กำรตรวจวิเครำะห์ Bacillus cereus...

ปีที่ 2 ฉบับที่ 1 มกราคม - มิถุนายน 255956 ว. วิทย. เทคโน. หัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ

บทคัดย่อปัจจุบันมีการน�าเอาเทคนิคพีซีอาร์มาใช้ในการตรวจสอบเชื้อที่ปนเปื้อนมากับอาหารมากมาย เพื่อลดเวลาในการ

วิเคราะห์ และเพิ่มความแม่นย�าในการตรวจสอบเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีดั้งเดิม Bacillus cereus เป็นเชื้อที่เป็นสาเหตุหลัก

ของโรคอาหารเป็นพิษ การตรวจสอบเชื้อเบื้องต้นด้วยวิธีที่รวดเร็วและมีความแม่นย�า จะช่วยให้ผู้บริโภคลดความเสี่ยงของ

การเกิดโรคท้องร่วงได้ ในการศึกษานี้ได้ท�าการพัฒนาเทคนิคพีซีอาร์ โดยหาสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจสอบ B. cereus

ที่มีความไวและจ�าเพาะเจาะจงต่อเชื้อก่อโรคนี้ ซึ่งไพรเมอร์ที่มีความจ�าเพาะต่อยีนก่อโรค nheA ถูกน�ามาใช้ในการศึกษานี้

โดยความเข้มข้นต�่าสุดของไพรเมอร์ในการตรวจวิเคราะห์ยีน nheA ด้วยเทคนิคพีซีอาร์เท่ากับ 0.4 ไมโครโมลาร์ ส�าหรับ

อุณหภูมิของ annealing ที่เหมาะสมในการตรวจวิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus ด้วยเทคนิคพีซีอาร์เท่ากับ 50 องศา

เซลเซียส โดยผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของไพรเมอร์ดังกล่าว มีขนาดเท่ากับ 500 bp เมื่อท�าการทดสอบความไวของเทคนิคพีซีอาร์

ต่อการตรวจวิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus ในตัวอย่างอาหาร พบว่าปริมาณเชื้อต�่าสุดที่ตรวจพบเท่ากับ 35 CFU/g

ส�าหรับการทดสอบความไวของเทคนิคพีซีอาร์ต่อการตรวจวิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus พบว่าปริมาณเชื้อต�่าสุดที่

ตรวจพบ เท่ากับ 7.5 × 102 CFU/ml ส�าหรับการตรวจวิเคราะห์ B. cereus ในตัวอย่างอาหารด้วยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่ามี

ตัวอย่างอาหาร จ�านวน 8 ตัวอย่าง จากตัวอย่างอาหารทั้งหมด จ�านวน 10 ตัวอย่าง ที่มีการตรวจพบ B. cereus ซึ่งมีค่า

เท่ากับ 80 เปอร์เซ็นต์ (8/10) และพบ B. cereus เท่ากับ 50 เปอร์เซ็นต์ (5/10) โดยการตรวจวิเคราะห์แบบดั้งเดิม ในการ

ทดสอบความจ�าเพาะของไพร์เมอร์ของยีน nheA ต่อ B. cereus พบว่าไพร์เมอร์มีความจ�าเพาะต่อ B. cereus ถึง 100

เปอร์เซ็นต์ จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าการพัฒนาเทคนิคพีซีอาร์ในการศึกษาคร้ังน้ี ให้ผลในการตรวจวิเคราะห์

แบคทเีรยีก่อโรคในตวัอย่างอาหารได้อย่างรวดเรว็และถกูต้อง ซึง่สามารถน�าไปประยกุต์ใช้ตรวจสอบ B. cereus ในตวัอย่าง

อาหารประเภทอื่น ๆ ได้

ค�ำส�ำคัญ: Bacillus cereus วิธีทดสอบแบบดั้งเดิม ยีน nheA ไพรเมอร์

กำรตรวจวิเครำะห์ Bacillus cereus ในอำหำรโดยเทคนิคพีซีอำร์

Detection of Bacillus cereus in food samples by

polymerase chain reaction technique

ภำคภูมิ กนกพรเวโรจน์1 รัชรณ วำรินทร์1 จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์2 และ ปิยำภรณ์ สุภัคด�ำรงกุล1*

1 สาขาวิชาวิทยาศาสตร์ชีวภาพ คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ

สมุทรปราการ 105402 ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล กรุงเทพมหานคร 10400

Pakpoom Kanokpornverod1, Ratcharon Warin1, Chanpen Wiwat2

and Piyaporn Supakdamrongkul1*

1 Division of Biological Science, Faculty of Science and Technology, Huachiew Chalermprakiet University,

Samutprakarn 10540 2 Department of Microbiology, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, Bangkok 10400

Corresponding author: [email protected]

ว. วิทย. เทคโน. หัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ 57ปีที่ 2 ฉบับที่ 1 มกราคม - มิถุนายน 2559

AbstractPresently, polymerase chain reaction (PCR) has been wildly applied to detect food contamination

which is rapid assay and high accuracy when compared with conventional method. Bacillus cereus is

a type of bacteria that produces toxins. It is the cause of food poisoning symptom. Rapid detection with

high accuracy is important step that will protect and reduce this symptom. This study aim to develop

efficient PCR condition with high sensitivity and specific for detecting the B. cereus in food. The primer

pairs corresponding to the non-hemolytic enterotoxin gene (nheA) was carried out for PCR assay. It was

found that the minimum primer concentration required for PCR amplification of B. cereus nheA gene

was found to be 0.4 µM. The optimal annealing temperature was 50°C that could be amplified

nheA in B. cereus with single band. The PCR products of these primers showed expected product

size of 500 bp. The sensitivity of the developed PCR targeting nheA gene on food samples were 35

CFU/g. For the sensitivity of the developed PCR targeting nheA gene on culture were 7.5×10 2

CFU/ml. The prevalence of B. cereus on food samples was 80% (8/10) for PCR and 50% (5/10)

for conventional methods. The nheA pr ime r s fo r B . ce reus detec t i on were 100% specific.

The PCR assay in this study allows rapid and accurate detection of B. cereus in food samples and has

the potential to be used with other food samples.

Keywords: Bacillus cereus, Conventional method, nheA, Primer

บทน�ำ

อาการเจ็บป่วยที่เกิดจากการรับประทานอาหาร

และน�้า หรือเรียกอีกอย่างหนึ่งว่า โรคอาหารเป็นพิษ (food

poisoning) สาเหตุอาจเกิดจากการปนเปื้อนของสารเคมี

โลหะหนกั หรอืสารพษิจากแบคทเีรยีทีป่นเป้ือนมากบัอาหาร

ส�าหรับแบคทีเรียที่มีสารพิษที่สามารถเจริญในอาหารก่อนที่

ผูบ้รโิภคจะรบัประทาน เช่น Bacillus cereus, Clostridium

botulinum, Listeria monocytogenes, Shigella spp.,

Staphylococcus aureus และ Vibrio parahaemolyticus

ทั้งนี้แบคทีเรียบางสายพันธุ์สามารถผลิตสารพิษในล�าไส้เมื่อ

บริโภคอาหารที่มีการปนเป ื ้อนเชื้อนั้น เข ้าไป เช ่น

C. perfringens การระบาดของโรคอาหารเป็นพิษพบได้

จากการที่คนจ�านวนมากรับประทานอาหารร่วมกัน และมี

อาการอย่างรวดเร็วภายหลังจากรับประทานอาหาร ซึ่งการ

เก็บตัวอย่างส่งตรวจทางห้องปฏิบัติการโดยละเอียดและ

รวดเร็ว จะเป็นส่วนส�าคัญในการตรวจวิเคราะห์โรค ผู้ป่วย

เพียงรายเดียวอาจจะยากในการค้นหาสาเหตุ ยกเว้น

botulism ที่มีอาการทางคลินิกที่เด่นชัด โดยทั่วไปพบว่า

ประมาณ 80-90 เปอร์เซ็นต์ ของโรคอาหารเป็นพิษไม่

รุนแรงนั้น ผู้ป่วยสามารถหายจากโรคได้ภายใน 2-3 วัน

อย่างไรก็ตามก็ขึ้นอยู่กับชนิดและปริมาณของเชื้อโรคหรือ

สารพิษด้วย ทั้งน้ีความรุนแรงของโรคจะสูงมากขึ้น และ

อาจถึงขั้นเสียชีวิตในผู้รับเช้ือท่ีมีภูมิคุ้มกันต้านทานโรคต�่า

เช่น เด็กเล็ก ผู้ป่วยโรคเอดส์ หรือผู้สูงอายุ [1]

ในปี พ.ศ. 2550 ส�านกัระบาดวิทยา กรมควบคมุโรค

กระทรวงสาธารณสุข [2] ได้รายงานการวิเคราะห์ตัวอย่าง

อาหารเพื่อตรวจหาแบคทีเรียก่อโรคทางเดินอาหารจาก

ทั้งหมด 1,395 ตัวอย่าง พบว่าร้อยละ 7.13 ของจ�านวน

ตัวอย่างอาหารทั้งหมด มีการปนเปื้อนของ B. cereus ซึ่ง

เป็นสาเหตุส�าคัญของโรคอาหารเป็นพิษ นอกจากนี้ยังมีการ

รายงานพบการปนเป้ือนของ Aeromonas spp., S. aureus

และ Escherichia coli เท่ากับ 4.95, 4.01 และ 3.44

เปอร์เซ็นต์ ตามล�าดับ ในปี ค.ศ. 2000 Thorns [3] ได้

รายงานว่า Salmonella spp. เป็นแบคทเีรยีทีก่่อให้เกิดโรค


อาหารเป็นพิษและเป็นสาเหตุส�าคัญของปัญหาทางด้าน

สาธารณสุขในหลายประเทศท่ัวโลก ส�าหรับในประเทศไทย

จากการรายงานการตรวจวิเคราะห์โรคอาหารเป็นพิษของ

ส�านกัระบาดวทิยา กรมควบคมุโรค กระทรวงสาธารณสขุใน

ปี พ.ศ. 2555 (ตัง้แต่วนัที ่1 มกราคม ถงึวนัที ่26 พฤศจกิายน

พ.ศ. 2555) พบว่ามีผู้ป่วยด้วยโรคอาหารเป็นพิษ จ�านวนถึง

105,028 ราย [4]

B. cereus เป็นแบคทีเรยีทีพ่บว่ามีการปนเป้ือนใน

อาหารจ�านวนมาก โดยสามารถพบ B. cereus ได้ทั่วไปใน

อากาศหรือดิน ในส่วนของการปนเปื้อนในอาหารน้ันมักจะ

พบการปนเปื้อนในอาหารที่มีโปรตีนสูงจ�าพวกเนื้อสัตว์ นม

และไข่ เช่น ขนมไส้สังขยาหรือวานิลาสอดไส้ครีม เป็นต้น

และยังสามารถพบการปนเปื้อนได้ในของแห้ง เช่น ธัญพืช

แป้ง และเครื่องเทศ การที่พบ B. cereus มีการปนเปื้อนใน

อาหารมาก อาจเนื่องจากเชื้อนี้สามารถสร้างสปอร์ซึ่งทนต่อ

ความร้อนได้สูง การให้ความร้อนแก่อาหารอาจไม่สามารถ

ฆ่าเชื้อนี้ได้ 100 เปอร์เซ็นต์ ดังน้ันจึงพบการปนเปื้อนของ

B. cereus เหลอือยูใ่นอาหาร เมือ่รบัประทานอาหารทีม่กีาร

ปนเปื้อนของ B. cereus หรือสปอร์ของ B. cereus จะท�าให้

เกิดโรคอาหารเป็นพิษหรือโรคกระเพาะและล�าไส้อักเสบ

(gastroenteritis) ซึง่โรคอาหารเป็นพษิทีเ่กดิจาก B. cereus

นั้น สาเหตุเกิดจากสารพิษที่ B. cereus สร้างขึ้น เรียกว่า

เอนเทอโรท๊อกซนิ (enterotoxin) โดยสามารถจ�าแนกได้เป็น

2 ชนิด คือ เอนเทอโรท๊อกซินท่ีทนร้อน (heat stable

enterotoxin) ท�าให้เกดิโรคอาหารเป็นพษิทีม่ลีกัษณะอาการ

เป็นการอาเจยีน (emetic form) และเอนเทอโรท๊อกซนิทีไ่ม่

ทนร้อน (heat labile enterotoxin) ท�าให้เกิดโรคอาหาร

เป็นพิษที่มีลักษณะอาการเป็นแบบท้องร่วง (diarrheal

form) [5]

ประเทศไทยเป็นประเทศในเขตร้อนซ่ึงมีอุณหภูมิ

ที่เหมาะสมกับการเจริญของเชื้อที่ท�าให้เกิดโรคอาหาร

เป็นพิษ โดยอุณหภูมิท่ีเช้ือก่อโรคจะเจริญเติบโตได้ดี คือ

ประมาณ 37 องศาเซลเซียส ในช่วงฤดูร้อนนี้อาจจะเกิดการ

ระบาดของโรคติดต่อบางชนิด โดยเฉพาะอย่างยิ่งโรคติดต่อ

ทางอาหารและน�้า เช่น โรคอุจจาระร่วง โรคอาหารเป็นพิษ

บิด อหิวาตกโรค ไข้รากสาดน้อย และไข้ไทฟอยด์ เป็นต้น

ดังนั้นจึงมีการก�าหนดมาตรฐานการตรวจวิเคราะห์หาเช้ือ

จุลินทรีย์ที่มีการปนเปื้อนในอาหาร โดยท�าการสุ่มตัวอย่าง

อาหารมาท�าการตรวจวิเคราะห์ ซึ่งตัวอย่างที่ท�าการสุ่มมา

นั้นต้องเป็นตัวแทนที่ดีของอาหารทั้งหมด โดยการเพาะเชื้อ

ในอาหารเพาะเชือ้ การทดสอบทางชีวเคมขีองเชือ้ หรอืมกีาร

ใช้ชุดทดสอบเช้ือจุลินทรีย์ในอาหาร เป็นต้น การตรวจ

วเิคราะห์เหล่านีท้�าให้เกดิค่าใช้จ่ายในการตรวจทีค่่อนข้างสงู

ต้องใช้ผูช้�านาญการในการตรวจ และทีส่�าคญัคอืการใช้ระยะ

เวลาในการตรวจวเิคราะห์นาน ซึง่ท�าให้คณุภาพความสดของ

อาหารลดลงกว่าจะถึงผู้บริโภค หรืออาจมีการวางจ�าหน่าย

สินค้าก่อนที่จะทราบผลการตรวจ ซ่ึงอาจส่งผลต่อผู้บริโภค

ในภายหลังได้ ในปัจจุบันการตรวจวิเคราะห์และจ�าแนกเชื้อ

ต่าง ๆ ได้มีการน�าเอาเทคนิคพีซีอาร์ (Polymerase Chain

Reaction; PCR) เข้ามาช่วยในการตรวจสอบ โดยอาศัย

หลักการเพิ่มขยายปริมาณชิ้นส่วนของดีเอ็นเอเป้าหมายที่

จ�าเพาะต่อเชื้อนั้น ๆ ซึ่งท�าได้อย่างรวดเร็วและมีความ

จ�าเพาะเจาะจงมากขึ้น เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีดั้งเดิม [6, 7]

แต่อย่างไรกต็ามการน�าเทคนคิพซีอีาร์มาใช้ในการตรวจสอบ

เชื้อแต่ละชนิด การหาดีเอ็นเอเป้าหมายที่มีความจ�าเพาะ

ต่อเชื้อนั้น ๆ ไพรเมอร์ที่มีความจ�าเพาะต่อดีเอ็นเอเป้าหมาย

และสภาวะที่เหมาะสมในการเพิ่มจ�านวนดีเอ็นเอเป้าหมาย

เป็นสิ่งส�าคัญที่ควรศึกษา เพื่อให้การตรวจสอบเชื้อมีความ

แม่นย�าและมีประสิทธิภาพสูง

ดังนั้นในงานวิจัยนี้จึงศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสม

ของเทคนิคพีซีอาร์ เพื่อน�ามาตรวจวิเคราะห์เชื้อ B. cereus

ในตัวอย่างอาหาร โดยมียีนเป้าหมายคือ non-hemolytic

enterotoxin gene (nheA) ซึ่ง B. cereus มีความจ�าเพาะ

ต่อยีน nheA มากที่สุด โดยจะท�าการศึกษาหาสภาวะที่

เหมาะสมต่อการเพิ่มจ�านวนดีเอ็นเอเป้าหมาย รวมทั้งการ

ศึกษาหาความไวและความจ�าเพาะของไพรเมอร์ เพื่อให้การ

ตรวจ B. cereus ในตัวอย่างอาหารนั้นมีประสิทธิภาพสูงสุด

นอกจากนีไ้ด้ท�าการศกึษาเปรยีบเทยีบการตรวจวเิคราะห์เชือ้

ด้วยเทคนิคพีซีอาร์กับวิธีแบบดั้งเดิมด้วย (conventional

method)


วิธีด�ำเนินกำรวิจัย

วัสดุและอุปกรณ์

ตัวอย ่างอาหารส�าหรับการตรวจวิ เคราะห ์

B. cereus จุลินทรีย์ท่ีใช้ทดสอบความจ�าเพาะและความไว

ของไพรเมอร์ จ�านวน 7 สายพนัธุ ์คอื B. cereus TISTR 687,

B. subtilis TISTR 6633, B. megaterium TISTR 003,

E. coli TISTR 8739, S. Typhimurium ATCC 13311

DMST 562, S. sonnei ATCC 11060 DMST 561,

S. aureus TISTR 1466 และดีเอ็นเอแม่แบบของ

B. thuringiensis ซ่ึงได้รบัความอนเุคราะห์จากห้องปฏบิตักิาร

microbial biotechnology ภาควิชาจุลชีววิทยา

คณะเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล

วิธีด�ำเนินกำร

1. กำรตรวจวิเครำะห์เบื้องต้นเพื่อตรวจหำกำรปนเปื้อน

ของแบคทีเรียในอำหำร

1.1 กำรตรวจวิเครำะห์เชิงคุณภำพหำ B. cereus ใน

ตัวอย่ำงอำหำร (ดัดแปลงจำกวิธีมำตรฐำน BAM) [8]

ท�าการชั่งตัวอย่างอาหาร หนัก 25 กรัม เติม

tryptone soya broth (TSB) ปริมาตร 225 มิลลิลิตร

แล้วน�าไปตีป ั ่นที่ความเร็ว 230 รอบต่อนาที เป็นเวลา

2 นาที จากนั้นบ่มตัวอย่างอาหารที่อุณหภูมิ 35 องศา

เซลเซียส เป็นเวลา 18-21 ชั่วโมง น�าตัวอย ่างอาหารที่

ผ ่านการบ ่มเชื้อ มาขีดแยกเชื้อบนอาหารเพาะเชื้อ

mannitol egg yolk polymyxin agar (MYP) แล้วบ่มที่

อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตรวจสอบ

ผลการเจริญของ B. cereus บนอาหารเพาะเช้ือ MYP คือ

ลักษณะโคโลนีขนาดใหญ่มีสีชมพู เนื่องจากเชื้อมีความ

สามารถในการหมักย่อยน�้าตาลแมนนิทอลจึงเปลี่ยนสี

อินดิเคเตอร์ (phenol red) และมีโซนขาวขุ่นรอบโคโลนี

เนื่องจากเชื้อมีความสามารถในการย่อยเลซิตินในไข่แดง

จากนัน้เลือกโคโลนีลักษณะดังกล่าว มาท�าการ

ขีดแยกเชื้อให้บริสุทธ์ิบนอาหารเพาะเชื้อ nutrient agar

(NA) ท�าการบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา

24 ชั่วโมง เลือกโคโลนีเดี่ยวของเชื้อมาจุด (spot) ลงบน

อาหารเพาะเช้ือ blood agar บ่มที่อุณหภูมิ 35 องศา

เซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ท�าการย้อมสีแกรมเพื่อศึกษา

รูปร่างและการจัดเรียงตัวของเช้ือ และทดสอบคุณสมบัติ

ทางชีวเคมี (catalase test, nitrate broth และ phenol

red glucose broth) จากนัน้ท�าการอ่านผลและยืนยันการ

ตรวจพบ B. cereus ในตัวอย่างอาหารแต่ละตัวอย่าง

เพื่อคัดเลือกตัวอย่างอาหารที่พบ B. cereus มากที่สุด

มาท�าการทดสอบและตรวจวิเคราะห์ต่อไป

1.2 กำรตรวจวิเครำะห์เชิงปริมำณหำ B. cereus ใน

ตัวอย่ำงอำหำรตำมวิธีมำตรฐำน ISO 7932:2004 [9]

ท�าการสุ่มเก็บตัวอย่างอาหารจากแหล่งต่าง ๆ

จ�านวน 5 ตวัอย่าง ชั่งตัวอย่างอาหาร หนัก 25 กรัม ท�าการ

เติม peptone water ปริมาตร 225 มิลลิลิตร แล้วน�าไป

ตีปั่นที่ความเร็ว 230 รอบต่อนาที เป็นเวลา 2 นาที จากนั้น

ท�าการเจือจางตัวอย่างที่ระดับการเจือจางที่ 10-1-10-3

ปิเปตต์ตัวอย่าง ปริมาตร 0.1 มิลลิลิตร จากแต่ละ

ระดับการเจือจางลงในอาหารเพาะเชื้อ MYP โดยท�า 2 ซ�้า

แล้วท�าการเกล่ียตัวอย่างให้กระจายทั่วผิวหน้าอาหาร

เพาะเชื้อจนกว่าผิวหน้าอาหารเพาะเชื้อแห้ง แล้วท�าการบ่ม

ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น

ท�าการอ่านผลและยืนยันการตรวจพบ B. cereus ใน

ตัวอย่างอาหารแต่ละตัวอย่างโดยการทดสอบคุณสมบัติ

ทางชีวเคมี เพื่อคัดเลือกตัวอย่างที่พบ B. cereus มากที่สุด

มาทดสอบ และตรวจวิเคราะห์ต่อไป

2. กำรสกัดจีโนมิกดีเอ็นเอของแบคทีเรีย

การเตรียมจี โ น มิ กดี เ อ็ น เ อของแบคที เ รี ย

ดดัแปลงมาจากวธิขีอง Frederick [10] โดยท�าการเพาะเลีย้ง

เชื้อ B. cereus ลงในอาหารเพาะเชื้อ LB broth ปริมาตร

5 มิลลิลิตร จากนั้นน�าไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส

เป็นเวลา 16-18 ช่ัวโมง ป ิเปตต์เ ช้ือ ปริมาตร 100

ไมโครลิตร ลงในอาหาร LB broth ปริมาตร 5 มิลลิลิตร

น�าไปบ่มที ่35 องศาเซลเซยีส เป็นเวลา 3 ชัว่โมง ท�าการเกบ็เชือ้

ปริมาตร 5 มิลลิลิตร น�ามาท�าการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว

8,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 1 นาที เทสารละลายส่วนใส


ทิ้งและเก็บตะกอนเซลล์ของเช้ือไว้ ละลายตะกอนดีเอ็นเอ

ด้วย extraction buffer ปริมาตร 600 ไมโครลิตร

(TE buffer ปริมาตร 560 ไมโครลิตร SDS ความเข้มข้น 10

เปอร์เซ็นต์ ปริมาตร 30 ไมโครลิตร และไลโซไซม์ ความ

เข้มข้น 20 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 10 ไมโครลิตร)

จากนัน้ท�าการผสมและน�าไปบ่มทีอ่ณุหภมู ิ35 องศาเซลเซยีส

เป็นเวลา 1 ชัว่โมง เติมโซเดยีมคลอไรด์ ความเข้มข้น 5 โมลาร์

ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เติมสารละลาย CTAB/NaCl

ปริมาตร 80 ไมโครลิตร และน�าไปบ่มที่อุณหภูมิ 65 องศา

เซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที

ท�าดีเอ็นเอให้บริสุทธิ์ โดยการท�า organic

extraction โดยใช้ 1 เท่าของฟีนอล คลอโรฟอร์ม และ

ไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ในอัตราส่วน 25:24:1 และ 1 เท่า

ของคลอโรฟอร ์มแ ล ะ ไ อ โ ซ เ อ มิ ล แ อ ล ก อ ฮ อ ล ์ ใ น

อัตราส่วน 24:1 ตามล�าดับ น�าสารละลายดีเอ็นเอที่ได้มา

ตกตะกอนโดยเติม 0.6 เท่าของไอโซโพรพานอล น�าไป

ป่ันเหวีย่งทีค่วามเรว็ 15,000 รอบต่อนาท ีเป็นเวลา 15 นาที

เทสารละลายส่วนใสทิ้ง ล้างตะกอนดีเอ็นเอด้วยเอทานอล

ความเข้มข้น 70 เปอร์เซ็นต์ ปริมาตร 1 มิลลิลิตร น�าไป

ป่ันเหวีย่งทีค่วามเรว็ 10,000 รอบต่อนาท ีเป็นเวลา 10 นาที

และเทสารละลายส่วนใสทิ้ง ตากตะกอนดีเอ็นเอให้แห้ง

จากนัน้ท�าการละลายด้วย TE buffer ปรมิาตร 30 ไมโครลิตร

แล ้ วตรวจสอบดี เ อ็ น เอด ้ วย เทคนิ คอะกา โรส เจล

อิเล็กโตรโฟเรซิส

3. กำรสกัดดีเอ็นเอโดยวิธีกำรต้ม

น�าตะกอนเซลล์ของเชื้อมาละลายตะกอนด้วย TE

buffer ปรมิาตร 100 ไมโครลติร และน�าไปต้มทีอ่ณุหภมู ิ100

องศาเซลเซยีส เป็นเวลา 10 นาท ีจากนัน้น�ามาแช่ในน�า้แขง็ทนัที

แล้วจงึน�าไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 12,000 รอบต่อนาที เป็น

เวลา 5 นาที ท�าการปิเปตต์สารละลายส่วนใสใส่ลงใน

เอพเพนดอร์ฟหลอดใหม่ จากนั้นน�าดีเอ็นเอท่ีสกัดได้ไปท�า

พีซีอาร ์ และวิ เคราะห ์ดี เอ็นเอด ้วยวิธีอะกาโรสเจล

อิเล็กโทรโฟเรซิส

4. ขั้นตอนกำรท�ำพีซีอำร์

การเตรียมส่วนประกอบส�าหรับท�าพีซีอาร์และ

สภาวะท่ีใช้ในการท�าพีซีอาร์ส�าหรับวิเคราะห์ยีน nheA ใน

B. cereus แสดงรายละเอียดดังตารางที่ 1 และ 2

ตำรำงที่ 1 การเตรียม reaction mixture และปริมาณที่ใช ้ต ่อ 1 ปฏิกิริยา ในปริมาตร 25 ไมโครลิตร ส�าหรับ

วิเคราะห์ยีน nheA ใน B. cereus

สำรละลำย ปริมำตร (ไมโครลิตร) ควำมเข้มข้นสุดท้ำย

nuclease free water

10X PCR buffer

50 มิลลิโมลาร์ MgCl2

2.5 มิลลิโมลาร์ dNTPs

10 ไมโครโมลาร์ ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์

10 ไมโครโมลาร์ รีเวิร์ดไพรเมอร์

Taq DNA polymerase (1 ยูนิตต่อไมโครลิตร)

ดีเอ็นเอแม่แบบ

12

2.5

1

2

1

1

0.5

5

-

1X

2 มิลลิโมลาร์

0.2 มิลลิโมลาร์

0.4 ไมโครโมลาร์

0.4 ไมโครโมลาร์

0.5 ยูนิต

-


5. กำรศึกษำหำสภำวะที่เหมำะสมในกำรท�ำพีซีอำร์

ในการศกึษาการปรบัสภาวะในการท�าพซีีอาร์เพือ่เพิม่

ความจ�าเพาะของไพรเมอร์ต่อ B. cereus ท�าโดยการปรับ

สภาวะต่าง ๆ คือ การปรับอุณหภูมิที่ใช้ในช่วง annealing

ที่ 50, 55 และ 60 องศาเซลเซียส และการปรับความเข้มข้น

ของไพรเมอร์ที่ใช้เป็น 0.2, 0.4, 0.6 และ 0.8 ไมโครโมลาร์

โดยในแต่ละการทดลองท�าการตรวจวิเคราะห์ผลด้วย

อะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส

6. กำรศกึษำควำมจ�ำเพำะของไพรเมอร์ของยนี nheA ต่อ

B. cereus

ท�าการทดสอบกับเชื้อแบคทีเรีย จ�านวน 5 สาย

พันธุ ์ คือ B. cereus, E. coli, S. Typhimurium, S. aureus

และ S. sonnei โดยการน�าเช้ือแต่ละสายพันธุ ์ไปสกัด

ดีเอ็นเอ จากน้ันน�าไปท�าพีซีอาร์ โดยใช้ไพรเมอร์ที่มีความ

จ�าเพาะต่อยีน nheA และท�าการวิิเคราะห์ผลความจ�าเพาะ

ของไพรเมอร์ด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส

ทดสอบกับ Bacillus สปีชีส์ต่าง ๆ คือ B. cereus,

B. subtilis, B. megaterium และ B. thuringiensis โดย

น�าจีโนมิกดีเอ็นเอของ Bacillus แต่ละสปีชีส์ไปท�าพีซีอาร์

โดยใช้ไพรเมอร์ที่มีความจ�าเพาะต่อยีน nheA และท�าการ

วิิเคราะห์ผลความจ�าเพาะของไพรเมอร์ด้วยวธิอีะกาโรสเจล

อิเล็กโทรโฟเรซิส

7. กำรศึกษำควำมไวของไพรเมอร์ต่อกำรตรวจวิเครำะห์

B. cereus

เพาะเล้ียง B. cereus ลงในอาหารเพาะเชื้อ

LB broth และบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา

3 ชั่วโมง จากนั้นน�า B. cereus ที่เพาะเล้ียงไว้ไปวัดค่า

OD625

เพื่อวัดปริมาณเชื้อเริ่มต้น ท�าการเจอืจางต้นเชือ้ทีค่่า

ความเจอืจางเท่ากบั 10-1- 10-7 และท�าการสกดัจโีนมกิดเีอน็เอ

ของ B. cereus ของแต่ละระดับความเจือจาง จากน้ันท�า

พีซีอาร์โดยใช้ไพรเมอร์ของยีน nheA และท�าการวิเคราะห์

ผลด้วยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส เพื่อตรวจสอบ

ปริมาณเชื้อต�่าสุดที่สามารถตรวจสอบได้ด้วยไพรเมอร์ของ

ยีน nheA

8. กำรตรวจวิเครำะห์ B. cereus ในตัวอย่ำงอำหำร

ท�าการสุ่มเก็บตัวอย่างอาหารที่ต้องการศึกษา

จากแหล่งต่าง ๆ จ�านวน 10 ตัวอย่าง จากนั้นท�าการตรวจ

วิเคราะห์ B. cereus จากตัวอย่างอาหารด้วยเทคนิคพีซีอาร์

เทียบกับการตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธีดั้งเดิม โดยแบ่งชุดการ

ทดลองเป็น 2 ชุด ดังนี้

ชุดที่ 1 เป็นชุดตัวอย่างอาหารที่ไม่ได้ผ่านขั้นตอน

การเพิม่จ�านวนเชือ้ ก่อนน�าไปวเิคราะห์ด้วยเทคนิคพีซีอาร์

ท�าการชั่ งตัวอย ่างอาหาร หนัก 25 กรัม ใส ่ลงใน

butterfield phosphate buffer ปริมาตร 225 มิลลิลิตร

จากนั้นน�าไปตีบดที่ความเร็ว 230 รอบต่อนาที เป็นเวลา

2 นาที จากนัน้น�ามาเจอืจางทีค่่าความเจอืจาง 10-1 - 10-3 เท่า

ตำรำงที่ 2 สภาวะท่ีใช้ในการท�าพีซีอาร์ส�าหรับวิเคราะห์ยีน nheA ต่อ B. cereus [11]

สภาวะ อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส)

เวลา (นาที) จํานวนรอบของปฏิกิริยา (รอบ)

Pre-heat

Denaturation

Annealing

Extension

Final extension

94

94

64

72

72

3

1

1

1

7

1

35

35

35

1


ชุดที่ 2 เป็นชุดตัวอย่างอาหารท่ีผ่านข้ันตอนการ

เพิ่มจ�านวนเชื้อ ก่อนน�าไปวิเคราะห์ด้วยเทคนิคพีซีอาร์

ท�าการชัง่ตวัอย่างอาหาร หนกั 25 กรัม ใส่ลงในอาหารเพาะเชือ้

TSB ที่ใส่ยา polymyxin B ความเข้มข้น 0.1 เปอร์เซ็นต์

ปริมาตร 225 มิลลิลิตร จากน้ันน�าไปตีบดท่ีความเร็ว

230 รอบต่อนาที เป็นเวลา 1 นาที แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 35

องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง

น�าตัวอย่างชุดที่ 1 แต่ละระดับความเข้มข้น และ

ชุด 2 หลังบ่มครบเวลาแล้วน�ามาเกลี่ย (spread) ลงบน

อาหารเพาะเชื้อ MYP โดยท�า 2 ซ�้า จากน้ันน�าไปบ่มที่

อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 16 ชั่วโมง ท�าการ

ปิเปตต์ตัวอย่างจากทั้ง 2 ชุดการทดลองลงเอพเพนดอร์ฟ

ปริมาตร 5 มิลลิลิตร จากนั้นน�าไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว

10,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 1 นาที ท�าการปิเปตต์

สารละลายส่วนใสทิ้งเก็บเอาตะกอนเซลล์ แล้วน�าตะกอนท่ี

ได้มาละลายด้วย TE buffer แล้วท�าการผสมตะกอนให้เข้ากนั

เพื่อน�าไปสกัดดีเอ็นเอโดยวิธีการต้มต่อไป

ผลกำรวิจัย

1. กำรตรวจวเิครำะห์เบือ้งต้นในเชิงคุณภำพและเชิงปริมำณ

เพื่อตรวจหำกำรปนเปื้อนของแบคทีเรียในอำหำร

จากการศึกษาการตรวจวิเคราะห์ B. cereus

เบื้องต้นในตัวอย่างอาหารปรุงสุกทั้งหมด 5 ตัวอย่าง

(ข้าวผัด ทองหยอด ขนมโตเกียวไส้หวาน ขนมจีน และ

เอแคร์ไส้ครมี) ที่มีความเสีย่งต่อการปนเปื้อนของ B. cereus

พบว่ามีการตรวจพบ B. cereus ในข้าวผัด ขนมโตเกียว

ไส้หวาน ขนมจีน และเอแคร์ไส้ครีม และจากการตรวจ

วิเคราะห์หาปริมาณเชื้อตามวิธีมาตรฐาน ISO 7932:2004

พบ B. cereus ในอาหารทั้ง 4 ชนิด และมีเชื้อเป็นจ�านวน

มากเกิน 150 โคโลนี (ตารางที่ 3)

2. กำรศึกษำสภำวะที่ เหมำะสมในกำรตรวจสอบ

B. cereus ด้วยเทคนิคพีซีอำร์

จากการศึกษาหาสภาวะท่ีเหมาะสมในการตรวจ

วิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus โดยการท�าพีซีอาร์ ซึ่ง

ได้ท�าการปรับค่าอุณหภูมิในข้ันตอน annealing พบว่า

อุณหภูมิในขั้นตอน annealing เท่ากับ 50 องศาเซลเซียส

เป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมในการตรวจสอบยีน nheA ของ

B. cereus ซึ่งได้แบนดีเอ็นเอขนาด 500 bp ที่ชัดเจน แสดง

ดังภาพที่ 1 โดยสภาวะที่ เหมาะสมในการตรวจสอบ

B. cereus ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ แสดงดังตารางที่ 4

ตำรำงที่ 3 การตรวจวิเคราะห์เชิงปริมาณของ B. cereus ในตัวอย่างอาหารปรุงสุกตามวิธีมาตรฐาน ISO 7932:2004

ตัวอย่ำงอำหำรจ�ำนวนเชื้อ (CFU/g)

10-1 10-2 10-3

ข้าวผัดหมู TNTC TNTC TNTC

ขนมโตเกียวไส้หวาน TNTC TNTC TNTC

ทองหยอด - - -

ขนมจีน TFTC - -

เอแคร์ไส้ครีม TNTC TNTC TFTC

หมำยเหตุ TNTC หมายถึง มีจ�านวนโคโลนี B. cereus มากกว่า 150 โคโลนี

TFTC หมายถึง มีจ�านวนโคโลนี B. cereus น้อยกว่า 15 โคโลนี

(-) หมายถึง ไม่พบ B. cereus


ของไพรเมอร์ เท่ากับ 0.4 ไมโครโมลาร์

3. กำรศึกษำควำมจ�ำเพำะของไพรเมอร์ภำยใต้สภำวะที่

เหมำะสม

จากการศึกษาความจ�าเพาะของไพรเมอร์ของยีน

nheA ต่อ B. cereus และแบคทีเรียสายพันธุ ์ต ่าง ๆ

จ� านวน 5 สายพันธุ ์ คื อ B . ce reus , E . co l i ,

S. Typhimurium, S. aureus และ S. sonnei พบว่า

ไพรเมอร์ทีใ่ช้ในการศกึษานีม้คีวามจ�าเพาะต่อยนี nheA ของ

B. cereus สงู โดยปรากฏแถบผลติภณัฑ์พซีอีาร์ขนาด 500 bp

เฉพาะตวัอย่างทีใ่ช้ดีเอ็นเอของ B. cereus เท่านัน้ (ภาพที ่1)

จากการศึกษาความเข ้มข ้นของไพรเมอร ์ที่

เหมาะสมต่อการวิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus ได้

ท�าการเจือจางไพรเมอร์ที่ความเข้มข้น เท่ากับ 0.2, 0.4, 0.6

และ 0.8 ไมโครโมลาร์ จากนั้นท�าการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค

พีซีอาร์ พบว่าความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่เหมาะสมต่อการ

วิเคราะห์ยีน nheA มากที่สุด คือ ไพรเมอร์ที่ความเข้มข้น

เท่ากับ 0.4 ไมโครโมลาร์ โดยส่งผลให้ปรากฎแถบผลิตภัณฑ์

พีซีอาร์ที่จ�าเพาะกับ B. cereus ตามขนาดท่ีก�าหนด คือ

500 bp อย่างไรก็ตามความเข้มข้นของไพรเมอร์ท่ี 0.2, 0.6

และ 0.8 ไมโครโมลาร์ ก็ปรากฏแถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์

ของ B. cereus เช่นเดียวกัน แต่แถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์มี

ความเข้มข้นน้อยกว่าแถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ที่ความเข้มข้น

ภำพที่ 1 แถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของยีน nheA ในแบคทีเรียสายพันธุ์ต่าง ๆ ช่อง M : ดีเอ็นเอมาตรฐานที่ทราบขนาด

โมเลกุล ช่องที่ 1 : ดีเอ็นเอแม่แบบของ B. cereus ช่องที่ 2 : ดีเอ็นเอแม่แบบของ S. aureus ช่องที่ 3 : ดีเอ็นเอแม่แบบ

ของ S. Typhimurium ช่องที่ 4 : ดีเอ็นเอแม่แบบของ S. sonnei ช่องที่ 5 : ดีเอ็นเอแม่แบบของ E. coli และช่องที่ 6 :

ชุดควบคุมผลลบ ใช้น�้าเป็นดีเอ็นเอแม่แบบ

ตำรำงที่ 4 สภาวะที่ใช้ในการท�าพีซีอาร์ส�าหรับการวิเคราะห์ยีน nheA ของ B. cereus

สภำวะ อุณหภูมิ (องศำเซลเซียส) เวลำ จ�ำนวนรอบของปฏิกิริยำ

(รอบ)

Pre-heat

Denaturation

Annealing

Extension

Final extension

95

95

50

72

72

3 นาที

30 วินาที



7 นาที

1

25

25

25

1

bp

1,000

500

300

M 1 2 3 4 5 6


จากการศึกษาความจ�าเพาะของไพรเมอร์ของยีน

nheA ต่อ B. cereus และ Bacillus สปีชีส์อื่น ๆ คือ

B. cereus, B. subtil is, B. thuringiensis และ

B. megaterium พบว่าไพรเมอร์ของยีน nheA มีความ

จ�าเพาะต่อ B. cereus การเกิดแถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ใน

ตัวอย่าง B. thuringiensis เนื่องมาจาก B. thuringiensis

มียีน nheA เช่นเดียวกับ B. cereus แต่อย่างไรก็ตามแถบ

ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ในตัวอย่าง B. thuringiensis มีหลายแถบ

ซึ่งเกิดจากความไม่จ�าเพาะของไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้

ต่อยีน nheA ของ B. thuringiensis (ภาพที่ 2)

ภำพท่ี 2 แถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของ B. cereus ในการทดสอบความจ�าเพาะของไพรเมอร์ต่อยนี nheA ของ Bacillus

สายพนัธุต่์าง ๆ ช่อง M : ดเีอน็เอมาตรฐานทีท่ราบขนาดโมเลกลุ ช่องที ่1 : ดเีอน็เอแม่แบบของ B. cereus ช่องที ่2 : ดเีอน็เอ

แม่แบบของ B. subtilis ช่องที่ 3 : ดีเอ็นเอแม่แบบของ B. megaterium ช่องที่ 4 : ดีเอ็นเอแม่แบบของ B. thuringiensis

และช่องที่ 5 : ชุดควบคุมผลลบ ใช้น�้าเป็นดีเอ็นเอแม่แบบ

4. กำรศึกษำควำมไวของไพรเมอร์ต่อยีน nheA ของ

B. cereus

จากการศึกษาความไวของไพรเมอร์ต่อยีน nheA

ของ B. cereus โดยการเพาะเลี้ยง B. cereus ลงในอาหาร

เพาะเชื้อ LB broth บ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมง และท�าการ

เจอืจางต้นเชือ้เท่ากบั 10-1-10-7 เพือ่น�ามาวเิคราะห์ด้วยเทคนคิ

พีซีอาร์ พบว่าไพรเมอร์ของยีน nheA สามารถเพ่ิมขยาย

ดีเอ็นเอของ B. cereus ได้ถึงระดับความเจือจางที่ 10-7 ซึ่ง

เทียบกับปริมาณเชื้อได้ เท่ากับ 1 CFU/ml (ภาพที่ 3) เมื่อ

ท�ามาเทียบกับการนับจ�านวนแบบวิธีดั้งเดิมได้เท่ากับ

7.5×102 CFU/ml (ตารางที่ 5) แสดงให้เห็นว่าเทคนิค

พีซีอาร์มีความไวที่สูงกว่าแบบวิธีดั้งเดิม

bp

1,000

500

300


ตำรำงที่ 5 ผลการนับจ�านวน B. cereus ที่ระดับความเจือจางต่าง ๆ โดยเทคนิค spread plate

ระดับควำมเจือจำงผลกำรนับจ�ำนวน (โคโลนี) ค่ำเฉลี่ย

(CFU/ml)1 2

10-1 TNTC TNTC -10-2 TNTC TNTC -

10-3 TNTC TNTC -

10-4 135 140 1.37×107

10-5 7 8 7.5×107

10-6 - - -

10-7 - - -



ภำพที่ 3 แถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของ B. cereus ในการศึกษาความไวของไพรเมอร์ของยีน nheA ช่อง M : ดีเอ็นเอมาตรฐาน

ที่ทราบขนาดโมเลกุล ช่องที่ 1 : ชุดควบคุมแบบบวก มีดีเอ็นเอแม่แบบของ B. cereus ช่องที่ 2-8 : B. cereus ระดับความ

เจือจางที่ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6 และ 10-7 ตามล�าดับ และช่องที่ 9 : ชุดควบคุมผลลบ ใช้น�้าเป็นดีเอ็นเอแม่แบบ

bp

1,000

500

300


5. กำรตรวจวิเครำะห์ B. cereus ในตัวอย่ำงข้ำวผัดด้วย

เทคนิคพีซีอำร์

การทดลองชุดท่ี 1 จากการทดลองโดยน�า

ตัวอย่างข้าวผัด จ�านวน 10 ตัวอย่าง มาท�าการเจือจาง

ตั้งแต่ระดับ 10-1 ถึง 10-3 ทุก ๆ ตัวอย่าง จากนั้นน�ามา

วิเคราะห์ด ้วยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่าเกิดแถบผลิตภัณฑ์

พีซีอาร์ของ B. cereus ทั้งหมด 8 ตัวอย่าง จากตัวอย่าง

ทั้งหมด 10 ตัวอย่าง (ตารางที่ 6) ซึ่งปริมาณ B. cereus ที่

ต�่าสุดที่ตรวจพบ คือ 35 CFU/g เมื่อน�ามาเปรียบเทียบ

กับการตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธีแบบดั้งเดิม พบว่าสามารถ

ตรวจวเิคราะห์ B. cereus ได้ทัง้หมด 5 ตวัอย่าง จากตัวอย่าง

ทั้ง 10 ตัวอย่าง (ตารางที่ 7) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าเทคนิค

พีซีอาร์มีความไวในการตรวจวิเคราะห์ B. cereus มากกว่า

วิธีแบบดั้งเดิม

ชุดการทดลองที่ 2 จากการทดลองโดยน�าตัวอย่าง

ข้าวผัดจากการทดลองที่ 1 ไปบ่มที่อุณหภูมิ 35 องศา

เซลเซียสเป็น 24 ชั่วโมง เพื่อเพิ่มจ�านวน B. cereus แล้วน�า

ไปตรวจวิเคราะห์ด้วยเทคนิคพีซีอาร์และวิธีแบบดั้งเดิม

พบว่าทั้ง 2 วิธีสามารถตรวจพบ B. cereus ในตัวอย่าง

ข้าวผัด 9 ตัวอย่าง จาก 10 ตัวอย่าง โดยท้ังสองวิธีตรวจ

ไม่พบเช้ือในตัวอย่าง ข้าวผัดร้านที่ 6 ร้านเดียว (ภาพที่ 4)

ตำรำงที่ 6 ผลการตรวจวิเคราะห์ B. cereus ในตัวอย่างข้าวผัดด้วยเทคนิคพีซีอาร์

แหล่งที่มำของตัวอย่ำงระดับควำมเจือจำง

10-1 10-2 10-3

ข้าวผัดร้านที่ 1 + + -

ข้าวผัดร้านที่ 2 + + +



ข้าวผัดร้านที่ 5 - - -

ข้าวผัดร้านที่ 6 - - -



ข้าวผัดร้านที่ 9 + - -


หมำยเหตุ (+) หมายถึง ตรวจพบ B. cereus

(-) หมายถึง ตรวจไม่พบ B. cereus




ตำรำงที่ 7 ผลการตรวจวิเคราะห์ B. cereus ในตัวอย่างข้าวผัดด้วยวิธีดั้งเดิม

แหล่งที่มำของตัวอย่ำง ระดับควำมเจือจำง จ�ำนวนโคโลนี จ�ำนวนเชื้อ (CFU/g)

ข้าวผัดร้านที่ 1 10-1 - -

10-2 - -

10-3 - -

ข้าวผัดร้านที่ 2 10-1 TNTC

10-2 16.5 1.65×104

10-3 3.5 3.5×104


10-2 - -

10-3 - -

ข้าวผัดร้านที่ 4 10-1 TNTC -

10-2 37 3.7×104

10-3 - -


10-2 - -

10-3 - -


10-2 - -

10-3 - -


10-2 - -

10-3 - -


10-2 13 -

10-3 - -

ข้าวผัดร้านที่ 9 10-1 3.5 3.5×102

10-2 - -

10-3 - -


10-2 118.5 1.185×105

10-3 40 4.0×105


ภำพที่ 4 แถบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของ B. cereus จากการตรวจวิเคราะห์ตัวอย่างข้าวผัดที่ท�าการเพิ่มจ�านวน B. cereus

ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ ช่อง M : ดีเอ็นเอมาตรฐานที่ทราบขนาดโมเลกุล ช่องที่ 1 : ชุดควบคุมแบบบวก มีดีเอ็นเอแม่แบบของ

B. cereus ช่องที่ 2-11 : ตัวอย่างข้าวผัดร้านที่ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 และ 10 ตามล�าดับ และช่องที่ 12 : ชุดควบคุม

ผลลบ ใช้น�้าเป็นดีเอ็นเอแม่แบบ

อภิปรำยและสรุปผลกำรวิจัย

ในการศึกษาวิจัยครั้งนี้ ได ้ท�าการทดสอบหา

สภาวะที่เหมาะสมในการตรวจวิเคราะห์ B. cereus ใน

ตัวอย ่างอาหารด้วยเทคนิคพีซีอาร์ โดยท�าการทดสอบ

ความไวและความจ�าเพาะของไพรเมอร์ ซึ่งสภาวะพีซีอาร์

ที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้ ได้น�ามาตรวจวิเคราะห์ B. cereus

โดยมีการเปรียบเทียบกับการตรวจวิเคราะห์แบบดั้งเดิม

เพื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพของวิธีการดังกล่าว

จากการทดสอบหาสภาวะท่ีเหมาะสมในการ

ตรวจวิเคราะห์ B. cereus โดยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่าใน

ขั้นตอน annealing อุณหภูมิท่ีเหมาะสมเท่ากับ 50 องศา

เซลเซียส ซ่ึงได้ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ตรงตามขนาดของยีน

nheA คือ 500 bp

ในการศึกษาความจ�าเพาะของไพรเมอร์ โดยใช้

ไพรเมอร ์ของยีน nheA ท่ี มีความจ�าเพาะต ่อก า ร

ตรวจวิเคราะห์ B. cereus จะท�าการศึกษาโดยน�า

ดีเอ็นเอแม่แบบของแบคทีเรียสายพันธุ ์ต่าง ๆ ทั้งหมด

5 สายพันธุ ์ คือ B. cereus, E. coli, S. Typhimurium,

S. aureus และ S. sonnei มาท�าการทดสอบ ผลจากการ

ทดลองพบว่า ไพรเมอร์สามารถเพิ่มขยายยีนของเช้ือได้

เพียงสายพันธุ์เดียว คือ B. cereus เนื่องจาก B. cereus

สร้างยีนเอนเทอโรท๊อกซินได้ 3 ชนิด คือ hemolytic

enterotoxin hbl, non-hemolytic enterotoxin nhe

และ bceT โดยพบว่า B. cereus มีความจ�าเพาะต่อยีน

nheA มากที่สุด [12] นอกจากนี้ยังได้ท�าการศึกษาโดยน�า

ดีเอ็นเอแม่แบบของเชื้อในกลุ่ม Bacillus สายพันธุ์ต่าง ๆ

คือ B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis และ

B. megaterium พบว่า ไพรเมอร์ nheA มีความจ�าเพาะ

และสามารถเพิ่ มขยายยีนของ B . ce reus และ

B. thuringiensis ทั้งนี้เนื่องจาก B. cereus สามารถสร้าง

เอนเทอโรท๊อกซินหลายชนิด ซึ่งมีความเกี่ยวข้องกับการก่อ

โรคท้องร่วง นอกจากน้ียงัมกีารรายงานว่า B. thuringiensis

มีล�าดับเบสของยีนดังกล่าว รวมทั้งมีล�าดับเบสที่มีความ

เหมือนหรือคล้ายคลึงกับ B. cereus มาก ดังนั้นจึงพบแถบ

ของผลิตภัณฑ์พี ซีอาร ์ของยีน nheA อย ่างไรก็ตาม

B. thuringiensis พบว่ามกีารใช้อย่างแพร่หลายในการเกษตร

เพื่อควบคุมแมลงศัตรูพืชเท่านั้น [13] จากผลการทดลอง

แสดงให้เห็นว่าไพรเมอร์ของยีน nheA มีความจ�าเพาะต่อ

B. cereus

bp

1,000

500

300


ส�าหรับการศึกษาความไวของไพรเมอร์ของยีน

nheA ในการตรวจวิเคราะห์หา B. cereus พบว่า

ไพรเมอร์ของยีน nheA มีความไวต่อการตรวจวิเคราะห์

ได้ที่ระดับความเจือจาง 10-7 ของ B. cereus ซ่ึงเท่ากับ

1 CFU/ml ตามล�าดับ ซึ่งให้ผลที่สอดคล้องกับงานวิจัยของ

สมหวัง [12] โดยได้รายงานถึงปริมาณเชื้อต�่าสุดที่สามารถ

ตรวจพบ B. cereus ได้ด้วยไพรเมอร์ที่จ�าเพาะต่อยีน

nheA คือ 5 CFU/ml จากการศึกษาครั้งนี้เมื่อเปรียบเทียบ

ผลความไวของไพรเมอร์ของยีน nheA ต่อ B. cereus ด้วย

เทคนิคพีซีอาร์กับการตรวจนับจ�านวนเชื้อแบบวิธีดั้งเดิม

ซึ่งให้ผลการตรวจนับจ�านวน B. cereus บนอาหารเพาะเชื้อ

เท่ากับ 7.5x102 CFU/ml ซ่ึงแสดงให้เห็นว่าไพรเมอร์ของ

ยีน nheA มีความไวต่อการตรวจวิเคราะห์ B. cereus สูง

ในการตรวจวิเคราะห์ B. cereus ในตัวอย่าง

ข้าวผัด จ�านวน 10 ตัวอย่าง โดยแบ่งการทดลองออกเป็น

ตัวอย่างข้าวผัดที่ไม่ผ่านขั้นตอนการเพิ่มจ�านวนเชื้อ และ

ตวัอย่างข้าวผดัทีผ่่านขัน้ตอนการเพิ่มจ�านวนเชื้อก่อนที่จะ

น�ามาตรวจวิเคราะห์หา B. cereus ด้วยเทคนิคพีซีอาร์

โดยเปรียบเทียบกับการตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธีดั้งเดิม พบว่า

ในตัวอย ่างข ้าวผัดท่ีไม ่ผ ่านการเพ่ิมจ�านวนสามารถ

ตรวจพบ B. cereus ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ท้ังหมด 8 ตัวอย่าง

คิดเป็น 80 เปอร์เซ็นต์ ของตัวอย่างท้ังหมด 10 ตัวอย่าง

ในขณะที่การตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธีด้ังเดิมสามารถตรวจ

พบ B. cereus เพียงแค่ 5 ตัวอย่าง คิดเป็น 50 เปอร์เซ็นต์

ของตัวอย่างทั้งหมด 10 ตัวอย่าง ซึ่งปริมาณเชื้อต�่าสุดที่

สามารถตรวจพบได้เท่ากับ 35 CFU/g จากการตรวจ

วิเคราะห์โดยเทคนิคพีซีอาร์และส�าหรับการตรวจนับ

จ�านวนเชื้อแบบวิธีดั้งเดิม พบว่าให้ผลการตรวจวิเคราะห์

ที่สอดคล้องกัน ส�าหรับตัวอย่างข้าวผัดท่ีผ่านขั้นตอนการ

เพิ่มจ�านวนเชื้อก่อนน�าไปวิเคราะห์น้ัน พบว่าสามารถตรวจ

พบเชื้อทั้งหมด 9 ตัวอย่าง ซึ่งจะเห็นได้ว่าเมื่อท�าการเพิ่ม

จ�านวนเชื้อในข้าวผัดก่อนที่จะท�าการตรวจวิเคราะห์พบว่า

ช่วยให้การตรวจวเิคราะห์ได้ผลทีด่ ีและมีประสทิธภิาพในการ

ตรวจพบเชื้อมากยิ่งขึ้น หรือเป็นการยืนยันผลของการมีอยู่

ของเชือ้ จากการตรวจไม่พบด้วยเทคนคิพซีอีาร์และวธิดีัง้เดมิ

ในตัวอย่างข้าวผัดที่ไม่ผ่านขั้นตอนการเพิ่มจ�านวน ผลจาก

การศึกษาวิจัยนี้แสดงให้เห็นว่า เทคนิคพีซีอาร์ที่ได้รับการ

พัฒนานี้มีประสิทธิภาพสูงในการตรวจวิเคราะห์แบคทีเรีย

ก่อโรคในตัวอย่างอาหารได้อย่างรวดเร็วและถูกต้อง และ

สามารถน�าไปประยกุต์ใช้กบัตวัอย่างอาหารประเภทอืน่ ๆ ได้

กิตติกรรมประกำศ

ขอขอบคณุภาควชิาจุลชวีวทิยา คณะเภสชัศาสตร์

มหาวิทยาลัยมหิดล และสาขาวิชาวิทยาศาสตร์ชีวภาพ

คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหัวเฉียว

เฉลิมพระเกียรติ ในการสนับสนุนการท�าวิจัย

เอกสำรอ้ำงอิง

1. กลุ่มส่ือสารความเส่ียงและพัฒนาพฤติกรรมสุขภาพ.

โรคอาหารเป็นพิษ. [อินเตอร์เน็ต]. 2558 [เข้าถึงเม่ือ

18 เม.ย. 2559]. เข้าถึงได้จาก: http://dpc9.ddc.

moph.go.th/crd/disease/food.html

2. ส�านกัระบาดวทิยา กรมควบคมุโรค กระทรวงสาธารณสุข.

โรคอาหารเป็นพิษ. [อินเตอร์เน็ต]. 2558 [เข้าถึงเมื่อ

2 เม.ย. 2559]. เข้าถงึได้จาก: http://www.boe.moph.

go.th/Annual/ANNUAL2550/Part1/3950_

FoodPoisoning

3. Thorns CJ. Bacterial food-borne zoonoses. Rev

Sci Tech 2000;19:226-39.

4. ส�านกัระบาดวทิยา กรมควบคมุโรค กระทรวงสาธารณสุข.

Annual epidemiological surveillance r e p o r t

2012. [อินเตอร์เน็ต]. 2558 [เข้าถึงเมื่อ 10 มี.ค. 2559].

เข้าถงึได้จาก: http//www.boe.moph.go.th/boedb/

d506_1index.php

5. พิมพ์เพ็ญ พรเฉลิมพงศ์, นิธิยา รัตนาปนนท์. โรคอาหาร

เป็นพษิทีม่สีาเหตมุาจาก Bacillus cereus. [อนิเตอร์เนต็].

2558 [เข้าถงึเมือ่ 18 เม.ย. 2559]. เข้าถงึได้จาก: http://

www.foodnetworksolution.com/wiki/word/3933/

โรคอาหารเป็นพิษที่มีสาเหตุจาก-bacillus-cereus


6. วีรพงศ์ ลุลิตานนท์. คู่มือปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพ

พิมพ์ครั้งที่ 1. กรุงเทพฯ: โรงพิมพ์สาธารณสุขมูลฐาน

อาเซียน; 2536.

7. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis

of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed

chain reaction. Methods Enzymol 1987;155:335-

50.

8. Allent SM, Rhodehamel EJ, Harmon SM, Bennett

RW. Bacteriological Analytical Manual Chapter

14 Bacillus cereus. [Internet]. 2558 [Cited 2016

April 10]. Available from: http://www.fda.gov/

Food/FoodScienceResearch/Laboratory

Methods/ucm070875.htm

9. ISO 7932:Microbiology of food and animal

feeding stuffs - horizontal method for the

enumeration of presumptive Bacillus cereus.

2004.

10. Frederick MA. Short protocols in molecular

biology. 3rd ed. Canada: John Wiley and Sons Inc.;

1995.

11. Hansen BM, Hendriksen NB. Detection of

enterotoxin Bacillus cereus and Bacillus

thuringiensis strains by PCR analysis. Appl

Environ Microbiol 2001;67(1):185-9.

12. สมหวัง จรรยาขันติกุล. การตรวจหายีน enterotoxin

จากเชื้อ Bacillus cereus โดยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่

โพลิ เมอเรส . วิทยานิพนธ ์ปริญญาวิทยาศาสตร

มหาบัณฑิต สาขาวิชาเภสัชศาสตร์ชีวภาพ, บัณฑิต

วิทยาลัย มหาวิทยาลัยมหิดล. กรุงเทพฯ; 2546

13. ภูริยา งามวงศ์สถิต และ วัฒนาลัย ปานบ้านเกร็ด. การ

แพร่กระจายของยีนที่สร้างเอ็นเทอโรท๊อกซินในเชื้อ

Bacillus cereus และ Bacillus thuringiensis.

วิทยานิพนธ์ปรัชญาดุษฎีบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยี

ชวีภาพ, บณัฑติวทิยาลยั มหาวทิยาลยัมหดิล. กรงุเทพฯ;

2549.

Date post:	07-Oct-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

กำรตรวจวิเครำะห์ Bacillus cereus...

Documents