12.11.2008 AC – BPBS HS08 1
Analytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungs-
wissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren
LC / HPLC
12.11.2008 AC – BPBS HS08 2
LC / HPLC High-Pressure-Liquid-Chromatography
High-Performance-Liquid-Chromatography
High-Price-Liquid-Chromatography
Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
HPLC vs GC
Apparatur
Trennprinzip
Mobile Phase
Säule und Stationäre Phase
Unterarten HPLC
Detektoren
Dünnschichtchromatographie
Wahl einer Methode
!
12.11.2008 AC – BPBS HS08 3
Warum HPLC ? •! GC: nur Trennung von Substanzen, die sich bis ca. 300°C
unzersetzt verdampfen lassen
•! Sehr polare und thermisch labile Substanzen
•! Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere
•! Selektivität hängt ...... ab
!! von der stationären Phase
!! von der mobilen Phase (Polarität, Gradientselution)
•! Stofftransport in flüssiger Phase ist deutlich langsamer
(kleinere Diffusionskoeffizienten), Hochdruck ist nötig
•! Analytische, Präparative und Produktive
12.11.2008 AC – BPBS HS08 4
Apparatur
Schematisch HPLC
12.11.2008 AC – BPBS HS08 5
300 – 400 bar!LM 10 ml/min!
(5) Vorsäule/Trennsäule!
(1b) LM Aufteilungsventil!
He/Ar
(1a) LM Behälter!
(6) Detektor!
(4) Injektorventil!
(3) Filter!
(2) Pumpe!
Eluentvorrat (Entgaser, Aufteilungsvalve)!
Pumpe (reproduzierbar und konstant Druck)!
Injektor (bestimmte Menge zur Säule)!
Filter/Vorsäule (fein Partikel)!
Säule !
Detektor!
Vor- und Nach-Derivatisierungsteile!
6-Wege-Ventile
12.11.2008 AC – BPBS HS08 6
Probenschleife!
zur Säule! zur Säule!
Probe ein!
Probe aus!
Eluens! Eluens!
Probe ein!
Probe aus!
Laden ! Injizieren!
HPLC Säule
12.11.2008 AC – BPBS HS08 7
Physikalische Eigenschaften:!
•! Partikelgrösse, Form und
Grössenverteilung
•! Porosität, Porengrösse, Oberfläche
und Volumen
•! Stärke (mechanisch) gegen Druck und
Lösungsmettel (Bruch und Deformation)
Stahlrohre porösen Partikeln (3-10 !m) HPLC Säule
L: 10-50 cm
ID: 1-10 mm
SiO2: ideale SP (NP)
Al2O3, ZrO2
Polymere: Copolymere von
Styrol und Divinylbenzol
Trennprinzip
12.11.2008 AC – BPBS HS08 8
Normalphasenchromatographie – Adsorption/Verteilung
Umkehrphasenchromatographie – Verteilung/Adsorption
Grössenausschlusschromatographie – Molekülgrösse
Ionenaustauschenchromatographie – Ionische Wechselwirkung
Affinitätschromatographie – Ligand-Bindungsaffinität
Komplexierungschromatographie – Metal-Ligand-Komplexierung
Chiralchromatographie – Diastereomere-Bildung
Stationäre Phase Mobile Phase Elutionsreihenfolge
der Analyten
Bezeichnung
polar apolar (z.B. Hexan) apolar vor polar Normalphasen (NP)
apolar Polar (z.B. Wasser) polar vor apolar Umkehrphasen
(RP: reversed-phase)
!
12.11.2008 AC – BPBS HS08 9
Klassische Theorie
!
K =A[ ]
S
A[ ]M
!
v =L
tR
!
u =L
tM
!
k = KVs
VM
!
k =tR" t
M
tM
=tR
'
tM
!
" =K
B
KA
!
" =kB
kA
!
" =(tR
')B
(tR
')A
!
N = Neff "k +1
k
#
$ %
&
' (
2
=tR'
)
#
$ %
&
' (
2
"k +1
k
#
$ %
&
' (
2!
N =L
H=tR
2
" 2=16
tR
w
#
$ %
&
' (
2
!
tR
'= t
R" t
M
Trennfaktor / Selektivätsfaktor
Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor
Retentionszeit / Geschwindigkeit
Verteilungskoeffizient
Auflösung !
H =L
16
w
tR
"
# $
%
& '
2
Bodenzahl und Bodenhöhe
!
R =tB" t
A
wB
+ wA
2
=2(t
B" t
A)
wB
+ wA
!
R =" #1
"
$
% &
'
( ) *
kB
1+ kB
*N
4
norm
iert
e S
ignalh
öhe h
tM
tA
tB
ZeitwA wB
B
A
12.11.2008! AC – BPBS HS08 10!
Van Deemter Gleichung
Minimaler H-Wert!
Theore
tisc
he B
odenhöhe H
!
!
H = 2" # dp +2kD #DM
u+ u #
f (dp2,dc
2)
DM
+q # k # d f
2
(1+ k)2DS
$
% &
'
( )
optimale u!
Minimum H!
A! B! C!
12.11.2008 AC – BPBS HS08 11
Eddy Diffusion
A Term: die eddy Diffusion
(diese tritt nur bei gepackten Säulen auf) !
H = A +B
u+ C " u
Wegen Umwanderung der Molekül durch die Partikel des
Packungs-materials legen die Analyten unterschiedliche Weglängen zurück.
Ausmass
Homogenität
Dichte
!
A = 2 " # " dpdp Teilchendurchmesser
! Packungsfaktor
1
2
1 2
! "
12.11.2008 AC – BPBS HS08 12
Longitudinale Diffusion
B Term: die longitudinale Diffusion
!
H = A +B
u+ C " u
!
B
u=2k
DDM
u
DM: Diffusionskoeffizienten
in der mobilen Phase, kD: Labyrinthfaktor,
constant
In GC: B Term => einen
entscheidenden Beitrag zu
Peakverbreiterung leistet,
insbesondere bei niedrigen u.
In der LC kann der B-Term wegen der sehr kleinen DM-Werte ignoriert werden.
12.11.2008 AC – BPBS HS08 13
Massentransport-Effekte
C Term: die Masstransfer zwischen den zwei Phasen
!
CM " u =f (dp
2,dc
2)u
DM
In der mobilen Phase
In HPLC, klein DM => grosse CM
!
C " u = CS" u + C
M" u
Gleichgewichtseinstellung zwischen S/M Phasen benötigt Zeit => da die
mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand nicht vollständig einstellen => Zunahme der Höhe eines theoretischen Boden
(HETP)
!
H = A +B
u+ C " u
!
CS " u =qk " d f
2" u
(1+ k)2"DS
!
CS" u =
2td" k " u
(1+ k)2
Gleichgewichts
einstellung
In flüssigstationären Phase
Filmdicke df und DS
In feststationären
Phase sehr klein
Desorptions-geschwindigkeit td "0
HETP
u
12.11.2008 AC – BPBS HS08 14
Mobile Phase
Reinheit, Inert, Preis
Korrosionsbeständigkeit, Toxizität
UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex
Mischbarkeit
Haltbarkeit
!! Elutionsstärke
!! Selektivität Polarität, Viskosität!
Reihenfolge der Lösungsmittel nach zunehmender Polarität
12.11.2008 AC – BPBS HS08 15
n-Heptan, n-Hexan, Cyclohexan, Isooctan
Tetrachlorkohlenstoff
Toluen, Chlorbenzen, Benzen
Diethylether, Chloroform, Dichlormethan
1-Butanol, Pyridin, Acetonitril, 2-Propanol
Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Aceton
Ethanol, Methanol, Dimethylformamid
Wasser, wässrige Pufferlösungen
Polarität von Molekülen
12.11.2008 AC – BPBS HS08 16
Eluent–Gradient
12.11.2008 AC – BPBS HS08 17
Gradiententrennung: Eluent wird
während des Laufs verändert.
Isokratische Trennung: Eluent bleibt
während des Laufs unverändert.
Stationäre Phase
12.11.2008 AC – BPBS HS08 18
Original SiO2, Al2O3: Polare OH-Gruppe
Si
OH
Si
R2
ClR
R1Modifikation:
Si
R1
R2
R
Si
O
SiOH HN[Si(CH3)3]2
Entcapping:
Si(CH3)3SiO
19.11.2008 AC – BPBS HS08 19
Normalphase (NP)
O Si
R1
R2
CN
O Si
R1
R2
NH2
O Si
R1
R2
O OH
OH
Cyano (C3–CN)
Modifizierte polare NP:
Amino (C3–NH2)
Diol (C3–OCH2CH(OH)CH2(OH)
12.11.2008 AC – BPBS HS08 20
Modifizierte NP-Säule
Nonpolare Mobile Phase
z.B., Kohlenwasserstoff
Hydrophile Eigenschaft
12.11.2008 AC – BPBS HS08 21
Umkehrphase (RP)
O Si
R1
R2
R
R = C1 – C18
Straight-chain hydrocarbons (C18, C12, C8 C6, C4, C3, C2, C1)!
Cyclohexyl, Phenyl, Alkylphenyl!
O Si
R1
R2
O Si
R1
R2
O Si
R1
R2
Unpolare Modifikation durch Kohlenwasserstoffketten
12.11.2008 AC – BPBS HS08 22
Umkehrphase (Reversed Phase, RP)
Si
CH3
CH3
(CH2)17R = CH3
Hydrophobe Eigenschaft
12.11.2008 AC – BPBS HS08 23
Spezialphase: IC-Harze
Kationentrennung Anionentrennung
Sulfonsäuren: –SO3– H+ Quartäre Amine: –N(CH3)3
+ OH–
Carbonsäuren: -CO2– H+ Primäre Amine: –NH3
+ OH–
!
Alkylketten + Endgruppe Austauschharze:
Si
OH
Si
R2
ClR
R1Modifikation:
Si
R1
R2
R
Si
O
12.11.2008 AC – BPBS HS08 24
Detektoren für HPLC
•! Brechungsindex-Detektor (RID)
•! UV/Vis-Absorption-Detektor (UVD)
•! Lichtstreudetektor (ELSD)
•! Fluoreszenzdetektor
•! Elektrische Leitfähigkeitsdetektor (für Ionen)
•! Massenspektrometrie (MS)
•! IR, NMR (stop-flow technique)
"! Nachweisgrenze
"! Linearer Messbereich
"! Kompatibilität mit der mobilen Phase
"! Selektivität
"! Flexibilität, Robustheit, Preis
12.11.2008 AC – BPBS HS08 25
UV/vis-Detektor Variiert # oder PDA
(Photodiodenarray)
um ein ganzes UV-
Spektrum aufzu-
nehmen
Br, I, S
Carbonyl Konjugierte
Aromatische
12.11.2008 AC – BPBS HS08 26
Fluoreszenzdetekor Nachweisgrenze +++
Linearbereich +++
Nur einsetzbar für:
•! Nativ
fluoreszierenden
Substanzen
•! Nach derivati-
sierung nicht-
fluoreszierender
Analyten mit einem
Fluoreszenz-
marker
12.11.2008 AC – BPBS HS08 27
Massenspektrometrische Detektor
Interface – LC und MS!
Senkrecht!Offline!
räumlich
zeitlich
12.11.2008 AC – BPBS HS08 28
Brechungsindex-Detektor refractive index detectors, RID
Universell, aber geringe Empfindlichkeit
wegen kleiner RID-Unterschied von LM und Analytenmolekülen
12.11.2008 AC – BPBS HS08 29
Verdampfungs-Lichtstreudetektor ELSD
EBULIZE ELUENT AND
SELECT SMALL DROPLETS TO MINIMIZE
BACKGROUND NOISE
EVAPORATE AT LOW
TEMPERATURE
DETECT LIGHT
SCATTERING
Universell einsetzbarer Detektor, wenn"
•! Analytmolekül keine UV-Absorbtion "
•! Mit einem Brechungsindex-Detektor
nicht detektierbar"
•! Eine Gradientenelution anstatt
isokratischen Laufmittel Partikelgrösse
und -anzahl"
Partikelgrösse und -anzahl!
12.11.2008 AC – BPBS HS08 30
Charakteristika der Detektoren
Detektor Nachweisgrenze Linearer Bereich
Spezielle Eigenschaften des Analytmoleküls oder Bulk-Eigenschaften
von Analytmolekül und Lösungsmittel: Nachweisgrenze, Linearer
Messbereich, Kompatibität mit MP, Selektivität, Flexibilität und
Robustheit, Preis.!
UV/Vis 10–11 g 104
Fluoreszenz 10–14 g 105
Leitfähigkeit 10–8 g.mL–1 105
MS 10–7 – 10–9 g 105
AAS 10–9 – 10–12 g 103
ICP-MS 10–12 – 10–15 g 105
HPLC Trennprinzipien und Unterarten
12.11.2008 AC – BPBS HS08 31
Normalphasenchromatographie – Adsorption/Verteilung
Umkehrphasenchromatographie – Verteilung/Adsorption
Grössenausschlusschromatographie – Molekülgrösse
Ionenaustauschenchromatographie – Ionische Wechselwirkung
Affinitätschromatographie – Ligand-Bindungsaffinität
Komplexierungschromatographie – Metal-Ligand-Komplexierung
Chiralchromatographie – Diastereomere-Bildung
Stationäre Phase Mobile Phase Elutionsreihenfolge
der Analyten
Bezeichnung
polar apolar (z.B. Hexan) apolar vor polar Normalphasen (NP)
apolar Polar (z.B. Wasser) polar vor apolar Umkehrphasen
(RP: reversed-phase)
!
12.11.2008 AC – BPBS HS08 32
Adsorptionschromatographie
Elutrope Reihe:
Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan < Tetrahydrofuran < Acetonitril < Ethanol < Methanol < Wasser
Probenmoleküle Reihenfolge:
Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe < gesättigte Kohlenwasserstoffe
< Aromaten < halogenierte Verbindungen
< Äther < Nitrile < Nitroverbindung < Ester
< Ketone < Aldehyde < primäre Amine
< Amide < Phenole < Carbonsäuren
Präparative Trennung im Labor
Feste stationäre Phase
12.11.2008 AC – BPBS HS08 33
Verteilungschromatographie
Flüssige
stationäre
Phase
Nur chemisch-verbundene flüssige Filme
12.11.2008 AC – BPBS HS08 34
Wechselwirkungsmechanismus
schwach
stark
schwach
stark
Hydrophob
Hydrophil Dipol-Dipol
12.11.2008 AC – BPBS HS08 35
Trennung bei NP/RP Säulen
Unpolare Analyten erst eluiert Polare Analyten erst eluiert
12.11.2008 AC – BPBS HS08 36
Ionenchromatographie (IC)
"! Ionenaustauschchromatographie (Ion Exchange Chromatography)
"! Ionenpaarchromatographie (Ion Pair Chromatography)
"! Ionenausschlusschromatographie (Ion Exclusion Chromatography)
Schnelligkeit, Empfindigkeit, Selektiivität, und Simultanität
Organische Polymere als Trägermaterial, hohen pH-Stabilität; frei
vom ionische Verunreinigungen aus Edelstahl und korrosive Elutionsmittel zu vermeiden
Detektor – Leitfähigkeitsdetektor häufig, aber alle andere Detektoren
auch einsetzen können
Suppressor: Reduktion der Grundleitfähigkeit auf minimalen Wert und
Erhöhung des Signal/Untergrund Verhältnisse
Mobile Phase: Wasser oder Puffer (mit pH)
12.11.2008 AC – BPBS HS08 37
Ionenaustauschchromatographie (IC)
Stationäre Phase mit funktionellen Gruppen
•! SO3–H+ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14
•! COO–H+ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14
•! NR3+OH– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10
•! NR2 (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei
niedrigem, pH 0 – 6.
12.11.2008 AC – BPBS HS08 38
Ionenaustauschschromatographie
Beispiel stark saurer Kation-
enaustauscher:
Harz-SO3H + M+(aq) " Harz-
SO3M + H+(aq)
Der Selektivitätskoeffizient S
für den Austausch zweier
verschiedener Metallionen ist
gegeben durch den
Quotienten der entsprechend-
en Gleichgewichtskonstanten
K:
S(M1/M2) = K(M1)/K(M2)
More highly charged
molecules are more
tightly bound to the
resin, and so travel
slowly and are eluted
later.
Moderately charged
molecules equilibrating
between the resin and
the moving buffer more
readily.
Less charged molecules
bind less strongly to the
resin, equilibrate with
the moving buffer more
readily, and so travel
rapidly and are eluted
faster.
12.11.2008 AC – BPBS HS08 39
Elutionsreihenfolge
Elutionsreihenfolge für Kationen:
Ba2+ < Ca2+ < Zn2+ < Mg2+ < Cs+ < Rb+ < K+ < NH4+ < Na+ < H+ < Li+
Elutionsreihenfolge für Anionen:
Citrat (COO–)3 < Sulfat < Oxalat (COO–)2 < Iodid < Nitrat (NO3–) <
Phosphat < Bromid < Nitrit (NO2–) < Chlorid <Acetat < Hydroxid
MP: Wasser, Puffer (gewisser pH-Werte einstellen)
Leitfähigkeitsdetektor mit Supressionsäulen
12.11.2008 AC – BPBS HS08 40
Leitfähigkeitsdetektor
•! Universell für Ionenchromatographie
•! Grundleitfähigkeit des Eluenten wird durch Suppressortechnik
erniederigt, um die Nachweisgrenzen zu senken. !
" = "0# $ % C
Harz-NR3OH + H+ + Cl– ––> Harz-Cl + H2O
Harz-SO3H + Na+ + HCO3– ––> Harz-Na + H2CO3
Für Kationenanalytik, Suppressorsäule mit OH– beladen :
Für Aionenanalytik, Suppressorsäule mit Protonen beladen:
Harz-SO3H + Na+ + Cl– ––> Harz-Na + H+
+ Cl–
Harz-SO3H + Na+ + Br– ––> Harz-Na + H+
+ Br–
12.11.2008 AC – BPBS HS08 41
Suppressor
Suppressor (Kation-Typ)
Harz-SO3H + Na+ + HCO3– ––> Harz-Na + H2CO3
Harz-SO3H + Na+ + Cl– ––> Harz-Na + H+ + Cl
–
Harz-SO3H + Na+ + Br– ––> Harz-Na + H+ + Br
–
Grundleitigkeit zu erniedrigen
Analyt-signal zu verstärken
# (H+) = 350
# (Na+) = 50
Beispiel von Cl– and Br
–
NaHCO3– als Eluent
12.11.2008 AC – BPBS HS08 42
Gelpermeationschromatographie (GPC) Grössenausschluss-Chromatographie/Size Exclusion Chromatography
Mechanismus: Grösse / Molekularer Radius
SP:
5 – 100,000 nm
Ausschluss-Limit
Eindringen-Limit
Geeignet für
10% Unterschied in MW
Kein Wechselwirkung
Biopolymer, Polymer
Organische Moleküle
12.11.2008 AC – BPBS HS08 43
12.11.2008 AC – BPBS HS08 44
Größenausschlusschromatographie
!
tR"
1
log10 MW
CH3(CH2)nCOOH
12.11.2008 AC – BPBS HS08 45
Dünnschichtchromatographie (HPTLC)
DC-laufmitteltest
Wahl der DC Platte
Probeauftragen
Laufmitteltest
Entwicklung
Detektion
Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates C 18-50 (50% silanization)
and C–18-100 (100% silanization) with fluorescent indicator
12.11.2008 AC – BPBS HS08 46
Entwicklung der DC
Laufmittel
Wahl des Laufmittels
(Rein oder Gemisch)
Entwicklung
12.11.2008 AC – BPBS HS08 47
Selektivität und Trennleistung
!
Rf =Sx
S f
Auswertung
