NU Science Journal 2011; 7(2): 30 - 44
การพฒนาวธการหาปรมาณโปรตนในน ายางพาราโดยใช เครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทไดออกแบบขน
ปรญญา มาสวสด* และ ยทธพงษ อดแนน
Development of Protein Assay in Natural Rubber Latex by the Designed Spectropantonometer
Prinya Masawat* and Yuthpong Udnan
ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร จงหวดพษณโลก 65000 ภาควชาเคม และศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล
*Corresponding author. E-mail: [email protected]
บทคดยอ
ในงานวจยนไดพฒนาวธการวเคราะหโปรตนในน ายางพารา โดยใชวธการทาใหเกดสดวย
วธเลาร เปรยบเทยบกบวธไบยเรต กอนนาไปตรวจวดดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทไดออกแบบและสรางขน ซงสารสทเกดขนจะมความเขมทแปรผกผนกบความเขมขนของปรมาณโปรตนทมในน ายาง โดยพบวาการวเคราะหโปรตนในน ายางพาราซงมลกษณะเปนคอลลอยดสามารถวเคราะหไดโดยตรง โดยไมตองตกตะกอนกอน ดงนนการวเคราะหโปรตนในน ายางพาราดวยวธน จงสามารถวเคราะหสแลวเทยบกลบไปเปนความเขมขนของโปรตนไดโดยตรง จากการทดลองพบวา ปรมาณของโปรตนในน ายางพารามคาเทากบ 0.037 และ 0.044 % โดยน าหนกตอปรมาตรดวยวธการทาใหเกดสแบบเลารและไบยเรตตามลาดบ ซงวธการทาใหเกดสทงสองวธใหผลไมแตกตางกนอยางมนยสาคญทระดบความเชอมน 95% ค ำส ำคญ : นายางพารา โปรตน วธเลาร วธไบยเรต
NU Science Journal 2011; 7(2) 31
Abstract
In this research, protein assay in natural rubber latex (NRL) was developed by using Lowry and Biuret methods for color developing followed by analysis with a laboratory designed and fabricated spectropantonometer. It was found that the developed method could directly be used to quantify colloidal protein in latex without precipitation and preconcentration. Therefore, this protein assay could directly be used to detect the intensity of the color developed proportional to the concentrations of protein in natural rubber latex. From the experiment, the proteins found in natural rubber are 0.037 and 0.044 %w/v by Lowry and Biuret methods, respectively. The results obtained from both color developing methods are not significantly different at 95 % confidence limit.
Keywords: natural rubber latex, protein, Lowry method, Biuret method
บทน า
ในปจจบนประเทศไทยเปนประเทศทผลตยางพาราเปนอนดบหนงของโลก จากรายงาน การประเมนของสานกงานเศรษฐกจการเกษตรพบวา มผลผลต 32% ของโลกในป 2552 ซงหนวยงาน IRSG (International Rubber Study Group) รายงานวา ความตองการใชผลผลตยางมเพมขน 11.8% ในป 2553 (สกว., 2553) ดงนน ยางพาราจงเปนพชทมความสาคญทางเศรษฐกจ สามารถนารายไดเขาสประเทศไดมากอกชนดหนง ซงในน ายางพาราน น ประกอบดวยอนภาคทเปนไฮโดรคารบอน 30-40 % แขวนลอยอยในเซรม และยงมสวนทไมใชยางอก 2-3 % เชน โปรตน ไขมน คารโบไฮเดรต น าตาล โลหะ และน า ซงในงานวจยนจะเนนถงความสาคญของโปรตนทมอยในน ายางพารา เพราะน ายางพาราซงมโปรตนเปนองคประกอบ กอใหเกดการตกคางของโปรตนในผลตภณฑบางชนด ทาใหเกดอาการแพตามผวหนงสาหรบผทแพโปรตน พบวาโปรตนททาใหเกดอาการแพกบผทสมผสยาง จะมน าหนกโมเลกลอยในชวง 14-30 kD (วราภรณ ขจรไชยกล, 2549) จากการคนควางานวจย ทเกยวกบการหาปรมาณโปรตนในน ายางพารา (NRL proteins) โปรตนแอนตเจน (antigenic proteins) และ โปรตนทกอใหเกดอาการแพ (allergenic proteins) พบวา วธวเคราะหทางภมค มกนวทยา (immunologic method) จะใชเทคนค ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)เปนวธมาตรฐาน สาหรบวเคราะหโปรตนแอนตเจน ซงจะใชแทนปรมาณโปรตนรวมทอาจจะกอใหเกดอาการแพได โดยเปนเทคนคทใหความไวในการวเคราะหสง แตมขอเสยคอ ตองใชตวอยางเปนเซรมของมนษย (human serum) ซงไมสามารถ standardized ได (Tomazic-Jezic et al., 2002; Beezhold, et al., 2002)
NU Science Journal 2011; 7(2) 32
สาหรบการวเคราะหทางเคมเพอหาปรมาณโปรตนในน ายางพารา มวธมาตรฐาน คอวธ เลารดดแปร (Modified Lowry method) ซงเปนวธมาตรฐานสาหรบใชในการหาปรมาณโปรตนทสามารถสกด และละลายน าไดในน ายางและผลตภณฑทไดจากน ายาง (ASTM D5712-05, 2005) โดยโปรตนทละลายน าจะถกสกดในสารละลายบฟเฟอร จากนนทาการตกตะกอนเพอเพมความเขมขน และเพอทาการแยกโปรตนออกจากสารอนๆ ทละลายน าไดซงอาจจะรบกวนการวเคราะห แลวจงนาโปรตนทตกตะกอนไดมาละลายอกครง กอนทาการวเคราะหสดวยวธเลารดดแปรซงเทยบกบสารมาตรฐานโปรตน พบวา วธมาตรฐานนมขนตอนยงยาก เสยเวลาและคาใชจายมาก (Yeang et al., 1995; Siler and Cornish, 1995) ดงนนคณะผวจยจงไดทาการพฒนาวธการวเคราะหปรมาณโปรตนในน ายางพารา ซงจะเปนการวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยตรงในน ายาง โดยอาศย charge-coupled devices (CCD) camera (WebCam) เปนเครองตรวจวด ซงจะทาการถายภาพสดจตอลทเกดจากการฟอรมสของโปรตนในน ายางพาราดวยวธเลาร (ดรณ วชราเรองวทย, 2544; ดารตน ไชยวาร และคณะ, 2552) และวธไบยเรต (สพรรษา หนทอง และคณะ, 2551) แลวจงอานคาสในระบบ red green and blue (RGB) โดยอาศยความสมพนธทวา คาความเขมสทเกดจากการกระเจงแสง (scattering intensity) ทเกดขน และคาสในระบบ RGB จะแปรผนกบคาความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา ซงจากเอกสารงานวจยทเกยวของกบการใช WebCam เปนเครองตรวจวดนนยงไมมงานวจยใดประยกตใชวธการนในการหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราเลย (Maleki et al., 2004; Gaiao et al., 2006; Chuan-Xiao et al., 2007; Wongwilai et al., 2010)
อปกรณ สารเคมและวธการทดลอง
1. Spectropantonometer เครองตรวจวดปรมาณโปรตนในน ายางธรรมชาตดวยวธวดคาความเขมของการกระเจงแสง (Spectropantonometer) ทไดออกแบบและสรางขนน มวตถประสงคเพอทาใหการวเคราะหปรมาณโปรตนในน ายางธรรมชาตเปนวธทงาย รวดเรว และเครองมอยงสามารถเคลอนยายไดสะดวก สาหรบวธการทจะไดพฒนาขนน เปนการวดปรมาณ Total Reactive Protein ในตวอยางคอลลอยด โดยใชหลอดไดโอดแปลงแสงสขาว (LED) เปนแหลงกาเนดแสงขาวทตงฉากกบตวอยาง และวดแสงทกระเจงจากตวอยางทมการฟอรมสกบสารเกดส เชน ไบยเรต เลาร หรอ แบรดฟอรด รเอเจนต เพอใหไดสารสทสามารถกระเจงแสงไดในระบบคอลลอยด โดยไมจาเปนทจะตองนามาทาใหเปนสารละลายใส และในระบบคอลลอยด เมอสารไดผสมกนอยางสมบรณ อนภาคของคอลลอยดนนจะเคลอนทแบบบราวเนยน และแพรกระจายสทกพนทของภาชนะจงสามารถอนมานไดวา ทกสวนของภาชนะนนมความเขมขนของสารละลายและอนภาคของคอลลอยดอยางละเทา ๆ กน ในการสบคนสทธบตร
NU Science Journal 2011; 7(2) 33
ทงในประเทศและตางประเทศ พบวา มการใชระบบนเพยงแตในการวดสของตวอยางในระบบ L*a*b เทานน ยงไมมการใชระบบ RGB สหสมพนธแบบพห (Multiple Regression) ในการหาปรมาณของตวอยางสารละลายใด ๆ เลย มเพยงการประยกตใช RGB model ในการวเคราะหภาพถายดาวเทยมในแบนดตางๆ เทานน (photogrammetry) ดงนนเครองทสรางขนจงเปนเครองแรกทไดมการประยกตใช RGB model ในการหาปรมาณของโปรตนในน ายางธรรมชาต (อยในระหวางดาเนนการขอจด อนสทธบตร)
รป 1 การจดอปกรณของเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทออกแบบและสรางขน ตามรป 1 เปนภาพแสดงองคประกอบของเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงซงประกอบดวย กลองควบคมแสงจากภายนอกซงครอบคลมในสวนของหลอดไดโอดแปลงแสงสขาว (super bright LED) ทาหนาทเปนแหลงกาเนดแสงทสองแสงขาวตงฉากกบสารตวอยางซงคอน ายางพาราทผานการทาใหเกดสกบสารสเชนสารละลายไบยเรตแลวบรรจอยในเซลลใสสารตวอยาง (sample cell) ซงเปน polystyrene cuvette ขนาด 4 มลลลตร โดยมกลองถายวดโอขนาดจว (WebCam) ทาหนาทถายภาพดวยโปรแกรม JPEG PC Camera (China camera Manufacturers, China) และสงขอมลแสงสไปยงเครองคอมพวเตอรโนตบค จากนนใชโปรแกรม Color detector version 1.0 (Cosmin software) ในการอานคาสของตวอยางทระดบโปรตนตางๆ หลงจากทาการฟอรมสกบสารใหสแลวในระบบ RGB จากนนเกบเมตรกซสและความเขมขนไวในตาราง แลวนาคาจากตารางมาสรางกราฟดวยวธ Multiple Regression เพอหาความสมพนธระหวางระดบความเขมของส และปรมาณโปรตน แลวคานวณออกมาเปนปรมาณโปรตนในน ายางพาราไดตอไป ซงวธการคานวณหา
NU Science Journal 2011; 7(2) 34
ความเขมขนของโปรตนโดยใชวธการสรางกราฟมาตรฐานดวยวธ Multiple Regression สามารถแสดงไดดงตาราง 1 และ 2 ดงน
ตาราง 1 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารละลายมาตรฐานโปรตน (Albumin) และ ความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB (เตรยมสารโดยวธเตมสารมาตรฐาน)
ความเขมขนของสารละลาย Albumin
(ppm)
ความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB
R G B
40 115 119 122 80 96 103 111 120 91 98 106 160 91 105 108 200 77 84 94
ตาราง 2 การใสขอมลในโปรแกรม Excel เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐานดวยวธ Multiple Regression
แกน x แกน y แกน x แกน y
40 115 120 106
40 119 160 91
40 122 160 105
80 96 160 108
80 103 200 77
80 111 200 84
120 91 200 94
120 98
NU Science Journal 2011; 7(2) 35
นาขอมลทไดจากตาราง 2 มาสรางกราฟโดยใชโปรแกรม Excel จะไดกราฟเสนตรงดงรป 2และสมการเสนตรงรวมของ RGB จากนนนาสมการทไดมาคานวณหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราไดโดยการแทนคา y = 0 เนองจากใชวธการเตรยมสารละลายเพอทากราฟมาตรฐานแบบวธเตมสารมาตรฐาน เมอแทนคา y = 0 จะไดคา x ออกมา ซงคอความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราในหนวย ppm และ สามารถคานวณเปน % w/v ไดตอไป
รป 2 ความสมพนธระหวางความเขมขนของสารละลายโปรตนมาตรฐานกบความเขมของสในระบบ RGB
2. สารเคม อปกรณ และวธการทดลอง 2.1 วธการท าใหเกดสแบบไบยเรต (สพรรษา หนทอง และคณะ, 2551)
สารละลายไบยเรตประกอบดวย สารละลาย 0.5% w/v คอปเปอรซลเฟต (CuSO4) และ 10% w/vโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ซงสามารถเตรยมไดดงน ละลาย CuSO4 (99.5%, AR grade, Merck, Germany) 0.5 กรม ดวยน าปราศจากไอออน แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน จะไดสารละลาย 0.5% w/v CuSO4 ละลาย NaOH (99%, AR grade, Merck, Germany) 10 กรม ดวยน าปราศจากไอออน แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน จะไดสารละลาย 10% w/v NaOH
NU Science Journal 2011; 7(2) 36
การเตรยมสารละลายเพอท ากราฟมาตรฐานโดยวธเตมสารมาตรฐาน stock solution : สารละลาย 200 ppm Albumin ปรมาตร 500 มลลลตรซงเตรยมไดโดยการ
ชง Albumin (Albumin from hen egg white, Fluka Biochemika, Netherland) มา 0.1000 กรม แลวปรบปรมาตรเปน 500 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออน จากนนเตรยม Albumin เขมขน 40, 80, 120, 160 และ 200 ppm ตามลาดบ เตรยมโดยปเปต stock solution มา 20, 40, 60, 80 และ 100 มลลลตร แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตร ดวยน าปราศจากไอออนตามลาดบ
จากนนนาสารละลาย Albumin ทความเขมขนตางๆ มาอยางละ 10 มลลลตร มาทาการเตมน ายางพารา (น ายางขนชนดแอมโมเนยสง) 0.06 มลลลตร เขยาใหเขากน แลวนาไปหมนเหวยงเปนเวลา 20 นาท เพอไลแอมโมเนยออกจากน ายางขนชนดแอมโมเนยสง จากนนทาการเตมสารละลายไบยเรต คอ 0.5% w/v CuSO4 1 มลลลตร และ 10% w/v NaOH 1 มลลลตร เขยาใหเขากน ตงทงไว 5 นาท นาไปวด คาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครอง Spectropantonometer ทออกแบบและสรางขน
2.2 วธการท าใหเกดสแบบเลาร (ดรณ วชราเรองวทย, 2544; ดารตน ไชยวาร และคณะ, 2552)
สารละลาย 3% w/v โซเดยมซเตรท (Na3(C6H5O7)) เตรยมโดยการชง Na3(C6H5O7) (Nutritional Products Ltd., Switzerland) มา 3 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร
สารละลาย A คอ สารละลาย 6 % w/v โซเดยมคารบอเนต (Na2CO3) ซงเตรยมโดย การชง Na2CO3 (AR grade, Merck, Germany) มา 6 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร
สารละลาย B คอ สารละลาย 1.5 % w/v CuSO4 (99.5%, AR grade, Merck,Germany) ซงเตรยมโดยการชง CuSO4 มา 1.5 กรมละลายในสารละลาย 3% w/v Na3(C6H5O7) เปน 100 มลลลตร สารละลาย C เตรยมโดยใชสารละลาย A ปรมาตร 50 มลลลตร ผสมกบสารละลาย B ปรมาตร 1 มลลลตร ซงตองเตรยมใหมทกครงกอนทาการวเคราะห
สารละลาย D คอ 72 % w/v Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, Switzerland) เตรยมโดยปเปตสารละลาย Folin-Ciocalteu มา 3.6 มลลลตร แลวปรบปรมาตรดวยน าปราศจากไอออน เปน 5 มลลลตร
สารละลาย 5% w/v กรดไตรคลอโรอะซตก (TCA) เตรยมโดยการชง TCA (C2HCl3O2, 95.5%, Sigma-Aldrich, Germany) มา 5 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร
NU Science Journal 2011; 7(2) 37
สารละลาย 0.2% w/v กรดฟอสโฟทงสตก (PTA) เตรยมโดยการชง PTA (H3O40PW12, Fluka, Switzerland) มา 0.2 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร สารละลาย 0.2 M NaOH เตรยมโดยการชง NaOH (99.9%, AR grade, Merck, Germany) มา 0.8 กรม ละลายในน าปราศจากไอออนเปน 100 มลลลตร
การเตรยมสารละลายเพอท ากราฟมาตรฐานโดยวธเตมสารมาตรฐาน นาสารละลาย Albumin ทความเขมขนตางๆ มาอยางละ 10 มลลลตร มาทาการเตมน ายางพารา (น ายางขนชนดแอมโมเนยสง) 0.06 มลลลตร เขยาใหเขากน นาสารละลายทไดมา 6 มลลลตรแลวทาการเตมสารละลาย 5% TCA 1 มลลลตร จากนนนาเขาเครองอลตราโซนคเปน เวลา 2 นาท แลวนามาเตม 0.2% PTA 1 มลลลตร นาเขาเครองอลตราโซนคตออก 2 นาท กอนนาไปหมนเหวยงเปนเวลา 30 นาท แลวจงเตมสารละลาย 0.2 M NaOH 2 มลลลตร เขยาและตงทงไว 20 นาท จากนนเตมสารละลาย C 0.6 มลลลตร เขยาใหเขากน ตงทงไว 10 นาท แลวเตมสารละลาย D 0.2 มลลลตร เขยาใหเขากน ตงทงไวอก 10 นาท เพอใหเกดสน าเงนอยางสมบรณ จากนนจงนาไปวดคาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง ทออกแบบและสรางขน
3. ผลการทดลอง และการวจารณ 3.1 การทดสอบหาความสมพนธของโปรตนในตวอยางสารคอลลอยดกบความเขมของ
สในระบบ RGB เนองจากตวอยางน ายางพารามลกษณะเปนสารคอลลอยด ซงไมสามารถวดคาการ
ดดกลนแสงไดโดยตรง เพราะอนภาคของคอลลอยดขดขวางการสองผานของแหลงกาเนดแสง แมวาจะมโครโมฟอร (chromophore) บางชนดทสามารถทาปฏกรยากบสารตวอยางแลวเกดสารสทมความเขมทแปรผนกบความเขมขนของสารเคมททาปฏกรยานน ๆ กตาม สารสทมความเขมของสแปรผนกบความเขมขนของสารทตองการวเคราะห สามารถวเคราะหเทยบความเขมของสกลบไปเปนความเขมขนของสารทตองการวเคราะหในตวอยางนนได ไดแก ระบบ RGB (Red, Green, Blue) และระบบ CMYK (Cyan, Magenta, Yellow, Black) บางระบบ ใชคา L, a, b หรอ L, a*, b
ดงนนจงไดทาการทดลองหาความสมพนธของความเขมขนของโปรตนในตวอยางสารคอลลอยดกบความเขมของสในระบบ RGB โดยใชตวอยางสารคอลลอยดคอ สบซงเตรยม โดยการชงเนอสบ (สขาว) 0.5 กรม ละลายเนอสบในน าปราศจากไอออนปรมาตร 500 มลลลตรบน Hot plate จากนนเตมน ามนพช (มรกต,น ามนปาลมบรสทธ 100%) 0.1 มลลลตร คนจนละลาย เปนสารละลายคอลลอยด ทงใหเยนทอณหภมหอง
NU Science Journal 2011; 7(2) 38
จากนนทาการชงสารมาตรฐานโปรตน (Albumin) 1, 2, 3, 4 และ 5 มลลกรมตามลาดบ แลวปรบปรมาตรเปน 100 มลลลตรดวยสารละลายคอลลอยดทเตรยมขน ทาการเตมสารละลายไบยเรต คอ 0.5% CuSO4 และ 10% NaOH อยางละ 2 มลลลตร จะไดความเขมของสทแตกตางกนไปขนอยกบความเขมขนของปรมาณโปรตนทมอย แลวนาไปวดคาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทออกแบบและสรางขน แลวทาการสรางกราฟความสมพนธระหวางคาความเขมสในระบบ RGB กบคาความเขมขนของโปรตน จากการทดลองพบวาไดกราฟท มความชนเปนลบเหมอนรป 2 (ไดทาการทดลองซ า 10 ครง) จงทาใหสามารถสรปไดวา โปรตนในสารละลายคอลลอยดสามารถทาใหเกดสกบสารละลายไบยเรต แลวใหสารสมวงทม ความเขมของสแปรผกผนกบความเขมขนของปรมาณของโปรตนทมอยในสารละลายคอลลอยด ทาใหการวเคราะหโปรตนสามารถทาไดโดยตรงจากตวอยางทมลกษณะเปนคอลลอยด โดยไมตองตกตะกอนโปรตนออกมากอน ดงนนวธทพฒนาขนนมความสามารถในการวเคราะหส แลวเทยบกลบไปเปนความเขมขนของปรมาณโปรตนไดโดยตรง โดยการแทนคาในสมการเสนตรงดงทไดอธบายขางตน
3.2 การทดสอบหาชวงความเขมขนของน ายางพาราทเหมาะสม ไดทาการเตรยมน ายางพารา 2 ชวงความเขมขน คอ 0.01-0.05 %v/v (ใชน ายางพาราปรมาตร 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 และ 0.05 มลลลตรตามลาดบ เจอจางดวยน าปราศจากไอออนเปน 10 มลลลตร) และ 0.04-0.08 %v/v (ใชน ายางพาราปรมาตร 0.04, 0.05, 0.06, 0.07 และ 0.08 มลลลตรตามลาดบ เจอจางดวยน าปราศจากไอออนเปน 10 มลลลตร) แลวนาไปเขาเครองเหวยงเปนเวลา 40 นาท จากนนเตมสารละลายไบยเรต คอ 0.5% CuSO4 1 มลลลตร และ 10% NaOH 1 มลลลตร ตงทงไว 5 นาท แลวนาไปวดคาความเขมของการกระเจงแสงในระบบ RGB ดวยเครอง วดคาความเขมของการกระเจงแสง ไดผลการทดลองดงตาราง 3-4 และรป 3-4 ตาราง 3 คาความเขมของสในระบบ RGB โดยใชปรมาตรน ายางพารา 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 และ 0.05 มลลลตร ตามลาดบ
ความเขมขนของน ายาง (%v/v)
ความเขมของสในระบบ RGB R G B
0.01 81 91 141 0.02 75 77 134 0.03 61 73 115 0.04 55 57 98 0.05 50 50 94
NU Science Journal 2011; 7(2) 39
รป 3 ความสมพนธระหวางความเขมขนของน ายางพารากบความเขมของสในระบบ RGB โดยใชน ายางปรมาตร 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 และ 0.05 มลลลตร ตามลาดบ ตาราง 4 คาความเขมของสในระบบ RGB โดยใชปรมาตรน ายางพารา 0.04, 0.05, 0.06, 0.07 และ 0.08 มลลลตร ตามลาดบ
ความเขมขนของน ายาง (%v/v)
ความเขมของสในระบบ RGB R G B
0.04 108 118 154 0.05 93 112 144 0.06 82 105 130 0.07 73 75 124 0.08 59 68 111
NU Science Journal 2011; 7(2) 40
รป 4 ความสมพนธระหวางความเขมขนของน ายางพารากบความเขมของสในระบบ RGB
โดยใชน ายางปรมาตร 0.04, 0.05, 0.06, 0.07 และ 0.08 มลลลตร ตามลาดบ
จากผลการทดลองพบวา กราฟในรป 3-4 มความชนเปนลบ แสดงใหเหนวาคาความเขมสในระบบ RGB แปรผกผนกบความเขมขนของน ายางพารา (สทตามองเหนดเขมขนเมอความเขมขนของน ายางพาราเพมขนแตคาความเขมสในระบบ RGB กลบลดลงตามความเขมขนของน ายางพารา) ไดความสมพนธเปนสมการเสนตรงดงลงซงมคาความเปนเสนตรง (r2) มากกวา 0.9 ทงสองชวง ความเขมขน แตเราจะเลอกชวงความเขมขนของน ายางพาราเทากบ 0.04-0.08 %v/v สาหรบ การวเคราะหในขนตอนตอไปเนองจากใหคาความเปนเสนตรงดกวาชวงความเขมขน 0.01-0.05 %v/v และไดทาการทดลองซ าแบบเดมอก 5 ซ า กใหผลในทานองเดยวกน โดยในการทดลองเพอ หาความเขมขน ของโปรตนในน ายางพาราดวยวธการทาใหเกดสแบบไบยเรตและเลาร ไดเลอกความเขมขนของน ายางซงเปนคากลางของความเขมขนทเหมาะสม (0.04-0.08 %v/v) คอ เทากบ 0.06 %v/v เนองจากเมอทดลองทาใหเกดสดวยทงสองวธจะสงเกตสไดชดเจนและใชน ายางไมมากหรอนอยเกนไป (ดารตน ไชยวาร และคณะ, 2552) 3.3 การวเคราะหหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา
เมอทราบความสมพนธของโปรตนในตวอยางสารคอลลอยดกบความเขมของส ในระบบ RGB และไดเลอกความเขมขนของน ายางพาราแลวกไดทาการทดลองดงหวขอ 2.1 และ 2.2 ซงวเคราะหหาปรมาณของโปรตนในตวอยางน ายางพาราขนชนดแอมโมเนยสงดวยวธการทาใหเกด ส
NU Science Journal 2011; 7(2) 41
แบบไบยเรตและเลารโดยวธการเตมสารมาตรฐาน (standard addition method) และใชวธการสรางกราฟมาตรฐานดวยวธ Multiple Regression ดงทไดอธบายขางตนซงกราฟทไดจะมลกษณะดงรป 2 คอเปนเสนตรงเสนเดยวทเกดจากการรวมกนของเสนตรง 3 เสนของความสมพนธระหวางคาความเขมขนของโปรตนและคาความเขมสอาร จ และ บ โดยไดทาการทดลองทงหมด 7 ครงทงการทาใหเกดสดวยวธไบยเรตและวธเลาร ไดแสดงสมการของทง 7 ครงดงตาราง 5 และแสดงผลความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราทไดจากการแทนคา y = 0 ในสมการในตาราง 5 ไดผลดงตาราง 6 ตาราง 5 สมการรวมแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของสารละลายโปรตนมาตรฐานกบ ความเขมของสในระบบ RGB ดวยวธไบยเรตและวธเลาร
ครงท
สมการเสนตรงทใชในการคานวณหา ความเขมขนของโปรตนจากวธ Multiple Regression
วธไบยเรต วธเลาร 1 y = -2600x + 115.6
r2 = 0.996 y = -2675x + 93.3
r2 = 0.998 2 y = -2575x + 116.5
r2 = 0.984 y = -3000x + 107.4
r2 = 0.984 3 y = -1040x + 136.8
r2 = 0.994 y = -1050x + 134.8
r2 = 0.999 4 y = -1100x + 148.8
r2 = 0.999 y = -1110x + 129.8
r2 = 0.994 5 y = -1050x + 145.4
r2 = 0.992 y = -1210x + 147.0
r2 = 0.995 6 y = -1080x + 135.2
r2 = 0.997 y = -1500x + 173.4
r2 = 0.989 7 y = -950x + 119.4
r2 = 0.997 y = -1040x + 154.2
r2 = 0.998
NU Science Journal 2011; 7(2) 42
ตาราง 6 ความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราซงไดจากการทาใหเกดสดวยวธไบยเรต และวธเลาร กอนตรวจวดดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง
ครงท
ปรมาณของโปรตนในน ายางพารา (%โดยน าหนกตอปรมาตร)
วธไบยเรต วธเลาร 1 0.045 0.035 2 0.045 0.036 3 0.041 0.039 4 0.042 0.035 5 0.043 0.037 6 0.045 0.038 7 0.047 0.038
คาเฉลย 0.044 0.037
S.D. 0.0021 0.0016
%RSD 4.7 4.3
สรปผลการทดลอง ในงานวจยนไดทาการวเคราะหหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา ซงใชวธทาใหเกดสตามวธการของเลารและไบยเรต แลวจงทาการตรวจวดดวยเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสงทไดออกแบบและสรางขนโดยมไดโอดสขาวเปนแหลงกาเนดแสง เมอเรานาน ายางพาราทเจอจาง ใสลงในเครองและใช WebCam ถายภาพสดจตอลกอนทาการตรวจวดคาความเขมของสในระบบ RGB แลวจงทาการแปลงคาความเขมของสเปนคาตวเลข พบวาเมอสงเกตดวยตาเปลา สของสารละลายทเกดขนจะเขมขนตามความเขมขนของโปรตนทเพมขน แตเมอทาการตรวจวดคาส ในระบบ RGB แลวทาการสรางกราฟความสมพนธระหวางคาสในระบบ RGB กบคาความเขมขน ของโปรตนพบวาไดกราฟทมความชนเปนลบแสดงวา คาสในระบบ RGB แปรผกผนกบความเขมขนของโปรตนในน ายางพารา จากนนนาผลการทดลองจากวธการทาใหเกดสทงสองวธมาเปรยบเทยบกนโดยใช paired t-test (Miller et al., 1993) พบวาสามารถใชการทาใหเกดสทงสองวธในการวเคราะหหาปรมาณโปรตนในน ายางพาราได โดยวธการทาใหเกดสทงสองวธใหผลทไมแตกตางกนอยาง มนยสาคญ ทระดบความเชอมน 95% แตวธการทาใหเกดสแบบไบยเรตมขอดทเหนอกวาวธการทาให
NU Science Journal 2011; 7(2) 43
เกดสแบบเลาร คอ สามารถทาไดสะดวก รวดเรว เตรยมตวอยางไดงาย ใชสารเคมในปรมาณ ทนอยกวา และประหยดคาใชจายมากกวา ดงนนวธการทาใหเกดสแบบไบยเรต จงนาจะเหมาะสมสาหรบนาไปวเคราะหหาความเขมขนของโปรตนในน ายางพาราไดเปนอยางดตอไป เมอนาน ายางพารามาวเคราะหหาปรมาณโปรตนโดยใชวธมาตรฐาน คอวธเลารดดแปร (Modified Lowry method; ASTM D5712-05, 2005) ซงสงไปใหสวนอตสาหกรรมยาง สถาบนวจยยาง กรมวชาการเกษตร กรงเทพมหานคร เปนผทดสอบ พบวาน ายางพารามปรมาณโปรตนเทากบ 0.046 %โดยน าหนกตอปรมาตร เมอเปรยบเทยบกบวธทเราไดพฒนาขนโดยใชเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง ทไดสรางขนในหองปฏบตการนโดยใช paired t-test (Miller et al., 1993) พบวาใหคาไมแตกตางกนอยางมนยสาคญ ทระดบความเชอมน 95% ดงนนวธการทไดพฒนาขนนจงใหผลการทดลองทเชอถอได อกทงเปนวธทงาย สะดวก รวดเรวกวาวธมาตรฐานมาก กตตกรรมประกาศ ขอขอบคณ ดร.ช.วยากรณ เพชญไพศษฏ นายศภโชค อปาล นางสาวชตมา สารมย และนางสาวพรชนก พนทอง ทชวยใหงานวจยนสาเรจลลวงดวยด ขอขอบคณภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวรทใหความอนเคราะหทาง ดานเครองมอและอปกรณรวมทงเงนทนสนบสนนงานวจยนบางสวน ขอขอบคณมหาวทยาลยนเรศวรทใหเงนทนสนบสนนงานวจยจากงบประมาณแผนดน ประจาป 2553 งานวจยนไดรบการสนบสนนจากศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม (PERCH-CIC) สานกงานคณะกรรมการการอดมศกษา กระทรวงศกษาธการ เอกสารอางอง ดรณ วชราเรองวทย. (2544). การศกษาหาปรมาณโปรตนทละลายน าจากถงมอยางทางการแพทยและ
เทคนคการลดปรมาณโปรตนทละลายน า. กลมงานเทคโนโลยผลตภณฑ 1 กองฟสกสและวศวกรรม กรมวทยาศาสตรบรการ. กรงเทพมหานคร.
ดารตน ไชยวาร นษยา วงษเกดชวน และ ปรญญา มาสวสด. (2552). การพฒนาการวเคราะหโปรตนโดยใชเครองวดคาความเขมของการกระเจงแสง. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร.
วราภรณ ขจรไชยกล. (2549). ยางธรรมชาต : การผลตและการใชงาน. หางหนสวนจากด ซโน ดไซน. กรงเทพมหานคร.
NU Science Journal 2011; 7(2) 44
สพรรษา หนทอง ศรวมล อนทรเอยม และ ปรญญา มาสวสด. (2551). การวดความเขมของแสงโดยอาศยปฏกรยาการเกดสในตวอยางคอลลอยด. ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยนเรศวร.
สานกงานการวจยแหงชาต. (2553). เอกสารการประชมวชาการยางพาราแหงชาต ครงท 2 Value Creation สการพงพาตนเอง. กรงเทพมหานคร.
ASTM D5712-05. (2005). Standard Test Method for Analysis of Aqueous Extractable
Protein in Natural Rubber and its Products Using the Modified Lowry Method.
ASTM International. United States.
Beezhold, D.H., Kostyal D.A. and Tomazic-Jezic, V.J. (2002). Measurement of latex
proteins and assessment of latex protein exposure. Method, 27, 46-51.
Chuan-Xiao, Y., Xiang-Ying, S., Bin, L. and Hui-Ting, L. (2007). Determination of Total
Phosphorus in Water Sample by Digital Imaging Colrimetry. Chinese J. Anal. Chem.,
35, 850-853.
Gaiao, E.N., Martins, V.L., Lyra, W.S., Almeida, L.F., Silva, E.C. and Araujo, M.C.U.
(2006).Digital image-based titrations. Anal. Chim. Acta., 570, 283-290. Retrieved June
4, 2010, from http://coursewares.mju.ac.th/ea341/lesson2/ch02_6.pdf
Maleki, N., Safavi, A. and Sedaghatpour, F. (2004). Single-step calibration, prediction and real
samples data acquisition for artificial neural network using a CCD camera. Talanta, 64,
830-835.
Miller, J.C. and Miller, J.N. (1993). Statistics for Analytical Chemistry, 3rd
edition. Ellis
Horwood Limited, England.
Siler, D.J. and Cornish, K. (1995). Measurement of protein in natural rubber latex. Anal.
Biochem., 229, 278-281.
Tomazic-Jezic, V.J. and Lucas, A.D. (2002). Protein and allergen assays for natural rubber
latex products. J. Allergy Clin. Immunol., 110(2), 40-46.
Wongwilai, W., Lapanantnoppakhun, S., Grudpan, S. and Grudpan, K. (2010). Webcam
camera as a detector for a simple lab-on-chip time based approach. Talanta, 81, 1137-
1141.
Yeang, H.Y., Yusof, F. and Abdullah, L. (1995). Precipitation of Hevea brasiliensis latex
proteins with trichloroacetic acid and phosphotungstic acid in preparation for the
Lowry protein assay. Anal. Biochem., 226, 35-43.