายแตละชนด
อานผลภายใน5นาทอยาอานผลภายหลง10นาท
ผลบวก : เกดสชมพถงสแดงบนผวหนาอาหารเลยงเชอ
ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส หรอเกดสนาตาลแดง
(coppercolor)
E. coli ใหผลลบ
การทดสอบSimmons’citrate
ขดเชอปรมาณนอย (light inoculum)ลงบนผวหนาของ Simmons’
citrateagarบมท35C48ชวโมง
ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสเขยวเปนสนาเงน
ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส
E. coli ใหผลลบ
การทดสอบmotility
ใช needle เขยเชอแลว stab ลงตรงกลางหลอดของ semi-solid
mediumformotilitytestลก5มลลเมตรบมท35C1-2วน
ผลบวก : เชอเจรญกระจายออกจากinoculationpoint
ผลลบ : เชอเจรญเฉพาะแนว stabและอาหารเลยงเชอบรเวณ
โดยรอบยงคงมลกษณะใส
ถาผลเปนลบใหบมตออก5วนท22-25C
E. coli ใหผลบวก
การทดสอบlysineและornithinedecarboxylase
เขยเชอลงใน basal medium for decarboxylasetest ทม lysine
หรอornithineเทmineraloilสงประมาณ10มลลเมตรปดฝาใหแนน
บมท35-37 C4วนอานผลทกวน(เปรยบเทยบผลกบหลอดควบคม
ทไมเตมเชอ)
98
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสเหลองเปนสมวงหรอ
สมวงแดงถาเปลยนเปนสเทาอมฟาใหหยดสารละลาย
bromocresol purple จานวน 1หยดถาสไมเปลยน
ใหแปลผลเปนลบ
ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส
E. coliใหผลบวก
การทดสอบoxidase
นาเชอทมอายนอยกวา24ชวโมงขด(smear)บนกระดาษกรองทหยด
oxidase reagent (ไมใชหวงเขยเชอนเกล-โครเมยมหรอลวดโลหะ
เพราะจะทาใหเกดผลบวกปลอม) ใชกระดาษกรองWhatmanNo. 1
หรอกระดาษกรองทมคณสมบตเทยบเทา
ผลบวก : กระดาษกรองเปลยนเปนสมวงเขมภายใน10วนาท
ผลลบ : กระดาษกรองไมเปลยนส
E. coliใหผลลบ
การทดสอบyellowpigment
ขดเชอบนผวหนาของTSAplateหรอslant(สามารถใชNAแทนได)
บมท25C48ชวโมง
ผลบวก : โคโลนสเหลองสจะเขมขนตามระยะเวลาการบม
ผลลบ : โคโลนไมเปนสเหลอง
E. coli ใหผลลบ
บนทกผลและคานวณตามขอ8
8. การคานวณ(Calculationofresults)
8.1 นาจานวนหลอดทใหผลบวกเปรยบเทยบกบตารางMPN(ตารางท1และ2:ภาคผนวก3)
ไดผลเปนคาMPN/100มลลลตรพรอมขดความเชอมนทระดบ 95% (95% confidence
limits)
99
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8.2 กรณอานผลตามตารางท 2 (ภาคผนวก3)ถาระดบการเจอจางของตวอยางใน3dilutions
แตกตางจากทกาหนดไวใหนาผลบวกทไดไปอานคาMPNจากตารางแลวคานวณโดยใชสตร
MPN/100มลลลตร = (คาMPNจากตาราง)× 10/V
เมอ V = ปรมาตรของตวอยางทdilutionตาสดทเลอก
8.3 กรณอานผลตามตารางท 2 (ภาคผนวก3)ถาเจอจางตวอยางมากกวา3dilutionsใหเลอก
3 dilutions ทเหมาะสม แลวอานคาMPN จากตารางท 2 ตามผลบวกของ dilutions
ทเลอกโดยใชเกณฑการเลอก3dilutionsดงน(ตวอยางตามตารางท3)
8.3.1 ใหตด dilutionสงสด (มปรมาณตวอยางนอยทสด)ทใหผลลบทง 5หลอดโดย
ใหอยางนอย1dilutionทเหลออยมหลอดทใหผลลบจากนนใหตดdilutionตาสด
(มปรมาณตวอยางมากทสด)ทมผลบวกทง5หลอดและอยางนอย1dilutionทเหลอ
อยมหลอดทใหผลบวกดงตวอยางAเลอก3dilutionsโดยตดdilutionสงสดคอ
0.001มลลลตรและตดdilutionตาสดคอ10มลลลตรจะได5-1-0
8.3.2 ถาdilutionตาสดมผลบวกไมครบทง5หลอดและมหลายdilutionsทสงขนไปให
ผลลบทงหมด ใหตด dilutions สงสดทใหผลลบทงหมดออก ดงตวอยาง B
จะได4-5-1
8.3.3 ถาทาตามขอ 8.3.1 และ 8.3.2 แลวพบวา dilutionทเหลออยมจานวนมากกวา 3
dilutionsใหเลอกดงน
8.3.3.1 ถา dilutionสงสดทเหลออยมผลบวกครบทง 5หลอดและอยในกลม
อกสอง dilutionsสงสดทมผลบวกไมครบ ใหเลอก dilutionสงสดทม
ผลบวกไมครบและอก2dilutionsทตากวาถดขนมา
- ตามตวอยางCพบวาdilutionสงสดทใหผลบวกครบทง5หลอดคอ
0.1มลลลตรซงอยในกลมสองdilutionsสงสดทมผลบวกไมครบคอ
0.01มลลลตรและ0.001มลลลตรจงเลอกdilutionสงสดทมผลบวก
ไมครบคอ0.001มลลลตรและอก2dilutionsทตากวาถดขนมาคอ
0.01มลลลตรและ0.1มลลลตรจะได5-2-1
100
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
- ตามตวอยางDพบวาdilutionสงสดทใหผลบวกครบทง5หลอดคอ
0.01มลลลตรซงอยในกลมสองdilutionsสงสดทมผลบวกไมครบคอ
0.1และ0.001มลลลตรจงเลอกdilutionสงสดทมผลบวกไมครบคอ
0.001มลลลตรและอก2dilutionsทตากวาถดไปคอ0.01มลลลตร
และ0.1มลลลตรจะได4-5-1
8.3.3.2 หลงจากตดdilutionตาสดทมผลบวกครบทง5หลอดและไมมdilution
ทใหผลบวกครบเหลออยอก ใหเลอก 2 dilutionsตาสดทมผลบวกและ
รวมจานวนหลอดบวกของ dilutions สงขนถดไปเปน dilution ทสาม
ดงตวอยางEนนคอเมอตดdilution10มลลลตรออกแลวใหเลอกdilution
1มลลลตรและ0.1มลลลตรและรวมdilutionทเหลอคอ0.01มลลลตร
และ0.001มลลลตรเปนdilutionท3จะได4-4-1
8.3.3.3 ถาไมม dilution ใดเลยทใหผลบวกครบทง 5หลอดใหเลอก2 dilutions
ตาสดและรวมจานวนหลอดบวกของdilutionsทเหลออยใหเปนdilution
ท3ตามตวอยางFพบวาไมมdilutionsใดมผลบวกครบทกหลอดจงเลอก
2dilutionsตาสดคอ10และ1มลลลตรและdilutionท3 เปนผลรวม
ของจานวนหลอดทเหลอทใหผลบวกคอ 0.1, 0.01และ0.001มลลลตร
จะได4-3-2
8.3.3.4 ถาทาตามขอ 8.3.3.3 แลวพบวา dilutionทสามมจานวนเกน 5หลอด
ซงไมสามารถอานคาในตารางท 2 ได ถอวากรณนไมปกต ควรทดสอบ
ตวอยางซา แตถาไมมตวอยางใหตรวจซา ใหเลอก 3 dilutions ใหม
โดยเลอกdilutionสงสดทมหลอดบวกและอก2dilutionsทตากวาถดไป
ตามตวอยางGนนคอถาทาตามขอ8.3.3.3จะเลอกdilutions10,1มลลลตร
เปน2dilutionsแรกและรวมหลอดบวกของdilutions 0.1, 0.01, 0.001
มลลลตรเปนdilutionท3จะได4-3-6จงตองเลอกใหมโดยเลอกdilution
สงสดทมผลบวกคอ 0.001มลลลตรและอก 2 dilutionsทตากวาถดไป
คอ 0.01และ 0.1มลลลตร จะได 3-2-1 จากนนนาผลไปอานคาMPN
ในตารางท2ถาปรมาตรของตวอยางใน3dilutionsทเลอกใหมนแตกตาง
จากทกาหนดไวในตาราง ใหนาคาMPNจากตารางไปคานวณตามสตร
ในขอ8.4
101
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8.4 กรณอานผลตามตารางท 2 (ภาคผนวก3)ถา3dilutionsทเลอกไมมคาMPNในตาราง
ใหใชสตรคานวณดงน
230.3 MPN/100มลลลตร=- log10 zs
เมอ j = แตละdilutionทเลอก
s = dilutionสงสดทมผลบวกอยางนอย1หลอด
Xs = จานวนหลอดทใหผลบวกของdilutions
nj = จานวนหลอดของdilution j
Zj = ปรมาณตวอยางในแตละหลอดของdilution j
Zs = ปรมาณตวอยางในแตละหลอดของdilutions
K = จานวนdilutionทเลอก
ตวอยาง ปรมาตรของตวอยาง 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 มลลลตรตามลาดบ
ผลทดสอบx–x–3–0–0
ในทนdilutions คอdilutionทมปรมาณตวอยางในแตละหลอด=0.1มลลลตร
คาทใชคานวณคอ
Zs = 0.1, Xs = 3, XsZs = 0.1 × 3 = 0.3
∑njZj = (0.1 ×5)+(0.01×5)+(0.001×5)
= 0.555
ดงนนMPN/100มลลลตร = -230.3log10 1 – 0.3 = 780
0.1 0.555
xszsl - ∑ k
j = snjzj( (
( (
102
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8.5กรณทจานวนหลอดในแตละdilutionและ/หรอระดบเจอจาง(dilutions)ไมตรงตามตาราง
MPNในตารางท2สามารถประมาณคาMPNไดโดยปฏบตดงน
8.5.1 เลอกdilutionตาสดทใหผลบวกไมครบทกหลอด
8.5.2 เลอกdilutionสงสดทใหผลบวกอยางนอย1หลอด
8.5.3 เลอกทกdilutionsทอยระหวางขอ8.5.1และขอ8.5.2
8.5.4 คานวณคาMPN โดยใชสตรของ “Thomas” คาMPNทไดเปนคาประมาณ
(approximatevalue)
สตรMPN/100มลลลตร(approx.)=100× P/(N ×T)1/2
เมอ P = จานวนหลอดทใหผลบวก
N = ปรมาตรของตวอยาง(มลลลตร)ทใหผลลบทกหลอด
T = ปรมาตรรวมของตวอยาง(มลลลตร)ในdilutionsทเลอก
ตวอยางท1
ปรมาตรของตวอยาง(มลลลตร/หลอด) 10 1 0.1 0.01 0.001
มผลบวก 10/10, 10/10,4/10, 1/10, 0/5
Dilutionsทเลอก - - 4/101/10 -
ดงนนMPN/100มลลลตร(approx.) = 100× P/(N ×T)1/2
= 100 × 5/(0.69 ×1.1)1/2
= 500/0.87 = 570
ตวอยางท2
ปรมาตรของตวอยาง(มลลลตร/หลอด) 10 1 0.1 0.01 0.001
มผลบวก 10/10, 10/10, 10/10, 0/10, 0/10
Dilutionsทเลอก - - 10/10 0/10 -
ดงนนMPN/100มลลลตร(approx.) = 100× P/(N ×T)1/2
= 100 × 10/(0.1 ×1.1)1/2
= 1,000/0.332 = 3,000
103
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การรายงานผล(Expressionofresults)
9.1 การตรวจหา(detection)รายงานเปน
E. coli/100มลลลตรพบหรอไมพบ
9.2 การตรวจปรมาณ(enumeration)รายงานเปน
9.2.1 ColiformsMPN/100มลลลตรหรอTotalcoliformsMPN/100มลลลตร
9.2.2 FecalcoliformsMPN/100มลลลตร
9.2.3 E. coli MPN/100มลลลตร
10. รายละเอยดอน
10.1 ภาคผนวก1: อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
10.2 ภาคผนวก2: แผนภม การตรวจปรมาณ (enumeration) coliforms, fecal coliforms
และE. coli ในตวอยางนาและนาแขง
10.3 ภาคผนวก3: ตารางท1คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบ
เมอใชตวอยาง10มลลลตรจานวน10หลอด
ตารางท2คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบ
เมอใชตวอยาง10,1.0,0.1มลลลตรจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง
10.4 ภาคผนวก4: ตารางท 3 ตวอยางการเลอกผลบวก 3 ระดบความเจอจางจากการเจอจาง
5ระดบเพอรายงานคาMPN
104
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก1
อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
อาหารเลยงเชอ(กรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ)
1. Basal medium for lysine and ornithine decarboxylase tests
1.1 Basal medium according to the Moeller method
Peptone 5 กรม
Beefextract 5 กรม
Bromcresolpurple(1.6%) 0.625 มลลลตร
Cresolred(0.2%) 2.5 มลลลตร
Glucose 0.5 กรม
Pyridoxal 5 มลลกรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรpH6.0-6.5
1.2 BasalmediumaccordingtotheFalkowmethod
Peptone 5 กรม
Yeastextract 3 กรม
Bromcresolpurple(1.6%) 1 มลลลตร
Glucose 1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรpH6.7-6.8
การใชงาน
เลอกใชBasalmediumในขอ 1.1หรอ 1.2อยางใดอยางหนงแบงอาหารเลยงเชอ
เปน3สวนสวนแรกแบงใสหลอดเกลยวตามปรมาตรทตองการ(หลอดควบคม)สวนทสอง
เตมL-lysine dihydrochloride ใหไดความเขมขน1%สวนทสามเตมL-ornithine dihydro
chloride ใหไดความเขมขน 1% (สาหรบ Falkowmethod ใหเตม L-amino acid 0.5%)
หลงจากเตมL-ornithinedihydrochlorideปรบpH6.0± 0.2แบงใสหลอดเกลยว3-4มลลลตร
ฆาเชอท121oC10นาท
105
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
2. Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth
Peptone 10 กรม
Lactose 10 กรม
Oxgall 20 กรม
Brilliantgreen 0.0133 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตร
ทตองการแลวใสหลอดดกกาซลงในหลอดโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ1/2หรอ2/3
ของหลอดดกกาซหลงการฆาเชอฆาเชอท121C12-15นาทpH7.2± 0.2
3. Buffered glucose broth
Proteosepeptoneorequivalentpeptone 7 กรม
Glucose 5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอด 5 มลลลตร
ฆาเชอท121C12-15นาท
4. Carbohydrateutilizationbroth(lactose,sorbitol,cellobiose)
Phenolredbrothbase 16 กรม
Carbohydrate(lactose,sorbitol,cellobiose) 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตร
ทตองการโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ 1/3ของความยาวหลอดแลวใสหลอดดกกาซ
ลงในหลอดฆาเชอท121C12-15นาท
106
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. EC medium
Tryptoseหรอtrypticase 20 กรม
Lactose 5 กรม
BilesaltsmixtureorbilesaltsNo.3 1.5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 4 กรม
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1.5 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตร
ทตองการแลวใสหลอดdurhamในหลอดโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ 1/2หรอ 2/3
ของหลอดดกกาซหลงการฆาเชอฆาเชอท121C12-15นาทpH6.9± 0.2
6. EC-MUG medium
Tryptoseหรอtrypticase 20 กรม
Lactose 5 กรม
BilesaltsmixtureorbilesaltsNo.3 1.5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 4 กรม
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1.5 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG) 0.05 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตร
ทตองการ(หลอดทใชตองไมเรองแสงภายใตแสงยวทความยาวคลน366นาโนเมตร)ฆาเชอ
ท121C15นาทpH6.9± 0.2
107
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7. Lauryltryptose(LST)brothความเขมขน1เทาและ2เทา
Tryptose 20หรอ(2×20) กรม
Lactose 5หรอ(2×5) กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 2.75หรอ กรม
(2 ×2.75)
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 2.75หรอ กรม
(2 ×2.75)
Sodiumchloride(NaCl) 5หรอ(2×5) กรม
Sodiumlaurylsulfate 0.1หรอ(2×0.1) กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรสาหรบความเขมขนสองเทา
ชงสวนประกอบแตละชนดเปนสองเทา ละลายในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร
แบงใสหลอด10มลลลตรแลวใสหลอดดกกาซในหลอดโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ
1/2หรอ2/3ของหลอดดกกาซหลงการฆาเชอฆาเชอท121C12-15นาทpH6.8± 0.2
8. LES Endo agar
Yeastextract 1.2 กรม
Casitoneortrypticase 3.7 กรม
Thiopeptoneorthiotone 3.7 กรม
Tryptose 7.5 กรม
Lactose 9.4 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 3.3 กรม
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 3.7 กรม
Sodiumdesoxycholate 0.1 กรม
Sodiumlaurylsulfate 0.05 กรม
Sodium sulfite (Na2SO3) 1.6 กรม
Basicfuchsin 0.8 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
108
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรทม95%ethanol20มลลลตร
ตอลตรใหความรอนจนagarละลายใกลเดอด(หามนาไปAutoclave)pH7.2± 0.2ทาให
เยนจนมอณหภม 45 C – 50 C ทนท เทใสจานเพาะเชอใหมความหนา 4-5 มลลเมตร
เกบในตเยนระวงแสงหามใชagarหลงจากเตรยมแลว2สปดาห
9. MacConkey agar
Peptone 17 กรม
Proteosepeptone 3 กรม
Lactose 10 กรม
Bilesalts 1.5 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Agar 13.5 กรม
Neutralred 0.03 กรม
Crystalviolet 0.001 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจน agar
ละลายฆาเชอท121C15นาทpH7.1± 0.2
10.Nutrientagar(NA)
Peptone 5 กรม
Beefextract 3 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร ใหความรอนจนagarละลาย
แบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121 C15นาทpH6.8± 0.2เอยงหลอดและ
ปลอยใหวนแขง
109
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
11. Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)brothใชชนดสาเรจรป
12. Semi-solid medium for motility test
Beefextract 3 กรม
Peptone 10 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Agar 4 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร ใหความรอนจนagarละลาย
แบงใสหลอด 3มลลลตร (หลอดขนาด 13× 100mm)หรอ 8มลลลตร (หลอดขนาด
16 ×125mm)ฆาเชอท121C15นาทpH7.4
13. Simmons’ citrate agar
Ammonium dihydrogen phosphate (NH4H2PO4) 1 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 1 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Sodiumcitratedihydrate 2 กรม
Magnesium sulfate (MgSO4.7H2O) 0.2 กรม
Agar 15 กรม
Bromthymolblue 0.08 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร ใหความรอนจนagarละลาย
แบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121 C12-15นาทpH6.8± 0.2เอยงหลอด
และปลอยใหวนแขง
110
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
14.Trypticsoyagar(TSA)
Tryptone 15 กรม
Soytone 5 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร ใหความรอนจนagarละลาย
ฆาเชอท121C15นาทpH7.3±0.2
15. Tryptophan broth
Tryptoneortrypticase 10 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอด 5มลลลตร
ฆาเชอท121C15นาท
16.Bufferedwater
16.1 stock phosphate buffer solution
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 34 กรม
นากลน 1,000 มลลลตร
ชงKH2PO434กรมละลายในนากลน500มลลลตรปรบpH7.2±0.5โดยใช1NNaOH
และปรบปรมาตรเปน1ลตรฆาเชอท121C15นาทหรอใชการกรอง
16.2 magnesium chloride stock solution
magnesium chloride
(MgCl2 หรอMgCl2 . 6H2O) 38หรอ81.1 กรม
นากลน 1,000 มลลลตร
ชงmagnesiumchlorideละลายในนากลน1ลตรฆาเชอท121C15นาท
111
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
16.3 workingsolution
ปเปตstockphosphatebuffersolution1.25มลลลตรและmagnesiumchloridestocksolution
0.5มลลลตรลงในนากลน1ลตรปรบpH7.2±0.1แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตร
ทตองการฆาเชอท121C15นาท
17.0.1%peptonewater
peptone 1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรองปรบ pH7.0 ± 0.2แบงใสหลอดหรอขวดตาม
ปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท
สารเคม(กรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ)
1. Gramstainreagentsใชชนดสาเรจรป
2. Kovac’sreagent
p-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม
Hydrochloricacidเขมขน 25 มลลลตร
Isoamyl(oramyl)alcohol 75 มลลลตร
ผสมสวนประกอบใหเขากน
3. Methyl red indicator solution
Methylred 0.1 กรม
95%Ethylalcohol 300 มลลลตร
นากลนหรอนากรอง 500 มลลลตร
(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย)
ละลายmethyl red ใน 95% ethyl alcoholปรบปรมาตรเปน 500มลลลตรดวยนากลน
หรอนากรอง
112
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4. Mineraloilใชชนดสาเรจรปฆาเชอท121C30-60นาทขนกบขนาดภาชนะทใชบรรจ
5. Naphtholsolution(5%)
Purified α-naphthol 5 กรม
(meltingpoint92.5Cหรอสงกวา)
Absoluteethylalcohol 100 มลลลตร
ละลายα-naphthol ใน absolute ethyl alcohol เกบสารละลายทเตรยมแลวทอณหภม
5-10Cไดนาน2สปดาห
6. Oxidase reagent
N, N, N', N' -tetramethyl-p-phenylenediamine 1 กรม
dihydrochloride(C10H16N2.2HCl)
นากลน 100 มลลลตร
เตรยมใหมกอนใชหรอเกบในอณหภมแชเยนไดนานไมเกน1สปดาห
7. Potassium hydroxide, 7N
Potassiumhydroxide(KOH) 40 กรม
นากลนหรอนากรอง 100 มลลลตร
ละลายPotassiumhydroxideในนากลนหรอนากรอง
113
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก2
แผนภมการตรวจปรมาณ(enumeration)coliforms,fecalcoliformsและ E. coli ในตวอยางนาและนาแขง
suspected detection of E. coli or quality control
completed Test EC-MUG or biochemical test MacConkey agar E. coli detected/not detected or LES Endo agar LST broth/Gram stain
35 ± 0.5C,24 ± 2hและ48 ± 3 h
growth/gasproduced growth/nogasproduced nogrowthorgrowth/nogasproduced (drinkingwateronly)
BGLB broth EC broth coliforms group absentdetectionofcoliforms (detectionoffecalcoliforms) (confirmedtest)
35±0.5C 44.5±0.2C48±3h 24±2h
negative positive coliforms negative positive fecal coliforms see MPN table see MPN table (MPN/100ml) (MPN/100ml)
coliforms group Fecal coliforms group absent absent
Coliforms detected Coliforms not detected(typicalresults:LSTbroth-positive (resultsnottypical) Gram stain: gram negative, rodshape,nospore)
Inoculatesampleinlauryltryptosebroth(presumptivetest)
114
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก3
ตารางMPN
ตารางท1 คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบเมอใชตวอยาง10มลลลตร
จานวน10หลอด
ขดความเชอมนทระดบ95% จานวนหลอดทใหผลบวก MPN/100มลลลตร ตาสด สงสด
0 <1.1 - 3.4
1 1.1 0.051 5.9
2 2.2 0.37 8.2
3 3.6 0.91 9.7
4 5.1 1.6 13
5 6.9 2.5 15
6 9.2 3.3 19
7 12 4.8 24
8 16 5.8 34
9 23 8.1 53
10 >23 13 -
115
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตารางMPN
ตารางท2 คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบเมอใชตวอยาง10,1.0,0.1
มลลลตรจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง
จานวนหลอด MPN/100 ขดความเชอมนท จานวน MPN/100 ขดความเชอมน ทใหผลบวก มลลลตร ระดบ95% หลอด มลลลตร ทระดบ95%
ตาสด สงสด ทใหผลบวก ตาสด สงสด
0-0-0 <1.8 - 6.8 2-1-1 9.2 3.4 22
0-0-1 1.8 0.090 6.8 2-1-2 12 4.1 26
0-1-0 1.8 0.090 6.9 2-2-0 9.3 3.4 22
0-1-1 3.6 0.70 10 2-2-1 12 4.1 26
0-2-0 3.7 0.70 10 2-2-2 14 5.9 36
0-2-1 5.5 1.8 15 2-3-0 12 4.1 26
0-3-0 5.6 1.8 15 2-3-1 14 5.9 36
1-0-0 2.0 0.10 10 2-4-0 15 5.9 36
1-0-1 4.0 0.70 10 3-0-0 7.8 2.1 22
1-0-2 6.0 1.8 15 3-0-1 11 3.5 23
1-1-0 4.0 0.71 12 3-0-2 13 5.6 35
1-1-1 6.1 1.8 15 3-1-0 11 3.5 26
1-1-2 8.1 3.4 22 3-1-1 14 5.6 36
1-2-0 6.1 1.8 15 3-1-2 17 6.0 36
1-2-1 8.2 3.4 22 3-2-0 14 5.7 36
1-3-0 8.3 3.4 22 3-2-1 17 6.8 40
1-3-1 10 3.5 22 3-2-2 20 6.8 40
1-4-0 10 3.5 22 3-3-0 17 6.8 40
2-0-0 4.5 0.79 15 3-3-1 21 6.8 40
2-0-1 6.8 1.8 15 3-3-2 24 9.8 70
2-0-2 9.1 3.4 22 3-4-0 21 6.8 40
2-1-0 6.8 1.8 17 3-4-1 24 9.8 70
116
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
จานวนหลอด MPN/100 ขดความเชอมนท จานวน MPN/100 ขดความเชอมน ทใหผลบวก มลลลตร ระดบ95% หลอด มลลลตร ทระดบ95%
ตาสด สงสด ทใหผลบวก ตาสด สงสด
3-5-0 25 9.8 70 4-5-1 48 15 120
4-0-0 13 4.1 35 5-0-0 23 6.8 70
4-0-1 17 5.9 36 5-0-1 31 10 70
4-0-2 21 6.8 40 5-0-2 43 14 100
4-0-3 25 9.8 70 5-0-3 58 22 150
4-1-0 17 6.0 40 5-1-0 33 10 100
4-1-1 21 6.8 42 5-1-1 46 14 120
4-1-2 26 9.8 70 5-1-2 63 22 150
4-1-3 31 10 70 5-1-3 84 34 220
4-2-0 22 6.8 50 5-2-0 49 15 150
4-2-1 26 9.8 70 5-2-1 70 22 170
4-2-2 32 10 70 5-2-2 94 34 230
4-2-3 38 14 100 5-2-3 120 36 250
4-3-0 27 9.9 70 5-2-4 150 58 400
4-3-1 33 10 70 5-3-0 79 22 220
4-3-2 39 14 100 5-3-1 110 34 250
4-4-0 34 14 100 5-3-2 140 52 400
4-4-1 40 14 100 5-3-3 170 70 400
4-4-2 47 15 120 5-3-4 210 70 400
4-5-0 41 14 100 5-4-0 130 36 400
ตารางMPN(ตอ)
117
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
จานวนหลอด MPN/100 ขดความเชอมนท จานวน MPN/100 ขดความเชอมน ทใหผลบวก มลลลตร ระดบ95% หลอด มลลลตร ทระดบ95%
ตาสด สงสด ทใหผลบวก ตาสด สงสด
ตารางMPN(ตอ)
5-4-1 170 58 400 5-5-1 350 100 1100
5-4-2 220 70 440 5-5-2 540 150 1700
5-4-3 280 100 710 5-5-3 920 220 2600
5-4-4 350 100 710 5-5-4 1600 400 4600
5-4-5 430 150 1100 5-5-5 >1600 700 -
5-5-0 240 70 710
118
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก4
ตารางท3 ตวอยางการเลอกผลบวก3ระดบความเจอจางจากการเจอจาง5ระดบเพอรายงานคาMPN
ปรมาตร มลลลตร(mL) Combination MPNIndexตวอยาง 10 1 0.1 0.01 0.001 ofpositives No./100mL
A 5 5 1 0 0 5-1-0 33 × 10 /1 = 330
B 4 5 1 0 0 4-5-1 48 × 10 /10 = 48
C 5 2 5 2 1 5-2-1 70 × 10 /0.1 = 7000
D 4 5 4 5 1 4-5-1 48 × 10 /0.1 = 4800
E 5 4 4 0 1 4-4-1 40 × 10 /1 = 400
F 4 3 0 1 1 4-3-2 39 × 10 /10 = 39
G 4 3 3 2 1 3-2-1 17 × 10 /0.1 = 1700
119
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
วธนใชในการตรวจวเคราะหแบคทเรยกลมcoliformsกลมfecalcoliformsและE. coliในอาหาร
ครอบคลมการตรวจหา(detection)และการตรวจปรมาณ(enumeration)
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2002; updated
2013, Chapter 4 “Enumeration of Escherichia coli andtheColiformBacteria”.[ออนไลน].
2002; [สบคน 22ธนวาคม 2557]. เขาถงไดท http://www.fda.gov/Food/FoodScience
Research/LaboratoryMethods/ucm064948.htm.
2.2 U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2010;
Appendix: 2MostProbableNumber fromSerialDilutions. [ออนไลน]. 2010; [สบคน
20 กมภาพนธ 2558]. เขาถงไดท http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/
Laboratory Methods/ ucm109656.htm.
3. นยามศพทและคายอ(Termsandabbreviation)
E. coli = Escherichia coli
IMViC = indole,methylred,Voges-Proskauer,citrate
Shellfish = สตวทะเลมเปลอกทบรโภคเปนอาหารไดเชนกงหอยป
4. หลกการ(Principle)
แบคทเรยในกลม coliforms เปนแบคทเรยแกรมลบรปทอนไมสรางสปอร เจรญไดในททม
ออกซเจนและไมมออกซเจน(facultativeanaerobe)สามารถใชนาตาลแลคโตส(lactose)เกดกรด
และสรางกาซทอณหภม 35 C ภายใน 48 ชวโมง พบทวไปในสงแวดลอม และในระบบ
DMScF2016: วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms และ
E. coliในอาหาร
Analytical method of Coliforms, Fecal coliforms
and E. coliinfood
120
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ทางเดนอาหารของคนและสตวใชเปนตวบงชสขลกษณะของนาและสงแวดลอมในกระบวนการ
ผลตอาหารสวนfecalcoliformsหรอthermotolerantcoliformsเปนกลมยอยของแบคทเรยกลม
coliformsพบมากในระบบทางเดนอาหารของคนและสตวสามารถใชนาตาลแลคโตส(lactose)
เกดกรดและสรางกาซทอณหภม44.5ถง45.5Cภายใน24-48ชวโมงอาจใชเปนตวบงชมาตรฐาน
สาหรบ shellfish และนาเพาะเลยง shellfishสาหรบ E. coli เปนแบคทเรยชนดหนงในกลม
fecal coliformsนยมใชเปนจลนทรยบงชสขลกษณะการผลตอาหารการจาแนกE. coli อาศย
หลกการทางชวเคมของปฏกรยาIMViCตามปกตการตรวจวเคราะหcoliforms,fecalcoliforms
และE. coli ในอาหารมกใชวธมาตรฐาน (conventionalmethod) แตเนองดวยคณสมบตท
E. coli มากกวา 95%สามารถสรางเอนไซมβ-glucuronidase (GUD) ซงยอย fluorogenic substrate เชน 4-methylumbelliferyl-β-D- glucuronide (MUG) และใหสารเรองแสง
4-methylumbelliferon(MU)ซงเหนเปนสนาเงนภายใตแสงอลตราไวโอเลต(UV)ความยาวคลน
ประมาณ 365 นาโนเมตร ในทมด ดงนนจงอาจใชหลกการทางานของเอนไซมดงกลาว
ในการตรวจสอบเบองตนและการตรวจยนยน เพอจาแนกE. coli จากกลม coliforms เชน
การใชอาหารเลยงเชอ LST-MUG broth, EC-MUG broth,VRBA-MUGนอกจากนอาจใช
chromogenic substrates อนแทน MUGสาหรบการตรวจวเคราะห coliforms และ E. coli
ไดเชนกน
การตรวจcoliforms,fecalcoliformsและ E. coli ในอาหารแบงออกเปน
4.1 การตรวจปรมาณ(enumeration)ม2วธคอ
4.1.1 วธMPNแบงเปน3ขนตอนดงน
4.1.1.1 การตรวจสอบเบองตน (presumptive phase) นาตวอยางเรมตนหรอ
ทเจอจางตามความเหมาะสมอยางนอย3ระดบตดตอกนระดบละ3หรอ
5 หลอด ใสในอาหารเลยงเชอชนดเหลวทมนาตาลแลคโตสเปน
องคประกอบ เพอแยกcoliformsออกจากแบคทเรยชนดอนทไมสามารถ
ใชนาตาลแลคโตสได
4.1.1.2 การตรวจยนยน (confirmed phase) นาหลอดทใหกาซไปตรวจยนยน
coliformsและ fecal coliformsโดยถายเชอลงในอาหารเลยงเชอจาเพาะ
ชนดเหลว(selectivebroth)
4.1.1.3 การตรวจขนสมบรณ (completed phase) แยกเชอและนาไปตรวจยนยน
E. coli โดยทดสอบทางชวเคม
121
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.1.2 วธpourplate:coliformsและE. coli
นาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสมปเปตลงบนจานเพาะเชอเทดวย
อาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงนาไปบมนบจานวนโคโลนทมลกษณะเฉพาะ
และนาไปตรวจยนยนโดยทดสอบทางชวเคม
4.2 การตรวจหา(detection):coliformsและE. coli
ตรวจสอบเบองตนโดยนาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสมใสลงในอาหาร
เลยงเชอชนดเหลวทมนาตาลแลคโตสเปนองคประกอบ จานวน 2 หลอดตอระดบ
การเจอจางและดาเนนการตามขนตอนการตรวจยนยนและการตรวจขนสมบรณ
5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents): ภาคผนวก1
5.1 อาหารเลยงเชอ
5.1.1 2%Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth
5.1.2 EC broth
5.1.3 EC-MUG broth
5.1.4 Koser’scitratebrothหรอSimmonscitrateagar
5.1.5 Lactose broth
5.1.6 Lauryltryptose(LST)broth
5.1.7 LauryltryptoseMUG(LST-MUG)broth
5.1.8 Levine’seosin-methyleneblue(L-EMB)agar
5.1.9 Methylred-VogesProskauer(MR-VP)broth
5.1.10Platecountagar(PCA)
5.1.11Tryptone(tryptophane)broth
5.1.12Violetredbileagar(VRBA)
5.1.13Violetredbileagar-MUGagar(VRBA-MUG)
5.2 สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent) ไดแก Butterfield’s phosphate-bufferedwater
(BPB)หรอ equivalent diluent เชน 0.1%peptonewater (กรณ shellfish ใชBPBหรอ
0.5%peptonewater)
5.3 สารเคม
5.3.1 Gram stain reagents
5.3.2 Kovacs’reagent
5.3.3 Methyl red indicator
5.3.4 Voges-Proskauer(VP)reagents
122
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 เครองมอ
6.1.1 เครองนงทาลายเชอ(autoclave)121±3C
6.1.2 เครองชง(balance)
6.1.3 เครองบดปน(blender)หรอเครองตผสมอาหาร(stomacher)
6.1.4 เครองนบโคโลน(colonycounter)
6.1.5 ตอบเพาะเชอ(incubator)32±1C,35±1Cและ35±0.5C(สาหรบshellfish)
6.1.6 กลองจลทรรศน(microscope)
6.1.7 เครองวดความเปนกรด-เบส(pH-meter)
6.1.8 เครองผสม(vortexmixer)
6.1.9 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)44.5±0.2C,45.5±0.2Cและ47±2C
6.1.10UVlampความยาวคลนประมาณ365นาโนเมตรไมเกน6วตต
6.2 อปกรณ
6.2.1 โถปน(blender)หรอถงตผสมอาหาร(stomacherbag)
6.2.2 ขวดรปชมพ(flask)หรอขวดแกวฝาเกลยว
6.2.3 แผนกระจก(glassslide)
6.2.4 หวงและเขมเขยเชอ(loopandneedle)
6.2.5 จานเพาะเชอ(petridish)
6.2.6 ปเปต(pipette)
6.2.7 หลอดทดลอง(testtube)พรอมหลอดดกกาซ(Durhamtube)
6.2.8 ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การสมตวอยาง(Sampling)
7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขงตดตวอยางจากหลายๆตาแหนงใหเปนชนเลกๆผสม
ใหเขากนกรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทวสมตวอยาง 50 กรม
(กรณมตวอยางนอยกวา50กรมใหใชตวอยางครงหนง)ใสในภาชนะปราศจากเชอ
7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทหรอ
ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆกนใสในภาชนะปราศจากเชอ ใหได
ปรมาตรรวมไมนอยกวา100มลลลตรเขยาใหเขากน(ตวอยางเรมตน)
123
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.1.3 กรณทตวอยางเปนหอยสองฝา (bivalvemolluscan shellfish) สดและแชแขง
[ไมรวม crustaceans (crabs, lobsters, and shrimp) และเนอหอยแปรรป
เชนชบเกลดขนมปง(breaded)แกะเปลอก(shucked)และปรงสก(pre-cookedand
heat-processed)]สมตวอยางหอย 10-12ตว (ทงเนอและสวนของเหลวนาหนก
รวม200กรม)ใสในภาชนะปราศจากเชอเทสารละลายสาหรบเจอจาง200มลลลตร
ผสมใหเขากนโดยใชเครองบดปนนาน2นาทจะไดตวอยางเจอจาง1:2
7.2 การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
เจอจางตวอยางตามลาดบลาดบละ10เทา(serialten-folddilutions)ดวยสารละลายสาหรบ
เจอจางดงน
7.2.1 กรณ 7.1.1 เทสารละลายสาหรบเจอจาง 450มลลลตรหรอปรมาตร 9 เทาลงใน
ตวอยางผสมใหเขากนโดยใชเครองบดปน 30-60วนาทหรอเครองตผสมอาหาร
2นาท จะไดตวอยางทเจอจาง 1:10 (initial suspensionหรอ primary dilution)
กรณ 7.1.3หลงจากเตรยมตวอยางเจอจาง 1:2 ใหเรมทาการตรวจวเคราะหภายใน
2นาท โดยนบจากทาการเจอจางเปน 1:10ดวยสารละลายสาหรบเจอจาง (BPB
หรอ 0.5% peptonewater) ปรมาตร 4 เทา (เชน ตวอยางเจอจาง 1:2 ปรมาณ
20กรมใสสารละลายสาหรบเจอจาง80มลลลตร)เขยาใหเขากน
7.2.2 กรณ7.1.2ปเปตตวอยาง10มลลลตรใสในสารละลายสาหรบเจอจาง90มลลลตร
เขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:10
7.2.3 ปเปตตวอยางทเจอจาง 1:10 มา 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง
90มลลลตรเขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:100ทาเชนนตอไปจนไดตวอยาง
ทเจอจางตามตองการ
7.3 การตรวจปรมาณ(enumeration)coliforms,fecalcoliformsและE. coli ในอาหารโดยวธ
MPN:ภาคผนวก2แผนภมท1
7.3.1 การตรวจสอบเบองตน(presumptivephase)
7.3.1.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม1มลลลตร
ใสในLSTbroth(หรอlactosebroth)อยางนอย3ระดบตดตอกนระดบ
ความเจอจางละ3หลอด
กรณตวอยางshellfishปเปตตวอยางใสในLSTbrothระดบความเจอจาง
ละ 5หลอดโดยใสตวอยางทเจอจาง 1:2ปรมาตร2มลลลตร (เทยบเทา
นาหนกตวอยาง1กรม)และตวอยางทเจอจาง10เทาตามลาดบ1มลลลตร
124
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
อยางนอย3ระดบ(1:10,1:100และ1:1,000ซงเทยบเทานาหนกตวอยาง
0.1,0.01และ0.001กรมตามลาดบ)
7.3.1.2 บมท35C24±2ชวโมง
7.3.1.3 อานและบนทกผลหลอดLSTbroth
ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซหรอเกดฟองกาซเมอเขยาหลอดเบาๆ
ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซ
ถาใหผลลบบมเพม24ชวโมงอานและบนทกผลท48±3ชวโมง
หมายเหต: กรณตรวจปรมาณE. coli ในอาหารอาจใชLST-MUGbroth
แทนLST broth ได (ยกเวนในหอยสองฝา เนองจากเนอหอย
มnaturalGUDactivityซงจะเกดการเรองแสงหรอผลบวกปลอม)
บมท35C24ถง48±2ชวโมงอานผลเชนเดยวกบLSTbroth
พรอมทงสงเกตการเรองแสงสนาเงนภายใตแสงUVความยาว
คลนประมาณ 365นาโนเมตรหลอดทใหผลบวก (เกดกาซ
ในหลอดดกกาซและเรองแสงสนาเงน)ใหดาเนนการตรวจยนยน
ตอตามขอ7.3.4
7.3.2 การตรวจยนยน(confirmedphase)สาหรบcoliforms
7.3.2.1 นา1loopของแตละหลอดLSTbrothทใหผลบวกถายลงในBGLBbroth
หลอดตอหลอด (อาจถายเชอโดยใชแทงไมปราศจากเชอแทน loopและ
กรณทพบฝาใหหลกเลยงสวนของฝา)
7.3.2.2 บมท35C48±3ชวโมง
ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซ
ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซ
7.3.2.3 อานและบนทกผลจานวนหลอดBGLBbrothทใหผลบวก
7.3.2.4 นาคาไปเปรยบเทยบกบตารางMPN
7.3.3 การตรวจยนยน(confirmedphase)สาหรบfecalcoliforms
7.3.3.1 นา 1 loopจากLSTbroth ทใหผลบวกแตละหลอดถายลงในECbroth
หลอดตอหลอด
7.3.3.2 บมท45.5C24±2ชวโมง(กรณตวอยางshellfishบมท44.5C)
ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซ
ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซ
125
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ถาใหผลลบบมเพม24ชวโมงอานและบนทกผลท48±2ชวโมง
7.3.3.3 อานและบนทกผลจานวนหลอดECbrothทใหผลบวก
7.3.3.4 นาคาไปเปรยบเทยบกบตารางMPN
หมายเหต กรณตรวจปรมาณE. coliในเนอหอยเชนหอยนางรมอาจใชEC-MUGbroth
แทนการใชECbrothในขนตอนconfirmedphaseบมและอานผลเชนเดยว
กบECbrothพรอมทงสงเกตการเรองแสงสนาเงนภายใตแสงUVความยาว
คลน365นาโนเมตรในทมดนาหลอดทใหผลบวก(เกดกาซในหลอดดกกาซ
และเรองแสงสนาเงน)ดาเนนการตรวจขนสมบรณตามขอ7.3.4
7.3.4 การตรวจขนสมบรณ(completedphase):E. coli
7.3.4.1 นาหลอดECbroth (หรอEC-MUGbrothหรอLST-MUGbroth)ทให
ผลบวกขดบนL-EMBagar
7.3.4.2 บมท35C18-24ชวโมง
7.3.4.3 เลอกโคโลนลกษณะแบนและมสดาตรงกลางมหรอไมมmetallic sheen
1-5โคโลนจากแตละจานเพาะเชอขดบนPCAslant
7.3.4.4 บมท35C18-24ชวโมง
7.3.4.5 นาเชอจากPCAslantมายอมสแกรมกรณทพบเชอแกรมลบรปทอนสน
ใหนาไปทดสอบตอดงน
7.3.4.5.1ปฏกรยาIMViC
การทดสอบindole
เขยเชอลงในtryptonebrothบมท35C24±2ชวโมงหยด
Kovacs’reagent0.2-0.3มลลลตรอานผล
ผลบวก : เกดวงแหวนสแดงดานบน
ผลลบ : เกดวงแหวนสเหลอง
E. coli(biotype1)ใหผลบวก
สาหรบE. coli(biotype2)ใหผลลบ
การทดสอบMR-VPreactivecompounds
เขยเชอลงในMR-VPbrothบมท35C48±2ชวโมง
ถายbroth1มลลลตรลงในหลอดปราศจากเชอ
หยด VP reagents (α-naphthol solution 0.6 มลลลตร
และ40%KOHsolution0.2มลลลตร)เขยาจากนนเตมเกลด
126
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
creatineเลกนอยเขยาอกครงแลวตงไวทอณหภมหองประมาณ
2ชวโมงอานผล
VP ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนเปนสชมพ-แดง
ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส
E. coli ใหผลลบ
สาหรบMRใหบมMR-VPbrothตออก48±2ชวโมง
หยดmethylredIndicator5หยดเขยาอานผล
MR ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสเหลองเปนสแดง
ผลลบ : อาหารเลยงเชอเปนสเหลอง
E. coli ใหผลบวก
การทดสอบcitrate
เขยเชอปรมาณเลกนอยลงในKoser’scitratebroth*
หรอนาเชอขดบนผวหนาและ stabลงในSimmons citrate
agar**บมท35C96ชวโมงอานผล
ผลบวก : อาหารเลยงเชอขนชดเจน*หรอเชอเจรญ
และอาหารเลยงเชอเปลยนจากสเขยวเปน
สนาเงน**
ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมขน*หรอเชอไมเจรญ/
เจรญเลกนอยและอาหารเลยงเชอไมเปลยนส**
E. coli ใหผลลบ
7.3.4.5.2 การสรางกาซจากนาตาลแลคโตส
เขยเชอลงใน LST broth อกครง เพอยนยนการสรางกาซ
บมท35C48±2ชวโมงอานผลในหลอดดกกาซ
ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซหรอเกดฟองกาซ
เมอเขยาหลอดเบาๆ
ผลลบ : ไมเกดกาซ
E. coli ใหผลบวก
การสรปผลวาพบE. coli ตองพบเชอทมคณสมบตดงน
1) ใชนาตาลแลคโตสและสรางกาซภายใน48ชวโมงท35C
2)พบเชอแกรมลบรปทอนไมสรางสปอร
127
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
3) ใหผลปฏกรยา IMViCรปแบบ++-- (biotype1)หรอ -+--
(biotype2)
หมายเหต อาจใชชดทดสอบทางชวเคมสาเรจรป เชนAPI20Eหรอ
VITEK เพอตรวจจาแนก E. coli แทนการทดสอบปฏกรยา
IMViC
7.3.4.6 บนทกจานวนหลอด EC broth ทไดผลการตรวจยนยนขนสมบรณวา
เปนE. coli
7.3.4.7 นาคาไปเปรยบเทยบกบตารางMPN
7.4 การตรวจปรมาณ(enumeration)coliformsและE. coli ในอาหารโดยวธpourplate:
7.4.1 coliforms:ภาคผนวก3แผนภมท2
7.4.1.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม1มลลลตร
ใสลงบนจานเพาะเชอระดบความเจอจางละ2จาน
7.4.1.1.1 กรณทวไป
เทVRBA10มลลลตรผสมใหเขากนตงทงไวใหวนแขง
เททบหนาดวยVRBA 5 มลลลตร (เพอปองกนเชอเจรญ
แผบนผวหนาวน)ตงทงไวใหวนแขง
7.4.1.1.2 กรณทคาดวาตวอยางมinjuredหรอstressedcell
เท TSA 8-10 มลลลตร ลงในแตละจานเพาะเชอ ผสมให
เขากนบมทอณหภมหอง2±0.5ชวโมง
เททบหนาดวยVRBA8-10มลลลตรตงทงไวใหวนแขง
7.4.1.2 บมท35C18-24ชวโมง(กรณตวอยางผลตภณฑนมบมท32C)
7.4.1.3 เลอกจานเพาะเชอทมเชอเจรญ 25-250 โคโลน นบโคโลนสแดง-มวง
ทมโซนลอมรอบ (โซนเกดจาก precipitated bile acids) ขนาดเสน
ผานศนยกลางของโคโลน±0.5มลลเมตร
7.4.1.4 ตรวจยนยนโดยสมโคโลนลกษณะเฉพาะอยางนอย10โคโลนใสในหลอด
BGLBbroth(1โคโลนตอหลอด)
7.4.1.5 บมท35Cอานผลการเกดกาซท24และ48ชวโมง
7.4.1.6 บนทกจานวนหลอดทใหผลบวก
(กรณหลอดBGLBbroth ทใหผลบวกพบฝา ใหยอมสแกรมจากbroth
เพอใหแนใจวากาชทเกดขน มไดเกดจากแบคทเรยแกรมบวก รปทอน
ทสามารถใชนาตาลแลคโตสได)
128
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4.2 E. coli:ภาคผนวก4แผนภมท3
7.4.2.1 เหมอนขอ7.4.1.1–7.4.1.2เวนแตเททบหนาดวยVRBA-MUGแทนVRBA
7.4.2.2 นาจานเพาะเชอทมเชอเจรญ 25-250 โคโลน ไปสองภายใตแสง UV
ความยาวคลนประมาณ365นาโนเมตรในทมด และนบจานวนโคโลน
ทมการเรองแสงสนาเงนรอบโคโลน
7.4.2.3 สมโคโลนทใหผลบวกจากขอ 7.4.2.2อยางนอย 10โคโลน ไปทดสอบ
ทางชวเคมตามวธการตรวจขนสมบรณในขอ7.3.4.5
7.5 การตรวจหา(detection)coliformsและ E. coli ในอาหาร:ภาคผนวก5แผนภมท4
7.5.1 นาตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม(เชน1:10และ1:100)
ใสลงLSTbroth(หรอlactosebroth)จานวน2หลอดตอระดบความเจอจาง
7.5.2 เหมอนขอ 7.3.1.2-7.3.1.3 และตอดวยขอ 7.3.2.1-7.3.2.3 สาหรบการตรวจหา
coliforms
7.5.3 เหมอนขอ 7.3.1.2-7.3.1.3 ตอดวยขอ 7.3.3.1-7.3.3.3 และขอ 7.3.4.1-7.3.4.6
สาหรบการตรวจหาE. coli
8. การคานวณผล(Calculationofresults)
8.1 การคานวณกรณตรวจวเคราะหปรมาณโดยวธMPN
8.1.1 นาจานวนหลอดทใหผลบวก เปรยบเทยบกบตารางMPN (ภาคผนวก 6) จะได
คาMPN/กรมและชวงความเชอมนทระดบ95%(95%confidenceintervals)
8.1.2 กรณจานวนหลอดบวกไมเปนไปตามตารางMPNใหใชสตรคานวณ(Thomas,1942)
ดงน
MPN/กรม = (∑gj)/(∑tjmj∑ (tj- gj)mj)(1/2)
∑gj = จานวนหลอดทงหมดทใหผลบวก
∑(tj - gj)mj = นาหนกรวมเปนกรมของตวอยางในหลอดทใหผลลบ
∑tjmj = นาหนกรวมเปนกรมของตวอยางในหลอดทงหมด
ใหเลอกระดบความเจอจางสาหรบการคานวณโดยเลอกระดบความเจอจางตาสด
ทใหผลบวกไมครบทกหลอด แลวเลอกระดบความเจอจางสงสดทมผลบวก
อยางนอย 1หลอด จากนนเลอกทกระดบความเจอจางทอยระหวางสองระดบ
ทเลอกไวแลวดงตวอยางตอไปน
129
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตวอยางท1 ระดบความเจอจาง 1:1 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000
จานวนหลอดทใหผลบวก 5/5 10/10 4/10 2/10 0/5
ในทนเลอกสองระดบความเจอจาง1:100และ1:1,000จะได
∑gj = 6
∑(tj - gj)mj = (6 ×0.01)+(8×0.001)
= 0.068
∑tjmj = (10 ×0.01)+(10×0.001)
= 0.11
แทนคาในสตร
MPN/กรม = 6/√(0.068)(0.011)
= 6/0.086
= 70
ตวอยางท2 ระดบความเจอจาง 1:10 1:100 1:1,000
จานวนหลอดทใหผลบวก 2/3 0/3 3/3
ในทนเลอกทงสามระดบความเจอจางจะได
∑gj = 5
∑(tj - gj)mj = (1 ×0.1)+(3×0.01)+(0×0.001)
= 0.13
∑ tjmj = (3 ×0.1)+(3×0.01)+(3×0.001)
= 0.333
แทนคาในสตร
MPN/กรม = 5/√(0.13)(0.333)
= 5/0.208
= 24
8.1.3 การประมาณคาขดความเชอมน (95% confidence limits) ของผลMPNคานวณ
จากคาstandarderrorของlog10(MPN)ดวยวธของHaldaneโดยใชสตรคานวณ
ดงน
130
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
95%confidenceintervals=LogMPN/กรม± (1.96)(standarderror)
standarderrorคานวณไดจากExcelspreadsheetตามเอกสารอางองขอ2.2
ตวอยาง ระดบความเจอจาง 1:10 1:100 1:1,000
จานวนหลอดทใหผลบวก 2/3 0/3 3/3
∴MPN/กรม = 5/√(0.1+0.03+0.000)(0.3+0.03+0.003)
= 5 /√(0.13)(0.333)
= 24
95% confidence intervals = log 24 ± (1.96)(0.1973)
= 1.3802 ± 0.3867
= 0.9935ถง1.7669
Lowerlimit =antilog0.9935=9.9
Upper limit = antilog 1.7669 = 58.5
8.1.4 ในกรณทระดบความเจอจางเรมตนไมใช 1:10 (เทากบนาหนกตวอยาง 0.1กรม)
สามารถหาคาMPNไดดงน
MPN/กรม=คาทอานไดจากตาราง×ระดบความเจอจางกลาง(middledilution)
100
ตวอยาง ระดบความเจอจาง 1:1,000 1:10,000 1:100,000
จานวนหลอดทใหผลบวก 3/3 2/3 1/3
ดงนนคาทอานไดจากตาราง = 150
ระดบความเจอจางกลาง = 10,000
∴ MPN/กรม=
150 × 10,000
100
= 15,000
131
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8.2 การคานวณกรณตรวจวเคราะหปรมาณโดยวธpourplate
กรณนบโคโลนทมลกษณะเฉพาะและนาไปตรวจยนยนปรากฏวาเปน coliformsหรอ
E. coli บางโคโลนใหนาสดสวนทยนยนแลววาเปนcoliformsหรอE. coli ไปคณจานวน
ทนบไดและคณดวยdilutionfactor
ตวอยาง คาเฉลยจานวนโคโลนทนบได = 65 โคโลน ทระดบการเจอจาง 1:10,000
ตรวจยนยนพบวาเปนcoliforms4จาก5โคโลนดงนน
coliformsCFU/กรมหรอมลลลตร = 65×(4/5)× 10,000
= 520,000
9. การรายงานผล(Expressionofresults)
9.1 การตรวจหา(detection)รายงานเปน
พบ/ไมพบตอนาหนกหรอปรมาตรของตวอยาง(เชนกรมหรอมลลลตร)
9.2 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธMPNรายงานเปน
ColiformsหรอFecalcoliformsหรอE. coli MPN/กรมหรอมลลลตร
ยกเวนshellfishรายงานMPN/100กรม
9.2.1 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธpourplateรายงานเปน
จานวนColiformsหรอE. coli CFU/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)
9.2.2 กรณตรวจวเคราะหปรมาณ โดยวธ pour plate ถาไมพบโคโลนลกษณะเฉพาะ
ของcoliformsหรอ E. coli หรอกรณทยนยนแลวพบวาไมใชcoliformsใหรายงาน
ดงน
ตวอยางของแขงหรอของเหลวขนหนดทระดบความเจอจางแรก ใหรายงาน
นอยกวา10
ตวอยางของเหลวทตวอยางเรมตนใหรายงานนอยกวา1หรอไมพบ
132
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
10. รายละเอยดอน
10.1 ภาคผนวก1 : อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
10.2 ภาคผนวก2 : แผนภมท 1การตรวจปรมาณ (enumeration) coliforms, fecal coliforms
และE. coli ในอาหารโดยวธMPN
10.3 ภาคผนวก3 : แผนภมท2การตรวจปรมาณ(enumeration)coliformsในอาหารโดยวธ
pour plate
10.4 ภาคผนวก4 : แผนภมท3การตรวจปรมาณ(enumeration)E. coli ในอาหาร
โดยวธpourplate
10.5 ภาคผนวก5 : แผนภมท4การตรวจหา(detection)coliformsและE. coli ในอาหาร
10.6 ภาคผนวก6 : ตารางท 1 คาMPNและConfidence limitsสาหรบผลบวกและผลลบ
เมอใชตวอยาง0.1,0.01,0.001กรมจานวน3หลอดตอระดบการเจอจาง
ตารางท 2 คาMPNและConfidence limitsสาหรบผลบวกและผลลบ
เมอใชตวอยาง0.1,0.01,0.001กรมจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง
133
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก1
อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
อาหารเลยงเชอกรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. 2%Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth
Peptone 10 กรม
Lactose 10 กรม
Oxgall 20 กรม
Brilliantgreen 0.0133 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบง 10มลลลตรใสหลอด
ทดลองทมหลอดดกกาซควาอยฆาเชอท121C12-15นาทpH7.2± 0.2
2. EC broth
Tryptoseหรอtrypticase 20 กรม
Lactose 5 กรม
BilesaltsmixtureorbilesaltsNo.3 1.5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 4 กรม
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1.5 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบง10มลลลตรใสหลอด
ทดลองทมหลอดดกกาซควาอยฆาเชอท121C12-15นาทpH6.9± 0.2
134
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
3. EC-MUG broth
Tryptoseหรอtrypticase 20 กรม
Lactose 5 กรม
BilesaltsmixtureorbilesaltsNo.3 1.5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 4 กรม
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1.5 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG) 0.05 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบง 10มลลลตรใสหลอด
ทดลองทมหลอดดกกาซควาอย(หลอดทใชตองไมเรองแสงภายใตแสงUVทความยาวคลน
ประมาณ365นาโนเมตร)ฆาเชอท121C15นาทpH6.9± 0.2อาหารเลยงเชอทเตรยมแลว
เกบทอณหภมหองไดนาน1สปดาหหรอเกบในตเยนไดนาน1เดอน
4. Koser’scitratebroth
Sodiumammoniumhydrogenphosphate 1.5 กรม
(NaNH4HPO4 4H2O)
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1 กรม
(monobasic)
Magnesium sulfate (MgSO4 7H2O) 0.2 กรม
Sodium citrate 2H2O 3 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบงใสหลอดตามปรมาตร
ทตองการฆาเชอท121C15นาทpH6.7± 0.2
135
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. Lactose broth
Beefextract 3 กรม
Peptone 5 กรม
Lactose 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบง10มลลลตรใสหลอด
ฆาเชอท121C15นาทpH6.9± 0.2
6. Laurylsulphatetryptosebroth(LSTbroth)
Tryptose 20 กรม
Lactose 5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 2.75 กรม
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 2.75 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Sodiumlaurylsulfate 0.1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบง 10มลลลตรใสหลอด
ทดลองทมหลอดดกกาซควาอยฆาเชอท121C12-15นาทpH6.8± 0.2
136
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7. LauryltryptoseMUG(LST-MUG)broth
Tryptose 20 กรม
Lactose 5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 2.75 กรม
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 2.75 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Sodiumlaurylsulfate 0.1 กรม
4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG) 0.05 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆ (ถาจาเปน)
แบง 10 มลลลตรใสหลอดทดลองทมหลอดดกกาซควาอย ฆาเชอท 121 C 15 นาท
pH 6.8 ± 0.2
8. Levineeosinmethyleneblue(L-EMB)agar
Peptone 10 กรม
Lactose 10 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 2 กรม
Agar 15 กรม
EosinY 0.4 กรม
Methyleneblue 0.065 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจน agar
ละลายแบงใสขวดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท 121 C 15นาท pH7.1± 0.2 เทใส
จานเพาะเชอตามปรมาตรทตองการ
137
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. Methylred-VogesProskauer(MR-VP)broth
สตร1
Bufferedpeptone-waterpowder 7 กรม
(DifcoorBBL)
Glucose 5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆ(ถาจาเปน)
แบง10มลลลตรใสหลอดฆาเชอท118-121C15นาทpH6.9± 0.2
สตร2
Pancreaticdigestofcasein 3.5 กรม
Pepticdigestofanimaltissue 3.5 กรม
Dextrose 5 กรม
Potassiumphosphate(K3PO4) 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆ(ถาจาเปน)
แบง10มลลลตรใสหลอดฆาเชอท118-121C15นาทpH6.9± 0.2
สตร3
Peptone 5 กรม
Glucose 5 กรม
Phosphatebuffer 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบง10มลลลตรใสหลอด
ฆาเชอท121C15นาทpH7.5± 0.2
138
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
10. Plate count agar
Tryptone 5 กรม
Yeastextract 2.5 กรม
Dextrose 1 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจน agar
ละลายฆาเชอท121C15นาทpH7.0± 0.2
11. Simmons citrate agar
Ammonium dihydrogen phosphate (NH4H2PO4) 1 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 1 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Sodiumcitratedihydrate 2 กรม
Magnesium sulfate (MgSO4 7H2O) 0.2 กรม
Agar 15 กรม
Bromthymolblue 0.08 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆพรอมเขยา
เปนครงคราวตมเดอดนาน1-2นาทจนagarละลายแบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการ
ฆาเชอท121C15นาทเอยงหลอดและปลอยใหวนแขงpH6.8±0.2
139
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
12. Tryptone broth
Tryptoneortrypticase 10 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายTryptoneor trypticase ในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบง 5มลลลตร
ใสหลอดฆาเชอท121C15นาทpH6.9± 0.2
13. Violetredbileagar(VRBA)
Peptoneorgelysate 7 กรม
Yeastextract 3 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
BilesaltsorbilesaltsNo.3 1.5 กรม
Lactose 10 กรม
Neutralred 0.03 กรม
Crystalviolet 0.002 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรตงทงไว 2-3นาทผสมให
เขากนปรบpH7.4± 0.2ตมใหเดอดนาน2นาททาใหเยนลงท45Cกอนนาไปใช
140
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
14. Violetredbile-MUG(VRBA-MUG)agar
Peptoneorgelysate 7 กรม
Yeastextract 3 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
BilesaltsorbilesaltsNo.3 1.5 กรม
Lactose 10 กรม
Neutralred 0.03 กรม
Crystalviolet 0.002 กรม
4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide(MUG) 0.1 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรตงทงไว 2-3นาท ผสมให
เขากนปรบpH7.4± 0.2ตมใหเดอดนาน2นาททาใหเยนลงท45Cกอนนาไปใช
15. Butterfield’sphosphate-buffereddilutionwater(BPB)
15.1 stock solution
Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 34 กรม
นากลน 1,000 มลลลตร
ชงKH2PO4 34กรมละลายในนากลน 500มลลลตรปรบpH7.2 โดยใช 1NNaOH
และปรบปรมาตรเปน1ลตรฆาเชอท121C15นาท
15.2 dilution blanks
ปเปตstocksolution1.25มลลลตรนามาปรบปรมาตรเปน1ลตรดวยนากลนแบงใสหลอด
หรอขวดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท
141
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
16. 0.1%peptonewater
peptone 1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรอง ปรบ pH 7.0 ± 0.2 แบงใสหลอดหรอขวด
ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท
17. 0.5%peptonewater
peptone 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรองปรบ pH 7.0 ± 0.2 แบงใสหลอดหรอขวด
ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท
สารเคมกรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. Gram stain reagents
ใชชนดสาเรจรป
2. Kovacs’reagent
p-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม
Amylalcohol(normalonly) 75 มลลลตร
Hydrochloricacid(HCl) 25 มลลลตร
ละลาย p-dimethylaminobenzaldehyde ใน normal amyl alcohol คอยๆ เตม HCl
เกบทอณหภม4C
142
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
3. Methyl red solution
Methylred 0.1 กรม
Ethylalcohol95% 300 มลลลตร
นากลน(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย) 500 มลลลตร
ละลายmethyl red ใน95% ethyl alcoholปรบปรมาตรเปน 500มลลลตรดวยนากลน
หรอนากรอง
4. VP reagents
Solution1
α-Naphthol 5 กรม
Alcohol(absolute) 100 มลลลตร
ละลายα-Naphtholในalcohol
Solution2
Potassiumhydroxide(KOH) 40 กรม
นากลน(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย) 100 มลลลตร
ละลายPotassiumhydroxideในนากลนและปรบปรมาตรเปน100มลลลตร
143
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก2
แผนภมท1 การตรวจปรมาณ (enumeration) coliforms, fecal coliformsและ E. coli ในอาหาร
โดยวธMPN
วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก 2
ตวอยางเจอจางอยางนอย 3 ระดบตดตอกน (เชน 1:10, 1:100 และ 1:1,000)
presumptive phase
LST broth* ระดบความเจอจางละ 3 หลอดๆ ละ 1 มลลลตร [กรณ shellfish ใช LST broth ระดบความเจอจางละ 5 หลอด และเพมระดบความเจอจาง 1:2 หลอดละ 2 มลลลตร]
35oC 24 ± 2 ถง 48 ± 3 ชวโมง
ผลลบ ผลบวก
confirmed phase
BGLB EC broth** 35oC48 ± 3 ชวโมง 45.5oC 24 ถง 48 ± 2 ชวโมง
อานผล (44.5oC: shellfish)
ผลลบ ผลบวก
completed phase
คานวณ คานวณ L-EMB agar 35oC 18-2 ชวโมง รายงานผล รายงานผล ยอมสแกรม (MPN coliforms) (MPN fecal coliforms) (แกรมลบรปทอนสน)
IMViC /LST broth
(E. coli : ++-- หรอ -+--/+) คานวณ
รายงานผล (MPN E. coli)
* กรณตรวจ E. coli ในอาหาร (ไมรวมหอยสองฝา) อาจใช LST-MUG broth แทน LST-broth ** กรณตรวจ E. coli ในเนอหอย อาจใช EC-MUG broth แทน EC broth
144
เปรยบเทยบผลกบ ตาราง MPN
รายงานผล (MPN coliforms, fecal coliforms
หรอ E.coli)
เปรยบเทยบผลกบ ตาราง MPN
เปรยบเทยบผลกบ ตาราง MPN
144
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
แผนภมท2การตรวจปรมาณ(enumeration)coliformsในอาหารโดยวธpourplate
ภาคผนวก3
วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก 3
ตวอยางเจอจาง 1:10 หรอ 1:100 หรอตามความเหมาะสม
ปเปตตวอยางแตละระดบความเจอจาง 1 มลลลตร ใสลงในจานเพาะเชอ 2 จาน (duplicate)
กรณทวไป กรณทคาดวาตวอยางม injured cell หรอ stressed cell
เท VRBA 10 มลลลตร เท TSA 8-10 มลลลตร ผสมใหเขากน ตงทงใหวนแขง ผสมใหเขากน
อณหภมหอง 2 0.5 ชวโมง
เททบหนาดวย VRBA 5 มลลลตร เททบหนาดวย VRBA 8-10 มลลลตร
ตงทงไวใหวนแขง ตงทงไวใหวนแขง
35oC 18-24 ชวโมง (32oC : นมและผลตภณฑนม) นบโคโลนทมลกษณะเฉพาะ (25-250 โคโลน)
สมอยางนอย 10 โคโลนเพอตรวจยนยน
BGLB broth (1 โคโลน/หลอด) 35oC 24-48 ชวโมง
ผลบวก
คานวณ
รายงานผล (จานวน coliforms)
145
145
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก4
แผนภมท3การตรวจปรมาณ(enumeration)E. coli ในอาหารโดยวธpourplate
วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตวอยางทเจอจาง 1:10 หรอ 1:100 หรอตามความเหมาะสม
ปเปตตวอยางแตละระดบความเจอจาง 1 มลลลตร ใสลงในจานเพาะเชอ 2 จาน (duplicate)
กรณทวไป กรณทคาดวาตวอยางม Injured หรอ stressed cell
เท VRBA 10 มลลลตร เท TSA 8-10 มลลลตร ผสมใหเขากน ตงทงใหวนแขง ผสมใหเขากน
อณหภมหอง 2 0.5 ชวโมง
เททบหนาดวย VRBA-MUG 5 มลลลตร เททบหนาดวย VRBA 8-10 มลลลตร ตงทงไวใหวนแขง ตงทงไวใหวนแขง
35oC 18-24 ชวโมง (32oC : นมและผลตภณฑนม)
นบโคโลนทมลกษณะเฉพาะ (25-250 โคโลน)
สมอยางนอย 10 โคโลน เพอตรวจยนยน
ยอมสแกรม (แกรมลบ รปทอนสน)
IMViC /LST broth (E. coli:++-- หรอ -+--/+)
คานวณ
รายงานผล (จานวน E. coli)
146
146
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก5
แผนภมท4การตรวจหา(detection)coliformsและE. coli ในอาหาร
วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก 5
ตวอยางเจอจางอยางนอย 3 ระดบตดตอกน (เชน 1:10, 1:100 และ 1:1,000)
LST broth* ระดบความเจอจางละ 3 หลอดๆ ละ 1 มลลลตร 35oC 24 ± 2 ถง 48 ± 3 ชวโมง
อานผลการเกดกาซ
ผลลบ ผลบวก
รายงานผล (ไมพบ coliforms หรอ E. coli) BGLB broth EC broth**
35oC 48 3 ชวโมง 45.5oC 24-48 ชวโมง (44.5oC :shellfish) อานผลการเกดกาซ ผลบวก รายงานผล L-EMB agar (พบหรอไมพบ coliforms) 35oC 18-24 ชวโมง
ยอมสแกรม (แกรมลบ รปทอนสน)
IMViC/ LST broth (E. coli : ++-- หรอ -+-- / +)
รายงานผล (พบหรอไมพบ E. coli)
* กรณตรวจ E. coli ในอาหารแชเยน/แชแขง (ไมรวมหอย 2 ฝา) ใช LST - MUG broth ได ** กรณตรวจ E. coli ในเนอหอย เรมตนวเคราะห โดยใช EC-MUG broth ได ทง 2 กรณตองตรวจขนสมบรณ (completed phase)
147
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก6
ตารางMPN
ตารางท1 ค า MPN และ Confidence limits สาหรบผลบวกและผลลบ เมอใช ตวอย าง
0.1,0.01,0.001กรมจานวน3หลอดตอระดบการเจอจาง
Positivetubes
MPN/g
Confidence Positivetubes
MPN/g
Confidence limits limits
0.1 0.01 0.001 Low High 0.1 0.01 0.001 Low High
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --
148
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตารางMPN
ตารางท2 คาMPNและConfidencelimitsสาหรบผลบวกและผลลบเมอใชตวอยาง0.1,0.01,0.001
กรมจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง
Positivetubes
MPN/g
Confidence Positivetubes
MPN/g
Confidence limits limits
0.1 0.01 0.001 Low High 0.1 0.01 0.001 Low High
0 0 0 <1.8 -- 6.8 2 3 0 12 4.1 26
0 0 1 1.8 0.09 6.8 2 3 1 14 5.9 36
0 1 0 1.8 0.09 6.9 2 4 0 15 5.9 36
0 1 1 3.6 0.7 10 3 0 0 7.8 2.1 22
0 2 0 3.7 0.7 10 3 0 1 11 3.5 23
0 2 1 5.5 1.8 15 3 0 2 13 5.6 35
0 3 0 5.6 1.8 15 3 1 0 11 3.5 26
1 0 0 2 0.1 10 3 1 1 14 5.6 36
1 0 1 4 0.7 10 3 1 2 17 6 36
1 0 2 6 1.8 15 3 2 0 14 5.7 36
1 1 0 4 0.7 12 3 2 1 17 6.8 40
1 1 1 6.1 1.8 15 3 2 2 220 6.8 40
1 1 2 8.1 3.4 22 3 3 0 17 6.8 40
1 2 0 6.1 1.8 15 3 3 1 21 6.8 40
1 2 1 8.2 3.4 22 3 3 2 24 9.8 70
1 3 0 8.3 3.4 22 3 4 0 21 6.8 40
1 3 1 10 3.5 22 3 4 1 24 9.8 70
1 4 0 11 3.5 22 3 5 0 25 9.8 70
2 0 0 4.5 0.79 15 4 0 0 13 4.1 35
2 0 1 6.8 1.8 15 4 0 1 17 5.9 36
2 0 2 9.1 3.4 22 4 0 2 21 6.8 40
2 1 0 6.8 1.8 17 4 0 3 25 9.8 70
2 1 1 9.2 3.4 22 4 1 0 17 6 40
2 1 2 12 4.1 26 4 1 1 21 6.8 42
149
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตารางMPN(ตอ)
Positivetubes
MPN/g
Confidence Positivetubes
MPN/g
Confidence limits limits
0.1 0.01 0.001 Low High 0.1 0.01 0.001 Low High
4 2 0 22 6.8 50 5 2 1 70 22 170
4 2 1 26 9.8 70 5 2 2 94 34 230
4 2 2 32 10 70 5 2 3 120 36 250
4 2 3 38 14 100 5 2 4 150 58 400
4 3 0 27 9.9 70 5 3 0 79 22 220
4 3 1 33 10 70 5 3 1 110 34 250
4 3 2 39 14 100 5 3 2 140 52 400
4 4 0 34 14 100 5 3 3 180 70 400
4 4 1 40 14 100 5 3 4 210 70 400
4 4 2 47 15 120 5 4 0 130 36 400
4 5 0 41 14 100 5 4 1 170 58 400
4 5 1 48 15 120 5 4 2 220 70 440
5 0 0 23 6.8 70 5 4 3 280 100 710
5 0 1 31 10 70 5 4 4 350 100 710
5 0 2 43 14 100 5 4 5 430 150 1100
5 0 3 58 22 150 5 5 0 240 70 710
5 1 0 33 10 100 5 5 1 350 100 1100
5 1 1 46 14 120 5 5 2 540 150 1700
5 1 2 63 22 150 5 5 3 920 220 2600
5 1 3 84 34 220 5 5 4 1600 400 4600
5 2 0 49 15 150 5 5 5 >1600 700 --
151
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
วธนใชในการตรวจวเคราะหClostridium botulinum ในอาหารครอบคลมการตรวจหา(detection)
2. เอกสารอางอง(Reference)
U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2001; Chapter 17
“Clostridium botulinum”. [ออนไลน]. 2001 [สบคน 20 กมภาพนธ 2558] เขาถงไดท
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-17.html
3. นยามศพทและคายอ(Termsandabbreviation)
3.1 C. botulinum = Clostridium botulinum
3.2 Proteolyticbacteria = แบคทเรยทสามารถยอยโปรตนใหเปนกรดอะมโน
3.3 Nonproteolyticbacteria = แบคทเรยทไมสามารถยอยโปรตน
4. หลกการ(Principle)
C. botulinum เปนแบคทเรยทไมตองการออกซเจนในการเจรญ(strictanaerobe)ตดสแกรมบวก
รปทอนสรางสปอรคอนไปทางปลายเซลลพบไดในดนนาและสงแวดลอมทวไปสปอรสามารถ
ทนตอความรอนทาใหสปอรยงคงหลงเหลออยในอาหารทผลตโดยใชความรอนไมเพยงพอ
เมอมสภาวะทเหมาะสม สปอรจะงอกเจรญเปน vegetative cell และสรางสารพษทเรยก
botulinal toxinAntigenic typeของ C. botulinum แบงเปน typeA,B,C,D,E, FและG
การตรวจหา(detection)แบงเปน3ขนตอนดงน
4.1 การเพมปรมาณเชอ(enrichment)ใชอาหารเลยงเชอcookedmeatmediumหรอchopped
liver broth สาหรบ C. botulinum สายพนธ proteolytic และใช trypticase-peptone-
glucose-yeastextractbrothสาหรบสายพนธnonproteolytic
4.2 การแยกเชอ(isolation)บนอาหารเลยงเชอชนดแขง
4.3 การตรวจยนยน(confirmation)นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะตรวจยนยน
DMScF2017: วธตรวจวเคราะหClostridium botulinum ในอาหาร
AnalyticalmethodofClostridium botulinum infood
152
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents): ภาคผนวก1
5.1 อาหารเลยงเชอ
5.1.1 Anaerobic egg yolk agar
5.1.2 Chopped liver broth
5.1.3 Cookedmeatmedium(CMM)
5.1.4 Gel-phosphate buffer, pH 6.2
5.1.5 Liver-veal-egg yolk agar
5.1.6 Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbroth(TPGY)
5.1.7 Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbrothwithtrypsin(TPGYT)
5.2 สารเคม
5.2.1 Absolute ethanol
5.2.2 Gram stain reagents
5.2.3 Trypsin(เตรยมจากDifco1:250)
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 เครองมอ
6.1.1 ตอบเพาะเชอแบบไรอากาศ(anaerobicincubator)35C
6.1.2 เครองนงทาลายเชอ(autoclave)121±3C
6.1.3 เครองชง(balance)
6.1.4 ตอบเพาะเชอ(incubator)28Cและ35C
6.1.5 กลองจลทรรศน(microscope)
6.1.6 เครองวดความเปนกรด-เบส(pH-meter)
6.2 อปกรณ
6.2.1 แผนกระจกทบหนา(coverslip)
6.2.2 ขวดรปชมพ(flask)หรอขวดแกวฝาเกลยว
6.2.3 แผนกระจก(glassslide)
6.2.4 หวงและเขมเขยเชอ(loopandneedle)
6.2.5 โกรงและทบด(mortarandpestle)
6.2.6 จานเพาะเชอ(petridish)
6.2.7 ปเปต(pipette)
153
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6.2.8 หลอดฝาเกลยว(screw-captube)
6.2.9 ถงตผสมอาหาร(stomacherbag)
6.2.10ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การสมตวอยาง(Sampling)
7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขงตดตวอยางจากหลายๆตาแหนงใหเปนชนเลกๆผสม
ใหเขากนกรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทว สมตวอยางตามปรมาณ
ทตองการใสในภาชนะปราศจากเชอ
7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทหรอ
ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆ กน ใสในภาชนะปราศจากเชอ
ตามปรมาตรทตองการและเขยาใหเขากน
7.2 การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
นาตวอยางอาหารจากขอ 7.1.1 โดยไมใหมสวนของของเหลวหรอมนอยทสดใสในโกรง
ปราศจากเชอเตม gel-phosphate buffer ในปรมาตรทเทากนบดดวยทบดปราศจากเชอ
หรอใสตวอยางในถงตผสมอาหารเตม gel-phosphate buffer ในปรมาตรทเทากนผสม
ใหเปนเนอเดยวกนโดยการตถงผสมอาหารดวยมอ หรออาจใชปากคบปราศจากเชอ
คบตวอยางชนเลกๆ จากขอ 7.1.1หรอปเปตตวอยางจากขอ 7.1.2 ใสในหลอดอาหาร
เลยงเชอโดยตรง
7.3 ขนตอนการเพมปรมาณเชอ(Enrichment)
อาหารเลยงเชอในขนตอนนตองตมไลอากาศ 10-15นาท แลวทาใหเยนลงอยางรวดเรว
กอนใชงานหามเขยา
7.3.1 เตมตวอยางอาหารแขง 1-2 กรมหรอปเปตตวอยางอาหารเหลว 1-2 มลลลตร
หรอตวอยางจากขอ7.2ใสในCMMปรมาตร15มลลลตร2หลอดและTPGY
2หลอดปลอยตวอยางชาๆใตผวหนาอาหารเลยงเชอใหตวอยางอยบรเวณกนหลอด
ถาสงสยวาเปนเชอสายพนธ nonproteolyticชนดB, Eหรอ Fอาจใช TPGYT
แทนTPGY
7.3.2 บมCMMท35C5วนและTPGYหรอTPGYTท28C5วน
7.3.3 นาหลอดจากขอ 7.3.2 มาตรวจสอบความขนกาซกลนการยอยของเนออาหาร
เลยงเชอและยอมสแกรมหรอทาwetmountถาเปนC. botulinumตดสแกรมบวก
154
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
รปทอนสรางสปอรคอนไปทางปลายเซลลทาใหเซลลมรปรางคลายไมเทนนส
ถาไมพบการเจรญของเชอใหบมเพมอก10วน
7.4 ขนตอนการแยกเชอ(isolation)ม2ขนตอน
7.4.1 Pre-treatmentofspecimensforstreakingทาได2วธ
7.4.1.1 ใช absolute ethanol ททาใหปราศจากเชอ (โดยการกรอง)ปเปต1หรอ
2มลลลตรจากenrichmentcultureขอ7.3.3ใสในหลอดฝาเกลยวปราศจาก
เชอหรอกรณตองการแยกเชอจากตวอยางอาหารโดยตรงใหนาตวอยาง
1หรอ2มลลลตรหรอกรมจากขอ7.1.1หรอ7.1.2ใสในหลอดฝาเกลยว
ปราศจากเชอ เตม absolute ethanol ในปรมาตรทเทากนผสมใหเขากน
บมทอณหภมหอง1ชวโมง
7.4.1.2 ใชความรอน(เปนวธทางเลอก)โดยปเปต1หรอ2มลลลตรจากenrichment
culture ขอ 7.3.3หรอกรณตองการแยกเชอจากตวอยางอาหารโดยตรง
ใหนาตวอยาง 1หรอ 2มลลลตรหรอกรมจากขอ 7.1.1หรอ 7.1.2 ให
ความรอน 80 C 10-15นาท เพอทาลาย vegetative cell (ไมใชวธนกบ
C. botulinum สายพนธnonproteolytic)
7.4.2 Plating of treated cultures นาเชอ (จากขอ 7.4.1.1 หรอ 7.4.1.2) ขดบน
liver-veal-eggyolkagarหรอanaerobiceggyolkagarหรอทงสองชนดหากจาเปน
ใหเจอจางปรมาณเชอเพอแยกใหไดโคโลนเดยว
7.4.3 บมท35C48ชวโมงในสภาวะไรออกซเจน
7.4.4 เลอกโคโลนทสงสยประมาณ 10 โคโลนทมสเหลองออนเหลอบเหมอนไขมก
(pearlylayer)นนหรอแบนผวเรยบหรอหยาบโดยทวไปโคโลนแผกระจายลกษณะ
ขอบไมเรยบนอกจากpearlyzoneแลวโคโลนของ C. botulinum typeC,Dและ
E จะลอมรอบดวยโซนสเหลองขนขนาด 2-4 มลลเมตรสวน typeA และB
จะมโซนขนาดเลกกวา
7.5 ขนตอนการตรวจยนยน(Confirmation)
เมอพบลกษณะโคโลนทสงสยใหสงตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข
กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสขหรอสถาบนอนทเชอถอได
155
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8. การรายงานผล(Expressionofresults)
C. botulinum/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ
9. รายละเอยดอน
9.1 ภาคผนวก1:อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
9.2 ภาคผนวก2:แผนภมการตรวจหา(detection)C. botulinum ในอาหาร
156
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก1
อาหารเลยงเชอและสารเคม
(Culturemediaandreagents)
อาหารเลยงเชอกรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. Anaerobic egg yolk agar
1.1 Base medium
Yeastextract 5 กรม
Tryptone 5 กรม
Proteosepeptone 20 กรม
Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม
Agar 20 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรฆาเชอท 121 C 15นาท
pH 7.0 ± 0.2
1.2 50% Egg yolk emulsion
ลางเปลอกไขใหสะอาดแชใน70%ethanol 1 ชวโมงตอกไขดวยวธ aseptic technique
นาสวนของไขแดงใสในภาชนะปราศจากเชอ ผสม sterile 0.85% saline ในปรมาตร
ทเทากน
การใชงาน
เตม50%Eggyolkemulsion(ขอ1.2)80มลลลตรลงในbasemedium(ขอ1.1)1,000
มลลลตรผสมใหเขากนเทลงจานเพาะเชอตามปรมาตรทตองการ
2. Chopped Liver Broth
Freshbeefliver 500 กรม
Peptone 10 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 1 กรม
Solublestarch 1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
157
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
นาตบบดใสนาตมจนเดอดและเคยวนาน1ชวโมงทาใหเยนแลวปรบpH7.0และตมเดอด
อก 10นาท กรองผานผา (cheesecloth) บบเอานาออก และเตมสวนประกอบอนปรบ
pH7.0เตมนากลนหรอนากรองจนปรมาตรครบ1,000มลลลตรกรองผานกระดาษกรอง
ชนดหยาบแยกเกบสวนนา (broth) และเนอในตแชแขง เมอตองการใชนาสวนเนอใส
ในหลอดขนาด18× 150หรอ 20× 150มลลเมตรใหสง 1.2-2.5 เซนตเมตร เตมสวน
นา(broth)10-12มลลลตรฆาเชอท121C15นาท
3. Cookedmeatmedium(CMM)
Beefheart 454 กรม
Proteosepeptone 20 กรม
Dextrose 2 กรม
NaCl 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ใส CMM 1.8 กรมในหลอดทดลองฝาเกลยว เตมนากลนหรอนากรอง 15 มลลลตร
ฆาเชอท121C15นาทpH7.2± 0.2
4. Gel-phosphate buffer, pH 6.2
Gelatin 2 กรม
Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) 4 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรองโดยคอยๆ ใชความรอนฆาเชอท 121 C
20นาทpH6.2
158
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. Liver-veal-egg-yolk agar
5.1 Base medium
Fresheggs,yolksonly 2หรอ3 กรม
Livervealagar 48.5 กรม
นากลนหรอนากรอง 500 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง500มลลลตรดวยความรอนฆาเชอท121 C
15นาททาใหไดอณหภม50C
5.2 50% Egg yolk emulsion
ลางเปลอกไขใหสะอาดแชใน70%ethanol 1 ชวโมงตอกไขดวยวธ aseptic technique
นาสวนของไขแดงใสในภาชนะปราศจากเชอ ผสม sterile 0.85% saline ในปรมาตร
ทเทากน
การใชงาน
เตม 50%Egg yolk emulsion (ขอ 5.2) 40 มลลลตร ลงใน basemedium (ขอ 5.1)
500 มลลลตร ผสมใหเขากน เทลงจานเพาะเชอตามปรมาตรทตองการ ทาผวหนา
อาหารเลยงเชอใหแหงทอณหภมหอง2วนหรอทอณหภม35C24ชวโมง
6. Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbroth(TPGY)
Trypticase 50 กรม
Peptone 5 กรม
Yeastextract 20 กรม
Dextrose 4 กรม
Sodiumthioglycollate 1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบงใสหลอด15มลลลตร
ฆาเชอท121C10นาทpH7.0± 0.2เกบท5C
159
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7. Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbrothwithtrypsin(TPGYT)
7.1 Base medium
Trypticase 50 กรม
Peptone 5 กรม
Yeastextract 20 กรม
Dextrose 4 กรม
Sodiumthioglycollate 1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบงใสหลอด15มลลลตร
ฆาเชอท121C10นาทpH7.0± 0.2เกบท5Cเตมtrypsinกอนใชงาน
7.2 Trypsin solution
Trypsin(1:250) 1.5 กรม
นากลนหรอนากรอง 100 มลลลตร
คน trypsin ในนากลนหรอนากรองปลอยใหนอนกน กรองสวนใสผานแผนกรอง
(membranefilter)ทมร(poresize)ขนาด0.45µm
การใชงาน
กอนใชงานตมไลอากาศBasemedium 10 นาท เตม trypsin 1 มลลลตรใน broth
15มลลลตรหรอ6.7มลลลตรในbroth100มลลลตร
สารเคมกรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. Absoluteethanol ใชชนดสาเรจรป
2. Gramstainreagents ใชชนดสาเรจรป
3. Trypsin(1:250) ใชชนดสาเรจรป
160
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก2
แผนภมการตรวจหา(detection)C. botulinum ในอาหาร
วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก 2
ตวอยางอาหารแขง + gel phosphate buffer ในปรมาตรทเทากน ตวอยางอาหารเหลว 1-2 มลลลตร 1-2 มลลลตร
CMM TPGY CMM TPGY 35oC 5 วน 28oC 5 วน 35oC 5 วน 28oC 5 วน
บม 5 วน หรอเพมอก 10 วนตรวจสอบความขน การเกดกาซ กลน
การยอยสลายของเนออาหารและยอมสแกรม (C. botulinum ตดสแกรมบวก รปทอน สรางสปอรคอนไปทางปลายเซลลทาใหเซลลมรปรางคลายไมเทนนส)
Treat ดวย absolute ethanol หรอใชความรอน
ขดบน liver-veal-egg-yolk agar หรอ anaerobic egg yolk agar
Ano2 35oC 48 ชวโมง โคโลนทสงสย [สเหลองออนเหลอบเหมอนไขมก (pearly layer) นนหรอแบน ผวเรยบหรอหยาบโดยทวไปโคโลนแผกระจาย ลกษณะขอบไมเรยบ นอกจาก pearly zone แลวโคโลนของ C. botulinum type C, D และ E จะลอมรอบดวยโซนสเหลองขนขนาด 2-4 มลลเมตร สวน type A และ B จะมโซนขนาดเลกกวา]
สงตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทยหรอสถาบนอนทเชอถอได
160
161
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
วธนใชในการตรวจวเคราะหจลนทรยเจรญท 35 Cและ55 CรวมทงClostridium botulinum
ในอาหารชนดทมความเปนกรดตาครอบคลมการตรวจหา(detection)
2. เอกสารอางอง(Normativereference)
U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2001, Chapter 21A
“ExaminationofCannedFoods”.[ออนไลน].2001[สบคน20กมภาพนธ2558]. เขาถงไดท
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109398.htm
3. นยามศพทและคายอ(Termsandabbreviation)
อาหารในภาชนะบรรจทปดสนท = อาหารทผานกรรมวธทใชทาลายหรอยบยงการขยายพนธ
ของจลนทรยดวยความรอนภายหลงหรอกอนการบรรจ
หรอปดผนกซงเกบรกษาไวในภาชนะบรรจทปดสนท
ทเปนโลหะหรอวตถอนทคงรปทสามารถปองกนมให
อากาศภายนอกเขาไปในภาชนะบรรจไดและสามารถ
เกบรกษาไวไดในอณหภมปกต เชนกระปอง (can)
รทอรทเพาซ(retortpouch)ขวดแกวฯลฯ
อาหารชนดทมความเปนกรดตา = อาหารทมคาความเปนกรด-เบสมากกวา 4.6และคา
ปรมาณนาอสระ(wateractivity,aw)มากกวา0.85
Thermophilicanaerobes = จลนทรยเจรญไดทอณหภมสงในสภาพไมมออกซเจน
Flat =ลกษณะปกตของกระปองทฝาทงสองดานเวาเขาขางใน
เมอกดฝากระปองบนพนแขงและเรยบยงคงสภาพเดม
DMScF2018: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนทชนดทม
ความเปนกรดตา
Analyticalmethodoflow-acidcannedfoods
162
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
Flipper = ลกษณะการบวมของกระปองทมสภาพปกต (flat)
เมอกดฝาดานใดดานหนงอกดานจะโปงออก เมอกด
ดานทโปงกระปองจะกลบคนสภาพปกต
Springer = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาดานหนงบวมแบบ
ถาวรเมอกดฝาดานนจะยบเขา แตดานตรงขามจะ
โปงออก
Softswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน
แตไมแนนมาก เมอกดฝาจะยบตวลงพอปลอยมอฝา
จะบวมเชนเดม
Hardswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน
และแนนมากเมอกดฝาจะไมยบตวลงตะเขบกระปอง
อาจแตกและกระปองอาจระเบดได
C. botulinum = Clostridium botulinum
C. thermobutylicum = Clostridium thermobutylicum
C. sporogenes = Clostridium sporogenes
C. perfringens = Clostridium perfringens
C. thermosaccolyticum = Clostridium thermosaccolyticum
B. coagulans = Bacillus coagulans
B. stearothermophilus = Bacillus stearothermophilus
B. thermoacidurans = Bacillus thermoacidurans
4. หลกการ(Principle)
อาหารในภาชนะบรรจทปดสนทหมายถงอาหารซงสามารถเกบรกษาทอณหภมปกตไดนาน
โดยไมเนาเสย (shelf stable food) แตถากระบวนการฆาเชอดวยความรอนหรอการเกบรกษา
ไมถกตองหรอภาชนะบรรจเกดการรว (leakage)ทาใหจลนทรยทเหลออยหรอปนเปอนเขามา
ภายหลงเจรญเตบโตและทาใหอาหารเนาเสยได การเนาเสยอาจเกดจากจลนทรยหลายชนด
ทงชนดทตองการออกซเจน(aerobe)หรอไมตองการออกซเจน(anaerobe)ซงสามารถเจรญไดท
อณหภม35Cและ/หรอ55C
การตรวจหาม3ขนตอนดงน
163
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.1 อาหารกระปองทมสภาพปกตใหบมท35C14วนถากระปองบวมไมตองบมหรอระหวาง
บมพบกระปองบวมขนใหนาออกจากตบมและวางไวทอณหภมหอง
4.2 สมอาหารจากขอ 4.1 ใสในอาหารเลยงเชอชนดเหลวนาไปบมท 35 Cและ 55 Cตาม
ระยะเวลาทกาหนด
4.3 กรณทพบการเจรญของเชอใหตรวจยนยน
หมายเหตใชอาหารกระปองเปนตวแทนอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท
5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents):ภาคผนวก1
5.1 อาหารเลยงเชอ
5.1.1 Bromcresolpurpledextrosebroth(BCP)
5.1.2 Choppedliverbrothหรอcookedmeatmedium(CMM)
5.1.3 Liver-vealagar(withouteggyolk)(LVA)
5.1.4 Nutrientagar(NA)
5.2 สารเคม
5.2.1 4%Iodinein70%ethanol
5.2.2 Methylenebluestain,crystalvioletหรอGramstainreagents
5.2.3 นาปนใส(limewater)
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 เครองมอ
6.1.1 ตอบเพาะเชอแบบไรอากาศ(anaerobicincubator)35Cและ55C
6.1.2 เครองนงทาลายเชอ(autoclave)121±3C
6.1.3 เครองชง(balance)
6.1.4 ตปราศจากเชอ(biosafetycabinet)
6.1.5 ตดดควน(fumehood)
6.1.6 ตอบเพาะเชอ(incubator)35Cและ55C
6.1.7 กลองจลทรรศน(microscope)
6.1.8 เครองวดความเปนกรด-เบส(pH-meter)
164
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6.2 อปกรณ
6.2.1 ทเปดกระปอง(canopener)
6.2.2 ทเจาะรกระปอง(canpunch)
6.2.3 ผาสะอาดปราศจากเชอ(cleansteriletowel)
6.2.4 แผนกระจกทบหนา(coverslip)
6.2.5 หลอดหยดสารละลาย(dropper)
6.2.6 ขวดรปชมพ(flask)หรอขวดแกวฝาเกลยว
6.2.7 ปากคบ(forceps)
6.2.8 แผนกระจก(glassslide)
6.2.9 ปากกากนนา(Indelibleinkmarkingpen)
6.2.10 หวงและเขมเขยเชอ(loopandneedle)
6.2.11 จานเพาะเชอ(petridish)
6.2.12 ปเปต(pipette)
6.2.13 กรรไกร(scissors)
6.2.14 สบหรอนายาทาความสะอาด(soapordetergent)
6.2.15 ชอน(spoon)
6.2.16 กรวยปราศจากเชอ(sterilefunnel)
6.2.17 หลอดทดลอง(testtube)
6.2.18 ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure):ภาคผนวก2
7.1 การเตรยมภาชนะบรรจ(Preparationofcontainer)
7.1.1 ดงฉลากออกเขยนรหสตวอยาง(labcode)ทดานขางภาชนะบรรจ
7.1.2 ตรวจสอบลกษณะภาชนะบรรจ(ปกตหรอผดปกตเชนบวมบบรวซมเปนสนม)
และแบงตามรหส(codenumber)
7.2 การชกตวอยาง(Samplingcancontents)
7.2.1 กรณทพบกระปองบวมแบบ springers, swells และอาจมแบบ flatหรอ flipper
รวมอยดวยใหตรวจวเคราะหทนทพรอมกบกระปองทมลกษณะ flat และ flipper
อกอยางนอย 6 กระปอง (ถาม) และแบงเกบตวอยางกระปองแตละลกษณะ
สารองไว (ถาม) แลวนากระปอง flat และ flipper ทเหลอไปบมท 35 C 14 วน
165
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ ถาพบกระปองผดปกตหรอบวม
มากขนใหจดบนทก เมอบวมจนเปน hard swellหรอไมบวมมากขนสมตวอยาง
ไปเพาะเชอ
7.2.2 กรณทพบกระปองแบบ flat และ flipperแบงเกบตวอยางกระปองสารองไวแลว
นาสวนทเหลอไปบมท35C14วนระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ
ถาพบกระปองบวมใหทาตามขอ7.2.1กรณไมพบกระปองบวมเมอบมครบกาหนด
นากระปองแบบ flat และ flipper ออกจากตบมนาไปตรวจวเคราะหอยางนอย
6กระปอง(ถาม)อาหารกระปองทปกต(normalcan)ไมจาเปนตองตรวจวเคราะห
ทงหมดหามบมกระปองทอณหภมสงกวา35C
7.3 การเปดกระปอง(Openingthecan)
7.3.1 กรณกระปองบวมแบบhardswells,softswellsและspringers(ถาเปนhardswells
นาไปแชเยนในตเยนกอนเปดกระปอง)
ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนา เชดใหแหงดวย
ผาสะอาดปราศจากเชอ
ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด (ดานทไมมรหส) โดยใช 4% iodine in 70%
ethanol เทราดบนฝาปลอยทงไว 30นาท เชดออกดวยผาสะอาดปราศจาก
เชอหามลนไฟควรหาอปกรณคลมกระปองทบวมมากเชนผาสะอาดปราศจาก
เชอหรอควากรวยปราศจากเชอครอบไวเพราะอาหารในกระปองทอาจมสารพษ
ปนเปอนอยพนกระจายออกมา
ตรวจหาชนดของกาซทเกดขนโดยใชทเจาะรกระปองปราศจากเชอเจาะบรเวณ
ฝา เมอเจาะแลวใหกดทเจาะรคางไวกอนนาหลอดแกวปราศจากเชอมาเกบ
กาซจากบรเวณรทเจาะ จากนนรบจอปากหลอดใกลเปลวไฟถาไดยนเสยง
ระเบดเบาๆ(slightexplosion)แสดงวาพบกาซไฮโดรเจน(H2)แลวหงายหลอด
ตงตรงทนทและเทนาปนใสปรมาณเลกนอยลงไปถาเกดตะกอนสขาวแสดงวา
พบกาซคารบอนไดออกไซด(CO2)
เปดฝากระปองดวยทเปดกระปองปราศจากเชอ แยกใชหนงอนตอกระปอง
(ทาในตปราศจากเชอ)
7.3.2 กรณกระปองแบบflatและflipper
ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนา เชดใหแหง
ดวยผาสะอาดปราศจากเชอ
166
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
เขยากระปองเบาๆเพอใหสวนประกอบอาหารผสมกน
ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด (ดานทไมมรหส) โดยใช 4% iodine in 70%
ethanol เทราดบนฝาปลอยทงไวอยางนอย 15นาท เชดออกดวยผาสะอาด
ปราศจากเชอและลนไฟทฝากระปองจนสารละลายไอโอดน-เอทานอล
เผาไหมหมด(ทาในตดดควนระวงอยาสดดมควนไอโอดน)
เปดฝากระปองดวยทเปดกระปองปราศจากเชอ แยกใชหนงอนตอกระปอง
(ทาในตปราศจากเชอ)
7.4 การสมตวอยาง(Removalofmaterialfortesting)
7.4.1 ปเปตของเหลวหรอใชปากคบ ชอน ทปราศจากเชอนาอาหารทเปนของแขง
จากบรเวณจดกงกลางของกระปองใสหลอดอาหารเลยงเชอ เพอนาไปวเคราะห
ตามขอ7.5.2หลงจากนนนาอาหารอยางนอย30มลลลตร(กรม)หรอถามปรมาณ
นอยใหเกบทเหลอทงหมด ใสขวดแกวปราศจากเชอไวทต เยนประมาณ 4 C
เพอนามาวเคราะหซา
7.4.2 บนทกลกษณะทวไปความคงตว (consistency) ส กลนของอาหาร และลกษณะ
พนผวภายในกระปองเชนกดกรอนเปนตน
7.5 การตรวจวเคราะหเชอ(Culturalexamination)
7.5.1 ถาสงสยคาความเปนกรด-เบสของตวอยางอาหาร ใหวดคาความเปนกรด-เบส
จากกระปองปกตทเปนตวแทนจานวนหนงกอนดาเนนการตอไป
7.5.2 ส มตวอยางจากแตละกระปองใสในหลอด chopped liver broth หรอ CMM
(กอนใชนาไปตมเดอด 100 C แลวทาใหเยนลงทอณหภมหองทนทเพอไลกาซ
ออกซเจน) และBCPอยางละ 4หลอดๆละ 1-2มลลลตร (ตวอยางของเหลว
หรอตวอยางทมนาเปนสวนประกอบ)หรอ1-2กรม (ตวอยางของแขง)นาไปบม
ตามตารางแลวอานผลตามขอ7.6
167
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตาราง แสดงอาหารเลยงเชอ อณหภม และเวลาบมทใชวเคราะหอาหารทมความเปนกรดตา
(คาความเปนกรด-เบส>4.6)
อาหารเลยงเชอ จานวน อณหภม เวลา
(หลอด) (C) (ชวโมง)
Choppedliverbroth(CMM) 2 35 96-120
Choppedliverbroth(CMM) 2 55 24-72
BCP 2 55 24 - 48
BCP 2 35 96 - 120
7.5.3 การตรวจสอบภายใตกลองจลทรรศนโดยนาตวอยางอาหารทเหลอจากแตละกระปอง
มาปายบนแผนกระจก (direct smear) ปลอยใหแหง (dry) ตรงเซลลโดยผาน
เปลวไฟ (fix) ยอมดวยสmethylene blue, crystal violetหรอGram stain เพอ
ดรปรางและลกษณะของเซลลและนบจานวนเซลลทงหมด/fieldของกลองจลทรรศน
(โดยประมาณ)ถาตวอยางมสวนผสมของนามนใหหยดสารละลายxyleneลงบน
warm-fixed filmแลวนาไปผานนาไหล(rinse)และยอมสระหวางเตรยมการยอม
ถาตวอยางถกลางออกไปจากแผนกระจก ใหตรวจสอบตวอยางอาหารดวยวธ
wetmountหรอ hanging dropหรอหยด chopped liver brothทปราศจากเชอ
บนแผนกระจกผสมตวอยางอาหารแลวปลอยใหแหง
7.6 การอานผลการเจรญของเชอ(Culturalfindings)ในCMMและBCP
7.6.1 ตรวจสอบการเจรญของเชอเปนระยะๆจนครบเวลาบมตามตาราง
7.6.2 กรณไมพบการเจรญของเชอ (CMMและBCP ไมเปลยนแปลง) ใหรายงานผล
กรณพบการเจรญของเชอนาเชอมาขดบนLVA (ไมผสมไขแดง)หรอNAagar
2จานเพาะเชอแยกบมทสภาวะAnO2 และO2ตามอณหภมทพบการเจรญของเชอ
ดงแผนภมท1(การถายเชอ)
168
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.6.3 กรณไมพบการเจรญของเชอบนLVAหรอNAagarใหรายงานผล
กรณพบการเจรญของเชอบน LVAหรอ NA agar ใหเลอกโคโลนทแตกตาง
ทกลกษณะทาตามแผนภมท1(เชอบรสทธและการแสดงลกษณะ)
แผนภมท1 ขนตอนการเพาะเชอของอาหารทมความเปนกรดตา
169
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.6.4 ถาพบเชอหลายชนด(mixedmicroflora)
เฉพาะในBCPใหรายงานลกษณะรปรางของเชอ
ในCMMพบชนดรปทอนรวมอยดวยใหทดสอบหาสารพษ (botulinal toxin)
ถาพบเฉพาะเชอรปทอน ยอมตดสแกรมบวกหรอGram-variable มลกษณะ
เฉพาะของเชอ Bacillus spp.หรอClostridium spp.ตองตรวจสอบการสราง
สปอรบางกรณ เซลล(vegetativecell)ทแกอาจยอมตดเปนสแกรมลบดงนน
ควรทาการทดสอบหาสารพษเชนเดยวกน
7.7 การแปลผล(Interpretationofresults)
7.7.1 ถาพบเฉพาะแบคทเรยชนดสรางสปอรเจรญท35Cในอาหารกระปองทตะเขบปกต
ไมรวแสดงวาอาหารกระปองผานกรรมวธฆาเชอดวยความรอนไมเพยงพอ
(underprocessing) ในกรณทแบคทเรยทพบนทนความรอนไดเทากบหรอนอยกวา
C. botulinum
7.7.2 การเนาเสยทเกดจากthermophilicanaerobesเชนC. thermobutylicumอาจบงชได
จากการเกดกาซในCMM(55C)และมกลนเนยแขง(cheesyodor)
7.7.3 การเกดกาซและมกลนเหมนเนา(putridodor)ในCMM(35C)และพบเชอรปทอน
สรางสปอรยอมตดสแกรมบวกอาจบงชไดวาเกดการเนาเสยจากเชอC. botulinum,
C. sporogenesหรอC. perfringens ตองทดสอบสารละลายทเพาะเลยงเชอเพอหา
สารพษ (botulinal toxin) ถงแมวาตรวจไมพบสารพษในผลตภณฑอาหาร เพราะ
การตรวจพบสปอร ของC. botulinum แสดงวาอาหารนนอาจเปนอนตรายตอ
ผบรโภค
7.7.4 การเกดกรดในBCP (35 C และ/หรอ 55 C) อาจบงชไดวาเกดการเนาเสยแบบ
flat-sourจากเชอเจรญไดทอณหภมปานกลาง(mesophiles)เชนB. thermoacidurans
หรอB. coagulans และ/หรอทอณหภมสง (thermophiles) เชนB. stearother-
mophilus
7.7.5 ถาอาหารทใสลงไปทาใหอาหารเลยงเชอขนตงแตเรมตนของการเพาะเลยงเชอ
ตองทดสอบหาเชอดวยการถายเชอ(subculture)
170
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.7.6 อาหารกระปองหลายชนดทมเชอเจรญไดทอณหภมสง(thermophiles)และไมเจรญ
ภายใตการเกบรกษาปกตแตเมออณหภมสงขน(50-55C)เชอจะเจรญและทาใหเกด
การเนาเสยเชน B. stearothermophilus ซงทาใหเกดการเนาเสยแบบ flat-sour
การบมท 55 C ไมทาใหสภาพกระปองเปลยนแปลง แตทาใหผลตภณฑมกลน
ผดปกตและคาความเปนกรด-เบสอาจลดลงหรอไมลดลงสาหรบ C. thermosacco-
lyticum เปน thermophilic anaerobesททาใหกระปองบวมและผลตภณฑมกลน
เนยแขง(cheesyodor)
7.7.7 กระปองทไมผานกระบวนการใหความรอนมกปนเปอนดวยเชอทไมสรางสปอร
และเชอสรางสปอรลกษณะการเนาเสยจะเหมอนกรณกระปองรว
7.7.8 ถาพบกลมแบคทเรยมชวตรปทอน (rod) และรปกลม (cocci) บงชวาเกดจาก
กระปองรวหรออาจเกดจากอาหารกระปองไมผานกระบวนการฆาเชอซงกรณน
คาดวาจะพบกระปองบวมในอตราสง
7.7.9 ถาพบกลมแบคทเรยปรมาณมากในอาหารจากการทา direct smear แตไมพบ
การเจรญของเชอ(nogrowth)ในขนตอนการเพาะเชออาจบงชไดวาเกดการเนาเสย
จากแบคทเรยในอาหารกอนการบรรจกระปอง (precanning) อาหารอาจมคา
ความเปนกรด-เบสกลนและลกษณะผดปกต
7.7.10ถาตรวจไมพบการเจรญของเชอในกระปองบวมแสดงวากระปองบวมเนองจาก
กาซไฮโดรเจน(H2)ทเกดขนจากปฏกรยาเคมของอาหารกบผวดานในภาชนะบรรจ
แตถากระปองบวมทเกดจาก thermophilic anaerobes ซงสรางกาซและเซลล
แตกสลายอยางรวดเรวหลงจากเจรญกรณนอาจทาใหสบสนวากระปองบวม
เนองจากกาซไฮโดรเจนนอกจากนการแตกตวทางเคมของอาหารอาจทาใหเกด
กาซคารบอนไดออกไซด(CO2)โดยเฉพาะอาหารทมนาตาลและกรดและปฏกรยา
นถกเรงดวยอณหภมทสงขน
171
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8. การรายงานผล(Expressionofresults)
8.1 จลนทรยเจรญท 35 C/นาหนกหรอปรมาตร (เชนกรมหรอมลลลตร) พบหรอไมพบ
(รายงานการยอมตดสแกรมรปรางและลกษณะของเชอ)
8.2 จลนทรยเจรญท 55 C/นาหนกหรอปรมาตร (เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ
(รายงานการยอมตดสแกรมรปรางและลกษณะของเชอ)
8.3 C. botulinum/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ
8.4 กาซ(กรณภาชนะบรรจบวมถาพบกาซใหระบชนด)
9. รายละเอยดอน
9.1 ภาคผนวก1: อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
9.2 ภาคผนวก2: แผนภมท 2 การตรวจหา (detection) จลนทรยเจรญท 35 C และ 55 C
ในอาหารชนดทมความเปนกรดตา
172
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก1
อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
อาหารเลยงเชอกรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. Bromcresolpurpledextrosebroth(BCP)
Dextrose 10 กรม
Beefextract 3 กรม
Peptone 5 กรม
Bromcresolpurple(1.6%inethanol) 2 มลลลตร
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบงใสหลอด12-15มลลลตร
ฆาเชอท121C15นาทpH7.0±0.2
2. Chopped liver broth
Freshbeefliver 500 กรม
Peptone 10 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 1 กรม
Solublestarch 1 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
นาตบบดใสนาตมจนเดอดและเคยวนาน1ชวโมงทาใหเยนแลวปรบpH7.0และตมเดอด
อก 10นาท กรองผานผา (cheesecloth) บบเอานาออก และเตมสวนประกอบอนปรบ
pH7.0เตมนากลนหรอนากรองจนปรมาตรครบ1,000มลลลตรกรองผานกระดาษกรอง
ชนดหยาบแยกเกบสวนนา (broth) และเนอในตแชแขงเมอตองการใชนาสวนเนอใส
ในหลอดขนาด18× 150มลลเมตรหรอ20× 150มลลเมตรใหสง1.2-2.5เซนตเมตร
เตมสวนนา(broth)10-12มลลลตรฆาเชอท121C15นาท
173
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
3. Cookedmeatmedium(CMM)
Beefheart 454 กรม
Proteosepeptone 20 กรม
Dextrose 2 กรม
NaCl 5 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ใสCMM1.25กรมในหลอดขนาด20× 150มลลเมตรเตมนากลนหรอนากรอง10มลลลตร
เขยาผสมใหชนเนอเปยกนาฆาเชอท121 C15นาทpH7.2±0.2กอนใชนาไปตมเดอด
100Cแลวทาใหเยนลงทอณหภมหองทนท(หามเขยาหลอด)
4. Nutrientagar(NA)
Beefextract 3 กรม
Peptone 5 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร ใหความรอนจนวนละลาย
แบงใสขวดฆาเชอ121C15นาทpH6.8±0.2
5. Liver-vealagar(withouteggyolk)(LVA)
Liver,infusionfrom 50 กรม
Veal,infusionfrom 500 กรม
Proteosepeptone 20 กรม
Neopeptone 1.3 กรม
Tryptone 1.3 กรม
Dextrose 5 กรม
Starch,soluble 10 กรม
174
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
Casein,isoelectric 2 กรม
NaCl 5 กรม
Sodiumnitrate 2 กรม
Gelatin 20 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนและ
คนจนวนละลายฆาเชอท121C15นาทpH7.3±0.2
สารเคมกรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. 4%Iodinein70%ethanol
Potassiumiodide 10 กรม
Iodine 10 กรม
Ethanol(70%) 500 มลลลตร
2. นาปนใส(limewater)
ปนแดงผสมนา กวนใหเขากนตงทงไว 1 ชวโมงเพอใหตกตะกอนนานาสวนใสดานบน
มาใชนาปนใสหรอสารละลายแคลเซยมไฮดรอกไซดมคณสมบตเปนดาง
3. Crystal violet stain
Crystalviolet(90%dyecontent) 2 กรม
Ethanol(95%) 20 มลลลตร
นากลนหรอนากรอง 80 มลลลตร
175
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4. Methylenebluestain(Loeffler’s)
Solution A
Methyleneblue(90%dyecontent) 0.3 กรม
Ethanol(95%) 30 มลลลตร
Solution B
Dilutedpotassiumhydroxide(0.01%) 100 มลลลตร
ผสมsolutionAและB
5. Gramstainreagentsใชชนดสาเรจรป
176
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก2
แผนภมท2การตรวจหา(detection)จลนทรยเจรญท35Cและ55Cในอาหารชนดทมความเปนกรดตา
วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย ตวอยาง กระปองบวม กระปองปกต
Springers Flat Soft swells Flipper Hard swells กระปองบวม กระปองปกต ลางภาชนะบรรจ ลางภาชนะบรรจ และทาใหแหง และทาใหแหง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ตรวจหากาซ นาตวอยาง 1-2 มลลลตร/กรม ใสอาหารเลยงเชอ บมทอณหภมและเวลาตามตาราง direct smear ไมพบการเจรญของเชอ พบหรอสงสยวามการเจรญของเชอ
รายงานผล ทาตามแผนภมท 1 ขนตอนการเพาะเชอ ของอาหารทมความเปนกรดตา
รายงานผล
บม 35oC 14 วน
177
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
วธนใชในการตรวจวเคราะหจลนทรยเจรญท 30 C และ 55 C รวมทงยสตและราในอาหาร
ชนดทมความเปนกรดครอบคลมการตรวจหา(detection)
2. เอกสารอางอง(Reference)
U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2001, Chapter 21A
“ExaminationofCannedFoods”.[ออนไลน].2001[สบคน20กมภาพนธ2558]. เขาถงไดท
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109398.htm
3. นยามศพทและคายอ(Termsandabbreviation)
อาหารในภาชนะบรรจทปดสนท = อาหารทผานกรรมวธทใชทาลายหรอยบยงการขยาย
พนธของจลนทรยดวยความรอนภายหลงหรอกอน
การบรรจหรอปดผนกซงเกบรกษาไวในภาชนะบรรจ
ทปดสนททเปนโลหะหรอวตถอนทคงรปทสามารถ
ปองกนมใหอากาศภายนอกเขาไปในภาชนะบรรจได
และสามารถเกบรกษาไวไดในอณหภมปกต เชน
กระปอง (can) รทอรทเพาซ (retort pouch)ขวดแกว
ฯลฯ
อาหารชนดทมความเปนกรด = อาหารทมคาความเปนกรด-เบสตงแต4.6ลงมา
Flat = ลกษณะปกตของกระปองทฝาทงสองดานเวาเขาขางใน
เมอกดฝากระปองบนพนแขงและเรยบยงคงสภาพเดม
DMScF2019: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนทชนดทม
ความเปนกรด
Analyticalmethodofacidcannedfoods
178
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
Flipper = ลกษณะการบวมของกระปองทมสภาพปกต (flat)
เมอกดฝาดานใดดานหนงอกดานจะโปงออก เมอกด
ดานทโปงกระปองจะกลบคนสภาพปกต
Springer = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาดานหนงบวม
แบบถาวรเมอกดฝาดานนจะยบเขา แตดานตรงขาม
จะโปงออก
Softswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน
แตไมแนนมาก เมอกดฝาจะยบตวลงพอปลอยมอฝา
จะบวมเชนเดม
Hardswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน
และแนนมากเมอกดฝาจะไมยบตวลงตะเขบกระปอง
อาจแตกและกระปองอาจระเบดได
B. thermoacidurans = Bacillus thermoacidurans
C. thermosaccolyticum = Clostridium thermosaccolyticum
C. pasteurianum = Clostridium pasteurianum
4. หลกการ(Principle)
อาหารในภาชนะบรรจทปดสนทหมายถง อาหารซงสามารถเกบรกษาทอณหภมปกตไดนาน
โดยไมเนาเสย (shelf stable food) แตถากระบวนการฆาเชอดวยความรอนหรอการเกบรกษา
ไมถกตองหรอภาชนะบรรจเกดการรว (leakage)ทาใหจลนทรยทเหลออยหรอปนเปอนเขามา
ภายหลงเจรญเตบโตและทาใหอาหารเนาเสยได การเนาเสยอาจเกดจากจลนทรยหลายชนด
ทงชนดทตองการออกซเจน(aerobe)หรอไมตองการออกซเจน(anaerobe)ซงสามารถเจรญไดท
อณหภม30Cและ/หรอ55C
การตรวจหาม3ขนตอนดงน
4.1 อาหารกระปองทมสภาพปกตใหบมท 35 C 14 วน ถากระปองบวมไมตองบมหรอ
ระหวางบมพบกระปองบวมขนใหนาออกจากตบมและวางไวทอณหภมหอง
4.2 ส มอาหารจากขอ 4.1 ใสในอาหารเลยงเชอชนดเหลว นาไปบมท 30 C และ 55 C
ตามระยะเวลาทกาหนด
4.3 กรณทพบการเจรญของเชอใหตรวจยนยน
หมายเหตใชอาหารกระปองเปนตวแทนอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท
179
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents):ภาคผนวก1
5.1 อาหารเลยงเชอ
5.1.1 Acid broth
5.1.2 Malt extract broth
5.1.3 Nutrientagar(NA)
5.1.4 Sabouraud’sdextroseagar(SAB)
5.2 สารเคม
5.2.1 4%Iodinein70%ethanol(สารละลายไอโอดน-เอทานอล)
5.2.2 Methylenebluestain,crystalvioletหรอGramstainreagents
5.2.3 นาปนใส(limewater)
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 เครองมอ
6.1.1 เครองนงทาลายเชอ(autoclave)121±3C
6.1.2 เครองชง(balance)
6.1.3 ตปราศจากเชอ(biosafetycabinet)
6.1.4 ตดดควน(fumehood)
6.1.5 ตอบเพาะเชอ(incubator)30C,35Cและ55C
6.1.6 กลองจลทรรศน(microscope)
6.1.7 เครองวดความเปนกรด-เบส(pH-meter)
6.2 อปกรณ
6.2.1 ทเปดกระปอง(canopener)
6.2.2 ทเจาะรกระปอง(canpunch)
6.2.3 ผาสะอาดปราศจากเชอ(cleansteriletowel)
6.2.4 แผนกระจกทบหนา(coverslip)
6.2.5 หลอดหยดสารละลาย(dropper)
6.2.6 ขวดรปชมพ(flask)หรอขวดแกวฝาเกลยว
180
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6.2.7 ปากคบ(forceps)
6.2.8 แผนกระจก(glassslide)
6.2.9 ปากกากนนา(Indelibleinkmarkingpen)
6.2.10หวงและเขมเขยเชอ(loopandneedle)
6.2.11จานเพาะเชอ(petridish)
6.2.12ปเปต(pipette)
6.2.13กรรไกร(scissors)
6.2.14สบหรอนายาทาความสะอาด(soapordetergent)
6.2.15ชอน(spoon)
6.2.16กรวยปราศจากเชอ(sterilefunnel)
6.2.17หลอดทดลอง(testtube)
6.2.18ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure):ภาคผนวก2
7.1 การเตรยมภาชนะบรรจ(Preparationofcontainer)
7.1.1 ดงฉลากออกเขยนรหสตวอยาง(labcode)ทดานขางภาชนะบรรจ
7.1.2 ตรวจสอบลกษณะภาชนะบรรจ(ปกตหรอผดปกตเชนบวมบบรวซมเปนสนม)
และแบงตามรหส(codenumber)
7.2 การชกตวอยาง(Samplingcancontents)
7.2.1 กรณทพบกระปองบวมแบบ springers, swells และอาจมแบบ flatหรอ flipper
รวมอยดวย ใหตรวจวเคราะหทนทพรอมกบกระปองทมลกษณะ flatและ flipper
อกอยางนอย 6 กระปอง (ถาม) และแบงเกบตวอยางกระปองแตละลกษณะ
สารองไว (ถาม) แลวนากระปอง flatและ flipperทเหลอไปบมท 35 C 14วน
ระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ ถาพบกระปองผดปกตหรอบวม
มากขนใหจดบนทกเมอบวมจนเปนhardswellหรอไมบวมมากขนสมตวอยางไป
เพาะเชอ
181
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2.2 กรณทพบกระปองแบบ flat และ flipperแบงเกบตวอยางกระปองสารองไวแลว
นาสวนทเหลอไปบมท35C14วนระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ
ถาพบกระปองบวมใหทาตามขอ7.2.1กรณไมพบกระปองบวมเมอบมครบกาหนด
นากระปองแบบ flat และ flipper ออกจากตบมนาไปตรวจวเคราะหอยางนอย
6กระปอง(ถาม)อาหารกระปองทปกต(normalcan)ไมจาเปนตองตรวจวเคราะห
ทงหมดหามบมกระปองทอณหภมสงกวา35C
7.3 การเปดกระปอง(Openingthecan)
7.3.1 กรณกระปองบวมแบบhardswells,softswellsและspringers(ถาเปนhardswells
นาไปแชเยนในตเยนกอนเปดกระปอง)
ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนาเชดใหแหงดวย
ผาสะอาดปราศจากเชอ
ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด(ดานทไมมรหส)โดยใชสารละลายไอโอดน-
เอทานอลเทราดบนฝาปลอยทงไว30นาทเชดออกดวยผาสะอาดปราศจากเชอ
หามลนไฟควรหาอปกรณคลมกระปองทบวมมากเชนผาสะอาดปราศจากเชอ
หรอควากรวยปราศจากเชอครอบไวเพราะอาหารในกระปองทอาจมสารพษ
ปนเปอนอยพนกระจายออกมา
ตรวจหาชนดของกาซทเกดขนโดยใชทเจาะรกระปองปราศจากเชอเจาะ
บรเวณฝา เมอเจาะแลวใหกดทเจาะรคางไวกอนนาหลอดแกวปราศจากเชอ
มาเกบกาซจากบรเวณรทเจาะจากนนรบจอปากหลอดใกลเปลวไฟถาไดยนเสยง
ระเบดเบาๆ(slightexplosion)แสดงวาพบกาซไฮโดรเจน(H2)แลวหงายหลอด
ตงตรงทนทและเทนาปนใสปรมาณเลกนอยลงไปถาเกดตะกอนสขาวแสดงวา
พบกาซคารบอนไดออกไซด(CO2)
เปดฝากระปองดวยทเปดกระปองปราศจากเชอ แยกใชหนงอนตอกระปอง
(ทาในตปราศจากเชอ)
182
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.3.2 กรณกระปองแบบflatและflipper
ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนาเชดใหแหงดวย
ผาสะอาดปราศจากเชอ
เขยากระปองเบาๆเพอใหสวนประกอบอาหารผสมกน
ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด(ดานทไมมรหส)โดยใชสารละลายไอโอดน-
เอทานอล เทราดบนฝาปลอยทงไวอยางนอย 15นาท เชดออกดวยผาสะอาด
ปราศจากเชอและลนไฟทฝากระปองสารละลายไอโอดน-เอทานอลเผาไหมหมด
(ทาในตดดควนระวงอยาสดดมควนไอโอดน)
เปดฝากระปองดวยทเปดกระปองปราศจากเชอ แยกใชหนงอนตอกระปอง
(ทาในตปราศจากเชอ)
7.4 การสมตวอยาง(Removalofmaterialfortesting)
7.4.1 ปเปตของเหลวหรอใชปากคบ ชอน ทปราศจากเชอนาอาหารทเปนของแขง
จากบรเวณจดกงกลางของกระปองใสหลอดอาหารเลยงเชอ เพอนาไปวเคราะห
ตามขอ 7.5.2 หลงจากนนนาอาหารอยางนอย 30 มลลลตร (กรม) หรอถาม
ปรมาณนอยใหเกบทเหลอทงหมด ใสขวดแกวปราศจากเชอไวทตเยนประมาณ
4Cเพอนามาวเคราะหซา
7.4.2 บนทกลกษณะทวไปความคงตว (consistency) ส กลนของอาหาร และลกษณะ
พนผวภายในกระปองเชนกดกรอนเปนตน
7.5 การตรวจวเคราะหเชอ(Culturalexamination)
7.5.1 ถาสงสยคาความเปนกรด-เบสของตวอยางอาหาร ใหวดคาความเปนกรด-เบส
จากกระปองปกตทเปนตวแทนจานวนหนงกอนดาเนนการตอไป
7.5.2 สมตวอยางจากแตละกระปองใสในหลอดacidbroth4หลอดและmaltextractbroth
2หลอดๆ ละ1-2มลลลตร(ตวอยางของเหลวหรอตวอยางทมนาเปนสวนประกอบ)
หรอ1-2กรม(ตวอยางของแขง)นาไปบมตามตารางแลวอานผลตามขอ7.6
183
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตาราง แสดงอาหารเลยงเชอ อณหภม และเวลาบมทใชวเคราะหอาหารทมความเปนกรด
(คาความเปนกรด-เบส ≤ 4.6)
Acid broth 2 55 48
Acid broth 2 30 96
Malt extract broth 2 30 96
จานวน อณหภม เวลา อาหารเลยงเชอ (หลอด) (C) (ชวโมง)
7.5.3 การตรวจสอบภายใตกลองจลทรรศนโดยนาตวอยางอาหารทเหลอจากแตละกระปอง
มาปายบนแผนกระจก (direct smear) ปลอยใหแหง (dry) ตรงเซลลโดยผาน
เปลวไฟ (fix) ยอมดวยสmethylene blue, crystal violetหรอGram stain เพอ
ดรปรางและลกษณะของเซลลและนบจานวนเซลลทงหมด/fieldของกลองจลทรรศน
(โดยประมาณ)ถาตวอยางมสวนผสมของนามนใหหยดสารละลายxyleneลงบน
warm-fixed filmแลวนาไปผานนาไหล(rinse)และยอมสระหวางเตรยมการยอม
ถาตวอยางถกลางออกไปจากแผนกระจก ใหตรวจสอบตวอยางอาหารดวยวธ
wetmountหรอ hanging dropหรอหยด chopped liver broth ทปราศจากเชอ
บนแผนกระจกผสมตวอยางอาหารแลวปลอยใหแหง
7.6 การอานผลการเจรญของเชอ(Culturalfindings)ในacidbrothและmaltextractbroth
7.6.1 กรณไมพบการเจรญของเชอ(อาหารเลยงเชอไมเปลยนแปลง)ใหรายงานผล
7.6.2 กรณพบหรอสงสยวามการเจรญของเชอ(acidbrothขน,maltextractbrothขน/มฝา
หรอพบเชอรา)นามายอมสแบบแกรม บนทกลกษณะรปรางและการตดสของเชอ
กรณตองการแยกเชอบรสทธ ให streakบนNAplateหรอSABplateแยกบมท
สภาวะAnO2 และO2ตามอณหภมทพบการเจรญของเชอดงแผนภมท1(การถายเชอ)
184
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
แผนภมท1ขนตอนการเพาะเชอของอาหารทมความเปนกรด
185
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.7 การแปลผล(Interpretationofresults)
7.7.1 การเนาเสยของอาหารกระปองทมความเปนกรดโดยทวไปเกดจากแบคทเรยกลม
lactobacilli ซงไมสรางสปอร และยสต มะเขอเทศและนามะเขอเทศกระปอง
ทมลกษณะกระปองปกต (flat) แตผลตภณฑมกลนผดปกต โดยทคาความเปน
กรด-เบสอาจจะลดลงหรอไมลดลงกได เนองจากกลมแบคทเรยทสรางสปอร
ทงaerobicmesophilicและaerobicthermophilicซงการเนาเสยแบบนเปนขอยกเวน
ของผลตภณฑทมคาความเปนกรด-เบสตากวา 4.6ทมความตานทานการเนาเสย
จากกลมแบคทเรยทสรางสปอร
7.7.2 อาหารกระปองหลายชนดทมเชอเจรญไดทอณหภมสง(thermophiles)และไมเจรญ
ภายใตการเกบรกษาปกต แตเมออณหภมสงขน (50-55 C) เชอจะเจรญและทาให
เกดการเนาเสย เชนB. thermoacidurans ซงทาใหเกดการเนาเสยแบบ flat- sour
การบมท 55 C ไมทาใหสภาพกระปองเปลยนแปลง แตทาใหผลตภณฑมกลน
ผดปกตและคาความเปนกรด-เบสอาจจะลดลงหรอไมลดลง การเนาเสยของ
มะเขอเทศแพรมะเดอสบปะรดบางครงเกดจากC. pasteurianum ทสรางกาซ
และกลนกรดบวทรก (butyric odor) สาหรบ C. thermosaccolyticum เปน
thermophilic anaerobes ททาใหกระปองบวม และผลตภณฑมกลนเนยแขง
(cheesyodor)
7.7.3 กระปองทไมผานกระบวนการใหความรอนมกปนเปอนดวยเชอทไมสรางสปอร
และเชอสรางสปอรลกษณะการเนาเสยจะเหมอนกรณกระปองรว
7.7.4 ถาพบกลมแบคทเรยมชวตรปทอน (rod) และรปกลม (cocci) บงชวาเกดจาก
กระปองรวหรออาจเกดจากอาหารกระปองไมผานกระบวนการฆาเชอซงกรณน
คาดวาจะพบกระปองบวมในอตราสง
7.7.5 ถาพบกลมแบคทเรยปรมาณมากในอาหารจากการทา direct smear แตไมพบ
การเจรญของเชอ(nogrowth)ในขนตอนการเพาะเชออาจบงชไดวาเกดการเนาเสย
จากแบคทเรยในอาหารกอนการบรรจกระปอง (precanning) อาหารอาจมคา
ความเปนกรด-เบสกลนและลกษณะผดปกต
186
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.7.6 ถาตรวจไมพบการเจรญของเชอในกระปองบวมแสดงวากระปองบวมเนองจาก
กาซไฮโดรเจน(H2)ทเกดขนจากปฏกรยาเคมของอาหารกบผวดานในภาชนะบรรจ
แตถากระปองบวมทเกดจาก thermophilic anaerobes ซงสรางกาซและเซลล
แตกสลายอยางรวดเรวหลงจากเจรญกรณนอาจทาใหสบสนวากระปองบวมเนองจาก
กาซไฮโดรเจน นอกจากนการแตกตวทางเคมของอาหารอาจทาใหเกดกาซ
คารบอนไดออกไซด (CO2) โดยเฉพาะอาหารทมนาตาลและกรดและปฏกรยาน
ถกเรงดวยอณหภมทสงขน
8. การรายงานผล(Expressionofresults)
8.1 แบคทเรยชนดชอบหรอทนกรดเจรญท30C/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)
พบหรอไมพบ
8.2 แบคทเรยชนดชอบหรอทนกรดเจรญท55C/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)
พบหรอไมพบ
8.3 ยสตและรา/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ
9. รายละเอยดอน
9.1 ภาคผนวก1: อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)
9.2 ภาคผนวก2: แผนภมท 2 การตรวจหา (detection) จลนทรยเจรญท 30 C และ 55 C
ในอาหารชนดทมความเปนกรด
187
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก1
อาหารเลยงเชอและสารเคม
(Culturemediaandreagents)
อาหารเลยงเชอกรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. Acid broth
Proteosepeptone 5 กรม
Yeastextract 5 กรม
Dextrose 5 กรม
Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 4 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดทดลอง
ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาทpH5.0±0.2
2. Malt extract broth
Maltextractbase 6 กรม
Maltose,technical 1.8 กรม
Dextrose 6 กรม
Yeastextract 1.2 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดทดลอง
ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาทpH4.7±0.2
188
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
3. Nutrientagar(NA)
Beefextract 3 กรม
Peptone 5 กรม
Agar 15 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร ใหความรอนจนวนละลาย
แบงใสขวดฆาเชอท121C15นาทpH6.8±0.2
4. Sabouraud’sdextroseagar(SAB)
Polypeptoneorneopeptone 10 กรม
Dextrose 40 กรม
Agar 15-20 กรม
นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร
ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร ใหความรอนจนวนละลาย
แบงใสขวดฆาเชอท118–121C15นาทpH5.6±0.2
สารเคมกรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ
1. 4%Iodinein70%ethanol
Potassiumiodide 10 กรม
Iodine 10 กรม
Ethanol(70%) 500 มลลลตร
2. นาปนใส(limewater)
ปนแดงผสมนากวนใหเขากนตงทงไว 1ชวโมงเพอใหตกตะกอนนานาสวนใสดานบนมาใช
นาปนใสหรอสารละลายแคลเซยมไฮดรอกไซดมคณสมบตเปนดาง
189
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
3. Crystal violet stain
Crystalviolet(90%dyecontent) 2 กรม
Ethanol(95%) 20 มลลลตร
นากลนหรอนากรอง 80 มลลลตร
4. Methylenebluestain(Loeffler’s)
SolutionA
Methyleneblue(90%dyecontent) 0.3 กรม
Ethanol(95%) 30 มลลลตร
SolutionB
Dilutedpotassiumhydroxide(0.01%) 100 มลลลตร
ผสมsolutionAและB
5. Gramstainreagentsใชชนดสาเรจรป
190
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก2
แผนภมท2การตรวจหา(detection)จลนทรยเจรญท30Cและ55Cในอาหารชนดทมความเปนกรด
วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย ตวอยาง กระปองบวม กระปองปกต
Springers Flat Soft swells Flipper Hard swells กระปองบวม กระปองปกต ลางภาชนะบรรจ ลางภาชนะบรรจ และทาใหแหง และทาใหแหง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ตรวจหากาซ นาตวอยาง 1-2 มลลลตร/กรม ใสอาหารเลยงเชอ บมทอณหภมและเวลาตามตาราง direct smear ไมพบการเจรญของเชอ พบหรอสงสยวามการเจรญของเชอ
รายงานผล ทาตามแผนภมท 1 ขนตอนการเพาะเชอ ของอาหารทมความเปนกรด
รายงานผล
บม 35oC 14 วน วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหาร
ของกรมวทยาศาสตรการแพทย
คณะผจดทา
1. นางสาวจารวรรณลมสจจะสกล ผอานวยการสานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร
2. นางนตยาพนธบว นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ
3.นางปวณาพานชกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
4.นางสาวสแพรชชวา นกวทยาศาสตรการแพทยปฏบตการ
บรรณาธการ
5.นางปยมาศแจมศร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ
วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหาร
ของกรมวทยาศาสตรการแพทย
193
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย
Method รหสวธ ชนดอาหาร รายการ หนา Type
DMScF4001 อาหารทมสวนประกอบ การสกดดเอนเอดวยวธCTAB - 195 ของพชดดแปรพนธกรรม พนฐาน
DMScF4002 อาหารทมสวนประกอบ การสกดดเอนเอดวยวธ - 201 ของพชดดแปรพนธกรรม Basicsilicamethod
DMScF4003 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 207 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:lectin(bymeansof PolymeraseChainReaction)
DMScF4004 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 215 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:thechloroplasttrnL intron (by means of Polymerase ChainReaction)
DMScF4005 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 223 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:Invertase(bymeansof PolymeraseChainReaction)
DMScF4006 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 231 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:hmgA(bymeansof real-time Polymerase ChainReaction)
DMScF4007 อาหารทมสวนประกอบ Screeningmethodforthedetection - 239 ของพชดดแปรพนธกรรม ofgeneticallymodifiedplant DNA: CaMV-35S promoter (by means of Polymerase ChainReaction)
DMScF4008 อาหารทมสวนประกอบ Screeningmethodforthe - 247 ของพชดดแปรพนธกรรม detectionofgeneticallymodified plant DNA: NOS-terminator (by means of Polymerase ChainReaction)
DMScF4009 อาหารทมสวนประกอบ Screeningmethodforthe - 255 ของพชดดแปรพนธกรรม detectionofgeneticallymodified plantDNA:nptII(bymeansof PolymeraseChainReaction)
195
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชในการสกดดเอนเอดวยวธ CTAB extraction ในตวอยางขาวโพดถวเหลอง และอาหาร
ทมสวนประกอบจากขาวโพดและถวเหลองเหมาะกบตวอยางทเปนmediumถงhighprocessed
food
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysisforthedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysisforthedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
CTABชอเตมคอHexadecyltrimethylammoniumbromide(cethyltrimethylammoniumbromide)
PCR: Polymerase Chain Reaction
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป
เปนวธสกดดเอนเอใหไดดเอนเอทมปรมาณและคณภาพดเพยงพอในการนาไปทดสอบ
ในขนตอนตอไป (คณภาพในทนหมายถงปรมาณและความยาวของดเอนเอเปาหมายทม
มากพอสาหรบการวเคราะหหาขนตอไปโดยไมกลาวถงดเอนเอทงจโนม)
4.2 การสกดดเอนเอ
เปนวธการเฉพาะในการสกดดเอนเอจากพชหรออาหารทมสวนประกอบของพชและ
สามารถลดหรอกาจดสารจาพวกโพลแซคคาไรดและสารประกอบโพลฟนอลทมผลกระทบ
ตอคณภาพของดเอนเอซงตองนาไปใชทดสอบในขนตอไปวธนมขนตอนการทาลายผนง
เซลลดวยCTABรวมกบความรอนตามดวยขนตอนการกาจดสารทยบยงปฏกรยาPCR
DMScF4001: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบของพช
ดดแปรพนธกรรมดวยวธCTABพนฐาน
196
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
อกหลายขนตอนการเตมα-amylaseในการสกดอาหารหลายๆชนดจะสามารถชวยยอย
สลายสารจาพวกแปงไดหรอการใสProteinase-Kจะชวยลดปรมาณโปรตนไดนอกจาก
นนแนะนาใหใชRNAse-AในการกาจดRNAออกไปดวยเพราะอาจรบกวนการวเคราะห
ไดความเขมขนเกลอและคลอโรฟอรมมสวนสาคญอยางมากเนองจากDNAจะตกตะกอน
ไดตองมความเขมขนของเกลอตาๆประมาณ 0.5Mและ/หรอทอณหภมตากวา 16ºC
ปรมาณความเขมขนของเกลอทเพมขนจะทาใหโปรตนและpolysaccharidesตกตะกอน
ในขณะท DNA ยงคงละลายอยในนา สวนคลอโรฟอรมจะชวยแยกดเอนเอออกจาก
CTABและสารประกอบโพลแซคคาไรดกบโปรตน
4.3 การวดคาดเอนเอทสกดได
เปนขนตอนทมประโยชนสาหรบการทาPCR เพอทดสอบหายนเปาหมายสามารถทาได
หลายเทคนค คอเทคนคทางฟสกส (เชน วดการดดกลนแสงทความยาวคลนทจาเพาะ)
เทคนคเคม-ฟสกส(เชนใชการแทรกหรอจบกนของดเอนเอกบสารฟลออเรสเซนตทาให
เกดการเรองแสง)การใชเอนไซม (เชนการตรวจวดแสงทางชวภาพ)หรอการวดปรมาณ
โดยวธ PCR เปนวธทเหมาะสมสาหรบตวอยางทมความซบซอนขององคประกอบของ
อาหารตวอยางทมปรมาณดเอนเอนอยๆหรอตวอยางทดเอนเอถกทาลาย
5. สารเคม(Reagent)
5.1 α-amylase (ในกรณทตองใช) เตรยมเปนสารละลายความเขมขน10mg/ml (โดยละลาย
ในนาทฆาเชอแลวโดยไมตองนงฆาเชอหลงการเตรยมแบงเปนหลอดเลกๆ เกบท –20 C
หลกเลยงการละลายหลายรอบ)
5.2 Chloroform
5.3 Ethanol absolute
5.4 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2EDTA)
5.5 Hexadecyltrimethylammoniumbromide(CTAB)
5.6 Hydrochloric acid 37%
5.7 Isopropanol
5.8 Proteinase-K(ในกรณทตองใช)เตรยมเปนสารละลายความเขมขน20mg/ml(โดยละลาย
ในนาทฆาเชอแลวโดยไมตองนงฆาเชอหลงการเตรยม แบงเปนหลอดเลกๆ เกบท
–20Cหลกเลยงการละลายหลายรอบ)
197
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.9 RNaseA (DNase free),สารละลายความเขมขน10mg/ml (แบงเปนหลอดเลกๆ เกบ
ท–20C)
5.10 Sodium chloride
5.11 Sodium hydroxide
5.12 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)
5.13 CTAB extraction buffer (CTAB 20 g/l, NaCl 1.4 M, Tris 0.1 M, Na2EDTA0.02M)
ปรบpHใหได8.0ดวยHClหรอNaOH
5.14 CTAB-precipitationbuffer(CTAB5g/l,NaCl0.04M)
5.15Sodiumchloridesolutionความเขมขน1.2M
5.16Ethanolsolutionเตรยมเปน70%
5.17 TE buffer (Tris 0.01 M, Na2EDTA0.0001M)ปรบpHใหได8.0ดวยHClหรอNaOH
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Incubatorควรใชชนดทเขยาได
6.2 Centrifuge(ปนเหวยงไดสงสด12,000g)
6.3 Mixer
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การสมตวอยาง(Sampling)
7.1.1 ใชตวอยางทดสอบ (test portion) ทเปนตวแทนทเหมาะสมจากตวอยางของ
หองปฏบตการ (Lab sample)ซงในกรณทตองการLOD0.1% ตองใชตวอยาง
ปรมาณไมนอยกวา3,000particles
7.1.2 นาตวอยางของหองปฏบตการทงหมดมาบดปนและคนใหเขากนกอนสมตวอยาง
ทดสอบไปสกดระวงการปนเปอนขณะทาการบดปนหรอเตรยมตวอยาง
7.1.3 ตวอยางทเปนของเหลวใหผสมใหเขากนใหดกอนหรอในกรณทเปนผลตภณฑ
ทตกตะกอนไดใหทาการผสมจนมนใจวาไมมตะกอนตดอยทกนภาชนะ
7.1.4 ตวอยางทเปนของเหนยวขนหรออยในสภาพทบดไดยาก อาจเพมขนตอนชวง
กอนบดหรอกาลงบดไดคอการใหความรอนท 40ºCการละลายนาเพมขนการ
แชแขงท-20ºCหรอตากวา
198
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.1.5 กรณตวอยางมสวนประกอบหลายอยางทสามารถแยกสวนเปาหมายการทดสอบได
เชนขนมปงไสปลาอาจใชการสมแยกเฉพาะสวนทตองการนาไปสกดดเอนเอเทานน
7.2. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
การเตรยมตวอยางเพอใหไดดเอนเอทมคณภาพดตองมการกาจดหรอลดปรมาณ
การปะปนของสารทมผลตอการสกดดเอนเอดงน
Polysaccharides สามารถกาจดโดยใชเอนไซมทเหมาะสม (เชน pectinase,
α-amylase)หรอการสกดดวยสารอนทรย(เชนCTAB/chloroform)
RNA และ/หรอโปรตน ใชวธทเหมาะสมเชนการใชเอนไซม RNase -A และ
proteinase-Kตามลาดบไขมนใชตวทาละลายเชนn-hexane
เกลอทมในตวอยางสารสกดหรอขนตอนการตกตะกอนมผลตอการทาการวเคราะห
ในขนตอไป จงตองระวงการเหลอตกคาง โดยการปรบ pH ใหไดประมาณ 7.0 กอน
การสกด
7.3 ขนตอนการสกด
7.3.1 ชงตวอยางทดสอบ200–300มลลกรมใสหลอดขนาด2-ml (แตในอาหารทอาจ
มปรมาณดเอนเอนอยหรอเปนดเอนเอทเสยสภาพตองมการใชปรมาณตวอยางมาก
ขนเพอใหมปรมาณดเอนเอทเพยงพอ และมคณภาพเพอทาการวเคราะหตอไป
แตไมแนะนาใหใชปรมาณตวอยางทดสอบมากกวา 2กรมและตองมการคานวณ
ปรมาตรสารตางๆใหเหมาะสมกบปรมาณตวอยางทดสอบทเพมขนดวย)
7.3.2 เตมCTABextraction(5.13)ทใหความรอนไวทอณหภม65Cจานวน1.5มลลลตร
ผสมใหเขากน (ในตวอยางบางชนดอาจตองใช CTAB extraction ในปรมาตร
ทมากกวานเพอใหสามารถผสมกบตวอยางไดทงหมด)
7.3.3 เตมα-amylase 10 ไมโครลตร (5.1) ผสมใหเขากน (กรณทในตวอยางม
polysaccharides)
7.3.4 บมท65Cเปนเวลา30นาทเขยาเปนระยะๆ
7.3.5 เตมproteinase-K10ไมโครลตร(5.8)ผสมใหเขากน(กรณทในตวอยางมโปรตน)
7.3.6 บมท65Cเปนเวลา30นาทเขยาเปนระยะ
7.3.7 เหวยงท 12,000 g เปนเวลา 10 นาท แลวดดสวนใสใสในหลอดขนาด 2-ml
หลอดใหม
199
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.3.8 เตมคลอโรฟอรมในปรมาณ0.7–1เทาของสวนใสทดดออกมา
7.3.9 เขยาใหเขากนนาไปเหวยงท12,000gเปนเวลา15นาท
7.3.10 ดดสวนบน(aqueousphase)ใสหลอดขนาด2-mlหลอดใหม
7.3.11 เตมCTABprecipitate(5.14)ในปรมาณ2เทาของสวนใสทดดออกมา
7.3.12 บมท 65 C เปนเวลา 60นาทโดยไมเขยานาไปปนเหวยงท 12,000 g เปนเวลา
15นาท
7.3.13 เทสวนใสทง
7.3.14ละลายตะกอนดวยสารละลายNaCl(5.15)ปรมาตร350ไมโครลตร
7.3.15เตมคลอโรฟอรม 350 ไมโครลตร เขยาใหเขากนนาไปปนเหวยงท 12,000 g
เปนเวลา10นาท
7.3.16 ดดสวนทเปนaqueousใสหลอดขนาด1.5-mlหลอดใหม
7.3.17 เตม isopropanol (5.7) ในอตราสวน 0.6 เทาของสวนใสทงหมด ผสมโดยการ
พลกหลอด
7.3.18 ตงไวทอณหภมหอง20นาทนาไปปนเหวยงท12,000gเปนเวลา15นาท
7.3.19 เทสวนใสทง
7.3.20 เตมEtOH(5.16)ปรมาตร500ไมโครลตรผสมโดยการพลกหลอด(เปนขนตอน
ทสาคญมากเพอทจะกาจดCTABออกใหหมด)
7.3.21นาไปปนเหวยงท12,000gเปนเวลา10นาทเทสวนใสทง
7.3.22 ละลายตะกอนในนาหรอ buffer ทเหมาะสม เชน TE buffer (5.17) ปรมาตร
100ไมโครลตร
7.3.23เกบดเอนเอนเปนmasterstock
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
วดปรมาณของดเอนเอทสกดโดยใชSpectrophotometer วดการดดแสงในชวงความยาวคลน
ท 260และ 320 nmคาOD (optical density) วดท 260 nmนามาคานวณคาปรมาณดเอนเอ
โดย 1ODของดเอนเอเสนคและดเอนเอเสนเดยว (ทถกทาใหเสยสภาพโดย 0.2MNaOH)
จะมปรมาณ50ng/µlและ37ng/µlตามลาดบ
200
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
DNA = F × (OD260 - OD320 )×50
เมอ Fเปนคาdilutionfactor
OD260 คอคาabsorbanceเมอวดทความยาวคลน260nm
OD320 คอคาabsorbanceเมอวดทความยาวคลน320nm
50เปนคาconversionfactorของดเอนเอเสนคมหนวยเปนไมโครกรม/มลลลตร
บนทกผลคาความเขมขนทไดเปนng/µl
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 สกดตวอยางทดสอบเปนจานวนอยางนอย2sub-sample
9.2 ตองมการควบคมคณภาพในการสกด โดยอยางนอยตองประกอบดวย extraction blank
controlและpositiveextractioncontrolหรอมการทดสอบสภาวะแวดลอมเพมเตมดวย
201
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
DMScF4002: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบของพช
ดดแปรพนธกรรมดวยวธBasicsilicamethod
1. ขอบขาย(Scope)
ใชในการสกดดเอนเอดวยวธ Basic silicamethod ในตวอยางขาวโพด ถวเหลองและอาหาร
ทมสวนประกอบจากขาวโพดและถวเหลองทไมใช high-process food แตไมแนะนาใหใช
กบตวอยางทมไขมนปรมาณมาก
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.1 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
PCR:Polymerase Chain Reaction
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป
เปนขนตอนการสกดเพอใหไดดเอนเอทมปรมาณและคณภาพดเพยงพอในการนาไปทดสอบ
ในขนตอนตอไป (คณภาพในทนหมายถงปรมาณและความยาวของดเอนเอเปาหมายทม
มากพอสาหรบการวเคราะหหาขนตอไปโดยไมกลาวถงดเอนเอทงจโนม)
4.2 การสกดดเอนเอ
เปนการแยกดเอนเอออกจากสวนประกอบอนๆของตวอยางจากพชหรอมสวนประกอบ
ของพช และสามารถใชเปนขนตอนกาจดหรอลดปรมาณสารยบยงปฏกรยา PCR
จากการสกดดเอนเอดวยวธอน
วธนจะมขนตอนการทาลายผนงเซลลโดยใชความรอนรวมกบ Sodium dodecyl
sulfate ในสารละลายบฟเฟอร และทาใหบรสทธโดยใช silica resin ในสารละลายทม
202
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
guanidine-hydrochlorideดเอนเอจะจบกบsilicaในสภาวะทมwateractivityตาจากนน
จะลางสงอนๆทปะปนอยออกไปโดยใช iso-propanol โดยดเอนเอยงคงตดอยกบ silica
ขนตอนสดทายใชสารละลายทมปรมาณเกลอตาๆละลายดเอนเอออกมา
4.3 การวดคาดเอนเอทสกดได
เปนขนตอนทมประโยชนสาหรบการทาPCR เพอทดสอบหายนเปาหมายสามารถทาได
หลายเทคนค คอเทคนคทางฟสกส (เชน วดการดดกลนแสงทความยาวคลนทจาเพาะ)
เทคนคเคม-ฟสกส (เชน ใชการแทรกหรอจบกนของดเอนเอกบสารฟลออเรสเซนตทาให
เกดการเรองแสง)การใชเอนไซม (เชนการตรวจวดแสงทางชวภาพ)หรอการวดปรมาณ
โดยวธ PCR เปนวธทเหมาะสมสาหรบตวอยางทมความซบซอนขององคประกอบ
ของอาหารตวอยางทมปรมาณดเอนเอนอยๆหรอตวอยางทดเอนเอถกทาลาย
5. สารเคม(Reagent)
5.1 Sodiumchloride(NaCl)
5.2 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)
5.3 Ethylenediaminetetraacetic acid-disodium salt (Na2EDTA)(C10H14N2O8Na2)
5.4 Hydrochloricacid,(HCl)37%
5.5 Sodiumhydroxide(NaOH)
5.6 Sodiumdodecylsulfate(SDS)(C12H25O4SNa)
5.7 Proteinase-K~20U/mgชนดlyophilised
5.8 Guanidine hydrochloride (CH5N3-HCl)
5.9 Potassiumchloride(KCl)
5.10 Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)
5.11Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4)
5.12 Isopropanol[CH3CH(OH)CH3]
5.13 Silica (SiO2),silicondioxideทมขนาดระหวาง0.5และ10ไมโครเมตร(โดยปรมาณ80%
จะเปนขนาดระหวาง1ถง5ไมโครเมตร)Silicasuspension:ชงsilica5g(5.13)ใสหลอด
50-ml เตมPBS-buffer (5.18)50มลลลตร เขยาใหเขากนตงทงไว 2ชวโมงใช pipette
ดดสวนใสออกแลวเตมPBS-buffer(5.18)อก50มลลลตรเขยาใหเขากนตงทงไว2ชวโมง
ใช pipetteดดสวนใสออกหลงจากนนนาไปเหวยงท 2000g เปนเวลา2นาททงสวนใส
203
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ทเหลอทงหมดแลวเตมguanidine-HClsolutionII(5.17)50มลลลตรSilicaทเตรยมมอาย
การใชงาน2–5เดอน
5.14 RNase-A,DNase-freeสารละลายความเขมขน 10mg/ml (แบงเปนหลอดเลกๆ
เกบท–20C)
5.15 Proteinase-K เตรยมเปนสารละลายความเขมขน 20mg/ml (โดยละลายในนา
ทฆาเชอแลวโดยไมตองนงฆาเชอหลงการเตรยมแบงเปนหลอดเลกๆเกบท–20C
หลกเลยงการละลายหลายรอบ)
5.16 GuanidinehydrochloridesolutionI, (CH5N3-HCl)=5mol/l (นงฆาเชอท121 C
15นาท)
5.17 Guanidine-HClsolutionII,(CH5N3-HCl)=6mol/l(นงฆาเชอท121C15นาท)
5.18 PBS-buffersolution(NaCl=0.157mol/l,KCl=0.0027mol/l,Na2HPO4 = 0.010
mol/l,KH2PO4=0.0018mol/l)
5.19 TNE-SDS extraction buffer (NaCl = 0.150 mol/l, Tris = 0.002 mol/l, Na2EDTA
=0.002mol/l,SDS=10g/l)ปรบpH8.0ดวยHClหรอNaOHและนงฆาเชอดวย
autoclaveกอนเตมSDS
5.20 Isopropanolsolution,CH3CH(OH)CH3 = 80%
5.21 TE-buffer solution (Tris = 0,010 mol/l and Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpH
8.0ดวยHClหรอNaOH
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Centrifugeทมความเรวรอบอยางนอย2,000gบางขนตอนตองใชแบบทมการใหความเยน
ขณะปนเหวยง
6.2 Ovenหรอincubatorโดยมอณหภมใชงานท60C
6.3 Shaker
6.4 Mixer
6.5 Centrifugationvialsขนาด50mlสาหรบเตรยมsilicasuspension.
6.6 UV Spectrophotometer
204
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การสมตวอยาง(Sampling)
7.1.1 ใชตวอยางทดสอบ (test portion) ทเปนตวแทนทเหมาะสมจากตวอยางของ
หองปฏบตการ(Labsample)ซงในกรณทตองการLOD0.1%ตองใชตวอยางปรมาณ
ไมนอยกวา3,000particles
7.1.2 นาตวอยางของหองปฏบตการทงหมดมาบดปนและคนใหเขากนกอนสมตวอยาง
ทดสอบนาไปสกดระวงการปนเปอนขณะทาการบดปนหรอเตรยมตวอยาง
7.1.3 ตวอยางทเปนของเหลวใหผสมใหเขากนใหดกอนหรอในกรณทเปนผลตภณฑ
ทตกตะกอนไดใหทาการผสมจนมนใจวาไมมตะกอนตดอยทกนภาชนะ
7.1.4 ตวอยางทเปนของเหนยวขนหรออยในสภาพทบดไดยาก อาจเพมขนตอนชวง
กอนบดหรอกาลงบดไดคอ การใหความรอนท 40 C การละลายนาเพมขน
การแชแขงท-20Cหรอตากวา
7.1.5 กรณตวอยางมสวนประกอบหลายอยางทสามารถแยกสวนเปาหมายการทดสอบได
เชนขนมปงไสปลาอาจใชการสมแยกเฉพาะสวนทตองการนาไปสกดดเอนเอเทานน
7.2. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)
การเตรยมตวอยางเพอใหไดดเอนเอทมคณภาพดตองมการกาจดหรอลดปรมาณการปะปน
ของสารทมผลตอการสกดดเอนเอดงน
การสกดPolysaccharidesสามารถกาจดโดยใชเอนไซมทเหมาะสมกอนขนตอนการสกด
(เชนpectinase,α-amylase)หรอใชการสกดดวยสารอนทรยกอนการตกตะกอนดเอนเอ
(เชนchloroform)
RNA และ/หรอโปรตน ใชวธทเหมาะสมเชนการใชเอนไซม RNase-A และ
proteinase-Kตามลาดบ
ไขมนใชตวทาละลายเชนn-hexaneเตมพรอมextractionbuffer
เกลอทมในตวอยางสารสกดหรอขนตอนการตกตะกอนมผลตอการทาการวเคราะห
ในขนตอไป จงตองระวงการเหลอตกคาง โดยการปรบ pH ใหได ประมาณ 7.0 กอน
การสกด
7.3 ขนตอนการสกด
7.3.1 ชงตวอยางทบดแลว200–300มลลกรม(แตในอาหารทอาจมปรมาณดเอนเอนอย
หรอ เปนดเอนเอทเสยสภาพตองมการใชปรมาณตวอยางมากขนเพอใหมปรมาณ
ดเอนเอทเพยงพอและมคณภาพเพอทาการวเคราะหตอไปแตไมแนะนาใหใชปรมาณ
205
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตวอยางทดสอบมากกวา 2 กรม และตองมการคานวณปรมาตรสารตางๆ ให
เหมาะสมกบปรมาณตวอยางทดสอบทเพมขนดวย)
7.3.2 เตมextractionbuffer(5.19)2มลลลตรและProteinase-K(5.15)20ไมโครลตร
7.3.3 บมท60Cเปนเวลา1–5ชวโมงพรอมเขยาอยางรนแรง(ประมาณ250รอบ/นาท)
7.3.4 ปนเหวยงท 2,000 g เปนเวลา 15นาท แลวดดสวนใสใสในหลอดขนาด 2-ml
หลอดใหม
7.3.5 เตมRNase-A(5.14)ปรมาณ2ไมโครลตรลงในสวนใสบม5นาทท37C(ขนตอน
การกาจดอารเอนเอน ตองทากอนขนตอนผสมกบ silica เพอใหการวดคาดวย
UV-spectrophotometerมความถกตองมากขน)
7.3.6 เตมGuanidine-HCl (5.16)ปรมาณ55ไมโครลตรและ silica suspension (5.17
ปรมาณ100ไมโครลตรตงทงไว1นาท
7.3.7 ปนเหวยงท800gเปนเวลา2นาท
7.3.8 ทงสวนใสแลวเตม isopropanol (5.20)ปรมาณ 500 ไมโครลตร เขยาใหเขากน
(อาจใชmixerในการผสม)
7.3.9 ปนเหวยงท1,500gเปนเวลา2นาททงสวนใส
7.3.10ทงใหแหง
7.3.11ละลายตะกอนในTEbuffer(5.21)ปรมาณ100ไมโครลตรผสมอยางระมดระวง
7.3.12บมท60Cเปนเวลา5นาท
7.3.13ปนเหวยงท2,000gเปนเวลา5นาท
7.3.14ดด 80%ของสวนใสใสหลอดใหม (ระวงอยาใหม silicaตดมาดวย เพราะ silica
มคณสมบตยบยงการทางานของเอนไซมเชนDNApolymerase)
7.3.15เตมRNase-A(5.14)ปรมาณ2ไมโครลตรบมท37Cเปนเวลา1ชวโมงวดคาความ
เขมขน
โดยใชUVspectrophotometerเกบดเอนเอนเปนmasterstock
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
วดปรมาณของดเอนเอทสกดโดยใช spectrophotometer วดการดดแสงในชวงความยาวคลนท
260 และ 320 nmคาOD (optical density) วดท 260 nmนามาคานวณคาปรมาณดเอนเอ
โดย 1 ODของดเอนเอเสนคและดเอนเอเสนเดยว (ทถกทาใหเสยสภาพโดย 0.2MNaOH)
จะมปรมาณ50ng/µlและ37ng/µlตามลาดบ
206
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
DNA = F × (OD260−OD320)×50
เมอ Fเปนคาdilutionfactor
OD260 คอคาabsorbanceเมอวดทความยาวคลน260nm
OD320 คอคาabsorbanceเมอวดทความยาวคลน320nm
50เปนคาconversionfactorของดเอนเอเสนคมหนวยเปนไมโครกรม/มลลลตร
บนทกผลคาความเขมขนทไดเปนng/µl
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
9.1 สกดตวอยางทดสอบเปนจานวนอยางนอย2sub-sample
9.2 ตองมการควบคมคณภาพในการสกด โดยอยางนอยตองประกอบดวย extraction blank
controlและpositiveextractioncontrolหรอมการทดสอบสภาวะแวดลอมเพมเตมดวย
207
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชทดสอบหาดเอนเอของถวเหลอง (Glycinemax) โดยตรวจหายน lectin (เปนยนทพบใน
ถวเหลองทงจากธรรมชาตและถวเหลองดดแปรพนธกรรม) ในอาหารทมสวนประกอบหรอ
มการปะปนของถวเหลองและเพอทดสอบคณภาพและปรมาณของดเอนเอทสกดไดจากตวอยาง
ทดสอบทมสวนประกอบหรอมการปะปนของถวเหลอง โดยใชวธ Polymerase Chain
Reaction(PCR)
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21569:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods
2.3 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysisforthedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
-
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ
ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ
จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ
การควบคมการทดสอบทเหมาะสมรวมกบ detection limitของวธทใชและสดสวนของ
ตวอยางทใชทดสอบ
DMScF4003: Qualitativeendogenousgenetesting:lectin
(bymeansofPolymeraseChainReaction)
208
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช
เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotidetriphosphates(dNTP)
ในbufferเปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอนคอในสวน
ผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ
4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน
4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primersสามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวทเปน
เปาหมาย
4.2.3 จาลองสายของ primers ทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออก แลวทาใหยาวขน
โดยใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม
4.3 การตรวจสอบและยนยนผล
สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR products สามารถตรวจสอบได
โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยกและ
จาแนกขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromideทจะเขาจบกบดเอนเอ
และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลตเทยบกบดเอนเอทรขนาดและ/
หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา
อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบสของ
PCR products สวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมายและ
การตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน
5. สารเคม(Reagent)
5.1 WaterชนดPCRgrade
5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2 ผสมอย)ความเขมขน10เทา
5.3 MgCl2solutionความเขมขน25mmol/l
5.4 dNTPsolutionความเขมขนของแตละnucleotideเทากบ5mM
5.5 Oligonucleotidesความเขมขนของแตละเสนเทากบ10µM
5.5.1 Forwardprimer:Soyabeanlectingene(GenBank®accessionNo.K00821)Primer-1
GM03:5'-gCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3'
5.5.2 Reverse primer: Soya bean lectin gene (GenBank®accessionNo.K00821)Primer-2
GM04:5'-gCCCATCTgCAAgCCTTTTTgTg-3'
209
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR),5U/µl
5.7 AgaroseทเหมาะสมสาหรบการแยกขนาดดเอนเอของPCRproductsเปาหมาย
5.8 Boric acid (H3BO3)สาหรบเตรยมTBEbuffer
5.9 Bromophenol blue (C19H9Br4O5SNa)และ/หรอxylenecyanoleFF(C25H27N2O6S2Na)
5.10 ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของPCRproducts(เชนrestriction-
digested λ-PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder)
5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer
5.12 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2-EDTA)(C10H14N2O8Na2)
5.13 Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l
5.14 Glycerol
5.15 Sodium acetate (C2H3O2Na)สาหรบเตรยมTAEbufferเทานน
5.16 Hydrochloricacid(HCl)=37%
5.17 Sodiumhydroxide(NaOH)
5.18 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)
5.19 TAEbuffersolution(1x)(Tris=0.050mol/l,Sodiumacetate=20mmol/l,Na2-EDTA
= 0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใช glacial acetic acidหรอNaOH (ควรเตรยม
เปน50xแลวเจอจางเปน1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอdeionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.20 Tris/borate(TBE)buffersolution(0.5x)(Tris=0.055mol/l,boricacid=0.055mol/l,
Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยมเปน
10x แลวเจอจางเปน 1x กอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอ deionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.21 Sample loading buffer solution (5x) (glycerol = 50%, bromophenol blue = 2.5 g/l
และ/หรอ xylene cyanol = 2.5 g/l) ละลายใน buffer ชนดเดยวกบทตองการใชงาน
(TAEorTBE)
5.22 Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l
210
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ขอแนะนา:
5.22.1 หลกเลยงการเตรยมโดยการชง EtBr ออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนา แตให
เตรยมโดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของ EtBr หรอใช EtBr ทเปนเมดเพอ
ละลายนา
5.22.2 ควรเตรยมเปน ethidiumbromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน
จากแสงท5C
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Thermal cycler
6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply โดยทวไปใชแรงดนไฟฟาท 5V/cm
(ระยะหางระหวางขวบวกและขวลบขนกบขนาดgeltray)
6.3 Ultraviolet(UV)trans-illuminatorทสามารถใหความยาวคลนท312nm.
6.4 Recordinginstrumentเชนphoto-documentหรอกลองCCD
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)
เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยาPCRโดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด25ไมโครลตร
เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทLectin_1
ตารางLectin_1
De-ionizedwater(µl) ปรบใหไดปรมาตรรวม25
10xbuffer+15mMMgCl2 1x
25 mM MgCl2 1.5 mM
5 mM dNTP 0.8 mM
10µMprimer-1 0.2µM
10µMprimer-2 0.2µM
5U/µlDNAtaqpolymerase 0.5U
Total(µl) 25
DNAtemplate(µl) 10–50ng
Reagent Final concentration
211
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2 สารควบคม(PCRcontrols)
7.2.1 positive extraction control
7.2.2 extraction blank control
7.2.3 positiveDNAtargetcontrolจากถวเหลองGTS40-3-2
7.2.4 negative DNA target control
7.2.5 amplification reagent control
7.3 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-timeprogramme)
อณหภมและเวลาทใชตามระบในตาราง Lectin_2 เปนการทดสอบความใชไดของ
วธวเคราะหกบเครอง GeneAmp® 2400 หรอ GeneAmp® 9600 และใชเอนไซม
AmpliTaq Gold®DNApolymeraseถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอ
ใหไดผลการวเคราะหตามตองการ
ตารางLectin_2
Step Time/temp
Activation/Initialdenature 10min/95C
Amplification 30s/95C
30s/60ºC
60s/72ºC
Number of cycles 35
Finalextension 3min/72ºC
เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activatedDNA polymerase
อาจแตกตางไปตามแตละผผลตใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา
จากผผลต
7.4 ตรวจสอบPCRproducts
โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟาและยอมสดวยEtBr
7.4.1 ชงagaroseในปรมาณทเหมาะสม(0.8–1.0%ในดเอนเอทมขนาดใหญแตPCR
products ทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณ agarose สงกวาน และอาจสง
ไดถง4.0%)ละลายในbuffer(TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ
จากกระแสไฟฟา)
212
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4.2 ละลายในmicrowaveหรอwaterbathเขยาใหเขากนโดยไมใหเกดฟอง
7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60 Cแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb
ทเหมาะสมกบปรมาณตวอยางททดสอบตงทงไวใหเยน(ใชเวลาประมาณ1ชวโมง)
เจลทเตรยมไมควรมความหนาเกน1เซนตเมตร
7.4.4 แกะcombออกและยกเจลไปวางในelectrophoresischamber
7.4.5 เทbuffer(ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและloadingbuffer)ลงไปใหทวมเหนอเจล
2มลลเมตร
7.4.6 ผสมPCRproducts(5µlหรอ10µl)กบloadingbufferประมาณ20%ของปรมาตร
รวมทงหมด (เชน ใช loading buffer 2.5 µl + PCR products 10µl)หยอดลง
ในหลมเทยบกบ100bpladder
7.4.7 เปดเครองelectrophoresischamber
7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลาแลวนาเจลออกไปแชในสารละลายEtBr15–50นาทแลว
ลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท
7.4.9 บนทกภาพเจลภายใตแสงUV
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 ตวอยางทดสอบหลอดจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของ PCRproducts เทากบ positive
controlคอเทากบ118bpและผลของPCRcontrolsทงหมดใหผลตามระบในขอ9
8.2 การสรปผล:
8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง
2sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9
8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sample ตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง
เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ
8.3 การรายงาน
8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวกใหรายงาน
ยนจาเพาะของถวเหลอง(lectin) พบ/detected
8.3.2 ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน
ยนจาเพาะของถวเหลอง(lectin) ไมพบ/notdetected
213
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทกครงททา PCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทา PCR เรยบรอยแลวผลของสารควบคม
ทถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ
9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก
9.2 extractionblankcontrol ตองใหผลเปนลบ
9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก
9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ
9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ
215
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
การทดสอบหาดเอนเอของยน trnL intron ทมใน chloroplast ของพชทกชนด โดยใชวธ
PolymeraseChainReaction(PCR)และเปนวธทใชควบคมวาวธทสกดดเอนเอจากตวอยางอาหาร
มความเหมาะสมและมดเอนเอของพชในอาหารนนๆ ในกรณอาหารทผานกระบวนการผลตจะ
ใชวธนตรวจไดหรอไมขนกบอตราการสญเสยสภาพดเอนเอเนองจากPCRproductsทเกดจาก
การทดสอบนจะใหดเอนเอทมขนาดยาวกวาลาดบเบสทใชทดสอบหาพชดดแปรพนธกรรมอนๆ
ในตวอยางทดสอบวธนไมควรใชเปนวธควบคมในการตรวจเชงปรมาณ
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21569:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods
2.3 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
-
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ
ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ
จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ
การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวน
ของตวอยางทใชทดสอบ
DMScF4004: Qualitativeendogenousgenetesting:thechloroplast trnL
intron(bymeansofPolymeraseChainReaction)
216
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช
เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotidetriphosphates(dNTP)
ในbufferเปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอนคอในสวน
ผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ
4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน
4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาค ไดกบดเอนเอสายเดยว
ทเปนเปาหมาย
4.2.3 จาลองสายของ primers ทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออก แลวทาใหยาวขน
โดยใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม
4.3 การตรวจสอบและยนยนผล
สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR products สามารถตรวจสอบได
โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก
และจาแนกขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromide ทจะเขาจบกบ
ดเอนเอและสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอท
ร ขนาดและ/หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจล
ดวยไฟฟาอาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยน
ลาดบเบสของ PCR productsสวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอ
เปาหมายและการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน
5. สารเคม(Reagent)
5.1 WaterชนดPCRgrade
5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2ผสมอย)ความเขมขน10เทา
5.3 MgCl2solutionความเขมขน25mmol/l
5.4 dNTPsolutionความเขมขนของแตละnucleotideเทากบ5mM
217
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.5 Oligonucleotidesความเขมขนของแตละเสนเทากบ10µM
5.5.1 Forward primer:Chloroplast tRNAgene (GenBank® accessionNo. Z00044,
X15901)Primer-1c[14]:5'–CgAAATCggTAgACgCTACg-3'
5.5.2 Reverse primer: Chloroplast tRNA gene (GenBank®accessionNo.Z00044,X15901)
Primer-2d[14]:5'–ggggATAgAgggACTTgAAC-3'
5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR)5U/µl
5.7 AgaroseทเหมาะสมสาหรบการแยกขนาดดเอนเอของPCRproductsเปาหมาย
5.8 Boric acid (H3BO3)สาหรบเตรยมTBEbuffer
5.9 Bromophenol blue (C19H9Br4O5SNa)และ/หรอxylenecyanoleFF(C25H27N2O6S2Na)
5.10ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของPCRproducts
(เชน restriction-digestedλ-PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ
100bpladder)
5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer
5.12 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2-EDTA)(C10H14N2O8Na2)
5.13Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l
5.14 Glycerol
5.15 Sodium acetate (C2H3O2Na)สาหรบเตรยมTAEbufferเทานน
5.16Hydrochloricacid(HCl)=37%
5.17Sodiumhydroxide(NaOH)
5.18Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)
5.19TAE buffer solution (1x) (Tris = 0.050 mol/l, Sodium acetate = 20 mmol/l,
Na2EDTA = 0.001 mol/l) ปรบ pH ใหได 8.0 โดยใช glacial acetic acid หรอ
NaOH (ควรเตรยมเปน 50x แลวเจอจางเปน 1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilled
หรอdeionisedwaterทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
218
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.20 Tris/borate (TBE) buffer solution (0.5x) (Tris = 0.055mol/l, boric acid = 0.055
mol/l, Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยม
เปน10xแลวเจอจางเปน1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอdeionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.21 Sample loading buffer solution (5x) (glycerol = 50%, bromophenol blue = 2.5 g/l
และ/หรอ xylene cyanol = 2.5 g/l) ละลายใน buffer ชนดเดยวกบทตองการใชงาน
(TAEorTBE)
5.22Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l
ขอแนะนา:
5.22.1หลกเลยงการเตรยมโดยการชงEtBrออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนาแตใหเตรยม
โดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของEtBrหรอใชEtBrทเปนเมดเพอละลายนา
5.22.2ควรเตรยมเปนethidiumbromidesolutionทความเขมขน10mg/mlเกบใหพนจาก
แสงท5C
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Thermal cycler
6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply โดยทวไปใชแรงดนไฟฟาท 5V/cm
(ระยะหางระหวางขวบวกและขวลบขนกบขนาดgeltray)
6.3 Ultraviolet(UV)trans-illuminatorทสามารถใหความยาวคลนท312nm.
6.4 Recordinginstrumentเชนphoto-documentหรอกลองCCD
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)
เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยาPCRโดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด25ไมโครลตร
เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทCT_1
219
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2. สารควบคม(PCRcontrols)
7.2.1 positive extraction control
7.2.2 extraction blank control
7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชนถวเหลองGT40-3-2
7.2.4 negative DNA target control
7.2.5 amplification reagent control
7.3 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-timeprogramme)
อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางCT_2เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห
กบเครองGeneAmp® 2400หรอGeneAmp® 9600 และใชเอนไซมAmpliTaqGold®
DNApolymeraseถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะห
ตามตองการ
De-ionizedwater(µl) ปรบใหไดปรมาตรรวม25
10xbuffer+15mMMgCl2 1x
25 mM MgCl2 1.5 mM
5 mM dNTP 0.8 mM
10µMprimer-1 0.8µM
10µMprimer-2 0.8µM
5U/µlDNAtaqpolymerase 0.5U
Total(µl) 25
DNAtemplate(µl) 10–50ng
Reagent Final concentration
ตาราง CT_1
220
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตาราง CT_2
Activation/Initialdenature 4min/94C
Amplification 30s/95C
30s/55C
120s/72C
Number of cycles 35
Finalextension 5min/72C
Step Time/temp
เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activatedDNA polymerase
อาจแตกตางไปตามแตละผผลตใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา
จากผผลต
7.4 ตรวจสอบPCRproducts
โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟาและยอมสดวยEtBr
7.4.1 ชง agarose ในปรมาณทเหมาะสม (0.8 – 1.0% ในดเอนเอทมขนาดใหญ แต
PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวาน และอาจสง
ไดถง4.0%)ละลายในbuffer(TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ
จากกระแสไฟฟา)
7.4.2 ละลายในmicrowaveหรอwaterbathเขยาใหเขากนโดยไมใหเกดฟอง
7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60 Cแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb
ทเหมาะสมกบปรมาณตวอยางททดสอบตงทงไวใหเยน(ใชเวลาประมาณ1ชวโมง)
เจลทเตรยมไมควรมความหนาเกน1เซนตเมตร
7.4.4 แกะcombออกและยกเจลไปวางในelectrophoresischamber
7.4.5 เท buffer (ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและ loading buffer) ลงไปใหทวมเหนอ
เจล2มลลเมตร
221
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4.6 ผสมPCRproducts(5µlหรอ10µl)กบloadingbufferประมาณ20%ของปรมาตร
รวมทงหมด(เชนใชloadingbuffer2.5µl+PCRproducts10µl)หยอดลงในหลม
เทยบกบ100bpladder
7.4.7 เปดเครองelectrophoresischamber
7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลา แลวนาเจลออกไปแชในสารละลาย EtBr 15 – 50นาท
แลวลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท
7.4.9 บนทกภาพเจลภายใตแสงUV
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 ตวอยางทดสอบจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของPCRproducts ใกลเคยงกบ positive
control คออยในชวง 500 - 600 bp และผลของ PCR controlsทงหมดใหผลตามระบ
ในขอ9
8.2 การสรปผล:
8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง 2
sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9
8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sampleตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง
เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ
8.3 การรายงาน
8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวกใหรายงาน
ยนจาเพาะของพช(chloroplastt-RNA) พบ/detected
8.3.2 ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน
ยนจาเพาะของพช(chloroplastt-RNA) ไมพบ/notdetected
222
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทกครงททาPCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทาPCRเรยบรอยแลวผลของสารควบคมท
ถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ
9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก
9.2 extractionblankcontrol ตองใหผลเปนลบ
9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก
9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ
9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ
223
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชทดสอบหาดเอนเอของขาวโพด(Zea mays)ในอาหารทมสวนประกอบหรอมการปะปนของ
ขาวโพดและเพอทดสอบคณภาพและปรมาณของดเอนเอทสกดไดจากตวอยางทดสอบทมสวน
ประกอบหรอมการปะปนของขาวโพดโดยใชวธPolymeraseChainReaction(PCR)
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21569:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods
2.3 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
-
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ
ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ
จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ
การควบคมการทดสอบทเหมาะสมรวมกบ detection limitของวธทใชและสดสวนของ
ตวอยางทใชทดสอบ
DMScF4005: Qualitativeendogenousgenetesting:Invertase
(bymeansofPolymeraseChainReaction)
224
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดย
ใชเอนไซม DNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotide triphosphates
(dNTP) ในbuffer เปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอน
คอในสวนผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ
4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน
4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวท
เปนเปาหมาย
4.2.3 จาลองสายของ primers ทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออก แลวทาใหยาวขน
โดยใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม
4.3 การตรวจสอบและยนยนผล
สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR products สามารถตรวจสอบได
โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก
และจาแนกขนาดและอานผลโดยการยอมดวยEthidiumbromide ทจะเขาจบกบดเอนเอ
และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลตเทยบกบดเอนเอทรขนาดและ/
หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา
อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบส
ของ PCR productsสวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย
และการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน
5. สารเคม(Reagent)
5.1 WaterชนดPCRgrade
5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2ผสมอย)ความเขมขน10เทา
5.3 MgCl2solutionความเขมขน25mmol/l
5.4 dNTPsolutionความเขมขนของแตละnucleotideเทากบ5mM
225
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.5 Oligonucleotidesความเขมขนของแตละเสนเทากบ10µM
5.5.1 Forward primer:Maize invertase gene (GenBank® accessionNo.U16123)
Primer-1IVR1-F:5'-CCgCTgTATCACAAgggCTggTACC-3'
5.5.2 Reverse primer: Maize invertase gene (GenBank® accessionNo. U16123)
Primer-2IVR1-R:5'-ggAgCCCgTgTAgAgCATgACgATC-3'
5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR),5U/µl
5.7 AgaroseทเหมาะสมสาหรบการแยกขนาดดเอนเอของPCRproductsเปาหมาย
5.8 Boric acid (H3BO3)สาหรบเตรยมTBEbuffer
5.9 Bromophenol blue (C19H9Br4O5SNa)และ/หรอxylenecyanoleFF(C25H27N2O6S2Na)
5.10ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกล ท เหมาะสมกบขนาดของ PCR products (เชน
restriction-digested λ -PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder) 5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer
5.12 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2-EDTA)(C10H14N2O8Na2)
5.13Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l
5.14 Glycerol
5.15 Sodium acetate (C2H3O2Na)สาหรบเตรยมTAEbufferเทานน
5.16Hydrochloricacid,(HCl)=37%
5.17Sodiumhydroxide(NaOH)
5.18Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)
5.19 TAEbuffersolution(1x)(Tris=0.050mol/l,Sodiumacetate=20mmol/l,Na2-EDTA
= 0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0 โดยใช glacial acetic acidหรอNaOH (ควรเตรยม
เปน50xแลวเจอจางเปน1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอdeionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
226
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.20 Tris/borate(TBE)buffersolution(0.5x)(Tris=0.055mol/l,boricacid=0.055mol/l,
Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยมเปน
10x แลวเจอจางเปน 1x กอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอ deionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.21 Sampleloadingbuffersolution(5x)(glycerol=50%,bromophenolblue=2.5g/lและ
/หรอxylenecyanol=2.5g/l)ละลายในbufferชนดเดยวกบทตองการใชงาน(TAEorTBE)
5.22 Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l
ขอแนะนา:
5.22.1หลกเลยงการเตรยมโดยการชงEtBrออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนาแตใหเตรยม
โดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของEtBrหรอใชEtBrทเปนเมดเพอละลายนา
5.22.2ควรเตรยมเปน ethidiumbromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน
จากแสงท5C
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Thermal cycler
6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply โดยทวไปใชแรงดนไฟฟาท 5V/cm
(ระยะหางระหวางขวบวกและขวลบขนกบขนาดgeltray)
6.3 Ultraviolet(UV)trans-illuminatorทสามารถใหความยาวคลนท312nm.
6.4 Recordinginstrumentเชนphoto-documentหรอกลองCCD
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)
เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยาPCRโดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด25ไมโครลตร
เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทInvertase_1
227
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
De-ionizedwater(µl) ปรบใหไดปรมาตรรวม25
10 ×buffer+15mMMgCl2 1x
25 mM MgCl2 1.5 mM
5 mM dNTP 0.4 mM
10µMprimer-1 0.5µM
10µMprimer-2 0.5µM
5U/µlDNAtaqpolymerase 1.0U
Total(µl) 25
DNAtemplate(µl) 10–50ng
Reagent Final Concentration
7.2. สารควบคม(PCRcontrols)
7.2.1 positive extraction control
7.2.2 extraction blank control
7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชนCRMของBt11maize
7.2.4 negative DNA target control
7.2.5 amplification reagent control
7.3 อณหภมและเวลาทใช (Temperature-time programme)อณหภมและเวลาทใชตามระบ
ในตาราง Invertase_2 เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะหกบเครองGeneAmp®
2400หรอGeneAmp® 9600และใชเอนไซมAmpliTaqGold®DNApolymeraseถาใช
เครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะหตามตองการ
ตารางInvertase_1
228
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
Step Time/temp
Activation/Initialdenature 12min/95C
Amplification 30s/95C
30s/64C
60s/72C
Number of cycles 35
Finalextension 10min/72C
ตาราง Invertase_2
เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activatedDNA polymerase
อาจแตกตางไปตามแตละผผลตใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา
จากผผลต
7.4 ตรวจสอบPCRproducts
โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟาและยอมสดวยEtBr
7.4.1 ชง agarose ในปรมาณทเหมาะสม (0.8 – 1.0% ในดเอนเอทมขนาดใหญ แต
PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวานและอาจสงได
ถง 4.0%)ละลายในbuffer (TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ
จากกระแสไฟฟา)
7.4.2 ละลายในmicrowaveหรอwaterbathเขยาใหเขากนโดยไมใหเกดฟอง
7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60ºCแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb
ทเหมาะสมกบปรมาณตวอยางททดสอบตงทงไวใหเยน(ใชเวลาประมาณ1ชวโมง)
เจลทเตรยมไมควรมความหนาเกน1เซนตเมตร
229
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4.4 แกะcombออกและยกเจลไปวางในelectrophoresischamber
7.4.5 เทbuffer(ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและloadingbuffer)ลงไปใหทวมเหนอเจล
2มลลเมตร
7.4.6 ผสมPCRproducts(5µlหรอ10µl)กบloadingbufferประมาณ20%ของปรมาตร
รวมทงหมด(เชนใชloadingbuffer2.5µl+PCRproducts10µl)หยอดลงในหลม
เทยบกบ100bpladder
7.4.7 เปดเครองelectrophoresischamber
7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลาแลวนาเจลออกไปแชในสารละลายEtBr15–50นาทแลว
ลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท
7.4.9 บนทกภาพเจลภายใตแสงUV
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 ตวอยางทดสอบจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของPCRproducts ใกลเคยงกบ positive
controlคออยในชวง226bpและผลของPCRcontrolsทงหมดใหผลตามระบในขอ9
8.2 การสรปผล:
8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง 2
sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9
8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sampleตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง
เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ
8.3 การรายงาน
8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวกใหรายงาน
ยนจาเพาะของขาวโพด(Invertase) พบ/detected
8.3.2 ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน
ยนจาเพาะของขาวโพด(Invertase) ไมพบ/notdetected
230
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทกครงททาPCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทาPCRเรยบรอยแลวผลของสารควบคมท
ถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ
9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก
9.2 extractionblankcontrol ตองใหผลเปนลบ
9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก
9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ
9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ
231
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
การทดสอบหาดเอนเอของยนhighmobilitygroupA(hmgA)ของขาวโพด(Zea mays)ในอาหาร
ทมสวนประกอบหรอมการปะปนของขาวโพดและเพอทดสอบคณภาพและปรมาณของดเอนเอ
ทสกดไดจากตวอยางทดสอบทมสวนประกอบหรอมการปะปนของขาวโพดโดยใชวธReal-time
PolymeraseChainReaction(real-timePCR)
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21569:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods
2.3 ISO21570:2005(E):Foodstuffs—Methodsofanalysisforthedetectionofgenetically
modifiedorganismsandderivedproducts—Quantitativenucleicacidbasedmethods
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
-
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ
ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ
จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ
การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวน
ของตวอยางทใชทดสอบ
DMScF4006: Qualitativeendogenousgenetesting:hmgA
(bymeansofreal-timePolymeraseChainReaction)
232
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช
เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotidetriphosphates(dNTP)
ในbufferเปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอนคอในสวน
ผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ
4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน
4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primersสามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวทเปน
เปาหมาย
4.2.3 จาลองสายของprimersทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออกแลวทาใหยาวขนโดย
ใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม
4.3 การทาปฏกรยาของTaqManProbeTaqManprobeเปนการใชOligonucleotideเสนเดยว
ตดฉลากFluorescent dyeซงเปน reporter dyeทตาแหนงปลาย5'ขณะทปลาย3'ของ
OligonucleotideถกตดฉลากดวยFluorescencequencherซงเปนตวยบยงการใหสญญาณ
ของFluorescencedyeทปลาย5'เมอทาปฏกรยาPCRถาTaqManprobeนนมความจาเพาะ
กบดเอนเอเปาหมายกจะจบทตาแหนงจาเพาะนนเมอTaqpolymeraseสรางสายใหมของ
ดเอนเอจาก primer ในแตละรอบของPCRและสายใหมของดเอนเอถกสรางเขามาถง
ตาแหนงท Taqman Probe จบอย เอนไซม Taq polymeraseทมคณสมบตของสวน 5'
nuclease activityจะยอยสายของTaqManprobeทจบอยตรงตาแหนงดงกลาวออกทาให
สวนของquencherหลดออกแยกหางจากFluoresecencereporterและเมอไมมquencher
มาดดกลนแสงจงทาให Fluoresecence ทปลาย 5' สามารถสงสญญาณออกมาใหเครอง
สามารถตรวจจบและวดไดในสภาพจรง(real-time)
4.4 การตรวจสอบและยนยนผล
4.4.1 วธทดสอบนใชตรวจยนhmg(highmobilitygroupofproteingene)ซงเปนยนจาเพาะ
ของขาวโพดมขนาด79bpโดยใชprimerและprobeสาหรบprobeใหตดฉลากส
ฟลออเรสเซนทคอFAMและTAMRAเปนrepoterdyeและQuencherตามลาดบ
233
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.4.2 วธนไดทาการปรบความเหมาะสมของวธวเคราะห (Optimized)พรอมทงทดสอบ
ความใชไดในการทาซาและความแมนยาโดยใชขาวโพดดดแปรพนธกรรมBt176
ชนดIRMM-411ทเปนวสดอางอง(Certifiedreferencematerial)โดยมการทดสอบ
เปรยบเทยบกนในระหวางหองปฏบตการ17แหงและใชเครองreal-timePCRของ
ABI7700SDSและABI5700SDS
4.4.3 วธวเคราะหนทดสอบกบดเอนเอของขาวโพดดดแปรพนธกรรม20ชนดและไมเกด
ปฏกรยาขามกบดเอนเอพชอนคอถวเหลองขาวไรนขาวสาลขาวบารเลยมลเลต
เลนทลถวขาวถวเขยวมะเขอเทศมนฝรงขาวฟาง เรพซดขาวโอต speltแฟลก
งามนษยปลาแซลมอนววยกเวนteosinte(Zeamays,spp.Mexicana)ซงมความ
ใกลชดกบขาวโพดมาก
5. สารเคม(Reagent)
5.1 PCRbuffer(ไมมMgCl2)ทความเขมขน10เทา(10x)
5.2 สารละลายMgCl2ทความเขมขน25mmol/l
5.3 สารละลายdNTPทความเขมขนแตละnucleotideเปน25mmol/l
5.4 Oligonucleotides เปน probe และ primer ความเขมขนปรบเปน 10 µMและ 20 µM
ตามลาดบดงน
5.4.1 primer
ZM1-F5'-TTggACTAgAAATCTCgTgCTgA-3'
ZM1-R5'-gCTACATAgggAgCCTTgTCCT-3‘
5.4.2 Probe
ZM1-P5'-FAM—CAATCCACACAAACgCACgCgTA-TAMRA-3'
234
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.5 Thermostable DNA polymerase
AmplTaq Gold® DNA polymerase*
(*เปนตวอยางผลตภณฑทางการคาทใชไดซงใหขอมลไวเพอความสะดวกในการใชงาน
วธวเคราะหนเทานนผลตภณฑของบรษทอนทใกลเคยงกนสามารถใชไดและใหผลเหมอนกน)
5.6 UracilN-glycolysate(ในกรณทตองการใช)
5.7 Amplificationreactionmixtureตามตารางhmg_1
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Thermal cycler
การทดสอบเรมตนครงแรกดวยเครองABI 7700 เครอง real-time PCRของบรษทอน
สามารถใชไดโดยตองปรบสภาวะการทางานและสวนผสมของปฏกรยานายา PCR ให
เหมาะสมกบเครองกอนใชงาน
6.2 Reaction vials
หลอดทใชกบการทาปฏกรยา PCR เลอกใหเหมาะสมกบการใชงาน เชน ชนดหลอด
หรอplateทเหมาะสาหรบแตละเครอง
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)
เตรยมสารเคมสาหรบการทาปฏกรยา PCR ใหมปรมาตร 25 ไมโครลตร/1 ปฏกรยา
เพอใหสารตางๆมความเขมขนสดทายตามตารางhmg_1
235
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ตาราง hmg_1แสดงสวนผสมของสารละลายในการทาปฏกรยาPCRตอ1reaction
PCRreactionbuffer TaqManbufferA(มสROXa) 1fold
MgCl2 6.5 mol/l
DNA polymerase AmplTaq Gold® 1.25 U
Decontaminantsystem dUTP 400µmol/l
(ในกรณทตองการใช) AmpEraseuracilN-glycosylase 0.5U
Primer ตามขอ5.4.1 300nmol/l
dNTP dATP,dCTP,dGTP 200µmol/l
Probe ตามขอ5.4.2 160nmol/l
TemplateDNA 5µl
2.3ngถง150ngmaizeDNA
ปรมาตรทงหมด 25µl
*ทดสอบจากการปรบสภาวะทเหมาะสมครงแรกสามารถปรบเปลยนไดโดยตองปรบคาให
เหมาะสมสาหรบแตละผลตภณฑ
ROXa = carboxyl-X-Rhodamine
สารเคม ผลตภณฑ* ความเขมขนสดทาย
236
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-TimeProgram)
รปแบบของอณหภมและเวลาทใช(Temperature-TimeProgram)เปนการทดสอบเรมตน
ครงแรกดวยเครองABI7700และGeneAmp5700 เวลาทกระตนการทางานเรมตนของ
เอนไซมDNApolymeraseขนกบผลตภณฑทใชสามารถใชเครองreal-timePCRของบรษท
อนไดโดยตองปรบสภาวะการทางานและสวนผสมของปฏกรยานายา PCRใหเหมาะสม
กบเครองกอนใชงานเวลาทกระตนการทางานเรมตนของเอนไซม DNA polymerase
ขนกบผลตภณฑทใช
ตาราง hmg_2 แสดงโปรแกรมทใช
Pre-PCR: decontamination 120 50
(ในกรณทตองการใช)
Pre-PCR: activation of DNA polymerase 600 95
and denaturation of template DNA
PCR(45cycles)
Step1 Denaturation 15 95
Step 2 Annealing elongation 60 60
ขนตอน เวลา(วนาท) อณหภม(ºC)
237
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 คาCrossingthresholdvalue(Ct)หรอQuantificationcycle(Cq)เปนคาทแสดงถงปรมาณ
ดเอนเอทมณรอบการทางานPCRทสามารถวดไดซงเปนชวงทตดกบthresholdbaseline
ทกาหนดของปฏกรยานนๆ โดยซอฟทแวรของเครองจะทาการคานวณใหตามสตร คอ
ปรมาณดเอนเอ(Quantity)=2Ct
8.2 Limitofdetection(LOD)
ผพฒนาวธไดกาหนดคา absolute LODของวธทดสอบนท 5 copies ของชนสวนยน
เปาหมาย
หมายเหต ถาดเอนเอของขาวโพดถกกาจดออกหรอขนตอนในการผลตอาหารไดทาลาย
คณภาพดเอนเอไปแลว (เชนนามนทผานกรรมวธ) หรอมขาวโพดเปนสวนประกอบ
ในตวอยางอาหารนนนอยมากอาจทาใหตรวจไมพบยนจาเพาะของขาวโพดจงไมสามารถ
ใชวธตรวจวเคราะหนได)
8.3 การแปลผล
ผลวเคราะหPCRแปลผลไดดงน
8.3.1 ตวอยางทดสอบใหผลบวกเมอตรวจพบยนจาเพาะของขาวโพดทตรวจทง 2
sub-sampleและชดควบคมการทดสอบตองไดผลตามกาหนดในขอ9
8.3.2 ตวอยางทดสอบใหผลลบเมอตรวจไมพบยนจาเพาะของขาวโพดทตรวจทง 2
sub-sampleและชดควบคมการทดสอบตองไดผลตามกาหนดในขอ9
8.3.3 ถาผลวเคราะห 2 sub-sample ตางกน ใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง
เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ
8.4 รายงานผลการทดสอบ(TestReport)
8.4.1 การรายงานผลกรณทไดผลบวก
ยนจาเพาะของขาวโพด(hmg) พบ/detected
8.4.2 การรายงานผลกรณทไดผลลบ
ยนจาเพาะของขาวโพด(hmg) ไมพบ/notdetected
238
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทกครงททาPCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทาPCRเรยบรอยแลวผลของสารควบคมท
ถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ
9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก
9.2 extractionblankcontrol ตองใหผลเปนลบ
9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก
9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ
9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ
หากผลของชดควบคม PCR ไมเปนไปตามนจะตองสกดตวอยางซาเพอตรวจวเคราะหใหม
หรอกรณทสงสยวาจะมinhibitorใหเพมขนการทาDNAใหบรสทธเพอยบยงinhibitorกอนนา
ไปทาPCRตอไป
239
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชทดสอบหาดเอนเอของยนจาก cauliflowermosaic virus (CaMV)35Spromoter ในอาหาร
โดยวธPolymeraseChainReaction(PCR)เนองจากยนนมในพชดดแปรพนธกรรมมากมายหลาย
ชนด วธทดสอบนจงใชตรวจสอบเบองตนในอาหารวามการปะปนของพชดดแปรพนธกรรม
ในอาหาร
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysisforthedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21569:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods
2.3 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
-
DMScF4007: Screeningmethodforthedetectionofgeneticallymodified
plantDNA:CaMV-35Spromoter(bymeansofPolymerase
ChainReaction)
240
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ
ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ
จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ
การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวน
ของตวอยางทใชทดสอบ
4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช
เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotidetriphosphates(dNTP)
ในbufferเปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอนคอในสวน
ผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ
4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน
4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวท
เปนเปาหมาย
4.2.3 จาลองสายของprimersทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออกแลวทาใหยาวขนโดย
ใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม
4.3 การตรวจสอบและยนยนผล
สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR products สามารถตรวจสอบได
โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก
และจาแนกขนาดและอานผลโดยการยอมดวยEthidiumbromide ทจะเขาจบกบดเอนเอ
และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอทรขนาด
และ/หรอปรมาณ เมอตรวจสอบPCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา
อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบส
ของ PCRproducts สวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย
และการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน
241
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.4 ผลวเคราะหทเปนผลบวกปลอมอาจเกดขนไดเนองจากชนสวนทนามาเพมจานวนนมาจาก
CauliflowerMosaicVirus ทพบไดในพชตระกลกะหลาทตดเชอนและพบในพชวงศ
Brassicaceae(Cruciferae)รวมทงResedaceaeและSolanacaeดงนนถาตรวจพบผลบวก
จากพชดงกลาว จะตองระมดระวง ผลบวกของการตรวจอาจแสดงวามชนสวนของพช
ดดแปรพนธกรรมแตไมสามารถแปลผลหรอใชเปนขอพสจนวามพชดดแปรพนธกรรม
จนกวาจะมการตรวจสอบยนยนเพมเตม และเพอทจะแยกความแตกตางระหวางไวรส
กบพชดดแปรพนธกรรมอาจตองใชวธการตรวจไวรสCauliflowermosaicvirusดวย
5. สารเคม(Reagent)
5.1 WaterชนดPCRgrade
5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2ผสมอย)ความเขมขน10เทา
5.3 MgCl2solutionความเขมขน25mmol/l
5.4 dNTPsolutionความเขมขนของแตละnucleotideเทากบ5mM
5.5 Oligonucleotidesความเขมขนของแตละเสนเทากบ10µM
5.5.1 Forward primer: CaMV 35S promoter,Designed to amplify theCaMV 35S
promoter, e.g. accession No. V00141
Primer-135s-cf3:5'-CCACgTCTTCAAAgCAAgTgg-3'
5.5.2 Reverse primer: CaMV 35S promoter, Designed to amplify the CaMV 35S
promoter, e.g. accession No. V00141
Primer-235s-cr4:5'-TCCTCTCCAAATgAAATgAACTTCC-3'
5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR),5U/µl
5.7 AgaroseทเหมาะสมสาหรบการแยกขนาดดเอนเอของPCRproductsเปาหมาย
5.8 Boric acid (H3BO3)สาหรบเตรยมTBEbuffer
5.9 Bromophenol blue (C19H9Br4O5SNa)และ/หรอxylenecyanoleFF(C25H27N2O6S2Na)
5.10 ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของ PCR products (เช น
restriction-digested λ-phageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder)
242
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer
5.12 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2-EDTA)(C10H14N2O8Na2)
5.13 Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l
5.14 Glycerol
5.15 Sodium acetate (C2H3O2Na)สาหรบเตรยมTAEbufferเทานน
5.16 Hydrochloricacid,(HCl)=37%
5.17Sodiumhydroxide(NaOH)
5.18Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)
5.19TAEbuffersolution(1x)(Tris=0.050mol/l,Sodiumacetate=20mmol/l,Na2-EDTA
= 0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0 โดยใช glacial acetic acidหรอNaOH (ควรเตรยม
เปน50xแลวเจอจางเปน1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอdeionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.20 Tris/borate(TBE)buffersolution(0.5x)(Tris=0.055mol/l,boricacid=0.055mol/l,
Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยมเปน
10x แลวเจอจางเปน 1x กอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอ deionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.21 Sampleloadingbuffersolution(5x)(glycerol=50%,bromophenolblue=2.5g/lและ
/หรอxylenecyanol=2.5g/l)ละลายในbufferชนดเดยวกบทตองการใชงาน(TAEorTBE)
5.22 Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l
ขอแนะนา:
5.22.1หลกเลยงการเตรยมโดยการชงEtBrออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนาแตใหเตรยม
โดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของEtBrหรอใชEtBrทเปนเมดเพอละลายนา
5.22.2ควรเตรยมเปน ethidiumbromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน
จากแสงท5C
243
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Thermal cycler
6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply โดยทวไปใชแรงดนไฟฟาท 5V/cm
(ระยะหางระหวางขวบวกและขวลบขนกบขนาดgeltray)
6.3 Ultraviolet(UV)trans-illuminatorทสามารถใหความยาวคลนท312nm.
6.4 Recordinginstrumentเชนphoto-documentหรอกลองCCD
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)
เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยาPCRโดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด25ไมโครลตร
เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทCaMV-35S_1
ตาราง CaMV-35S_1
De-ionizedwater(µl) ปรบใหไดปรมาตรรวม25
10xbuffer+15mMMgCl2 1x
25 mM MgCl2 1.5 mM
5 mM dNTP 0.64 mM
10µMprimer-1 0.6µM
10µMprimer-2 0.6µM
5U/µlDNAtaqpolymerase 0.8U
Total(µl) 25
DNAtemplate(µl) 10–50ng
Reagent Final Concentration
244
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.2. สารควบคม(PCRcontrols)
7.2.1 positive extraction control
7.2.2 extraction blank control
7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชน0.1%ถวเหลองGTS40-3-2
7.2.4 negative DNA target control
7.2.5 amplification reagent control
7.3 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-timeprogramme)
อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางCaMV-35S_2 เปนการทดสอบความใชไดของ
วธวเคราะหกบเครองGeneAmp®2400หรอGeneAmp®9600และใชเอนไซมAmpliTaq
Gold® DNA polymerase ถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผล
การวเคราะหตามตองการ
ตาราง CaMV-35S_2
Activation/Initialdenature 10min/95C
Amplification 25s/95C
30s/62C
45s/72C
Number of cycles 50
Finalextension 7min/72C
Step Time/temp
เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activatedDNA polymerase
อาจแตกตางไปตามแตละผผลตใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา
จากผผลต
7.4 ตรวจสอบPCRproducts
โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟาและยอมสดวยEtBr
7.4.1 ชง agarose ในปรมาณทเหมาะสม (0.8 – 1.0% ในดเอนเอทมขนาดใหญ แต
PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวาน และอาจสง
245
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ไดถง4.0%)ละลายในbuffer(TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ
จากกระแสไฟฟา)
7.4.2 ละลายในmicrowaveหรอwaterbathเขยาใหเขากนโดยไมใหเกดฟอง
7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60 Cแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb
ทเหมาะสมกบปรมาณตวอยางททดสอบตงทงไวใหเยน(ใชเวลาประมาณ1ชวโมง)
เจลทเตรยมไมควรมความหนาเกน1เซนตเมตร
7.4.4 แกะcombออกและยกเจลไปวางในelectrophoresischamber
7.4.5 เทbuffer(ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและloadingbuffer)ลงไปใหทวมเหนอเจล
2มลลเมตร
7.4.6 ผสมPCRproducts(5µlหรอ10µl)กบloadingbufferประมาณ20%ของปรมาตร
รวมทงหมด (เชน ใช loading buffer 2.5 µl + PCRproducts 10µl)หยอดลง
ในหลมเทยบกบ100bpladder
7.4.7 เปดเครองelectrophoresischamber
7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลาแลวนาเจลออกไปแชในสารละลายEtBr15–50นาทแลว
ลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท
7.4.9 บนทกภาพเจลภายใตแสงUV
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 ตวอยางทดสอบหลอดจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของ PCRproducts เทากบ positive
controlคอเทากบ123bpและผลของPCRcontrolsทงหมดใหผลตามระบในขอ9
8.2 การสรปผล:
8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง 2
sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9
8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sample ตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะห
ยงเหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ
246
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
8.3 การรายงาน
8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวกใหรายงาน
CaMV-35Spromoter พบ/detected
8.3.2 ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน
CaMV-35Spromoter ไมพบ/notdetected
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทกครงททาPCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทาPCRเรยบรอยแลวผลของสารควบคมท
ถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ
9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก
9.2 extractionblankcontrolตอง ใหผลเปนลบ
9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก
9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ
9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ
247
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1. ขอบขาย(Scope)
ใชทดสอบหาดเอนเอของยนจากAgrobacterium tumefaciens nopaline synthase (NOS)
terminatorในอาหารโดยวธPolymeraseChainReaction(PCR) เนองจากยนนมในพชดดแปร
พนธกรรมมากมายหลายชนดวธทดสอบนจงใชเพอตรวจสอบเบองตนการปะปนของพชดดแปร
พนธกรรมในอาหาร
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21569:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods
2.3 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
-
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ
ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ
จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ
การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวน
ของตวอยางทใชทดสอบ
DMScF4008: Screeningmethodforthedetectionofgeneticallymodified
plantDNA:NOS-terminator (bymeans of Polymerase
ChainReaction)
248
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช
เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucletidetriphosphates(dNTP)
ใน buffer เปนการทาซาในหลอดทดสอบ และมสงทเปนเงอนไขทตองทากอน คอ
ในสวนผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ
4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน
4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาค ไดกบดเอนเอสายเดยว
ทเปนเปาหมาย
4.2.3 จาลองสายของprimersทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออกแลวทาใหยาวขนโดย
ใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม
4.3 การตรวจสอบและยนยนผล
สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR products สามารถตรวจสอบได
โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก
และจาแนกขนาดและอานผลโดยการยอมดวยEthidiumbromide ทจะเขาจบกบดเอนเอ
และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลตเทยบกบดเอนเอทรขนาดและ/
หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา
อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบส
ของ PCR productsสวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย
และการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน
4.4 ผลบวกปลอมอาจเกดขนได เนองจากดเอนเอทเพมจานวนนมาจากAgrobacterium ซง
เปนแบคทเรยทพบไดในดนผลบวกอาจแสดงวามพชดดแปรพนธกรรมในผลตภณฑอาหาร
ทตรวจสอบแตไมสามารถใชเปนขอพสจนวามพชดดแปรพนธกรรมจนกวาจะมการตรวจ
สอบยนยนผลเพมเตม จะตองมความระมดระวงเพราะมโอกาสในการปนเป อนเชอ
Agrobacteriumหรอแบคทเรยอนทมสายพนธใกลชด
249
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5. สารเคม(Reagent)
5.1 WaterชนดPCRgrade
5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2ผสมอย)ความเขมขน10เทา
5.3 MgCl2solutionความเขมขน25mmol/l
5.4 dNTPsolutionความเขมขนของแตละnucleotideเทากบ5mM
5.5 Oligonucleotidesความเขมขนของแตละเสนเทากบ10µM
5.5.1 Forward primer:Agrobacterium tumefaciens NOS-terminator, designed to
amplify a sequence described in accession No. V0087
Primer-1HA-nos118f:5'-gCATgACqTTATTTATgAgATggg-3'
5.5.2 Reverse primer: Agrobacterium tumefaciens NOS-terminator, designed to
amplify a sequence described in accession No. V0087
Primer-2HA-nos118r:5'-gACACCgCgCgCgATAATTTATCC-3'
5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR),5U/µl
5.7 AgaroseทเหมาะสมสาหรบการแยกขนาดดเอนเอของPCRproductsเปาหมาย
5.8 Boric acid (H3BO3)สาหรบเตรยมTBEbuffer
5.9 Bromophenol blue (C19H9Br4O5SNa)และ/หรอxylenecyanoleFF(C25H27N2O6S2Na)
5.10 ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของPCRproducts(เชนrestriction-
digested λ-PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder)
5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer
5.12 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2-EDTA)(C10H14N2O8Na2)
5.13Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l
5.14 Glycerol
5.15 Sodium acetate (C2H3O2Na)สาหรบเตรยมTAEbufferเทานน
5.16Hydrochloricacid(HCl)=37%
5.17 Sodiumhydroxide(NaOH)
250
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.18 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)
5.19 TAEbuffersolution(1x)(Tris=0.050mol/l,Sodiumacetate=20mmol/l,Na2-EDTA
= 0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0 โดยใช glacial acetic acidหรอNaOH (ควรเตรยม
เปน50xแลวเจอจางเปน1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอdeionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.20 Tris/borate(TBE)buffersolution(0.5x)(Tris=0.055mol/l,boricacid=0.055mol/l,
Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยมเปน
10x แลวเจอจางเปน 1x กอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอ deionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.21 Sample loading buffer solution (5x) (glycerol = 50%, bromophenol blue = 2.5 g/l
และ/หรอ xylene cyanol = 2.5 g/l) ละลายใน buffer ชนดเดยวกบทตองการใชงาน
(TAEorTBE)
5.22 Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l
ขอแนะนา:
5.22.1หลกเลยงการเตรยมโดยการชงEtBrออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนาแตใหเตรยม
โดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของEtBrหรอใชEtBrทเปนเมดเพอละลายนา
5.22.2ควรเตรยมเปน ethidium bromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน
จากแสงท5C
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Thermal cycler
6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply โดยทวไปใชแรงดนไฟฟาท 5V/cm
(ระยะหางระหวางขวบวกและขวลบขนกบขนาดgeltray)
6.3 Ultraviolet(UV)trans-illuminatorทสามารถใหความยาวคลนท312nm.
6.4 Recordinginstrumentเชนphoto-documentหรอกลองCCD
251
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
De-ionizedwater(µl) ปรบใหไดปรมาตรรวม25
10xbuffer+15mMMgCl2 1x
25 mM MgCl2 1.5 mM
5 mM dNTP 0.64 mM
10µMprimer-1 0.6µM
10µMprimer-2 0.6µM
5U/µlDNAtaqpolymerase 0.8U
Total(µl) 25
DNAtemplate(µl) 10–50ng
Reagent Final Concentration
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)
เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยาPCRโดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด25ไมโครลตร
เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทNOS_1
ตาราง NOS_1
7.2 สารควบคม(PCRcontrols)
7.2.1 positive extraction control
7.2.2 extraction blank control
7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชน0.1%ถวเหลองGTS40-3-2
7.2.4 negative DNA target control
7.2.5 amplification reagent control
252
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.3 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-timeprogramme)
อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางNOS_2เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห
กบเครองGeneAmp® 2400หรอGeneAmp®9600และใชเอนไซมAmpliTaqGold® DNA
polymerase ถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะห
ตามตองการ
ตาราง NOS_2
Activation/Initialdenature 10min/95C
Amplification 25s/95C
30s/62C
45s/72C
Number of cycles 50
Finalextension 7min/72C
Step Time/temp
เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activatedDNA polymerase
อาจแตกตางไปตามแตละผผลตใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา
จากผผลต
7.4 ตรวจสอบPCRproducts
โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟาและยอมสดวยEtBr
7.4.1 ชง agarose ในปรมาณทเหมาะสม (0.8 – 1.0% ในดเอนเอทมขนาดใหญ แต
PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวานและอาจสงได
ถง 4.0%)ละลายในbuffer (TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ
จากกระแสไฟฟา)
7.4.2 ละลายในmicrowaveหรอwaterbathเขยาใหเขากนโดยไมใหเกดฟอง
253
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60 Cแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb
ทเหมาะสมกบปรมาณตวอยางททดสอบตงทงไวใหเยน(ใชเวลาประมาณ1ชวโมง)
เจลทเตรยมไมควรมความหนาเกน1เซนตเมตร
7.4.4 แกะcombออกและยกเจลไปวางในelectrophoresischamber
7.4.5 เทbuffer(ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและloadingbuffer)ลงไปใหทวมเหนอเจล
2มลลเมตร
7.4.6 ผสมPCRproducts(5µlหรอ10µl)กบloadingbufferประมาณ20%ของปรมาตร
รวมทงหมด(เชนใชloadingbuffer2.5µl+PCRproducts10µl)หยอดลงในหลม
เทยบกบ100bpladder
7.4.7 เปดเครองelectrophoresischamber
7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลาแลวนาเจลออกไปแชในสารละลายEtBr15–50นาทแลว
ลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท
7.4.9 บนทกภาพเจลภายใตแสงUV
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 ตวอยางทดสอบหลอดจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของ PCRproducts เทากบ positive
controlคอเทากบ118bpและผลของPCRcontrolsทงหมดใหผลตามระบในขอ9
8.2 การสรปผล:
8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง 2
sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9
8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sampleตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง
เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ
8.3 การรายงาน
8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวกใหรายงาน
NOS-terminator พบ/detected
8.3.2 ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน
NOS-terminator ไมพบ/notdetected
254
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทกครงททาPCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทาPCRเรยบรอยแลวผลของสารควบคมท
ถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ
9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก
9.2 extractionblankcontrol ตองใหผลเปนลบ
9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก
9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ
9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ
255
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
DMScF4009: Screeningmethodforthedetectionofgeneticallymodified
plant DNA :nptII (bymeans of Polymerase Chain
Reaction)
1. ขอบขาย(Scope)
ใชทดสอบหาดเอนเอของยนneomycinphosphotransferase(npt ll)ทมาจากE. coliK12
ซงสอดแทรกอยในชดของยนพชดดแปรพนธกรรมบางชนด วธทดสอบยน npt ll โดยใช
PolymeraseChainReaction(PCR)นสามารถใชตรวจสอบเบองตนวามการปะปนของพชดดแปร
พนธกรรมในอาหาร
2. เอกสารอางอง(Reference)
2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – General requirements and definitions
2.2 ISO21569:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods
2.3 ISO21571:2005(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically
modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction
3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)
-
4. หลกการ(Principle)
4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ
ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ
จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ
การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวน
ของตวอยางทใชทดสอบ
256
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช
เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotidetriphosphates(dNTP)
ในbufferเปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอนคอในสวน
ผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ
4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน
4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวท
เปนเปาหมาย
4.2.3 จาลองสายของprimersทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออกแลวทาใหยาวขนโดย
ใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม
4.3 การตรวจสอบและยนยนผล
สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR products สามารถตรวจสอบได
โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก
และจาแนกขนาดและอานผลโดยการยอมดวยEthidiumbromide ทจะเขาจบกบดเอนเอ
และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลตเทยบกบดเอนเอทรขนาดและ/
หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา
อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบส
ของ PCR productsสวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย
และการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน
5. สารเคม(Reagent)
5.1 WaterชนดPCRgrade
5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2ผสมอย)ความเขมขน10เทา
5.3 MgCl2solutionความเขมขน25mmol/l
5.4 dNTPsolutionความเขมขนของแตละnucleotideเทากบ5mM
257
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.5 Oligonucleotidesความเขมขนของแตละเสนเทากบ10µM
5.5.1 Forwardprimer:nptIIgene(GenBank®accessionNo.AF269238)
Primer-1APH2short:5'-CTCACCTTgCTCCTgCCgAgA-3'
5.5.2 Reverse primer:
Primer-2APH2reverse:5'-CgCCTTgAgCCTggCgAACAg-3'
5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR),5U/µl
5.7 AgaroseทเหมาะสมสาหรบการแยกขนาดดเอนเอของPCRproductsเปาหมาย
5.8 Boric acid (H3BO3)สาหรบเตรยมTBEbuffer
5.9 Bromophenol blue (C19H9Br4O5SNa)และ/หรอxylenecyanoleFF(C25H27N2O6S2Na)
5.10 ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของPCRproducts(เชนrestriction-
digested λ-PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder)
5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer
5.12 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2-EDTA)(C10H14N2O8Na2)
5.13Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l
5.14 Glycerol
5.15 Sodium acetate (C2H3O2Na)สาหรบเตรยมTAEbufferเทานน
5.16 Hydrochloricacid(HCl)=37%
5.17 Sodiumhydroxide(NaOH)
5.18 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)
5.19 TAEbuffersolution(1x)(Tris=0.050mol/l,Sodiumacetate=20mmol/l,Na2-EDTA
= 0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0 โดยใช glacial acetic acidหรอNaOH (ควรเตรยม
เปน50xแลวเจอจางเปน1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอdeionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
258
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
5.20 Tris/borate(TBE)buffersolution(0.5x)(Tris=0.055mol/l,boricacid=0.055mol/l,
Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยมเปน
10x แลวเจอจางเปน 1x กอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอ deionisedwater
ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)
5.21 Sample loading buffer solution (5x) (glycerol = 50%, bromophenol blue = 2.5 g/l
และ/หรอ xylene cyanol = 2.5 g/l) ละลายใน buffer ชนดเดยวกบทตองการใชงาน
(TAEorTBE)
5.22 Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l
ขอแนะนา:
5.22.1หลกเลยงการเตรยมโดยการชง EtBr ออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนา แตให
เตรยมโดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของEtBrหรอใชEtBrทเปนเมดเพอละลายนา
5.22.2ควรเตรยมเปน ethidiumbromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน
จากแสงท5C
6. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)
6.1 Thermal cycler
6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply โดยทวไปใชแรงดนไฟฟาท 5V/cm
(ระยะหางระหวางขวบวกและขวลบขนกบขนาดgeltray)
6.3 Ultraviolet(UV)trans-illuminatorทสามารถใหความยาวคลนท312nm.
6.4 Recordinginstrumentเชนphoto-documentหรอกลองCCD
7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)
7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)
เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยาPCRโดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด25ไมโครลตร
เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทnpt ll_1
259
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
De-ionizedwater(µl) ปรบใหไดปรมาตรรวม25
10 ×buffer+15mMMgCl2 1x
25 mM MgCl2 1.5 mM
5 mM dNTP 0.2 mM
10µMprimer-1 0.4µM
10µMprimer-2 0.4µM
5U/µlDNAtaqpolymerase 2U
Total(µl) 25
DNAtemplate(µl) 10–50ng
Reagent Final Concentration
ตาราง npt ll_1
7.2. สารควบคม(PCRcontrols)
7.2.1 positive extraction control
7.2.2 extraction blank control
7.2.3 positiveDNAtargetcontrol(สามารถใชMON863maize)
7.2.4 negative DNA target control
7.2.5 amplification reagent control
7.3 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-timeprogramme)
อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางnpt ll_2เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห
กบเครองGeneAmp® 2400หรอGeneAmp® 9600และใชเอนไซมAmpliTaqGold®
DNApolymeraseถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะห
ตามตองการ
260
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activatedDNA polymerase
อาจแตกตางไปตามแตละผผลตใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา
จากผผลต
7.4 ตรวจสอบPCRproducts
โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟาและยอมสดวยEtBr
7.4.1 ชง agarose ในปรมาณทเหมาะสม (0.8 – 1.0% ในดเอนเอทมขนาดใหญ แต
PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวาน และอาจสง
ไดถง4.0%)ละลายในbuffer(TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ
จากกระแสไฟฟา)
7.4.2 ละลายในmicrowaveหรอwaterbathเขยาใหเขากนโดยไมใหเกดฟอง
7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60 Cแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb
ทเหมาะสมกบปรมาณตวอยางททดสอบตงทงไวใหเยน(ใชเวลาประมาณ1ชวโมง)
เจลทเตรยมไมควรมความหนาเกน1เซนตเมตร
7.4.4 แกะcombออกและยกเจลไปวางในelectrophoresischamber
Activation/Initialdenature 10min/95C
Amplification 25s/95C
30s/62C
45s/72C
Number of cycles 35
Finalextension 7min/72C
Step Time/temp
ตาราง npt ll_2
261
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
7.4.5 เทbuffer(ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและloadingbuffer)ลงไปใหทวมเหนอเจล
2มลลเมตร
7.4.6 ผสมPCRproducts(5µlหรอ10µl)กบloadingbufferประมาณ20%ของปรมาตร
รวมทงหมด(เชนใชloadingbuffer2.5µl+PCRproducts10µl)หยอดลงในหลม
เทยบกบ100bpladder
7.4.7 เปดเครองelectrophoresischamber
7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลาแลวนาเจลออกไปแชในสารละลายEtBr15–50นาทแลว
ลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท
7.4.9 บนทกภาพเจลภายใตแสงUV
8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)
8.1 ตวอยางทดสอบหลอดจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของ PCRproducts เทากบ positive
controlคอเทากบ215bp(เมอใชเอนไซมตดจาเพาะชนดRsalตดชนสวนPCRproducts
จะไดชนสวนดเอนเอ2ขนาดคอ122และ93bp)และผลของPCRcontrolsทงหมดให
ผลตามระบในขอ9
8.2 การสรปผล:
8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง 2
sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9
8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sampleตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง
เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ
8.3 การรายงาน
8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวกใหรายงาน
npt II พบ/detected
8.3.2ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน
npt II ไมพบ/notdetected
262
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)
ทกครงททา PCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทา PCR เรยบรอยแลวผลของสารควบคม
ทถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ
9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก
9.2 extractionblankcontrol ตองใหผลเปนลบ
9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก
9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ
9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ
263
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
ภาคผนวก
รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหารเลมท1
วธมาตรฐานทางเคม
ท รหสวธ วธ
1 DMScF1001 การวเคราะหไนโตรเจนโดยKjeldahlmethod
2 DMScF1002 การวเคราะหปรมาณไขมนในนม
3 DMScF1003 การวเคราะหปรมาณไขมนในนมผงและผลตภณฑนมชนดผง
4 DMScF1004 การวเคราะหปรมาณไขมนในนมขนจดและนมขนหวาน
5 DMScF1005 การวเคราะหปรมาณไขมนในเนยแขง
6 DMScF1006 การวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในนมและผลตภณฑนม
7 DMScF1007 การวเคราะหของแขงทงหมดในนมขนหวาน
8 DMScF1008 การวเคราะหของแขงทงหมดในเนยแขง
9 DMScF1009 การวเคราะหเนอนมไมรวมไขมนในนมพรอมดมแลนมแปลงไขมน
10 DMScF1010 การวเคราะหเนอนมไมรวมไขมนในนมขนไมหวานและนมขนแปลง
ไขมนไมหวาน
11 DMScF1011 การวเคราะหปรมาณความชนในชา
12 DMScF1012 การวเคราะหปรมาณความชนในกาแฟ
13 DMScF1013 การวเคราะหปรมาณความชนในโกโกผง
14 DMScF1014 การวเคราะหปรมาณความชนในชาสมนไพร
15 DMScF1015 การวเคราะหปรมาณเถาทงหมดและเถาทละลายนาไดในชา
16 DMScF1016 การวเคราะหปรมาณเถาและเถาทละลายนาไดในกาแฟคว
17 DMScF1017 การวเคราะหปรมาณสารทสกดไดดวยนารอนในชา
18 DMScF1018 การวเคราะหปรมาณเอทานอลในเครองดมพรอมบรโภคจากพชผกผลไม
19 DMScF1019 การวเคราะหปรมาณอะซซลเฟม-เค,แอสพาแทมและซคคารนในอาหาร
20 DMScF1020 การวเคราะหปรมาณโซเดยมซยคลาเมตในอาหาร
21 DMScF1021 การวเคราะหปรมาณตะกวแคดเมยมทองแดงเหลกและสงกะสในอาหาร
22 DMScF1022 การวเคราะหปรมาณดบกในอาหารกระปอง
23 DMScF1023 การวเคราะหปรมาณอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง
24 DMScF1024 การวเคราะหปรมาณอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง
264
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
วธมาตรฐานทางจลชววทยา
1 DMScF2001 วธตรวจวเคราะหBacillus cereusในอาหาร
2 DMScF2002 วธตรวจวเคราะห Clostridium perfringensในอาหาร
3 DMScF2003 วธตรวจวเคราะหListeriaspp.และ Listeria monocytogenes ในอาหาร
4 DMScF2004 วธตรวจวเคราะห Salmonellaspp.ในอาหาร
5 DMScF2005 วธตรวจวเคราะห Salmonellaspp.ในนาและนาแขง
6 DMScF2006 วธตรวจวเคราะหStaphylococcus aureus ในอาหาร
7 DMScF2007 วธตรวจวเคราะหStaphylococcus aureusในนาและนาแขง
8 DMScF2008 วธตรวจวเคราะหCronobacter sakazakii ในนมและผลตภณฑนม
ท รหสวธ วธ
265
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหารเลมท2
วธมาตรฐานทางเคม
ท รหสวธ วธ
1 DMScF1025 การวเคราะหปรมาณสารทงหมดในนา
2 DMScF1026 การวเคราะหปรมาณความกระดางทงหมดในนา
3 DMScF1027 การวเคราะหปรมาณไขมนในไอศกรม
4 DMScF1028 การวเคราะหปรมาณไนโตรเจนในไอศกรมโดยKjeldahlmethod
5 DMScF1029 การวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในไอศกรม
6 DMScF1030 การวเคราะหปรมาณกรดซตรกในเครองดม
7 DMScF1031 การวเคราะหปรมาณไนไตรตและไนเตรตในผลตภณฑเนอสตว
8 DMScF1032 การวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหยอาหารจาลอง
9 DMScF1033 การวเคราะหปรมาณบสฟนอลเอ(BisphenolA;2,2-bis(4-hydroxy
phenylpropane)ทแพรลงสอาหารจาลอง
10 DMScF1034 การวเคราะหปรมาณ4,4'-Dichlorodiphenylsulfoneทแพรลงสอาหาร
จาลอง
11 DMScF1035 การวเคราะหปรมาณ4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneทแพรลงส
อาหารจาลอง
12 DMScF1036 การวเคราะหปรมาณฟอรมาลดไฮด (Formaldehyde) ทแพรจาก
ผลตภณฑยาง
13 DMScF1037 การวเคราะหปรมาณสงกะสทแพรจากผลตภณฑยาง
14 DMScF1038 การวเคราะหปรมาณN-NitrosaminesและN-Nitrosatablesubstances
ทแพรจากหวนมยาง
15 DMScF1039 การวเคราะหปรมาณสารทระเหยไดในหวนมยางสงเคราะห
16 DMScF1040 การวเคราะหปรมาณ2-Mercaptobenzothiazole(MBT)ทแพรออกมา
จากผลตภณฑvalcanisedrubber
17 DMScF1041 การวเคราะหปรมาณ 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol
(AntioxidantBHT)และ2,2'-Methylethylenebis(6-(1,1-dimethyl
ethyl)-4-methyl-phenol) (Antioxidant 2246) ทแพรออกมาจาก
ผลตภณฑvalcanisedrubber
266
วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย
1 DMScF2009 วธตรวจวเคราะหยสตและราในอาหารโดยวธpourplateและspread
plate
2 DMScF2010 วธตรวจวเคราะหVibriocholeraeในอาหาร
3 DMScF2011 วธตรวจวเคราะหVibrioparahaemolyticusในอาหาร
4 DMScF2012 วธตรวจวเคราะหVibrioparahaemolyticusในอาหารโดยวธMPN
5 DMScF2013 วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในอาหาร
โดยวธpourplate
6 DMScF2014 วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในนาและ
นาแขงโดยวธpourplateและspreadplate
วธมาตรฐานทางกายภาพ
ท รหสวธ วธ
วธมาตรฐานทางจลชววทยา
ท รหสวธ วธ
1 DMScF3001 การวเคราะหนาหนกสทธและนาหนกเนอในผกกระปอง
2 DMScF3002 การวเคราะหปรมาณนาอสระในผกกระปอง