agua dulce, Cherax quadricarinatus (Decapoda, … · ABREVIATURAS ... 1.4 Sistema reproductor...

Estudio de la diferenciación y madurez sexual en la langosta de agua dulce, Cherax quadricarinatus (Decapoda, Astacidea,

Parastacidae) y su aplicación en acuicultura

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires, Área Ciencias Agropecuarias

Fernanda Jimena Vazquez Licenciada en Ciencias Biológicas - Universidad de Belgrano - 2003

Lugar de trabajo: Laboratorio de Biología de la Reproducción y el Crecimiento de Crustáceos Decápodos. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental,

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires

Escuela para Graduados Ing. Agr. Alberto Soriano Facultad de Agronomía – Universidad de Buenos Aires

COMITÉ CONSEJERO

Director de tesis Dra Laura Susana López Greco

Licenciada en Ciencias Biológicas (Universidad de Buenos Aires) Doctora en Ciencias Biológicas (Universidad de Buenos Aires)

Consejero de Estudios Dr Enrique Chaneton

Licenciado en Ciencias Biológicas (Universidad CAECE) Doctor en Filosofía (University of London, Reino Unido)

JURADO DE TESIS

Dra Laura Susana López Greco Licenciada en Ciencias Biológicas (Universidad de Buenos Aires)

Doctora en Ciencias Biológicas (Universidad de Buenos Aires)

JURADO Dr. Gabriel Manrique

Licenciado en Cs. Biológicas (Universidad de Buenos Aires) Doctor en Ciencias Biológicas (Universidad de Buenos Aires)

JURADO Dr. Daniel Rocatagliata

Licenciado en Cs. Biológicas (Universidad de Buenos Aires) Doctor en Ciencias Biológicas (Universidad de Buenos Aires)

JURADO

Dr. Tomás Atilio Luppi Licenciado en Cs. Biológicas (Universidad de Buenos Aires) Doctor en Ciencias Biológicas (Universidad de Buenos Aires)

Fecha de defensa de la tesis: 07 de Julio de 2011

Diferenciación y madurez sexual en Cherax quadricarinatus

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DEDICATORIA “Al motivo y gran amor de mi vida…mi hijo Benjamín”


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AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas por el apoyo que he recibido para mi formación académica y porque permite que se pueda seguir haciendo ciencia en Argentina.

A la Universidad de Buenos Aires por los proyectos UBACYT X143 y X458, al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas por el proyecto PIP 129 y a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por los proyectos PICT 953 y 01187 dirigidos por la Dra. Laura López Greco que financiaron esta tesis.

A mi Directora, la Dra. Laura López Greco, porque me enseñó el camino de la ciencia y formó parte de mi gran formación académica.

Al Dr. Enrique Chaneton y a la Ing. Alicia Hirschhorn por su compromiso frente a los diversos problemas y el tratar de encontrar una solución. Al Dr. Cipriotti y a la Sra. Mabel, por su amabilidad e inmensa atención para con los alumnos.

Al Dr. Rolando Quirós quien me acompañó como Consejero de Estudios en los

primeros pasos de esta Tesis.

A la Escuela para Graduados Ing. Agr. Alberto Soriano, porque sus integrantes mostraron siempre interés por sus alumnos, y la posibilidad de plantear problemas y ser escuchado…que no es poco. En especial a: Romina, María Laura, Melina y Alejandra, mil gracias por su paciencia y comprensión.

Al Dr. Enrique Rodriguez, por su ayuda, buena predisposición y atención desinteresada.

Al Dr. Claudio Pereira, por su gran apoyo e ideas sugeridas desinteresadamente.

A mí hijo Benjamín, porque su sonrisa diaria es la que me dá la fuerza para seguir luchando y salir adelante…siendo el principal motivo de mi vida.

A mis padres, por el amor incondicional y el GRAN PILAR que son en mi vida.

A mis amigos, por sus consejos diarios, por el afecto que me brindan día a

día…Simplemente por ser de gran calidad HUMANA.

En especial a las chicas del laboratorio 50, 1 y 101….por los mates, experimentos y demás cosas compartidas en tantos años de trabajo….transpirando literalmente la camiseta en el 101.

A mis amigas/os del alma: Anu, Caro, Naty C, Lia, Dani, Xime, Anita y Marianita….seres especiales que adoro.


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A Marce, Gastón, Jo y Tinchín por sus consejos y apoyo incondicional.

A Natalia Ruiz, por estar muy presente y también formar parte de este trabajo.

A Juan Felipe, por las hermosas fotos, que recrean mi mente para poder seguir escribiendo.

A TODOS ELLOS….Gracias Totales!!!


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DECLARACIÓN

“Declaro que el material incluído en esta tesis es, a mí mejor saber y entender, original, producto de mi propio trabajo (salvo en la medida en que se identifique explícitamente las contribuciones de otros), y que este material no lo he presentado, en forma pacial o total, como una tesis en ésta u otra situación”

Lic. Fernanda J. Vazquez


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PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS

1- VAZQUEZ, F.J. and L. S. LÓPEZ GRECO. 2007. Sexual differentiation in the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus (Decapoda, Parastacidae). Revista de Biología Tropical (Internacional Journal of Tropical Biology and Conservation): 55: 33-38

2- VAZQUEZ, F.J. and L. S. LÓPEZ GRECO. 2007 Intersex females in the red claw freshwater crayfish Cherax quadricarinatus (Decapoda, Parastacidae). Revista de Biología Tropical (Internacional Journal of Tropical Biology and Conservation): 55: 25-32.

3- VAZQUEZ, F.J, TROPEA, C. and L.S. LOPEZ GRECO. 2008. Differentiation of the female reproductive system and the onset of maturity in the freshwater crayfish “red claw” Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae) through a macroscopic and microscopic approach. Invertebrate Biology 127 (4): 433-443.

4- VAZQUEZ, F. and L.S. LÓPEZ GRECO 2010. Differentiation of the male primary and secondary sexual characters and the onset of maturity in the freshwater crayfish “red claw” Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae). Animal Biology 60 (14):195-208.

Se han presentado también 13 resúmenes en Congresos Internacionales y Nacionales con los resultados de la tesis durante el período (2006-2010)


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INDICE GENERAL

DEDICATORIA………………………………………………………………….…… iii

AGRADECIMIENTOS…………………..……………………..………….…….……. iv

DECLARACIÓN……………..……………………………………...............................vi

PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS……………………….....................vii

INDICE GENERAL………………………………………………………….………. viii

INDICE DE TABLAS……………………………………………………….….……...xii

INDICE DE FIGURAS….……………………………………………....................... xiv

ABREVIATURAS …………………………………….………………………….... xviii

RESUMEN ………………………………………………………………………….. xix

ABSTRACT……………………………………………………………………….......xx

CAPITULO 1: Introducción General …………………………………………….....….1

1.1 Antecedentes ……………………………………………………...….……...…..1

1.2 Diferenciación sexual, termolabilidad y relaciones morfométricas ………....... 2

1.3 Sistema reproductor femenino en crustáceos decápodos......................................3

1.4 Sistema reproductor masculino en crustáceos decápodos....................................4

1.5 Intersexualidad en crustáceos decápodos..…………………………..…...…......4

1.6 Organización de la tesis..……………………….…….…..……………….….......5

1.7 Objetivo general ……………………………………………………..……….…..6

1.8 Objetivos específicos.……………………..……………………………………....6

CAPITULO 2: “Diferenciación sexual y efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual en la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (von Martens, 1868) (Decapoda, Parastacidae)”.......................................................................8


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2.1 INTRODUCCIÓN …………………………………………….…….…..……....8

2.2 OBJETIVO …………………………………………………………………....…9

2.3 MATERIALES Y MÉTODOS ……………………..……………….….…….. 10

2.3.1 Obtención y mantenimiento de los animales .……………..…………. 10

2.3.2 Identificación de caracteres sexuales secundarios…………………........ 10

2.3.3 Efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual…....………… 11

2.4 RESULTADOS ……………………………...…………………………….….. 12

2.4.1 Identificación de los caracteres sexuales secundarios……………....... 12

2.4.2 Efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual…………........ 13

2.5 DISCUSIÓN ………………………….…………………………………….…. 16

CAPITULO 3: “Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor y de la madurez sexual en hembras de Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)” ..……………….……….…………………………………. 17

3.1 INTRODUCCIÓN ………………………………..…………………………… 17

3.2 OBJETIVO…………………………………………………………………….. 18

3.3 MATERIALES Y MÉTODOS ………...…..………….………………………. 18

3.3.1 Obtención y mantenimiento de los animales …………..….………….. 18

3.3.2 Mediciones y determinaciones macroscópicas ……..……….…………18

3.3.3 Procesamiento y análisis histológico ………..……..…………………. 19

3.4 RESULTADOS …………………………………..…………………….……… 20

3.4.1 Caracterización del ovario ……………….……………………….……20

3.4.2 Estadio I ……………………..…………………..…………...………...23

3.4.3 Estadio II ……………………..………………….…….…………….... 26

3.4.4 Estadio III ……………………..…………………….………………… 28

3.4.5 Estadio IV ………………………………….…………..……………… 30


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3.4.6 Caracterización de ovario de post-puesta ..…..………….……………. 32

3.4.7 Conectores y oviductos ……………………..……….……….………... 34

3.5 DISCUSIÓN …………………………………………..………....……………. 35

CAPITULO 4: “Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor y de la madurez sexual en machos de Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae) y de las variaciones ontogenéticas de las estructuras copulatorias”……. 57

4.1 INTRODUCCIÓN .…………………………..….……….……….…….……....39

4.2 OBJETIVO ……………………………………………………………………. 40

4.3 MATERIALES Y MÉTODOS ………………….……………….……....……. 41

4.3.1 Análisis macroscópico y microscópico …….……...………......….….. 41

4.4 RESULTADOS ……………..………………………….……………………… 41

4.4.1 Estadio I ……….…...………………………….………………………. 41

4.4.2 Estadio II ……………………………………………………………… 44

4.4.3 Estadio III ……………………………………….………….................. 45

4.5 DISCUSIÓN ……………………………..…………………..….…………..….51

CAPITULO 5: “Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor de los intersexos y de la madurez sexual en “intersexos hembras” de Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)”.……………………………………....55

5.1 INTRODUCCIÓN ……………………………………………….……………..55

5.2 OBJETIVO ……………………………………………………………………...56

5.3 MATERIALES Y MÉTODOS ……………...………………….…….………...56

5.3.1 Análisis macroscópico y microscópico……….….……………......……56

5.4 RESULTADOS ……………….………………………………….…………....57


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5.4.1 Intersexo Tipo I ………………..……………………………….….......58

5.4.2 Caracterización del ovario de “intersexo hembra” ……..….….....…..58

5.4.3 Intersexo Tipo II …………………………………………….….….…..59

5.4.4 Intersexo Tipo III …………………………….…………...……...…….60

5.4.5 Intersexo Tipo IV ………………………………………………...……63

5.5 DISCUSIÓN ………………………………………………….…..………...…65

CAPITULO 6: “Relaciones morfométricas en hembras, machos e intersexos hembras de la langosta de agua dulce, Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)”…………………………………………………………………………. 68

6.1 INTRODUCCIÓN ……………………………………………….……………..... 68

6.2 OBJETIVO ………………………………………………………………..…....69

6.3 MATERIALES Y MÉTODOS …………………………………….…..…..…...70

6.4 RESULTADOS ……………………………..……………………..…..……… 72

6.4.1 Comparación entre sexos……………………….…………..….…..…..72

6.4.2 Crecimiento alométrico entre sexos………………..….……………… 72

6.5 DISCUSIÓN ………………………...…………………….…….………....… 78

CAPITULO 7: Discusión general ……………….…………………………..………. 80

7.1 DISCUSIÓN GENERAL……………...……………...……………….….....…80

7.2 CONCLUSIONES…………….………………………….…….………...….…81

BIBLIOGRAFIA ……………………………………….……….…………..…..….….83


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INDICE DE TABLAS CAPITULO 2 Tabla 2.1: Efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual en juveniles tempranos de C quadricarinatus. Para los resultados del año 2004 las proporciones se indican entre paréntesis, refiriéndose las de cada sexo al total de sobrevivientes. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p<0,05)………………………………………………...……………........14 Tabla 2.2: Proporciones de sobrevivientes, hembras, machos e intersexos de C. quadricarinatus en los distintos años expuestos a temperatura normal (25-27 °C) y alta (30-32°C) ……………………………………..….…….15 CAPITULO 3 Tabla 3.1: Caracterización macroscópica y microscópica de los distintos estadios de diferenciación ovárica de C. quadricarinatus y su relación con el tamaño de la hembra evaluado como, largo total del cefalotórax (LT), largo post-orbital (LPO) y peso (g). Todas las variables se expresan como media ± error estándar y para el diámetro de los oocitos también se incluyen el valor mínimo y máximo ……...…………………………….24 CAPITULO 4 Tabla 4.1: Caracterización macroscópica y microscópica de los diferentes estadios de diferenciación sexual en machos de C. quadricarinatus. LT (largo total), L (appendices masculinae de tipo lobulado), E (appendices masculinae de tipo elongado). (+) Indica presencia de un caracter, mientras que (-) indica la ausencia de caracter. La diferencia cualitativa para un carácter se indica por el aumento del número de (+)…………….………42 CAPITULO 5 Tabla 5.1: Observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes patrones de intersexualidad en C. quadricarinatus……………………………………………..…………....57 Tabla 5.2: Caracterización macroscópica y microscópica de los distintos estadios de diferenciación ovárica en intersexos hembra de C. quadricarinatus y su relación con la talla evaluada como, (LT) largo total del cefalotórax, (LPO) largo post-orbital y peso (g). Todas las variables se expresan como media ± error estándar y para el diámetro de los oocitos el también se incluyen el valor mínimo y máximo…………….…………...59


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Tabla 5.3: Tipos de intersexualidad con ó sin hermafroditismo en diferentes especies de Parastacidae. (H) hembras, (ISX) intersexos, (ISX H) intersexo hembra, (ISX M) intersexo macho, (ISX Trans) intersexo transicional, (M) machos………………………................……….......….67 CAPITULO 6 Tabla 6.1: Relaciones morfométricas entre variables reproductivas y de referencia de talla. Todos los valores F indicados con* corresponden a diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). LT1 y LPO2 corresponden a la intercepción de las rectas de juveniles y adultos, estimadas por el test de Somerton. (A) adulto, (ALP) alto de própodo, (ANP) ancho de própodo, (J) juvenil, (LT) largo máximo del cefalotórax (LP) largo de própodo, (LPO) largo post-orbital…………………..….…73


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INDICE DE FIGURAS

CAPITULO 2 Fig. 2.1: Porcentaje de juveniles cuyo sexo pudo ser determinado en función del tiempo transcurrido desde su independencia de las hembras (estadio juvenil III) ………………………...…………………………….12 CAPITULO 3 Fig. 3.1: Medición del largo total del cefalotórax (LT) desde el extremo anterior del rostro hasta el borde posterior del caparazón y (LPO) desde el borde posterior de la órbita ocular hasta el margen posterior del caparazón con calibre de precisión 0,01mm………………...……………….…..… 19

Fig. 3.2: Esquema del ovario de C. quadricarinatus en diferentes estadios. (C) conectores, (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OS) oocito secundario, (OVI) oviductos ……………….….21 Fig. 3.3: (a). Esquema del ovario de C. quadricarinatus. Ovario rodeado por pared ovárica. Todos los oocitos se encuentran rodeados por células foliculares y se observan nidos de oogonias en el epitelio ovárico cerca de la luz. (b). Corte transversal del ovario. Teca ovárica rodeando oocitos primarios. (c). Detalle de teca ovárica rodeando un oocito (d). Ovario de hembra ovígera con pared ovárica distendida. (e). Detalle de pliegue de la pared ovárica con capa de fibras musculares. (CF) células foliculares, (CM) capa muscular, (EO) epitelio ovárico (LO) lumen ovárico, (OG) oogonias, (OS) oocito secundario, (OP) oocito primario, (PL) pliegues, (PO) pared del ovario, (POG) pared ovárica gruesa, (TC) tejido conectivo (TO) teca ovárica………………………………………….....………..…22 Fig. 3.4: (a) y (b). Esquema de ovario en estadio I como cordones paralelos y forma de H, respectivamente. (c) y (d). Cortes longitudinales y transversales de ovario en estadio I teñidos con hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson, respectivamente. (CF) células foliculares (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OP) oocito primario, (OVI) oviducto, (PO) pared ovárica…………….….......25 Fig. 3.5: (a). Esquema de ovario en estadio II en forma de H con sus conectores diferenciados. (b), (c) y (d). Cortes histológicos en sección transversal del ovario en estadio II (teñidos con hematoxilina-eosina). (C) conectores, (CF) células foliculares (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LO) lúmen ovárico, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OP) oocito primario, (OVI) oviductos, (PO) pared ovárica ……………………..……27 Fig. 3.6: (a). Esquema de ovario en estadio III. (b). Vista general de sistema reproductor femenino, con conectores y lóbulos ováricos anteriores claramente diferenciados. (c) y (d). Cortes transversales de ovario en


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estadio III y detalle de oocitos intermedios (teñidos con hematoxilina eosina). (C) conector, (CF) células foliculares, (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LOP) lóbulos ováricos posteriores (OI) oocito intermedio, (OP) oocito primario (OS) oocito secundario, (OVI) oviductos………………..29 Fig. 3.7: (a) Esquema de ovario en estadio IV. (b). Vista general de ovario de color verde oliva. (c) y (d). Cortes transversales de ovario maduro (teñido con tricrómico de Masson). (C) conector, (CF) células foliculares, (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LO) lumen ovárico, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OP) oocito primario, (OS) oocito secundario, (OVI) oviductos, (PO) pared ovárica, (PV) plaquetas vitelinas........................................................................................................31 Fig. 3.8: (a). Esquema de ovario de hembra ovígera de C. quadricarinatus. (b) y (c). Cortes transversales de ovario (teñido con tricrómico de Masson) con folículos vacíos. (d). Detalle de oocito intermedio rodeado por una gruesa pared ovárica (teñido con tricrómico de Masson). (CF) células foliculares, (EO) epitelio ovárico, (FV) folículos vacíos, (LO) lumen ovárico, (OG) oogonias, (OP) oocito primario, (OS) oocito secundario, (PO) pared ovárica, (TC) tejid conectivo, (TM) Túnica muscular………………………………………………..………………….33 Fig. 3.9: (a). Corte longitudinal de conectores de ovario de C. quadricarinatus. (b). Detalle de la pared del conector. (c). Vista general de oviductos en un corte longitudinal de ovario. (ES) epitelio secretor, (L) lumen, (TC) tejido conectivo, (TM) túnica muscular ………………..……34 CAPITULO 4 Fig. 4.1: Estadio I (a). Corte transversal de testículo en vista general. (b). Corte transversal de tubo colector conteniendo espermatozoides. (c). Corte transversal de testículo mostrando vaso deferente proximal sin espermatóforo pero comenzando la síntesis de la capa primaria. (d). Esquema de appendices masculinae lobulados en vista dorsal. (CP) capa primaria del espermatóforo, (CX) coxa del quinto par de pereiópodos, (ESPZ) espermatozoides, (LI) lóbulo inmaduro, (LM) lóbulo maduro, (TC) tubo colector, (VD) vaso deferente………………………………….…….43 Fig. 4.2: Estadio II (a). Corte longitudinal de testículo. (b). Detalle de lóbulo testicular abierto al tubo colector. (c). Diferenciación de la capa primaria del espermatóforo dentro del vaso deferente. (d). Diferenciación de la capa secundaria del espermatóforo dentro del vaso deferente. (CP) capa primaria del espermatóforo, (CS) capa secundaria del espermatóforo, (ESPZ) espermatozoides, (LI) lóbulo testicular inmaduro, (LT) lóbulos testiculares, (TC) tubo colector………………….……………………..….44 Fig. 4.3: (a). Appendices masculinae de tipo lobulado en el estadio II. (b). Quelípedo sin “red patch” diferenciado en estadio II. (c) y (d). Corte transversal de testículo en estadio III, mostrando lóbulos maduros, tubo


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colector y lóbulos evacuados. (e). Detalle de lóbulo testicular con espermatozoides. (f). Detalle de lóbulo evacuado. (ESPZ) espermatozoides, (LE) lóbulos evacuados, (LM) lóbulos maduros (TC) tubo colector...…... 46 Fig. 4.4: Espermatóforo dentro del vaso deferente distal en machos de estadio III. (a) y (b). Vista general y detalle del vaso deferente distal con algunas áreas de capa primaria “vacía” de espermatozoides. (c) y (d). Vista general y detalle del vaso deferente distal con la capa primaria rodeando espermatozoides en machos de estadio III B. (CP) capa primaria, (CS) capa secundaria, (ESPZ) espermatozoides……………………..…………..……48 Fig. 4.5: Caracteres sexuales secundarios en machos de estadio III. (a). Appendices masculinae elongados (estadio III A). (b). Esquema de appendices masculinae “cónicos” en vista ventral (estadio III A). (c). Appendices masculinae elongados (estadio III B). (d). Esquema de appendices masculinae “tubulares” en vista ventral (estadio III B). (e). Esquema de appendices masculinae con gonoporos en vista dorsal (estadio III B). (f). Quelípedo con “red patch” diferenciado. (CX) coxa del quinto par de pereiópodos …………………………...………………………………..49 Fig. 4.6: Esquema del sistema reproductor masculino. (a). Esquema de testículo en estadio I. (b). Esquema de testículo en estadio II. (c). Esquema de testículo en estadio III. (P) puente testicular, (VDD) vaso deferente distal, (VDM) vaso deferente medio, (VDP) vaso deferente proximal, (T) testículos ………………………………………………………………… 50 CAPITULO 5 Fig 5.1: Esquema de los cuatro tipos de intersexos observados. (a). Intersexo Tipo I. (b). Intersexo Tipo II. (c). Intersexo Tipo III. (d). Intersexo Tipo IV …………………………………………………………61 Fig 5.2: (a). Intersexo Tipo III con ovario en vitelogénesis primaria y testiculo desarrollado con vaso deferente blanco. (b). Corte transversal de ovario. (c). Corte transversal de testículo maduro. (d). Corte tranversal de vaso deferente conteniendo espermatóforo. (CF) células foliculares, (CP) capa primaria del espermatóforo, (CS) capa secundaria del espermatóforo, (ESPZ) espermatozoides, (LE) lóbulos evacuados, (LI) lóbulo inmaduro, (LM) lóbulos maduros, (OP) oocito vitelogénico primario ……………....62 Fig 5.3: (a). Corte transversal de testículo de intersexo Tipo IV con tubo colector. (b). Corte transversal de testículo con oocito primario. (LI) lóbulo inmaduro, (LM) lóbulos maduros, (OP) oocito vitelogénico primario, (TC) tubo colector……………………………………….....................................64


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CAPITULO 6 Fig 6.1: Foto de C. quadricarinatus. ANP (ancho de própodo), AP (alto de própodo), LP (largo de própodo), LPO (largo post-orbital), LT (largo total de cefalotórax)...................................................………………..................71 Fig 6.2: Crecimiento relativo del ancho del própodo (ANP) en función del largo total del cefalotórax (LT) en hembras (H)…………...…………..….74 Fig 6.3: (a) Crecimiento relativo del alto del própodo (ALP) en función del largo total del cefalotórax (LT). (b) Crecimiento relativo del alto del própodo (ALP) en función del largo post-orbital (LPO). (c) Crecimiento relativo del ancho del própodo (ANP) en función del largo post-orbital (LPO) en intersexos hembras (ISX)…………………………………..…...76

Fig 6.4: (a) Crecimiento relativo del largo del própodo (LP) en función del largo total del cefalotórax (LT). (b) Crecimiento relativo del largo del própodo (LP) en función del largo post-orbital (LPO) en machos (M)………………………………………………….…………………..….77


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ABREVIATURAS

A …………………………... Adulto ANP …………………………... Ancho del própodo ALP …………………………… Alto del própodo CF ……………………………. Células foliculares CP …………………………… Capa primaria CS …………………………… Capa secundaria EO ……………………………. Epitelio ovárico ES ……………………………. Epitelio secretor ESPZ …………………………… Espermatozoides FV …………………………….. Folículos vacíos GA ……………………………. Glándula androgénica H …………………………….. Hembra ISX H …………………………….. Intersexo hembra ISX M …………………………….. Intersexo macho ISX TRANS …………………………….. Intersexo transcicional ISX …………………………….. Intersexo J …………………………..... Juvenil L …………………………….. Lumen LE ……………………………. Lóbulos evacuados LI ……………………………. Lóbulos inmaduros LM …………………………….. Lóbulos maduros LO …………………………….. Lumen ovárico LOA ……………………………. Lóbulo ovárico anterior LOP ……………………………. Lóbulo ovárico posterior LP ……………………………. Largo del própodo LPO …………………………… Largo post-orbital LRP …………………………… Largo “red patch” LT …………………………… Largo total M …………………………….. Macho OG ……………………………. Oogonias OS …………………………… Oocito secundario OVI …………………………… Oviductos P …………………………… Puente testicular PC ……………………………. Peso de la “cola” o pleon PL …………………………….. Pliegues PO …………………………….. Pared ovárica POG …………………………….. Pared ovárica gruesa PT ……………………………. Peso Total TC …………………………….. Tejido conectivo TC …………………………….. Tubo colector TM …………………………….. Túnica muscular TO …………………………….. Teca ovárica VDD ……………………………... Vaso deferente distal VDM …………………………….. Vaso deferente medial VDP …………………………….. Vaso deferente proximal


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RESUMEN

Cherax quadricarinatus, es una especie de langosta de agua dulce nativa de Australia y Papua Nueva Guinea que se cultiva en varios países incluyendo Argentina, por lo que las investigaciones acerca de su biología reproductiva están orientadas a conocer las condiciones óptimas de cultivo, y desarrollar técnicas para su reproducción y crecimiento. El objetivo general fue determinar el momento del desarrollo en que ocurre la diferenciación sexual y el posible rol regulador de la temperatura, caracterizar el proceso de diferenciación gonadal y madurez sexual, y los cambios morfométricos asociados. Los resultados indicaron que la diferenciación sexual secundaria ocurre a partir de los 0,23 g aproximadamente, correspondiente al estadio juvenil VI ó VII. La temperatura no ejerció un claro efecto sobre la diferenciación sexual. Las hembras, desde la diferenciación gonadal hasta su maduración, presentaron tres morfotipos ováricos. En función de la coloración ovárica, la estructura histológica y la proporción de los distintos tipos celulares se distinguieron cuatro estadios de desarrollo ovárico: I (blanco-transparente), II (crema pálido-naranja pálido), III (naranja con oocitos verdes) y IV (verde oliva). En los machos se identificaron tres estadios de desarrollo y dos tipos de appendices masculinae ó papilas fálicas. Se reconocieron diferentes patrones de intersexualidad y cuatro posibles combinaciones de aberturas genitales que permitieron definir cuatro tipos de intersexo: intersexo hembra (I), intersexo macho (II), y dos tipos de intersexo macho-hembra (III y IV). Los resultados del análisis morfométrico mostraron que los intersexos hembras representan un tipo sexual morfométricamente diferenciado de las hembras y los machos, aunque desde el punto de vista funcional son hembras. Los cambios en las relaciones morfométricas de las dimensiones de los quelípedos se vincularon con el inicio de la la madurez sexual desde el punto de vista histológico en los machos e intersexos hembra. PALABRAS CLAVES Cherax quadricarinatus, diferenciación sexual, hembras, machos, intersexos, madurez sexual, morfología gonadal, ovarios, testículos, morfología funcional, filogenia, ontogenia, caracteres sexuales, intersexos hembra, caracteres sexuales primarios, caracteres sexuales secundarios, appendices masculinae, “red patch”, morfometría, temperatura, reversión sexual, termolabilidad.


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"Study of the sexual differentiation and onset of sexual maturity of the freshwater crayfish, Cherax quadricarinatus (Decapoda, Astacidea, Parastacidae) and its

application in aquaculture" ABSTRACT Cherax quadricarinatus is a freshwater crayfish native of Australia and Papua New Guinea cultured in intensive and semi-intensive systems in several countries, including Argentina. Hence, the study of its reproductive biology is aimed at determining the optimal culture conditions and at developing techniques for its reproduction and growth. In this sense, the general objective of the present work was (1) to precise moment determine the time during development in which sexual differentiation occurs, and the possible role of temperature as a modulating factor, (2) to characterize the gonad differentiation and the onset of sexual maturity and the associated morphometrical changes. Secondary sexual differentiation occurs at an approximate weight of 0.23 g, which corresponds to the juvenile stage VI or VII. Temperature did not affect sexual differentiation under the assayed conditions. Females presented three different ovarian morphotypes from the gonad differentiation to its maturation. Based on the color and histological structure of the ovary, and the proportion of the different cellular types, four stages were distinguished: I (white- transparent), II (pale cream- pale orange), III (orange with green oocytes) and IV (olive green). The macroscopic and histological analysis of the male reproductive system allowed the identification of 3 developmental stages and two types of appendices masculinae. The macroscopic and microscopic observations of intersex individuals demostrated the existence four of different intersexuality patterns: female intersex (I), male intersex (II), and two types of male-female intersex (III and IV). The results of the morphometric study show that the female intersex represents a different morphometric sexual type with respect to males and females, although they are functionally females. The morphometric relationships analyzed would reflect an association with the onset of sexual maturity from the histological point of view for males and intersex females. The changes in the cheliped dimensions are asociated with the onset and histological sexual maturity and the gonads in females, males and female intersex. KEYWORDS Cherax quadricarinatus, sexual differentiation, females, males, intersex individuals, sexual maturity, gonad morphology, ovary, testis, functional morphology, phylogeny, ontogeny, sexual characters, female intersex, primary sexual characters, secondary sexual characters, appendices masculinae, red patch, morphometry, temperature, sexual reversion, thermolability.

1 Diferenciación y madurez sexual en Cherax quadricarinatus

CAPITULO 1

Introducción General

1.1 Antecedentes

Los crustáceos decápodos conforman un orden con aproximadamente

10.000 especies vivientes tanto marinas como de agua dulce y algunas especies que son terrestres en gran parte de su vida como adultos (Martin y Davis 2001).

Las especies del suborden Pleocyemata se caracterizan por incubar los huevos adheridos a los pleópodos hasta la eclosión, por la ausencia de branquias de tipo dendrobranquias y por abarcar los crustáceos conocidos como camarones no peneidos, langostas y cangrejos. La primera larva tiene características de zoea, excepto en aquellos casos de desarrollo directo, como ocurre en Cherax quadricarinatus, donde el individuo que eclosiona presenta todos sus somitos y apéndices diferenciados, con características similares al adulto (Boschi et al. 1992; Lawrence y Jones 2002).

El Infraorden Astacidea incluye dos superfamilias de langostas de agua dulce: Astacoidea y Parastacoidea (Martin y Davis 2001). Astacoidea incluye las familias Astacidae y Cambaridae del hemisferio norte y Parastacoidea incluye la familia Parastacidae del hemisferio sur (Scholz 2002; Hobbs et al. 2007).

C. quadricarinatus o langosta de “pinzas rojas” (“red claw”) es una especie de langosta de agua dulce de la familia Parastacidae originaria de la región norte de Australia y del sur de Papua Nueva Guinea, cuyo aprovechamiento acuícola comenzó a fines de la década del 80 y continúa siendo una producción de tipo intensiva y semi-intensiva en expansión (Lawrence y Jones 2002; Edgerton 2005; Rodgers et al. 2006). Es una especie de elevado precio en el mercado, rápido crecimiento, baja agresividad, sencilla reproducción con buena fecundidad y con desarrollo directo. Tiene una rápida aceptación de los alimentos balanceados, elevada sobrevida fuera del agua, por lo que se la puede comercializar viva manteniendo todas las propiedades de su carne y ausencia de enfermedades de difícil erradicación (Luchini 2004; Edgerton 2005). En América, se han desarrollado importantes emprendimientos en Ecuador y principalmente en México (Lawrence y Jones 2002; Edgerton 2005).

Según informes actuales de la Food and Agriculture Organization (FAO) sobre el estado mundial de la pesca y la acuicultura, la contribución de la acuicultura al suministro mundial de crustáceos, peces, moluscos y otros animales acuáticos ha ido aumentando, y ha pasado de un 3,9 % de la producción total en peso en 1970 a un 36,0 % en el 2006. En el mismo período, el crecimiento de la producción acuícola fue más rápido que el de la población humana, y así el suministro acuícola per capita pasó de los 0,7 kg en 1970 a los 7,8 kg en 2006, lo que supone un crecimiento medio anual del 7,0 % (FAO 2008).


Por otra parte, la acuicultura mundial se ha incrementado drásticamente en los últimos 50 años. Desde una producción de menos de un millón de toneladas a comienzos de la década del 50 ha alcanzado una producción de 51,7 millones de toneladas con un valor de 78.800 millones de USD en el año 2006. Esto significa que la acuicultura sigue creciendo a un ritmo mayor que otros sectores de producción de productos de origen animal (FAO 2008).

En el período 2000-2006 se evidenció un fuerte crecimiento en particular en la producción de crustáceos. La contribución de los crustáceos al suministro mundial ha crecido rápidamente en el último decenio, y ha alcanzado el 42 % de la producción mundial en el 2006 y, en ese mismo año, proporcionó el 70 % de los camarones y gambas (peneidos) producidos en todo el mundo (FAO 2008).

En Argentina, el cultivo de C. quadricarinatus es reciente y de tipo semi-intensivo y aunque su producción actualmente es escasa (alcanzando 7 ton/año), C. quadricarinaus es una especie con interesantes perspectivas para los productores locales tanto como producto para consumo humano como para el acuarismo (Luchini 2004; Panné Huidobro et al. 2004). En esta especie tropical el principal limitante para su crecimiento y reproducción es la temperatura, por lo que la optimización de su cultivo en climas templados como el nuestro es uno de los aspectos más importantes de su estudio.

Aunque se han investigado numerosos aspectos de la reproducción aplicados al cultivo de la especie (Jones 1995a y Jones 1995b; Sagi et al. 1997a y Sagi et al. 1997b; Karplus et al. 2003, entre otros) varios aspectos básicos de la biología reproductiva básica de esta especie, aún no han sido dilucidados.

1.2 Diferenciación sexual, termolabilidad y relaciones morfométricas

Se desconoce en que momento del desarrollo se produce la diferenciación sexual tanto primaria (gonadal) como secundaria (aparición de los caracteres sexuales secundarios) en esta especie. Este conocimiento permitiría identificar el momento más adecuado y temprano para separar a los ejemplares de distinto sexo para la optimización del cultivo monosexo, dado que tanto los machos como las hembras en cultivos monosexo crecen respectivamente un 17% y 31% más rápido que en los cultivos mixtos (Curtis y Jones 1995; Tropea et al. 2010a).

En cuanto a la temperatura como modulador en la diferenciación y/ó revesión sexual, se desconoce de que manera la manipulación térmica sería responsable de la reversión de hembras a machos en los Crustacea (Ginsburger-Vogel y Charniaux-Cotton 1982; Legrand et al. 1997), pero para peces se propuso un posible mecanismo disparado por estrés térmico consistente en la transformación de cortisol en andrógenos (Van den Hurk y Van Oordt 1985).

La termolabilidad en la expresión fenotípica del sexo ha sido poco estudiada en los crustáceos (Legrand et al. 1997). En peces óseos se ha demostrado la presencia de una “ventana” temporal de sensibilidad a la temperatura en la diferenciación sexual, la cual podría ser manipulada para obtener el sexo deseado (Azuma et al. 2004).


Uno de los parámetros más importantes en el estudio de la dinámica de las poblaciones de animales sometidos a comercialización, es el crecimiento (Petriella y Boschi 1997). Los estudios sobre relaciones morfométricas son usualmente realizados para evaluar, comparar y seleccionar especies de interés comercial en función de su crecimiento y rendimiento en carne (Austin 1995; Sagi et al. 1996).

La madurez morfométrica está relacionada con los cambios en el crecimiento relativo de los caracteres sexuales secundarios en el inicio de la madurez sexual (Minagawa y Higuchi 1997; López Greco 1997; López Greco y Rodríguez 1999). En C. quadricarinatus las relaciones entre las variables de longitud (largo total, largo post-orbital, largo, alto y ancho de los quelípedos, entre otras) y el peso (peso total o peso del pleon) han sido escasamente estudiadas (Austin 1995; Sagi et al. 1996).

1.3 Sistema reproductor femenino en los crustáceos decápodos

El sistema reproductor femenino en los decápodos está constituído por un par de ovarios asociados a oviductos que se comunican al exterior por gonoporos que se encuentran en la base de las coxas del tercer par de pereiópodos (Krol et al. 1992). Presentan también una variedad de estructuras específicas para la cópula y/ó fecundación. Las hembras de algunas especies poseen estructuras especializadas para la recepción de espermatozoides, tales como los receptáculos seminales en los cangrejos ó el thelycum en camarones peneidos y langostas de agua dulce de la familia Cambaridae (Bauer 1986).

En C. quadricarinatus las hembras no presentan thelycum ni receptáculos seminales. La fecundación es externa y el macho deposita su espermatóforo mediante sus appendices masculinae en el esterno de la hembra entre el cuarto y quinto par de pereiópodos. Los huevos adheridos a los pleópodos comienzan a observarse luego de que ésta es impregnada por el macho y son incubados en una cámara formada por el repliegue del pleon, permaneciendo allí hasta la independencia de las crías (Holdich 2002).

En cuanto al desarrollo gonadal en esta especie, la información es muy escasa y limitada a estudios de la gónada madura (Abdu et al. 2000; Karplus et al. 2003). En este contexto, la caracterización de la dinámica ovárica durante la ontogenia permitirá la posterior evaluación de la capacidad de respuesta de los ovarios juveniles y prepuberales a posibles inductores y/ó moduladores de la reproducción, aspectos nuevos de investigación con importantes perspectivas de aplicación, además de su relevancia como conocimiento teórico.


1.4 Sistema reproductor masculino en los crustáceos decápodos

El sistema reproductor masculino en los decápodos está constituído por un par de testículos y conductos genitales donde se reconocen diferentes partes del vaso deferente y el ducto eyaculador que en algunas especies está asociado a una vesícula seminal o ampolla terminal. Cada conducto genital desemboca en la base de la coxa del quinto par de pereiópodos (Krol et al. 1992).

En algunos decápodos el primer y segundo par de pleópodos están modificados para la transferencia espermática (Krol et al. 1992; Scholz 2002). En los Parastacoidea, incluyendo a C. quadricarinatus, las estructuras que participan en la transferencia espermática son los appendices masculinae, ubicados en la base del quinto par de pereiópodos (Vogt 2002; Hobbs et al. 2007). Uno de los caracteres sexuales secundarios de los machos de la especie es la presencia de una calllosidad color rojo-naranja, ubicada en el borde externo de cada propodo; dicha estructura no se encuentra calcificada y es característica de los machos adultos y es la que define con el nombre vulgar a la especie: Langosta de pizas rojas (“red claw”) (Karplus et al, 2003).

En relación a la biología reproductiva de los machos del género Cherax es muy limitado el conocimiento actual. Se han realizado estudios histológicos de formación del espermatóforo en Cherax albidus (Talbot y Beach 1989) y de la morfología espermática en C. tenuimanus y C. albidus (Beach y Talbot 1987) siendo recientes los primeros trabajos sobre la estructura testicular y del vaso deferente y la formación del espermatóforo en ejemplares adultos de C. quadricarinatus (López Greco et al. 2007; López Greco y Lo Nostro 2008).

1.5 Intersexualidad en los crustáceos decápodos

C. quadricarinatus es una especie gonocórica aunque lábil en cuanto a su diferenciación sexual, existiendo una proporción importante de individuos intersexo a los que se ha tipificado como “machos funcionales” con testículos funcionales y ovario arrestado en vitelogénesis primaria y con gonoporos femeninos y masculinos (Medley y Rouse 1993; Sagi et al. 1996; Khalaila et al. 1999).

Según Rudolph (1995a) y Scholz (2002) la intersexualidad en langostas de agua dulce fue observada en los géneros Astacus y Pacifastacus (Astacidae), Cambarus, Procambarus, Orconectes y Cambarellus (Cambaridae) y Astacoides, Cherax, Engaeus, Engaewa, Parastacus y Samastacus (Parastacidae).

Trabajos previos realizados en C. quadricarinatus indican que la proporción de individuos intersexos que normalmente se encuentra en criadero es de entre un 13 % y 17 % (Parnes et al. 2003) y de acuerdo a nuestra experiencia de laboratorio dicho porcentaje podría superarse.


La intersexualidad como una forma de plasticidad sexual característica de varias especies de Parastacoidea nos permite especular sobre la posibilidad de inducir la diferenciación sexual hacia machos o hacia intersexos machos, que producen similares valores de rendimiento en carne de acuerdo a Sagi et al. (1996), como una forma de incrementar el rendimiento de carne en criaderos.

1.6 Organización de la tesis

En función de los aspectos de la biología reproductiva que se desconocen en C. quadricarinatus vinculados a optimizar la reproducción de esta especie, se plantea en este trabajo de tesis doctoral determinar el momento del desarrollo en que ocurre la diferenciación sexual, el posible rol regulador de la temperatura, caracterizar el proceso de diferenciación ovárica y testicular y los cambios morfométricos asociados.

La tesis está organizada en siete capítulos: Capítulo 1: “Introducción Genral”. Se describe el tema general del trabajo, breves antecedentes y se plantearon la hipótesis principal, el objetivo general y los objetivos específicos.

Capítulo 2: Diferenciacion sexual y efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual en la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (von Martens, 1868) (Decapoda, Parastacidae)”. Se determinó el momento del desarrollo post-eclosión en que se produce la diferenciación sexual evaluada como la aparición de los caracteres sexuales secundarios en hembras, machos e individuos intersexo de C. quadricarinatus y se evaluó el efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual.

Capítulo 3: “Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor y de la madurez sexual en hembras de Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)”. Se caracterizó la diferenciación macroscópico y microscópico del sistema reproductor y el inicio de la madurez sexual en hembras de C. quadricarinatus desde un aspecto macro y microscópico.

Capítulo 4: “Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor y de la madurez sexual en machos de Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae) y de las variaciones ontogenéticas de las estructuras copulatorias”. Se caracterizó la diferenciación sexual y adquisición de la madurez sexual en los machos desde el punto de vista macroscópico y microscópico incluyendo la caracterización de los appendices masculinae.

Capítulo 5: “Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor de los intersexos y de la madurez sexual en “intersexos hembras” de Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)”. Se identificaron los distintos tipos de intersexos desde el punto de vista de los caracteres sexuales primarios y secundarios. Se caracterizó la morfología gonadal


desde el punto de vista macroscópico y microscópico de los diferentes tipos de intersexos con particular énfasis en los intersexos hembra.

Capítulo 6: “Relaciones morfométricas en hembras, machos e intersexos hembras de la langosta de agua dulce, Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)”. Se compararon las relaciones morfométricas y se evaluó el crecimiento relativo de las dimensiones de los quelípedos entre sexos y su vinculación con el inicio de la madurez sexual.

Capítulo 7: “Discusión general”. Incluye la discusión general y las conclusiones finales.

1.7 Objetivo general

El objetivo general del presente trabajo es determinar el momento del

desarrollo en que se produce la diferenciación sexual primaria y secundaria en C. quadricarinatus y caracterizar el proceso de diferenciación ovárica, testicular y de la gónada de los individuos intersexo desde el punto de vista morfológico y funcional. Se evalúa el efecto de la temperatura como posible modulador de la diferenciación sexual y su potencial aplicación a la producción de cultivos monosexo (solo macho).

Desde el punto de vista aplicado, el estudio de la diferenciación sexual de C. quadricarinatus está vinculado a optimizar la reproducción de esta especie en cultivo en nuestro país. El conocimiento de la diferenciación sexual y madurez gonadal podría permitir seleccionar la talla más adecuada para inducir las puestas de huevos ó desde tallas menores, inducir la producción de mayor proporción de machos y/ó la reversión sexual de las hembras hacia la producción del cultivo monosexo, dado que la mayor cantidad de carne comestible se encuentra en los machos.

1.9 Objetivos específicos

En función de la información limitada sobre aspectos de la biología reproductiva de C. quadricarinatus que tienen vinculación directa con aspectos de optimización del cultivo de la especie, se plantearon los siguientes objetivos específicos:

1- Determinar el momento del desarrollo post-eclosión en que se produce la diferenciación sexual evaluada por la aparición de los caracteres sexuales secundarios en C. quadricarinatus y estudiar el efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual.

2- Caracterizar la diferenciación del sistema reproductor y el inicio de la madurez sexual en hembras de C. quadricarinatus.

3- Caracterizar la diferenciación sexual y adquisición de la madurez sexual en los machos de C. quadricarinatus.


4- Identificar y caracterizar los distintos tipos de individuos intersexos desde el punto de vista de los caracteres sexuales primarios y secundarios en C. quadricarinatus.

5- Establecer la relación entre los cambios en el crecimiento relativo y el inicio de la madurez sexual.


CAPITULO 2

“Diferenciacion sexual y efecto de la temperatura sobre la diferenciación

sexual en la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (von Martens, 1868) (Decapoda, Parastacidae)”

2.1 INTRODUCCIÓN

La diferenciación sexual es un proceso secuencial resultado de la combinación del sexo cromosómico, gonadal y fenotípico (Espinosa Reyes et al. 2007). En los crustáceos este proceso está ligado a diversos factores como la temperatura, fotoperíodo, alimentación, presencia de parásitos, e interacción social ó de la “estructura social” dada por la densidad poblacional (Bulnheim 1978; Ginsburger-Vogel et al. 1982; McCabe y Dunn 1997; Rigaud et al. 1997; Fielder 2002; Rudolph 2002; Parnes et al. 2003; Zupo y Messina 2006; Schlechtriem et al. 2008).

Diversos trabajos proponen que la diferenciación sexual en los crustáceos también puede estar regulada genéticamente. En Gammarus duebeni duebeni (Amphipoda), la sexualidad de la progenie depende tanto de factores genéticos como del fotoperíodo y de la interacción de la madre con dos especies de microsporidios que afectan la proporción sexual de la descendencia, influyendo como un factor femenizante sobre las crías (Bulnheim 1978).

En Armadillidium vulgare (Isopoda) la sexualidad está determinada por un factor genético no-mendeliano de origen bacteriano, denominado F (factor feminizante). Dicha bacteria, es un parásito intracelular que transfiere al isópodo la información genética del factor feminizante, por medio de un fragmento de ADN con la información específica, mediante un mecanismo de transposición. Estos eventos “manejan” los mecanismos involucrados en la determinación sexual y explican el polimorfismo de factores sexuales (Rigaud et al. 1997).

En los crustáceos decápodos, la glándula androgénica (GA) juega un rol importante en la diferenciación sexual masculina, en el mantenimiento de la funcionalidad reproductiva del macho y en la inhibición de la diferenciación sexual femenina y de la vitelogénesis (Sagi y Khalaila 2001). Algunos trabajos postulan que dicha glándula no se desarrolla en hembras y por lo tanto los ovarios se diferencian espontáneamente sin estar regulados por la hormona de la GA. La implantación de la GA en hembras mostró diferentes resultados, dado que la sensibilidad a dicha hormona depende de la especie y de la receptividad del órgano (Hasegawa et al. 1993). En cinco especies de crustáceos decápodos (Leander serratus, Macrobrachium rosenbergii, Procambarus clarkii, C. quadricarinatus y C. destructor) principalmente, se ha demostrado el rol que ejerce la GA a nivel morfológico, fisiológico y comportamental en organismos adultos (Sagi y Khalaila 2001; Ventura et al. 2009).


En cuanto al desarrollo embrionario y post-embrionario, éste ha sido estudiado en algunas especies de langostas de agua dulce y marinas del hemisferio norte (Payen 1973; Rudolph y Iracabal, 1994; Taketomi et al, 1996). Aunque se propone que la diferenciación de los caracteres sexuales secundarios ocurriría en los estadios post eclosión tempranos (Rudolph & Iracabal, 1994; Taketomi, 1996); en Parastacidae el desarrollo embrionario y postembrionario ha sido parcialmente estudiado en especies australianas y sudamericanas (Hamr 1992; García Guerrero et al. 2003; Annis et al. 2007, entre otros) pero no se ha estudiado ni la diferenciación sexual ni los factores que la modulan.

En cuanto al factor térmico como modulador de la diferenciación y/ó reversión sexual, se desconoce de que manera la manipulación térmica podría ser responsable de la reversión de hembras a machos en los crustáceos, pero en los peces se propuso un posible mecanismo disparado por estrés térmico consistente en la transformación de cortisol en andrógenos (Van den Hurk y Van Oordt 1985).

Particularmente en especies de crustáceos de importancia comercial, varios estudios han indicado que su producción puede ser optimizada mediante el cultivo de poblaciones monosexo (Sagi et al. 1986; Medley y Rouse 1993; Curtis y Jones 1995; Lawrence y Morrisy 1997) de modo similar a lo realizado en cultivos de peces teleósteos (Azuma et al. 2004). En C. quadricarinatus se ha determinado que los machos y las hembras presentan un mayor crecimiento somático en cultivos monosexo que en cultivos mixtos, además, los machos presentan mayor crecimiento que las hembras (Curtis y Jones 1995).

Pese a las numerosas investigaciones realizadas en esta especie en relación a la optimización de la reproducción y el crecimiento en cultivo (Jones 1995a; Jones 1995 b; Lawrence y Morrys 1997, Stumpf et al. 2010, entre otros) y a los aspectos conocidos de la sexualidad de esta especie (Medley y Rouse 1993; Sagi et al. 1996; Sagi et al. 2002; Parnes et al. 2003, entre otros), aún no ha sido estudiada la diferenciación sexual ni dilucidados los aspectos genéticos, ambientales ó sociales involucrados en la determinación sexual. 2.2 OBJETIVO

Determinar el momento del desarrollo post-eclosión en que se produce la diferenciación sexual evaluada por la aparición de los caracteres sexuales secundarios en C. quadricarinatus y estudiar el efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual.

En el marco de este objetivo se plantearon las siguientes hipótesis:

Hipótesis 1: La diferenciación sexual ocurre en los primeros estadios post-eclosión. Hipótesis 2: En la fase temprana de la diferenciación sexual es posible modificar la proporción sexual en C. quadricarinatus mediante manipulación térmica obteniendo mayor número de machos.


2.3 MATERIALES Y MÉTODOS 2.3.1 Obtención y mantenimiento de los animales

Para determinar el momento del desarrollo en que se produce la diferenciación sexual se mantuvieron 2 hembras ovígeras de similar peso (30-40 g) y tamaño evaluado como largo total del cefalotórax (LT=47-49mm) con embriones próximos a la eclosión. Cada hembra fue colocada en acuario de 60 cm x 40 cm x 30 cm, a 27 ± 1 ºC, aireación constante, fotoperíodo 14:10hs luz: oscuridad conteniendo, 20L de agua corriente declorada (pH:7,4) (Jones (1995) y con alimentación ad libitum con Elodea sp y alimento balanceado para peces disco Tetradiskus®. En esta especie, los estadios juvenil I (primer estadio post-eclosión) y juvenil II (segundo estadio post-eclosión) permanecen sujetos a los pleópodos de la madre mediante estructuras similares a “ganchos” (hooks) presentes en sus pereiópodos 4to y 5to (Scholz 2002). Luego de la muda del juvenil II al juvenil III ocurre la “independencia” de sus madres (Levy et al. 1999) y a partir de este estadio se los puede manipular disminuyendo la mortalidad.

A partir de una muestra de 334 juveniles recién independizados provenientes de ambas hembras, se asignaron al azar 28 juveniles (de cada hembra) individualizados en envases plásticos de 300 mL de capacidad conteniendo 200 mL de agua declorada y un trozo de red tipo “cebollera” de 2 cm x 2 cm, que los animales utilizaron como refugio. Las condiciones de temperatura, pH, fotoperíodo y régimen de alimentación fueron similares a las descriptas anteriormente para el mantenimiento de las hembras ovígeras. Ninguno de los juveniles de estadio III mostró diferenciación de sus gonoporos.

2.3.2 Identificación de los caracteres sexuales secundarios

Diariamente se registró la ocurrencia de mudas y muertes y cada 15 días los animales fueron pesados quitando el exceso de agua con papel absorbente con balanza de precisión y sexados. A partir de los registros diarios de mudas, se determinó el porcentaje de juveniles cuyo sexo pudo ser determinado por primera vez en función del tiempo transcurrido desde su independencia

Para evaluar la diferenciación sexual secundaria, se sexaron bajo lupa los ejemplares, registrando la localización de los gonoporos en la base del tercer par de pereiópodos en las hembras y en la base del quinto par de pereiópodos en los machos. También se observó la ausencia/presencia de los appendices masculinae y su correspondiente morfología (lobulado ó elongado), además de la diferenciación de la callosidad roja (“red patch”) en el margen externo del própodo del primer par de pereiópodos, característica de los machos adultos de la especie (Thorn y Fielder 1991).

Dado que la especie presenta una proporción variable de individuos intersexos se evaluó su presencia mediante la observación de los caracteres sexuales secundarios, considerándose “intersexos” a aquellos animales que


presentaron gonoporos adicionales a los observados en la base del tercer ó quinto par de pereiópodos (Medley y Rouse 1993; Sagi et al. 1996).

2.3.3 Efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual

Para evaluar el posible efecto modulador de la temperatura sobre la diferenciación sexual, se seleccionaron 8 hembras ovígeras de similar peso y tamaño, en un intervalo de peso entre 40-60 g y un intervalo de LT de 50-60 mm cuyos desoves estuvieran próximos a la eclosión.

Cada hembra fue mantenida hasta la eclosión de los juveniles en un acuario de 60 cm x 40 cm x 30 cm, conteniendo un volumen de 10 L de agua declorada (pH:7,4), fotoperíodo 14:10hs luz: oscuridad (Jones (1995) con aireación constante, temperatura de 27-28ºC y alimentación ad libitum diaria con Elodea sp y alimento balanceado para peces disco Tetradiskus®. Luego de la independencia de los juveniles se separó a cada hembra de su acuario y se procedió a la selección de las crías. De cada hembra se seleccionaron al azar 56 juveniles, que fueron mantenidos en similares condiciones que las descriptas anteriormente en el punto 2.3.1. A partir de los 56 juveniles de cada hembra obtenidos se constituyeron dos grupos experimentales con 28 juveniles cada uno, sometidos a dos rangos de temperatura: normal (25-27ºC) y alta (30-32ºC). Resultados preliminares mostraron que temperaturas mayores inducían mortalidad significativa de las crías así como temperaturas menores a 23ºC.

Los 28 juveniles de cada hembra por tratamiento en sus envases individuales fueron colocados en acuarios 60 cm x 40 cm x 30 cm conteniendo 20L de agua. Para mantener constante la temperatura se colocó en cada acuario un termostato ALTMAN de 50W y aireación constante para homogeneizar la temperatura del agua y evitar la formación de gradientes térmicos dentro del acuario, no detectándose diferencias mayores a 0,5ºC entre las distintas áreas de cada acuario. Para controlar la formación de gradientes térmicos, la tempeatura se monitoreó 3 veces por día con termómetro de mercurio y se corroboró la coincidencia con el registro del termostato.

Diariamente se registró la muda ó muerte de los juveniles. Cada quince días los animales fueron pesados y sexados, observando bajo lupa la presencia de las aberturas genitales para determinar el sexo. El ensayo finalizó cuando todos los juveniles pudieron ser sexados y se calculó mediante el test de Fisher la proporción de cada sexo para cada temperatura.

Dada la baja disponibilidad de espacio y la cantidad de juveniles involucrados, las 8 hembras ovígeras no correspondieron a un mismo año de experimento sino que durante 2004, 2005, 2006 y 2008 se desarrolló este experimento con las progenies de 2 hembras por cada año provenientes del mismo criadero (Las Golondrinas SRL, Entre Ríos, Argentina) y mantenidas en laboratorio bajo las mismas condiciones experimentales.


2.4 RESULTADOS 2.4.1 Identificación de los caracteres sexuales secundarios

Las observaciones realizadas a partir del registro individual sobre el estadio en el que ocurre la diferenciación de los gonporos en ambos sexos y los appendices masculinae y diferenciación del “red patch” en los machos permitieron identificar el momento del desarrollo post-eclosión en que se produce la diferenciación sexual secundaria en C. quadricarinatus.

A los 90 días de iniciado el ensayo todos los juveniles pudieron ser sexados. En las hembras, la diferenciación de los gonoporos ocurrió entre los 0,16 y 0,24 g. En los machos, la diferenciación de los gonoporos ocurrió entre los 0,24 y 0,28 g, pero en algunos animales desde los 0,13 g se comenzó a observar el inicio de formación de las aberturas genitales. Los appendices masculinae se diferenciaron entre los 0,3-0,6 g y hasta los 0,7-0,8 g presentaron forma lobulada. Esta estructura comenzó a elongarse a partir de los 0,9 g.

Los individuos intersexos pudieron ser identificados a partir de los 0,26 g. En todos los casos mostraron aberturas femeninas y masculinas siendo las aberturas masculinas de los intersexos de menor tamaño que las de los machos. No se observaron appendices masculinae en los intersexos. En el intervalo de talla observado, no se observó la diferenciación del “red patch” ni en machos ni en intersexos.

A partir de los registros diarios de mudas, se determinó que la diferenciación de las aberturas genitales en hembras, machos e intersexos ocurre en los estadios juvenil VI o VII a los 45 a 90 días post-independencia (Fig. 2.1).

Tiempo (días)

0 20 40 60 80 100

% J

uven

iles

0

20

40

60

80

100

Fig. 2.1: Porcentaje de juveniles cuyo sexo pudo ser determinado por primera vez en función del tiempo transcurrido desde su independencia (estadio juvenil III).


2.4.2 Efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual

Los resultados de los ensayos realizados en los distintos años mostraron diferentes respuestas de los juveniles tanto en relación a la sobrevida como a la proporción sexual, por lo que no se pudieron realizar análisis estadísticos confiables ni adecuados con los resultados obtenidos. Sin embargo se presentan los resultados como tablas generales.

En el primer ensayo (año 2004), el análisis de proporción sexual mediante el test exacto de Fisher indicó diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre ambos grupos experimentales. La temperatura de 30-32ºC (temperatura alta) produjo una proporción significativamente mayor de machos, sobre el total de sobrevivientes, que la temperatura de 25-27ºC (temperatura nomal), junto con un incremento significativo de la mortalidad. La proporción de intersexos no presentó diferencias estadísticamente significativas entre grupos (p>0,05) (Tabla 2.1).

Los resultados obtenidos en los años posteriores, difieren entre sí y con los obtenidos en el 2004 (Tabla 2.1).


Grupo

Experimental/ Año

Número Inicial

Número de

Sobrevivientes

Número de

Hembras

Número de

Machos

Número de Intersexos

2004

Temperatura Normal

(25-27°C)

56

45 (0,80 *)

24 (0,53 *)

14 (0,31)

7 (0,16)

Temperatura

Alta (30-32°C)

56

32 (0,57)

9 (0,28)

18 (0,56 *)

5 (0,16)

2005

Temperatura Normal

(25-27°C)

56

30

14

14

2

Temperatura

Alta (30-32°C)

56

32

15

15

2

2007

Temperatura Normal

(25-27°C)

56

14

2

8

4

Temperatura

Alta (30-32°C)

56

6

1

4

1

2008

Temperatura Normal

(25-27°C)

56

34

17

16

1

Temperatura

Alta (30-32°C)

56

42

21

20

1

Tabla 2.1: Efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual en juveniles tempranos de C

quadricarinatus. Para los resultados del año 2004 las proporciones se indican entre paréntesis, refiriéndose las de cada sexo al total de sobrevivientes. El asterisco (*) indica diferencias significativas (p<0,05).


Tratamiento/

Año

Proporción de Sobrevivientes

Proporción de

Hembras

Proporción de

Machos

Proporción de

Intersexos

Año 2004

T° Normal 0,804 0,533 0,311 0,156

T° Alta 0,571 0,281 0,563 0,156

Año 2005

T° Normal 0,536 0,467 0,467 0,067 T° Alta 0,571 0,469 0,469 0,000

Año 2007

T° Normal 0,700 0,143 0,571 0,286 T° Alta 0,300 0,167 0,667 0,167

Año 2008

T° Normal 0,607 0,500 0,471 0,029

T° Alta 0,750 0,500 0,476 0,024

Tabla 2.2: Proporciones de sobrevivientes, hembras, machos e intersexos de C. quadricarinatus en los distintos años expuestos a temperatura normal (25-27 °C) y alta (30-32°C)


2.5 DISCUSION

El presente capítulo muestra que la diferenciación de los caracteres sexuales secundarios de C. quadricarinatus ocurre muy tempranamente, aproximadamente a partir de los 0,23 g, lo que de acuerdo a nuestras observaciones corresponde al estadio juvenil VI ó VII. Estos resultados representan el primer informe sobre el patrón de diferenciación de los caracteres sexuales secundarios en especies del género Cherax y de la mayoría de las especies de langostas de agua dulce. En la langosta Pontastacus leptodactylus leptodactylus (Astacidae) se ha determinado que la diferenciación de los caracteres sexuales secundarios ocurre aproximadamente en el estadio VII (Payen 1973), lo que sería comparable con los resultados del presente estudio.

Dado que el cultivo de esta especie podría mejorarse mediante la selección de poblaciones monosexo (Sagi et al. 1986; Curtis y Jones 1995; Lawrence y Morrissy 1997) la pronta identificación del sexo podría mejorar la tasa de crecimiento desde las etapas juveniles.

Por otra parte, la identificación temprana de las hembras, podría permitir el ensayo temprano de inducción de la reversión sexual, ya sea por factores hormonales o ambientales (Khalaila et al. 2001; Barki et al. 2003; Sánchez de Bock y López Greco 2010). Actualmente son muy fragmentarios los resultados obtenidos respecto de la reversión sexual en hembras mediante manipulación hormonal, y en estos casos, la reversión es parcial y lograda mediante la implantación de la glándula androgénica (GA) (Taketomi et al. 1996; Khalaila et al. 2001; Sagi y Khalaila 2001; Barki et al. 2003).

Otro de los factores que determina y/ó regulan la diferenciación sexual en especies gonocóricas es la temperatura (Van den Hurk y Van Oordt 1985; Strussman et al. 1996; Strussman et al. 1997; Azuma et al. 2004). Los resultados altamente variables obtenidos en los experimentos no nos permiten establecer un claro rol de la temperatura sobre la diferenciación sexual en C. quadricarinatus. La variabilidad de respuesta obtenida entre los distintos años de este ensayo concuerda con resultados obtenidos en nuestro laboratorio durante 2010-2011 en ensayos para evaluar la “calidad de progenie”. Estos ensayos han mostrado que el factor “madre” es responsable de significativas diferencias en la performance de crecimiento y sobrevida temprana de las crías (Tropea et al., 2010b; Tropea et al., en preparación). En este contexto no podríamos descatar que las diferencias de respuestas a la temperatura estén moduladas por diferencias en las madres aún proviniendo del mismo criadero y habiendo sido mantenidas en las mismas condiciones.

El incremento del número de madres y el desarrollo del experimento completo durante un mismo período podría permitirnos una evaluación más certera del efecto de la temperatura sobre la diferenciación sexual en esta especie.


CAPITULO 3

“Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor y de la madurez sexual en hembras de Cherax quadricarinatus

(von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)” 3.1 INTRODUCCIÓN

El sistema reproductor de las hembras de los crustáceos decápodos está

formado por ovarios pares constituídos por dos cordones longitudinales, ubicados dorso-lateralmente al sistema digestivo con sus respectivos oviductos que se abren en la coxa del tercer par de pereiópodos (Krol et al. 1992). El ovario está rodeado por una pared de tejido conectivo y un epitelio germinal ubicado por debajo de éste, del cual surgen y se desarrollan las oogonias (Krol et al. 1992; Ando y Makioka 1998; Elorza y Dupré 1999).

La etapa de crecimiento ovárico, la vitelogénesis, es un proceso energéticamente muy costoso y en el que se distinguen al menos dos etapas: la vitelogénesis primaria y la secundaria. Particularmente durante la vitelogénesis secundaria se produce un rápido crecimiento oocitario relacionado con la captación de los precursores del vitelo desde la hemolinfa (Meusy y Charniaux Cotton 1984; Tsukimura 2001; Tiu et al. 2009; Reppond et al. 2009). La vitelogenina es la molécula precursora de la vitelina y es sintetizada por el ovario y/ó tejido extra-ovárico. Durante la maduración ovárica, la vitelogenina extra-ovárica es transportada en la hemolinfa y es incorporada por endocitosis a los oocitos; dicho proceso se encuentra mediado por receptores específicos (Tsukimura 2001; Tiu et al. 2009) y regulado por hormonas (Yano y Hoshino 2006). En el citoplasma de los oocitos, la vitelina es modificada y transformada en una lipoglicocarotenoproteína por la adición de polisacáridos y lípidos, dicha molécula, es la forma más común en que se almacenan las plaquetas de vitelo en los oocitos y es el nutriente utilizado para el desarrollo embrionario. Por lo tanto, la síntesis de plaquetas de vitelo es un buen indicador de la actividad reproductiva en hembras e indicativo del inicio de madurez sexual (Abdu et al. 2000; Tsukimura 2001; Tiu et al. 2009).

El crecimiento ovárico usualmente es caracterizado mediante escalas colorimétricas e histológicas que constituyen herramientas simples para tipificar la dinámica gonadal a lo largo del año e identificar el período de puestas (Stewart et al. 1997; Abdu et al. 2000; Beatty et al. 2005; Lucic et al. 2006; Viau et al. 2006; Sokolowicz et al. 2007; Noro et al. 2008; Gregati et al. 2010, entre otros).

Dentro de Astacidea el ciclo de madurez ovárica ha sido estudiado en Procambarus clarkii (Kulkarni et al. 1991; Ando y Makioka 1998), en Parastacus defossus, P. varicosus, y P. brasiliensis (de Almeida y Buckup 1997; Rudolph y Almeida 2000; Rudolph et al. 2001; Noro et al. 2008; Silva-Castiglioni et al.


2009), en la langosta de agua dulce conocida como “Gilgie” Cherax quinquecarinatus (Beatty et al. 2005) y parcialmente en C. quadricarinatus desde el punto de vista fisiológico y bioquímico a nivel de gónada madura (Sagi et al. 1996; Abdu et al. 2000).

3.2 OBJETIVO

El objetivo del presente capitulo fue caracterizar la diferenciación del sistema reproductor y el inicio de la madurez sexual en hembras de C. quadricarinatus desde un aspecto macroscópico y microscópico. 3.3 MATERIALES Y METODOS

3.3.1 Obtención y mantenimiento de los animales

Para realizar la caracterización del sistema reproductor en hembras de C. quadricarinatus se utilizaron 184 hembras en un intervalo de peso de 0,09 a 108 g tanto provenientes del criadero San Mateo, Provincia de Entre Ríos, Argentina, como nacidas y criadas en el laboratorio.

Para determinar el momento del desarrollo en que se produce la diferenciación gonadal (diferenciación sexual primaria) y obtener los ovarios de desarrollo más temprano se mantuvieron hembras ovígeras con embriones próximos a la eclosión bajo las mismas condiciones que las indicadas en el Capítulo 2. Semanalmente, se separaron 5 juveniles que fueron pesados, medidos, sexados y posteriormente disecados. Este procedimiento se utilizó para obtener juveniles hembra hasta los 2g. Los tamaños mayores fueron obtenidos directamente del criadero mencionado.

3.3.2 Mediciones y determinaciones macroscópicas

Todas las hembras fueron pesadas con una precisión de 0,1 mg y se realizaron las siguientes mediciones: largo total del caparazón (LT) desde el extremo anterior del rostro hasta el borde posterior del caparazón y el largo post-orbital (LPO), desde el borde posterior de la órbita ocular hasta el margen posterior del caparazón con calibre (Swiss Confederation, Digital Caliper) de 0,01 mm de precisión (Fig 3.1).


Los animales luego fueron anestesiados con frío (20 min a 0ºC) y posteriormente disecados, previa remoción del caparazón. Se realizó la caracterización macroscópica del sistema reproductor considerando la forma, el color y el tamaño relativo.

3.3.3 Procesamiento y análisis histológico

Cada sistema reproductor fue fijado en solución acuosa de Bouin durante 4 horas, secuencialmente deshidratado en etanol 70 % (15 a 20 min), etanol 90 % (20 min), etanol 96 %: butanol (1:1v/v) durante 30 min, butanol (30 min) y finalmente incluídos en paraplast. Posteriormente fue cortado en secciones de 5 µm de espesor con micrótomo y coloreado con hematoxilina-eosina, ácido periódico de Schiff (PAS) y tricrómico de Masson (López Greco et al. 2007). De cada ejemplar se realizaron 2 ó 3 preparados, conteniendo de 3 a 4 cortes histológicos cada uno, que fueron posteriormente observados bajo microscopio óptico (Carl Zeiss, Axioimager A1) y fotografiados con cámara Nikon de 7 mpx. A partir de las secciones histológicas se caracterizó la proporción y el tipo celular presente: oocitos vitelogénicos primarios, intermedios y secundarios, presencia/ausencia de folículos vacíos y de células foliculares. Finalmente se midió con ocular micrométrico calibrado mediante una placa Leitz Wetzlar de 10 µm de espaciamiento el diámetro mayor y menor de cada oocito cuya sección

Fig. 3.1: Medición del largo total del cefalotórax (LT) desde el extremo anterior del rostro hasta el borde posterior del caparazón y (LPO) desde el borde posterior de la órbita ocular hasta el margen posterior del caparazón con calibre de precisión 0,01 mm


pasara por el núcleo, y se registró el número de “nidos” o grupos de oogonias y la cantidad de oogonias por grupo. Los promedios del diámetro medio de cada estadio celular fueron calculados mediante el programa estadístico Statistica 6.0 (StatSoft).

También se caracterizó desde el punto de vista microscópico la morfología de la pared de los oviductos y para caracterizar el ovario de postpuesta ó remaduración temprana se disecaron y procesaron según el protocolo previamente indicado, dos hembras ovígeras cuya puesta hubiese ocurrido en las últimas 48hs.

3.4 RESULTADOS 3.4.1 Caracterización del ovario

Las observaciones macroscópicas del sistema reproductor de C. quadricarinatus muestran la presencia de ovarios pares constituídos por dos cordones longitudinales con un grado variable de fusión a lo largo de la ontogenia, ubicados dorso lateralmente al sistema digestivo con sus respectivos oviductos. Los ovarios presentan conectores, los cuales son delgadas estructuras opalescentes, que se extienden desde la porción posterior de los lóbulos anteriores hasta el extremo anterior de los lóbulos posteriores (Fig. 3.2 b, c y d).

Los oviductos, son estructuras delgadas, isodiamétricas y opalescentes, que se extienden desde la parte media de los lóbulos posteriores hasta la base de la coxa del tercer par de pereiópodos (Fig. 3.2).

Desde el punto de vista histológico los ovarios presentan estructura sacular observándose la luz ovárica tanto en estadios tempranos como más avanzados (Fig. 3.3 a). La pared ovárica está constituída por tres capas. Por una capa externa, la serosa que al colorearse con tricrómico de Masson se la observa color roja y se distinguen núcleos de fibrocitos, una capa media de tejido conjuntivo laxo que se tiñe de azul, en la cual se distinguen fibras musculares intercaladas y una monocapa de células planas o cúbicas que constituye el epitelio germinal. Este epitelio delimita la luz ovárica y se encuentra formando pliegues que rodean a los distintos oocitos periféricos, generando un tipo de “saco oocitario u oogenético” (sensu Ando y Makioka, 1988) ó teca ovárica, conteniendo a los oocitos periféricos secundarios de diferentes diámetros (Fig. 3.3 b y c).

Desde la diferenciación de la gónada hasta su maduración C. quadricarinatus presenta 3 morfotipos ováricos, que pueden ser caracterizados desde el punto de vista macroscópico como: cordones paralelos, ovario en forma de H (Fig. 3.2 b y c) y ovario en forma de Y (Fig. 3.2 d).


Desde el punto de vista de la coloración, la estructura histológica y la proporción de los distintos tipos celulares se distinguen 4 estadios cuya caracterización y vinculación con la forma del ovario se indican a continuación:

Fig. 3.2: Esquema del ovario de C. quadricarinatus en diferentes estadios. (a) Estadio I, (b) Estadio II, (c) Estadio III y (d) Estadio IV. (C) conectores, (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OS) oocito secundario, (OVI) oviductos


Fig. 3.3: (a). Esquema del ovario de C. quadricarinatus. Ovario rodeado por pared ovárica. Todos los oocitos se encuentran rodeados por células foliculares y se observan nidos de oogonias en el epitelio ovárico cerca de la luz. (b). Corte transversal del ovario. Teca ovárica rodeando oocitos primarios. (c). Detalle de teca ovárica rodeando un oocito (d). Ovario de hembra ovígera con pared ovárica distendida. (e). Detalle de pliegue de la pared ovárica con capa de fibras musculares. (CF) células foliculares, (CM) capa muscular, (EO) epitelio ovárico (LO) lumen ovárico, (OG) oogonias, (OS) oocito secundario, (OP) oocito primario, (PL) pliegues, (PO) pared del ovario, (POG) pared ovárica gruesa, (TC) tejido conectivo (TO) teca ovárica

CM

(a)


3.4.2 Estadio I

La diferenciación del sistema reproductor de la hembra de C. quadricarinatus comienza entre los 0,09-0,10 g. A partir de este peso y hasta los 5 g, la gónada presenta color blanco-transparente (Estadio I). Desde el punto de vista macroscópico estos ovarios se observan como dos cordones longitudinales e isodiamétricos (Fig 3.4 a) de posición dorsal al hepatopáncreas o como una H diferenciada (Fig 3.4 b). Ambos tipos morfológicos están asociados a oviductos que muestran la misma relación anatómica en los estadios posteriores.

Los “cordones paralelos” representan una fase muy breve (uno ó dos estadios aneriores a la diferenciación sexual secundaria) del desarrollo temprano; éstos se caracterizan por ser estructuras delgadas que se extienden desde la porción posterior de los pedúnculos oculares hasta la porción media del cefalotórax y no presentan partes macroscópicas definidas. La fusión media de estos cordones por detrás del molinillo gástrico origina el siguiente tipo morfológico.

La “H” diferenciada está formada por dos cordones paralelos unidos en la línea media por detrás del molinillo gástrico formando un “puente” ovárico (Krol et al, 1992) delante del cual se distinguen dos lóbulos anteriores y por detrás del mismo, los lóbulos posteriores (Fig 3.4 b). Esta H diferenciada presenta la misma extensión dentro del cefalotórax que el morfotipo anterior.

Desde el punto de vista histológico, los ovarios de Estadio I se caracterizan por presentar solamente oocitos en vitelogénesis primaria y mayor proporción de oogonias y células foliculares formando “nidos” ó rodeando al oocito (Tabla 3.1).

Los oocitos vitelogénicos primarios son acidófilos y presentan un citoplasma homogéneo al inicio de la vitelogénesis primaria, y más heterogéneo en gónadas con vitelogénesis primaria más avanzada; en estos casos pueden distinguirse gotas lipídicas en la zona periférica al citoplasma (Fig 3.4 c y d). Estos oocitos, en gónadas muy pequeñas (correspondientes a juveniles de peso 0,09 a 0,5g) presentan un diámetro algo mayor al de su núcleo (Fig 3.4 c y d), y son característicos de una gónada inmadura ó en remaduración.

Las células foliculares son basófilas, presentan una forma redondeada y se ubican rodeando a los oocitos; mientras que las oogonias presentan un aspecto globoso y su distribución es central (Fig 3.4 d) A medida que avanza la madurez gonadal, disminuye el número relativo de “nidos oogoniales”, como así también el número de células por grupo; el número promedio de nidos por sección histológica es 5, y el número de células por nido varía en un intervalo de entre 5 a 10 células por nido (Tabla 3.1).


Tabla 3.1: Caracterización macroscópica y microscópica de los distintos estadios de diferenciación ovárica de C. quadricarinatus y su relación con el tamaño de la hembra evaluado como, largo total del cefalotórax (LT), largo post-orbital (LPO) y peso (g). Todas las variables se expresan como media ± error estándar y para el diámetro de los oocitos también se incluyen el valor mínimo y máximo.


Fig. 3.4: (a) y (b). Esquema de ovario en estadio I como cordones paralelos y forma de H, respectivamente. (c) y (d). Cortes longitudinales y transversales de ovario en estadio I teñidos con hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson, respectivamente. (CF) células foliculares (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OP) oocito primario, (OVI) oviducto, (PO) pared ovárica.


3.4.3 Estadio II

Entre los 2 y 16g la gónada adquiere color crema pálido-naranja pálido (Estadio II); presentando el mismo tipo de morfo descripto anteriormente, pero comenzando a diferenciarse una nueva estructura denominada “conector” (Fig 3.5 a). En este estadio aunque la proporción dominante de células de la línea germinal corresponde a los oocitos vitelogénicos primarios, se observa la aparición de algunos oocitos que comenzaron la vitelogénesis secundaria.

Existen diferencias microscópicas entre los oocitos vitelogénicos primarios. Esta diferencia está dada no solo por el diámetro promedio que presentan con respecto al avance de su vitelogénesis primaria, sino también por la presencia de lípidos y mucopolisacáridos en su citoplasma que le otorgan al citoplasma un aspecto más heterogéneo (Fig 3.5 b y c). Las oogonias y las células foliculares, presentan similares características que en el estadio anterior. Con respecto al tamaño, el ovario en estadio II es mayor que el estadio I (Tabla 3.1).


Fig. 3.5: (a). Esquema de ovario en estadio II en forma de H con sus conectores diferenciados. (b), (c) y (d). Cortes histológicos en sección transversal del ovario en estadio II (teñidos con hematoxilina-eosina). (C) conectores, (CF) células foliculares (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LO) lúmen ovárico, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OP) oocito primario, (OVI) oviductos, (PO) pared ovárica.


3.4.4 Estadio III

Entre los 6 a 18g las gónadas adquieren una coloración naranja con algunos oocitos verdes (Estadio III) presentando forma de H con conectores diferenciados y bien desarrollados y mayor tamaño respecto del estadio anterior (Fig 3.6 a y b). Los ovarios de este estadio se caracterizan por la presencia de oocitos vitelogénicos primarios, intermedios y secundarios.

Los oocitos vitelogénicos intermedios, son de mayor tamaño que los primarios, presentan un citoplasma homogéneo en la zona cercana al núcleo y otra más heterogénea en su periferia; ésta heterogeneidad está dada por el comienzo de formación de plaquetas de vitelo (Fig 3.6 d) que indicaría el inicio de la madurez sexual. Los oocitos vitelogénicos secundarios presentan un citoplasma heterogéneo de aspecto “espumoso”, acidófilo, cuyas plaquetas se distribuyen de forma heterogénea en aquellos casos donde el oocito recién comienza la vitelogénesis secundaria, y de forma homogénea en oocitos vitelogénicos secundarios avanzados, cuyas plaquetas son de mayor tamaño (Fig 3.6 c y d).

Este tipo de gónada también presenta nidos de oogonias y se observan las células foliculares de forma plana y picnóticas rodeando al oocito, las cuales son de mayor tamaño que las presentes en el estadio I y II. El ovario de estadio III es más grande que el de estadio II. (Tabla 3.1).


Fig. 3.6: (a). Esquema de ovario en estadio III. (b). Vista general de sistema reproductor femenino, con conectores y lóbulos ováricos anteriores claramente diferenciados. (c) y (d). Cortes transversales de ovario en estadio III y detalle de oocitos intermedios (teñidos con hematoxilina eosina). (C) conector, (CF) células foliculares, (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LOP) lóbulos ováricos posteriores (OI) oocito intermedio, (OP) oocito primario (OS) oocito secundario, (OVI) oviductos.

8,75mm


3.4.5 Estadio IV

A partir de los 19g la coloración del ovario es verde oliva intenso y adquiere su forma definitiva. Los lóbulos posteriores tienden a juntarse en la línea media formando una “Y” y se extienden desde la parte media del cefalotórax hasta la parte anterior del abdomen, mientras que los lóbulos anteriores mantienen la misma ubicación que en los morfos anteriores (Fig 3.7 a y b). En este estadio se diferencian macroscópicamente y de forma muy clara los oocitos maduros, que se caracterizan por un significativo incremento de su tamaño relativo respecto del estadio anterior, llegando a ocupar prácticamente toda la cavidad del cefalotórax.

Los ovarios de estadio IV, se caracterizan por una mayor proporción de oocitos vitelogénicos secundarios. Las células foliculares y son totalmente planas, presentando una coloración intensamente basófila y un tamaño similar al estadio anterior (Fig 3.7 c). En los oocitos vitelogénicos secundarios, coloreados con tricrómico de Masson, se observan plaquetas color rojo intenso ocupando la totalidad del citoplasma, y al teñirlos con PAS, se observan los componentes mucopolisacarídicos de color celeste (Fig 3.7 c y d).


Fig. 3.7: (a) Esquema de ovario en estadio IV. (b). Vista general de ovario de color verde oliva. (c) y (d). Cortes transversales de ovario maduro (teñido con tricrómico de Masson). (C) conector, (CF) células foliculares, (LOA) lóbulos ováricos anteriores, (LO) lumen ovárico, (LOP) lóbulos ováricos posteriores, (OP) oocito primario, (OS) oocito secundario, (OVI) oviductos, (PO) pared ovárica, (PV) plaquetas vitelinas.


3.4.6 Caracterización de ovario de post-puesta

El ovario de post-puesta o de remaduración se caracteriza por presentar forma de Y, aspecto sacular e hidratado y una coloración que varía entre el naranja pálido y naranja con algunos oocitos verdes. Este tipo de ovario presenta mayor proporción de oocitos vitelogénicos primarios, algunos oocitos intermedios y escasos oocitos secundarios (Fig 3.8 a y b). Otra de las características importantes de este tipo ovárico, es el gran número de folículos vacíos ó “sacos oogenéticos” (sensu Ando y Makioka, 1998) en forma de “flores” delimitados por el epitelio ovárico y ubicados entre los oocitos, además de un lumen ovárico claramente visible. La capa media de este tipo de ovario presenta un mayor grosor que los estadios descriptos anteriormente (Fig 3.8 b, c y d). Por otra parte en las gónadas de hembras ovígeras se observó que la pared del ovario se encuentra más distendida y con mayor números de pliegues, donde la capa de fibras musculares es más gruesa que en el resto de las hembras (Fig 3.3 d y e).


Fig. 3.8: (a). Esquema de ovario de hembra ovígera de C. quadricarinatus. (b) y (c). Cortes transversales de ovario (teñido con tricrómico de Masson) con folículos vacíos. (d). Detalle de oocito intermedio rodeado por una gruesa pared ovárica (teñido con tricrómico de Masson). (CF) células foliculares, (EO) epitelio ovárico, (FV) folículos vacíos, (LO) lumen ovárico, (OG) oogonias, (OP) oocito primario, (OS) oocito secundario, (PO) pared ovárica, (TC) tejido conectivo, (TM) túnica muscular.

(a)


3.4.7 Conectores y oviductos La estructura de los conectores y oviductos es similar a la pared ovárica, distinguiéndose las tres capas previamente indicadas. En ambos casos se destaca que el epitelio interno es cilíndrico secretor, cuyos núcleos también tiñen de rojo y las secreciones se observan celestes al teñirse con tricrómico de Masson. Tanto en los conectores como en los oviductos la pared presenta pliegues y carece de células germinales (Fig 3.9 a, b, c y d).

Fig. 3.9: (a). Corte longitudinal de conectores de ovario de C. quadricarinatus. (b). Detalle de la pared del conector. (c). Vista general de oviductos en un corte longitudinal de ovario. (ES) epitelio secretor, (L) lumen, (TC) tejido conectivo, (TM) túnica muscular.


3.5 DISCUSIÓN

La organización estructural del ovario de C. quadricarinatus es simple y en términos generales similar a la descripta para otros crustáceos decápodos (Krol et al. 1992; Ando y Makioka 1998; Elorza y Dupré 1999; Kronenberger et al. 2004; Lucic et al. 2006; Sokolowicz et al. 2007; Noro et al. 2008). En este trabajo se destaca la variación de forma de la gónada a lo largo de su ontogenia y la presencia de luz ovárica en todos los estadios de maduración. Se describen los tres tipos de morfología ovárica desde su diferenciación gonadal hasta alcanzar su madurez y su relación con los distintos tipos, tamaño y proporción de estadios celulares que permiten caracterizar una escala macro y microscópica de maduración.

De acuerdo a la bibliografía, en cangrejos y langostas marinas, el ovario presenta forma de H con un “puente” localizado detrás del molinillo gástrico (Johnson 1980; Talbot 1981; Beninger et al. 1988; Krol et al. 1992; Elorza y Dupré 1999; Kronenberger et al. 2004) que une los cordones izquierdo y derecho, definiendo una porción anterior y posterior al puente ovárico, quedando diferenciados los lóbulos ováricos anteriores y posteriores, respectivamente.

En C. quadricarinatus, los ovarios presentan forma de cordones paralelos durante la fase temprana de maduración y adoptan forma de Y en la fase más avanzada, pasando por un estadio de transición con una estructura diferenciada en forma de H. De acuerdo a nuestras observaciones macroscópicas se produciría una fusión de los lóbulos posteriores conforme avanza la maduración, y el ovario en forma de H, adoptaría forma de Y cuando alcanza su total madurez.

Dentro de las langostas de agua dulce, el ovario maduro en forma de Y, es característico de las langostas Astacidae y Cambaridae (Ando y Makioka 1998), mientras que dentro de la familia Parastacidae, se observan al menos dos patrones: uno es el patrón aquí caracterizado para C. quadricarinatus, y el segundo es el de los Parastacidae sudamericanos, donde los ovarios son dos lóbulos unidos longitudinalmente en toda su extensión (Rudolph 1995; de Almeida y Buckup 1999; Rudolph y Almeida 2000; Rudolph et al. 2001; Rudolph 2002; Noro et al. 2008; Silva-Castiglioni et al. 2009).

C. quadricarinatus en su fase más avanzada de madurez, presenta un morfotipo Y, que difiere de las gónadas en forma de Y de las langostas Astacidae y Cambaridae descriptas por Ando y Makioka (1998), ya que éstas últimas presentan sus lóbulos anteriores sin conectores y están íntimamente relacionados con el lóbulo posterior, formando un ovario “trilobular”. En C. quadricarinatus, los lóbulos anteriores están unidos a los lóbulos posteriores por los conectores.

Los oviductos de C. quadricarinatus son rectos e isodiamétricos al igual que en otros Parastacidae estudiados (Rudolph 1995; de Almeida y Buckup 1999; Rudolph y Almeida 2000; Rudolph et al. 2001; Rudolph 2002; Noro et al. 2008; Silva- Castiglioni et al. 2009) y contrastan con el plegamiento proximal del oviducto de Procambarus clarkii (Ando y Makioka 1998). El patrón microscópico del oviducto en C. quadricarinatus es similar al de Parastacus brasiliensis (de Almeida y Buckup 2000) en el cual la pared plegada (en corte transversal)


aumentaría el diámetro del conducto durante la evacuación de los grandes oocitos de ambas especies.

Por otra parte, el presente trabajo describe por primera vez desde un punto de vista macro y microscópico la presencia de estructuras denominadas “conectores”, los cuales caracterizan al presente modelo gonadal. Los conectores son estructuras de aspecto tubular con un tamaño relativo de 5 mm aproximadamente, carentes de células germinales, que unen ambas porciones del ovario y que favorecerían la evacuación de los oocitos maduros de los lóbulos anteriores; por otra parte es importante destacar que hasta el momento no se ha hallado este tipo de estructura ó similar en ningún otra Astacidea ni en especies de Brachyura ó Anomura.

Los oocitos maduros de C. quadricarinatus se caracterizan por su gran tamaño (alcanzando los 2,2 mm de largo) y en este caso, la existencia de los conectores optimizaría la evacuación total del ovario y sustituiría la contracción de la red de fibras musculares dispuestas como tabiques y proyecciones filamentosas que rodean a los folículos presentes en la teca ovárica de langostas marinas Homarus americanus y Jasus frontalis (Talbot 1981; Elorza y Dupré 1999).

A diferencia de H. americanus (Talbot 1981) y J. frontalis (Elorza y Dupré 1999) la pared ovárica de C. quadricarinatus no presenta una gruesa capa muscular (involucrada en la ovulación) sino una delgada y distendida capa de células musculares similar a lo observado en P. clarkii (Ando y Makioka 1998) y Aegla platensis (Sokolowicz et al. 2007) y en algunos otros decápodos como los camarones peneidos (Krol et al. 1992).

De acuerdo a las presentes observaciones, la capa muscular de los conectores y los oviductos, junto con la musculatura extrínseca podrían estar involucradas en la ovulación de C. quadricarinatus. Hasta el momento la presencia de áreas no-germinales en los ovarios de los crustáceos decápodos no ha sido encontrada en ninguna especie.

La secreción producida por el epitelio del conector y oviducto podrían estar vinculadas a una función de lubricación y/ó de modificación de las envolturas del oocito. La presencia de este tipo de epitelio también fue reportada en la pared de oviductos de A. platensis (Sokolowicz et al. 2007), Galathea intermedia (Kronenberger et al. 2004) y P. clarkii (Ando y Makioka 1998) y contrasta con el oviducto de los Brachyura que está escasamente desarrollado, y que solo en la porción mesodérmica de cada receptáculos seminal presenta un epitelio secretor, asociado al mantenimiento de los espermatozoides (Adiyodi y Subramoniam 1983; Bauer 1994; López Greco et al. 2009, entre otros).

Ando y Makioka (1998) proponen que este tipo de epitelio en las paredes del oviducto de P. clarkii puede estar relacionado con la fertilización que podría ocurrir dentro del oviducto. Debido a que la fertilización en C. quadricarinatus ocurre fuera del sistema reproductor femenino asociada al esterno de la hembra (fertilización externa), esta no sería la función de la secreción de los oviductos en esta especie.


De acuerdo a la caracterización bioquímica de la maduración ovárica de C. quadricarinatus (Abdu et al. 2000) los oocitos primarios se caracterizan por un patrón polipeptídico de entre 65-95 kDa mientras que los oocitos intermedios, secundarios y los huevos de desarrollo inicial presentan un patrón polipeptídico de entre 106-177 kDa. La incorporación de la vitelogenina por pinocitosis en los oocitos a partir de su síntesis en el hepatopáncreas (Abdu et al. 2000) determinaría el inicio de la vitelogénesis exógena (Avarre et al. 2003; Serrano-Pinto et al. 2003; Shechter et al. 2005).

En su etapa más avanzada de maduración, los oocitos secundarios de C. quadricarinatus alcanzan tamaños similares a los de otras especies del género (Brian et al. 2001; Beatty et al. 2005), al de otros Parastacidae de America del Sur (Iracabal, 1994; Rudolph y Rojas, 2003; Noro et al. 2008; Silva-Castiglioni et al. 2009), así como los de Anomura de agua dulce (López Greco et al. 2004; Sokolowicz et al. 2007). Estos tamaños relativos de oocitos maduros están vinculados a una baja fecundidad relativa compensada con un buen y rápido crecimiento de los juveniles; dichas características sumadas a la tolerancia a distintos rangos de condiciones de agua y temperatura, permiten siempre, una rápida reorganización y rearmado de los reproductores (Brian et al. 2001).

C. quadricarinatus muestra un patrón de madurez gonadal similar al de Cherax quinquecarinatus, donde el desarrollo de cada estadio ovárico está vinculado a un desarrollo intracelular y en particular a la presencia de plaquetas de vitelo distribuídas en el citoplasma de los oocitos presentes en ovarios maduros (Beatty et al. 2005), aunque los oocitos vitelogénicos secundarios de C. quinquecarinatus son de mayor tamaño y su fecundidad relativa menor respecto de la especie en estudio.

Cuando comparamos la estructura ovárica microscópica de C. quadricarinatus (presente estudio) con P. clarkii (Ando y Makioka 1998), encontramos algunas diferencias importantes. El epitelio ovárico de P. clarkii rodea tanto los oocitos primarios como los secundarios, mientras que en C. quadricarinatus éste solo rodea a los oocitos secundarios, principalmente cuando protruyen en el lumen ovárico. Al mismo tiempo y de acuerdo a Ando y Makioka (1998) “no existen folículos en P. clarkii si se tiene en cuenta que los oocitos rodeados por el epitelio ovárico a veces parecen folículos”.

En C. quadricarinatus las células foliculares que rodean a los oocitos (primarios y secundarios) se observan en todos los estadios ováricos, mientras que en los oocitos secundarios el epitelio ovárico está localizado inmediatamente por afuera de las células foliculares. En el momento de la ovulación cada epitelio ovárico vacío que rodea a un oocito secundario ovulado se asemeja a una “flor”, mientras que los oocitos más sus células foliculares se encuentran dentro del lúmen ovárico ó dentro de los conectores, luego son transferidos al oviducto y ovipuestos a través de los gonoporos femeninos.

Los ovarios maduros de los Parastacidae sudamericanos, Parastacus nicoletti, P. brasiliensis, P. defossus, P. varicosus y Samastacus spinifrons presentan células foliculares rodeando los oocitos primarios y secundarios (Rudolph 1995; de Almeida y Buckup 1997; de Almeida y Buckup 1999; Rudolph et al. 2001; Rudolph 2002). Si bien en ninguna de las especies mencionadas se


describió el epitelio ovárico, tales diferencias entre P. clarkii y C. quadricarinatus y otros Parastacidae necesitan mayor estudio, ya que podrían representar diferentes patrones dentro de Astacidea.

Recientemente, también se han reconocido claras diferencias en la estructura del espermatóforo dentro de Astacidea (Noro et al. 2006; López Greco et al. 2007), incluyendo diferencias entre los Parastacidae sudamericanos y las especies del género Cherax (Noro et al. 2006; López Greco et al. 2007).

Este hecho refuerza la idea de que la estructura gonadal sería una herramienta útil, además de la morfología espermática y las estrategias de transferencia espermática para aceptar ó rechazar hipótesis sobre la evolución de los decápodos (Bauer 1986; Bauer 1991; Hinsch 1991; Jamieson 1991; Jamieson y Tudge 2000; Amadio y Mantelato 2009; López Greco en prensa).

El presente trabajo presenta un valor teórico y comparativo de anatomía y diferenciación sexual del sistema repriductor que podrían vincularse con aspectos filogenéticos de los Astacidea; por otra parte, dicho trabajo también podría tener implicancias desde el punto de vista aplicado al cultivo de C. quadricarinatus

Trabajos previos han demostrado que la aplicación de hormonas exógenas estimulan el proceso de maduración ovárica en camarones (Okumura et al. 2000; Chen et al. 2003; Alfaro et al. 2004; Okumura et al. 2004; Wongprasert et al. 2006; Santhoshi et al. 2009), cangrejos (Richardson et al. 1991; Zapata et al. 2003; Nagaraju et al. 2006) y langostas (Laufer et al. 1998; Rodríguez et al. 2002; Meeratana et al. 2006). Este tipo de inducción se ha logrado inyectando compuestos (Vaca y Alfaro 2000; Rodríguez et al. 2002; Zapata et al. 2003), tales como hormonas y/ó neuroreguladores en el alimento para inducir la primera madurez sexual (López Greco et al. 2003) ó las puestas (Cahansky et al. 2008). Para este tipo de aplicación es fundamental conocer la dinámica del proceso de diferenciación y maduración ovárica y la correlación entre las características macroscópicas y microscópicas.

Los resultados de este capítulo también indican que las hembras de C. quadricarinatus comienzan su proceso de maduración gonadal (Estadio II: 2-16g) desde pesos menores a los indicados previamente en la bibliografía (20 a 25g) de acuerdo a Manor et al. (2004) y Rodríguez González et al. (2005). Esta información es de singular importancia en la optimización del cultivo de la especie, porque implica que las hembras comienzan a derivar energía hacia el crecimiento ovárico desde tallas más tempranas que las publicadas previamente. En el caso de aplicar técnicas para retardar o bloquear el crecimiento gonadal, generando una mayor derivación de nutrientes hacia el crecimiento somático, debería preverse su aplicación más temprana.


CAPITULO 4

“Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor y de la

madurez sexual en machos de Cherax quadricarinatus (Decapoda, Parastacidae) y de las variaciones ontogenéticas de las

estructuras copulatorias”

4.1 INTRODUCCIÓN

En los machos de los crustáceos decápodos, el sistema reproductor consiste en un par de testículos y vasos deferentes que se encuentran ubicados en el cefalotórax en posición dorso-lateral al sistema digestivo y desembocan en gonoporos pares en las coxas del quinto par de preiópodos. Los espermatozoides son empaquetados dentro del vaso deferente en espermatóforos y transferidos a la hembra mediante apéndices modificados y colocados externamente en la superficie esternal del cefalotórax (camarones peneidos, carideos y stenopodideos, langostas, anomuros) o internamente en receptáculos seminales como en los cangrejos Eubrachyura (Bauer 1986).

La morfología externa de los testículos varía en los decápodos. Por ejemplo, en el camarón Macrobrachium rosenbergii, los testículos están conectados en el extremo anterior formando una V, mientras que en los cangrejos Callinectes sapidus (“blue crab”) y Chionoecetes opilio (“snow crab”) los testículos presentan forman de H (Krol et al. 1992).

Los camarones peneidos presentan múltiples lóbulos testiculares, que están conectados al vaso deferente a través de un tubo corto y delgado. Aunque cada lóbulo testicular aparenta estar formado por un gran número de túbulos seminíferos, es en realidad un único túbulo seminífero altamente enrollado (Krol et al. 1992; Cuartas y Petriela 2010; Goldstein y Dupré 2010).

En langostas de agua dulce se reconocen dos morfotipos gonadales: el testículo con forma de H en Parastacoidea y el testículo con forma de Y en Astacoidea (Astacidae y Cambaridae) (Hobbs et al. 2007). Las observaciones macroscópicas del sistema reproductor de C. quadricarinatus indican la presencia de testículos pares de coloración opalescente-crema pálido, que se extienden a lo largo del cefalotórax hasta el segundo somito del pleon, alcanzando una longitud de aproximadamente 40-50 mm en machos adultos de mas de 100 g (López Greco et al. 2007). Desde el punto de vista histológico, están constituídos por numerosos lóbulos que se abren hacia el tubo colector. La pared testicular está formada por una delgada monocapa y cada lóbulo testicular contiene un único estadio de la espermatogénesis (López Greco et al. 2007).

El vaso deferente en los crustáceos decápodos es un conducto que conduce los espermatozoides desde el tubo colector testicular hacia los gonoporos y produce las secreciones que empaquetan los espermatozoides en espermatóforos (Krol et al. 1992; Adiyodi y Anilkumar 1998; Goldstein y Dupré 2010). En los


machos adultos de C. quadricarinatus se diferencian macroscópicamente tres porciones en el vaso deferente: proximal (VDP), media (VDM) y distal (VDD) (López Greco et al. 2007). La pared del vaso deferente secreta los componentes para la formación del espermatóforo. En el VDP y VDM los espermatozoides se rodean de una secreción que forma la capa primaria del espermatóforo y que consolida a los espermatozoides en una masa compacta llamada cordón espermático. En el VDD, este cordón es rodeado de la capa secundaria del espermatóforo que consta de una matriz uniforme y gotas citoplasmáticas, que le confieren al espermatóforo su capacidad de adherencia al esterno de la hembra (López Greco et al. 2007; López Greco y Lo Nostro 2008).

En los crustáceos decápodos, el dimorfismo sexual es frecuente, manifestándose diferencias en el tamaño entre sexos y/ó en el tamaño o morfología de algún apéndice. En cuanto a las estructuras para transferencia espermática, los crustáceos decápodos generalmente utilizan el primer y/ó segundo par de pleópodos modificados (Bauer 1986; Bauer et al. 2001; Martínez y Dupré 2010)

Los Astacidea presentan una “cópula” o transferencia espermática, donde los machos depositan el espermatóforo en la región esternal de la hembra (Astacidae y Parastacidae) o dentro del receptáculo seminal (Cambaridae). En Astacoidea la transferencia espermática ocurre mediante pleópodos modificados, pero en Parastacoidea las estructuras copulatorias corresponden a proyecciones denominadas appendices masculinae (Rudolph 1995; Almeida y Buckup 1997; Almeida y Buckup 1999; Rudolph y Almeida 2000) o papilas fálicas (Rudolph 1997; Sagi et al, 1996) ubicadas en la base de la coxa del quinto par de pereiópodos.

Se han investigado numerosos aspectos de la morfología testicular y del vaso deferente a nivel macroscópico y microscópico en decápodos adultos (de Almeida y Buckup 1999; Rudolph y Almeida 2000; Rudolph et al. 2001; Kronenberger et al. 2004; Viau et al. 2006; López Greco et al. 2007, entre otros) siendo escasa la información disponible sobre el momento de diferenciación sexual y la adquisición de la madurez sexual en machos de Parastacidae.

Esto contrasta con la extensa investigación realizada sobre morfología del sistema reproductor de langostas marinas comercialmente importantes (Radha y Subramoniam 1985; Kooda-Cisco y Talbot 1986), cangrejos (Sainte Marie y Sainte Marie 1999; Benhalima y Moriyasu 2000) y camarones (Chow et al. 1991; Díaz et al. 2001; Akarasanon et al. 2004). 4.2 OBJETIVO

El objetivo del presente capítulo fue caracterizar la diferenciación sexual y

adquisición de la madurez sexual en los machos de C. quadricarinatus desde el punto de vista macroscópico y microscópico.


4.3 MATERIALES Y METODOS

Para realizar la caracterización del sistema reproductor en machos de C. quadricarinatus se utilizaron 353 machos en un intervalo de peso de 0,09 a 150 g. Para la obtención de juveniles machos hasta los 2 g se procedió de acuerdo a lo indicado en el Capítulo 2 y los tamaños mayores fueron obtenidos directamente del criadero previamente mencionado.

4.3.1 Análisis macroscópico y microscópico

Las mediciones y caracterizaciones macroscópicas realizadas (forma, color

y tamaño relativo), son similares a las descriptas en el Capítulo 3. A partir del procesamiento histológico descripto en el punto 3.3.3 realizado para testículo y vaso deferente, se obtuvieron secciones histológicas a partir de las cuales se caracterizó la proporción y el tipo celular presente: lóbulos inmaduros (lóbulos testiculares con presencia de espermatogonias y espermatocitos I); maduros (lóbulos testiculares con presencia de espermátides y espermatozoides) y evacuados (lóbulos testiculares sin ningún tipo celular que se observan como lóbulos “vacíos”); presencia/ausencia de espermatozoides en el tubo colector y vaso deferente.

4.4 RESULTADOS

El análisis macroscópico e histológico del sistema reproductor de machos

de C. quadricarinatus permitió identificar 3 estadios de desarrollo cuyas características se indican a continuación y se resumen en la Tabla 4.1:

4.4.1 Estadio I

La diferenciación del sistema reproductor en machos de C.

quadricarinatus comienza a los 0,09 g. A partir de esta talla y hasta los 0,95 g se diferencian los testículos como dos cordones paralelos conectados en la parte media por un corto “puente”, adquiriendo el testículo forma de “X”, con pequeñas lobulaciones laterales y coloración opalescente. Los testículos se extienden a lo largo del cefalotórax y están conectados al vaso deferente. Esta última estructura surge de la parte media del testículo y define la región testicular anterior y posterior (Fig 4.6 a). Macroscópicamente, el vaso deferente es corto e isodiamétrico sin enrollamiento, transparente y no distinguiéndose ninguna diferenciación del mismo.

Desde el punto de vista histológico, los testículos en estadio I están constituídos por un número reducido de lóbulos que desembocan en el tubo colector. Este estadio presenta principalmente lóbulos inmaduros, pero ya


comienzan a observarse algunos espermatozoides en el tubo colector. (Fig 4.1 a y b). En el vaso deferente no se observa formación de espermatóforo, pero comienza la síntesis de la capa primaria, la cual puede ser identificada con tinción de hematoxilina-eosina como una secreción celeste (Fig 4.1 c).

En cuanto a los caracteres sexuales secundarios, entre los 0,09 y 0,95 g, los machos, poseen appendices masculinae lobulados, y no presentan “red patch” diferenciado (Fig 4.1 d y Tabla 4.1). Los appendices masculinae tienen aspecto redondeado, transparentecon cutícula poco endurecida; son simétricos, con una pequeña abertura (gonoporos) en su zona apical. La parte anterior de la coxa presenta sedas pequeñas y transparentes ordenadas en hileras. (Fig 4.1 d y 4.3 a; Tabla 4.1).

Tabla 4.1: Caracterización macroscópica y microscópica de los diferentes estadios de diferenciación sexual en machos de C. quadricarinatus. LT (largo total), L (appendices masculinae de tipo lobulado), E (appendices masculinae de tipo elongado). (+) Indica presencia de un caracter, mientras que (-) indica la ausencia de un caracter. La diferencia cualitativa para un carácter se indica por el aumento del número de (+).


Fig. 4.1: Estadio I (a). Corte transversal de testículo en vista general. (b). Corte transversal de tubo colector conteniendo espermatozoides. (c). Corte transversal de testículo mostrando vaso deferente proximal sin espermatóforo pero comenzando la síntesis de la capa primaria. (d). Esquema de appendices masculinae lobulados en vista dorsal. (CP) capa primaria del espermatóforo, (CX) coxa del quinto par de pereiópodos, (ESPZ) espermatozoides, (LI) lóbulo inmaduro, (LM) lóbulo maduro, (TC) tubo colector, (VD) vaso deferente.


4.4.2 Estadio II En los machos de 1 a 5 g, los testículos presentan un tamaño relativo

mayor y un mayor número de lóbulos, pero su coloración y extensión a lo largo del cefalotórax es similar al estadio I (Fig 4.2 a y b). En este estadio, los testículos se diferencian como H, estando los cordones paralelos claramente unidos en su parte media por un “puente-conector”. El vaso deferente comienza a diferenciarse en sus distintas porciones (VDP, VDM y VDD), y presenta coloración transparente (Fig 4.6 b).

Histológicamente, la proporción de lóbulos inmaduros supera levemente a la de los maduros. A partir de este estadio comienzan a observarse lóbulos evacuados y espermatozoides en el vaso deferente, algunos de los cuales se hallan rodeados por la capa primaria del espermatóforo mientras que otros “libres” sin esta capa a su alrededor (Fig 4.2 c y d). Por otra parte, en el VDM comienza a evidenciarse la formación de la capa secundaria del espermatóforo (Fig 4.2 d).

Fig. 4.2: Estadio II (a). Corte longitudinal de testículo. (b). Detalle de lóbulo testicular abierto al tubo colector. (c). Diferenciación de la capa primaria del espermatóforo dentro del vaso deferente. (d). Diferenciación de la capa secundaria del espermatóforo dentro del vaso deferente. (CP) capa primaria del espermatóforo, (CS) capa secundaria del espermatóforo, (ESPZ) espermatozoides, (LI) lóbulo testicular inmaduro, (LT) lóbulos testiculares, (TC) tubo colector.


Con respecto a los caracteres sexuales secundarios comienza la elongación de los appendices masculinae (Fig 4.3 a). En este rango de talla se encuentran ejemplares con appendices masculinae lobulados (descriptos anteriormente), como así también animales con appendices masculinae elongados (Tabla 4.1). Los appendices masculinae elongados son tubulares, con cutícula gruesa y coloración opalescente-crema pálido que se elongan proyectándose hacia la parte anterior del cefalotórax (Fig 4.5 a). En este estadio los machos no presentan “red patch” (Fig 4.3 b).

4.4.3 Estadio III El estadio III comienza a partir de los 6 g; podemos observar además del

aumento de tamaño del animal, un incremento en el tamaño relativo de la gónada, como así también en el número de lóbulos testiculares maduros (Fig 4.3 c y d).

En este estadio, el testículo tiene aún forma de H, pero ambos cordones se encuentran muy próximos tendiendo a formar una estructura impar medial aunque distinguiéndose su condición par (Fig 4.6 c). Pueden ser reconocidos 2 subestadios, denominados A y B, los cuales se caracterizan por un incremento del número de espermatozoides presentes en el vaso deferente en función de la talla (Tabla 4.1). El vaso deferente es blanco en toda su longitud y sus porciones VDP, VDM y VDD son claramente diferenciadas.

Macroscópicamente, los testículos se extienden desde la parte anterior del cefalotórax hasta el pleon, y son similares en los dos sub-estadios, tanto en color, tamaño y cantidad relativa de lóbulos.

Histológicamente, solo se diferencia en la cantidad de espermatozoides presentes en el vaso deferente, empaquetados en el espermatóforo, y en el aspecto que presentan las diferentes capas que lo conforman. También se puede observar la capa primaria del espermatóforo totalmente rodeada por el material acelular que representa el componente principal de la capa secundaria (Fig 4.4). En este estadio, ya pueden observarse un gran número de lóbulos testiculares evacuados (Fig 4.3 d y f).

A partir de este estadio los appendices masculinae son elongados y adquieren un patrón de estriación longitudinal; éstos presentan a sus laterales un grupo de sedas gruesas amarronadas y características de los machos adultos. Pueden diferenciarse dos clases de appendices masculinae: uno de aspecto más cónico, característico del sub-estadio A (Fig 4.5 a y b) y otro más elongado y robusto, típico del sub-estadio B (Fig 4.5 c, d y e). También comienza a diferenciarse el “red patch” (Fig 4.5 f; Tabla 4.1).


Fig. 4.3: (a). Appendices masculinae de tipo lobulado en el estadio II. (b). Quelípedo sin “red patch” diferenciado en estadio II. (c) y (d). Corte transversal de testículo en estadio III, mostrando lóbulos maduros, tubo colector y lóbulos evacuados. (e). Detalle de lóbulo testicular con espermatozoides. (f). Detalle de lóbulo evacuado. (ESPZ) espermatozoides, (LE) lóbulos evacuados, (LM) lóbulos maduros (TC) tubo colector.


Estadio III A:

El estadio III (A) comienza a partir de los 6 g y se extiende hasta los 20 g. En este rango de peso los animales presentan un vaso deferente claramente diferenciado en sus porciones y totalmente blanco.

Desde el punto de vista histológico, la capa primaria del espermatóforo está totalmente formada y diferenciada de la secundaria. Dentro del vaso deferente se observa poca cantidad de espermatozoides empaquetados (encerrados por la capa primaria), y por lo tanto existen numerosas secciones del cordón espermático del espermatóforo claramente diferenciadas y vacías. En este estadio, la capa secundaria presenta un aspecto homogéneo, y está formada por pequeñas gotas dispuestas de manera uniforme (Fig 4.4 a y b).

En este subestadio, los appendices masculinae elongados, presentan tanto una zona apical como basal con cutícula poco engrosada. Este tipo de appendix presenta forma “cónica” y comienza a evidenciarse la zona media de plegamiento y algunas estrías transversales (Fig 4.5 a y b).

Estadio III B:

El estadio III (B), abarca un rango de peso mayor a 20 g y, a diferencia del estadio anterior, se observan mayor cantidad de espermatozoides empaquetados en el vaso deferente. En este subestadio ya no se observan secciones del cordón espermático vacías y la capa secundaria presenta un aspecto heterogéneo dado por la disposición de gotas de diferentes tamaños (Fig 4.4 c y d).

En este subestadio, los appendices masculinae presentan un aspecto más rígido con cutícula engrosada en su parte basal, siendo la zona apical flexible, el lugar donde se abren los gonoporos. Por otra parte este tipo de appendix presenta dos estrías longitudinales marrones claramente visibles y una zona media de plegamiento claramente diferenciada (Fig 4.5 c, d, e; Tabla 4.1).

Las diferencias entre los tres estadios (I, II y III) a nivel macroscópico-testicular, radican en el tamaño de la gónada y la cantidad de lóbulos testiculares, donde de 0,09-0,95 g los lóbulos testiculares son pequeños y opalescentes, a partir de 1g y hasta los 5 g, dichas estructuras son de mayor tamaño pero su color es similar al intervalo anterior, y desde pesos mayores a 6 g, podemos observar un incremento en el tamaño relativo de la gónada, como así también en el número de lóbulos testiculares maduros.


Fig. 4.4: Espermatóforo dentro del vaso deferente distal en machos de estadio III. (a) y (b). Vista general y detalle del vaso deferente distal con algunas áreas de capa primaria “vacía” de espermatozoides. (c) y (d). Vista general y detalle del vaso deferente distal con la capa primaria rodeando espermatozoides en machos de estadio III B. (CP) capa primaria, (CS) capa secundaria, (ESPZ) espermatozoides.


Fig. 4.5: Caracteres sexuales secundarios en machos de estadio III. (a). Appendices masculinae elongados (estadio III A). (b). Esquema de los appendices masculinae “cónicos” en vista ventral (estadio III A). (c). Appendices masculinae elongados (estadio III B). (d). Esquema de appendices masculinae “tubulares” en vista ventral (estadio III B). (e). Esquema de appendices masculinae con gonoporos en vista dorsal (estadio III B). (f). Quelípedo con “red patch” diferenciado. (CX) coxa del quinto par de pereiópodos


Fig. 4.6: Esquema del sistema reproductor masculino. (a). Esquema de testículo en estadio I. (b). Esquema de testículo en estadio II. (c). Esquema de testículo en estadio III. (P) puente testicular, (VDD) vaso deferente distal, (VDM) vaso deferente medio, (VDP) vaso deferente proximal, (T) testículos.


4.5 DISCUSIÓN

El presente trabajo muestra que en machos de C. quadricarinatus la diferenciación de los caracteres sexuales primarios ocurre tempranamente (0,09-0,10 g) y de acuerdo a los resultados del Capítulo 2, la diferenciación de los caracteres primarios ocurriría probablemente una o dos mudas antes que los secundarios. Esto sería similar a los observado en Procambarus clarkii (Taketomi et al. 1996).

A partir de los 6 g, los appendices masculinae son estructuras elongadas, los lóbulos testiculares adquieren un mayor tamaño relativo, el vaso deferente presenta coloración blanca, debido a la producción de espermatóforo y comienza a diferenciarse el “red patch” en el lado externo del dáctilo de los quelípedos. El conjunto de estos caracteres sexuales primarios y secundarios indicaría el inicio de la madurez sexual en esta especie y de acuerdo a los resultados del Capítulo 3, la madurez sexual de los machos se alcanzaría a tallas menores que las hembras.

Sin embargo esto no implica necesariamente que la "madurez funcional" (evaluada como la capacidad para copular) ocurra a partir del mencionado peso (6g) así como tampoco que las posibilidades de apareamiento en esta talla sean similares que para los machos adultos (López Greco y Rodríguez 1999). Se requieren estudios adicionales para determinar si en C. quadricarinatus existe algún tipo de competencia jerárquica y/ó desplazamiento del espermatóforo entre los machos de diferentes tallas, tal como ocurre en langostas Astacidae (Aquiloni y Gherardi 2007; Aquiloni y Gherardi 2008) y algunas otras especies de decápodos (Raànan y Sagi 1985; Elner y Beninger 1995; Correa y Thiel 2003).

Trabajos realizados en C. quadricarinatus, muestran que existe una significativa relación entre la talla de los machos y la cantidad de espermatozoides dentro del espermatóforo. Los valores hallados de concentración espermática para el intervalo de 8,5 g a 270 g se encuentran en el orden de 107 a 109 espermatozoides/ml de espermatóforo, lo que evidencia que la concentración espermática es alta aún para tallas pequeñas (Bugnot y López Greco 2009). Algunos autores se basan en las observaciones microscópicas de presencia/ausencia de espermatozoides en el vaso deferente y/ó tubo colector para diagnosticar la “madurez sexual funcional” ó “funcionalidad reproductiva” (López Greco y Rodríguez 1999). Pero el criterio de funcionalidad reproductiva, no solo está ligado a los aspectos macro y microscópicos, sino también al entorno social. Por ejemplo, en el cangrejo Chionoecetes opilio, las oportunidades reproductivas están condicionadas por competición de niveles inter-machos, lo que significa que la presencia de machos grandes desplaza a los pequeños, y éstos solo participan en la función reproductiva cuando la cantidad de machos grandes es baja (Elner y Beninger 1995).

Similares casos de desplazamiento de machos de menor tamaño (con probada funcionalidad reproductiva en condiciones no competitivas) por machos de mayor tamaño han sido observados en el camarón Macrobrachium rosenbergii (Raànan y Sagi 1985) y varios de camarón del género Rhynchocinetes (Thiel et al. 2010 para revisión). Incluso trabajos recientes realizados en la langosta (Cambaridae) Procambarus clarkii, muestran que la elección de pareja puede


inplicar la selección por parte de la hembra de los machos más grandes y la selección por parte de los machos de las hembras vírgenes (Aquiloni y Gherardi 2007; Aquiloni y Gherardi 2008). Ningunos de estos aspectos han sido evaluados en C. quadricarinatus por lo cual para determinar el inicio “real” de la capacidad reproductiva se requerieren estudios adicionales de comportamiento de apareamiento.

En relación a los patrones morfológicos descriptos en este capítulo una revisión reciente sobre el sistema reproductor masculino en Astacidea (Hobbs et al. 2007), considera que la gónada masculina que se diferencia en dos formas básicas, esto es en forma de “H” ó “Y”. La primera forma es considerada la más primitiva y típica de Parastacoidea, Nephropoidea y Enoplometopoidea. Según Hobbs et al. (2007), los testículos de los Parastacidae se originan como dos cordones paralelos, cada uno de los cuales presenta su propio vaso deferente; luego estos cordones paralelos se conectarían entre sí medialmente por un puente, dando lugar al morfotipo H. Posteriormente, en Astacidae y Cambaridae, la “H” se transformaría en “Y” por fusión de los lóbulos posteriores, los cuales se caracterizan por ser más ó menos redondeados y/ó extendidos, en estos dos grupos.

C. quadricarinatus, pese a pertenecer a la familia Parastacidae, no presenta un patrón testicular primitivo similar al reportado por Hobbs et al. (2007), dado que desde su primer estadio (estadio I), muestra una gónada diferenciada como dos delgados cordones paralelos fusionados en su parte media, formando una X. Estudios previos mostraron que en los machos e intersexos machos de algunas especies de Parastacidae de América del Sur como Parastacus brasilensis (de Almeida y Buckup 1997) y P. varicosus (Rudolph et al. 2001; Silva-Castiglioni et al. 2008) y P. defossus (Noro et al. 2008), los testículos son dos estructuras tubulares yuxtapuestas, conectada lateralmente a ambos oviductos y vaso deferente.

Desde el punto de vista histológico, diversos cortes transversales muestran que la microanatomía de los testículos de C. quadricarinatus es similar a la descripta por Hobbs et al. (2007) para Parastacoidea, Nephropoidea y Enoplometopoidea, en la que cada uno de los lóbulos testiculares presenta una amplia base abierta a la luz del tubo colector. Los lóbulos contiguos, se encuentran medialmente fusionados y abiertos al tubo colector formando una única estructura ó lóbulo. En contraste, los lóbulos testiculares de Astacidae y Cambaridae se encuentran unidos al tubo colector por medio de “tallos” de tejido epitelial, lo que permite el pasaje de los espermatozoides maduros de los lóbulos hacia el tubo colector. En los lóbulos inmaduros, el “tallo” se encuentra cerrado, permaneciendo aislado de la luz del tubo colector (Hobbs et al. 2007).

Con respecto al vaso deferente, C. quadricarinatus presenta una estructura similar a la encontrada en Parastacoides tasmanicus y Astacopsis franklinii. Éste se encuentra formado por una porción proximal muy enrollada, ese grado de enrrollamiento disminuye hacia la parte distal del vaso deferente, mientras que su diámetro aumenta en la misma dirección. Esta estructura contrasta con el vaso deferente más corto y recto que presentan algunos Parastacidae de América del Sur (López Greco et al. 2007; Silva-Castiglioni et al. 2008; Noro et al. 2008).


Con respecto a la estructura del espermatóforo, C. quadricarinatus también difiere de Astacidae y Cambaridae. De acuerdo a nuestros resultados y a estudios recientes (López Greco et al. 2007; Lopez Greco y Lo Nostro 2008), los espermatozoides de C. quadricarinatus son empaquetados en un largo y enrrollado cordón espermático, similar a lo reportado para la langosta marina Panulirus homarus (Radha y Subramonian 1985), y diferente a lo observado en Parastacidae de America del Sur (Noro et al. 2007; Silva-Castiglioni et al. 2008; Noro et al. 2008), mientras que en Astacidae y Cambaridae los espermatozoides son empaquetados de manera individual dentro de un espermatóforo estructuralmente más complejo (Vogt 2002; Hobbs et al. 2007).

De acuerdo a Hobbs et al. (2007) y los presentes resultados (ver discusión in extenso en Vazquez y López Greco 2010) la “arquitectura” del sistema reproductor en las langostas de agua dulce presenta diferencias significativas que podrían estar vinculadas con la pertenencia a los taxones Astacoidea y Parastacoidea.

En cuanto al las estructuras copulatorias, en los Astacoidea, Nephropoidea y Enoplometopoidea, los primeros pleópodos del macho están presentes y funcionan conjuntamente para transferir el espermatóforo a la hembra. En los Astacoidea, el segundo par de pleópodos también está involucrado en la trasnferencia espermática y funcionan junto con el primer par de pleópodos (Hobbs et al. 2007).

Los Parastacoidea difieren de Astacoidea en que carecen de pleópodos modificados en el primer segmento abdominal y para transferir el espermatóforo poseen estructuras copulatorias llamadas appendices masculinae o papilas fálicas (Scholz 2002). Los appendices masculinae de los machos adultos de C. quadricarinatus son elongados y con porciones de cutículas mas engrosadas, presentando una región basal rígida y una región apical flexible en la que se localizan los gonoporos y su forma varía a lo largo de la ontogenia. En su estadio más avanzado, presentan un aspecto tubular y robusto, con un patrón de estriación longitudinal que contrasta con los Parastacidae de América del Sur. En éstos se reconocen dos patrones anatómicos: aquel observado en Parastacus y Samastacus, en el que los appendices masculinae son cortos y redondeados (Rudolph 1995; Almeida y Buckup 1997; Almeida y Buckup 1999; Rudolph y Almeida 2000; Rudolph y Crandall 2007), y el observado en el género Virilastacus. En V. retamalli las estructuras copulatorias son muy largas, delgadas, curvas y con cuticula altamente engrosada (Rudolph y Crandall 2007). En S. spinifrons también pueden observarse papilas fálicas endurecidas, pero nunca tan largas como las descriptas para V. retamalii.

Comparando estas estructuras con otros decápodos, estudios realizados en Coenobita perlatus y C. clypeatus (Anomura) mostraron la presencia de estructuras copulatorias llamadas tubos sexuales que tienen gran similitud con los appendices masculinae de C. quadricarinatus. Estos tubos sexuales también son proyecciones de las coxas del quinto par de pereiópodos, y presentan un aspecto robusto, calcificado, con numerosas setas. (Tudge y Lemaitre 2006).

Las diferencias observadas entre los appendices masculinae elongados, con cutícula mas engrosada, estriados y bastante flexibles de C. quadricarinatus y


los de otros Parastacidae y las similitudes con C. clypeatus plantean la pregunta sobre el valor de las estructuras copulatorias para el análisis filogenético en los decápodos, y la necesidad de llevar a cabo estudios sobre los mecanismos de apareamiento para entender posibles relaciones de convergencia en las estructuras involucradas en la transferencia espermática. En este sentido, las posibles convergencias en la morfología y en algunos aspectos de la “arquitectura” del sistema reproductor masculino entre los Parastacoidea (de agua dulce) y los Nephropoidea y Enoplometopoidea (ambos marinos) podrían estar relacionadas con las características basales del infraorden Astacidea (Martin y Davis 2001).


CAPITULO 5

“Caracterización de la diferenciación del sistema reproductor de los intersexos y de la madurez sexual en “intersexos hembras” de

Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)” 5.1 INTRODUCCIÓN

La ecología de la reproducción, la selección de diferentes sistemas genéticos y la historia filogenética, podrían explicar la distribución de los sistemas sexuales entre diferentes grupos (Bauer 2001). Dentro de los sistemas sexuales, la intersexualidad está definida por la existencia de caracteres femeninos y masculinos en el mismo individuo y ha sido caracterizada en especies gonocóricas y en especies hermafroditas abarcando caracteres de la morfología externa y/ó de la morfología gonadal (Khalaila y Sagi 1997; Almeida y Buckup 2000; Bauer 2001).

En los crustáceos, la intersexualidad ha sido documentada principalmente en especies que exhiben protandria total o parcial (Sagi et al. 1996; Bauer 2001).

Diferentes estudios en crustáceos decápodos han discutido la eventual relación entre intersexualidad y el verdadero hermafroditismo (Bauer 2002; Bauer 2002a; Turra 2004; Baeza et al. 2007; Noro et al. 2008, entre otros) así como el posible origen de la intersexualidad y sus posibles moduladores (densidad poblacional, factores hormonales y ambientales) (Juchault 1999; Rudolph 1999; Rudolph et al. 2001; Abdu et al. 2002; Parnes et al. 2003; Silva-Castiglioni 2008; López et al. 2010). Hasta el momento no existe una teoría consensuada sobre el origen de la intersexualidad a partir del gonocorismo o del hermafroditismo o eventualmente su condición ancestral dentro del taxón.

Dentro de la familia Parastacidae, la intersexualidad ha sido identificada en varias especies de América del Sur de los géneros Parastacus y Samastacus (Almeida y Buckup 2000; Rudolph y Almeida 2000) y en las especies australianas de los géneros Engaeus, Engaewa y Cherax (Horwitz 1988; Medley y Rouse 1993; Sagi et al. 1996).

En C. quadricarinatus se han descripto distintos patrones de intersexualidad, debido a las diferentes posibles combinaciones de gonoporos masculinos y femeninos que presenta cada individuo intersexo (Medley y Rouse 1993; Sagi et al. 1996). Estos intersexos han sido caracterizados como “machos funcionales” debido a la presencia de sistema reproductor masculino funcional y ovario arrestado en vitelogénesis primaria (Sagi et al. 1996) y representan proporciones variables en cultivos (Medley y Rouse 1993; Sagi et al. 1996). Debido a su “plasticidad sexual” C. quadricarinatus se ha transformado en un


modelo para la manipulación endócrina en los crustáceos decápodos (Sagi et al. 1996; Sagi et al. 1997; Manor et al. 2004).

A partir de las observaciones realizadas en el laboratorio desde el año 2004 que mostraban un gran número de “hembras” ovígeras con presencia de ambos pares de gonoporos (masculinos y femeninos) y juveniles de diferentes tallas con similares características, se decidió evaluar las características macroscópicas y microscópicas de los intersexos y en particular del tipo de intersexo que por su capacidad de portación de huevos, denominamos intersexo “hembra”.

5.2 OBJETIVO El objetivo del presente capitulo fue identificar los distintos tipos de

individuos intersexos a partir de los caracteres sexuales primarios y secundarios, caracterizar la diferenciación gonadal y madurez sexual del tipo intersexo “hembra”. 5.3 MATERIALES Y METODOS

Para realizar la caracterización del sistema reproductor en “intersexos hembra” de C. quadricarinatus se utilizaron 193 intersexos en un intervalo de peso de 0,11 a 134 g. Para la obtención de los juveniles de menor tamaño se procedió de acuerdo a lo indicado en el Capítulo 3 (3.3.1). 5.3.1 Análisis macroscópico y microscópico

Las mediciones y determinaciones macroscópicas se realizaron de acuerdo

a las descriptas en el mismo Capítulo (3.3.2). A partir del procesamiento histológico descripto en el punto 3.3.3, se obtuvieron secciones histológicas y se identificó la proporción y el tipo celular presente (oocitos vitelogénicos primarios, intermedios y secundarios), la presencia/ausencia de folículos vacíos y de células foliculares, como así también de lóbulos testiculares maduros/inmaduros y evacuados. Por último se midió con un ocular micrométrico calibrado mediante una placa Leitz Wetzlar de 10 µm de espaciamiento el diámetro mayor y menor de cada oocito cuya sección pasara por el núcleo, y se registró el número de “nidos” o grupos de oogonias y la cantidad de oogonias por grupo. Los promedios de diámetro medio de cada estadio celular fueron calculados y analizados por medio del programa estadístico Statistica 6.0 (StatSoft).

Además de la estructura ovárica, se caracterizó la morfología microscópica de la pared de los oviductos y conectores y el ovario de postpuesta o remaduración de dos intersexos “ovígeras” de menos de 48 horas de puesta.


5.4 RESULTADOS

El análisis de las observaciones macroscópicas y microscópicas de todos los individuos intersexos seleccionados en el presente trabajo ha demostrado que C. quadricarinatus presenta diferentes patrones de intersexualidad, observándose claramente cuatro posibles combinaciones de aberturas genitales que guardan relación directa con el sistema reproductor observado (tabla 5.1).

Caracteres Sexuales Secundarios

Caracteres Sexuales

Primarios

Tipo de Intersexualidad

Número de Gonoporos Femeninos

Número de Gonoporos

Masculinos

Número de Appendices masculinae

Presencia/

Ausencia de “Red Patch”

Tipo de Gónada presente

Número de individuos

(n)

TIPO I

2

2

0

-

Ovarios Funcionales

165

TIPO II

2

-

2

+

Testiculos + V. deferente

Funcionales

5

TIPO III

2

1

1

+/-

Ovario arrestado en Vtg 1+

Testiculo + V. Deferente funcional

12

TIPO IV

1

-

2

+

Oocito Vtg 1 + Testiculo funcional

3

Tabla 5.1: Observaciones macroscópicas y microscópicas de los diferentes patrones de intersexualidad en C. quadricarinatus.


5.4.1 Intersexo TIPO I Este tipo de intersexo se lo denominó “intersexo hembra”, ya que presenta

características gonadales similares (macro y microscópicas) a las observadas en hembras de esta especie (Capítulo 3), pero también presenta una o ambas aberturas genitales masculinas en la base de la coxa del quinto par de pereiópodos (Fig.5.1a).

5.4.2 Caracterización del ovario de “intersexo hembra” El sistema reproductor de este tipo de intersexo, fue comparado con el

encontrado en hembras de similar tamaño, y dichos resultados indicaron que este tipo de intersexualidad corresponde a hembras funcionales. Tanto las hembras como los individuos intersexos, muestran la presencia de ovarios pares, constituidos por dos cordones longitudinales con un grado variable de fusión a lo largo de la ontogenia, ubicados dorso-lateralmente al sistema digestivo con sus respectivos oviductos. Ambos ovarios presentan una zona más estrecha, delgada y opalescente denominada “conector” (Capítulo 3). En función del tamaño también se reconocieron los tres morfotipos descriptos en hembras: cordones paralelos, ovario en forma de H y ovario en forma de Y.

En cuanto a las observaciones histológicas, éstas corroboraron las observaciones macroscópicas, mostrando que los animales intersexos presentan el mismo tipo de patrón de organización que las hembras descriptas en el Capítulo 3, en cuanto a la estructura de la teca ovárica, presencia de nidos oogoniales, proporción de oocitos en vitelogénesis primaria, secundaria y células foliculares. Estas características permitieron distinguir cuatro estadios de desarrollo gonadal (Tabla 5.2).

Los estadios I y II presentan similares características que las descriptas en hembras, tanto en el rango de talla, como así también en la coloración y morfotipo gonadal, proporción celular y diámetro promedio de los diferentes estadios oocitarios (Tabla 5.2). A partir del estadio III se encuentran diferencias en la relación entre el tamaño y el estadio de madurez gonadal. Los oocitos del estadio III de estos intersexos son mayores que los del mismo estadio de las hembras (Capítulo 3). En el estadio IV de los intersexos también se observa que los animales de menor tamaño con ovarios maduros (verde oliva) son menores que en el caso de las hembras (Tabla 5.2). Los ovarios de post-puesta de los intersexos fueron idénticos a lo descripto para las hembras.


5.4.3 Intersexo TIPO II

Este tipo de intersexualidad fue denominada “intersexo macho”. Estos individuos presentan un par de gonoporos femeninos (en la base del tercer par de pereiópodos) y un par de appendices masculinae (lobulados y elongados) con la morfología caracterizada en el Capítulo 4. Otro carácter sexual secundario importante observado en este tipo de intersexo es la presencia de “red patch” en el margen externo del propodo del primer par de pereiópodos, característico de los machos de esta especie (Fig. 5.1 b y Tabla 5.1).

Desde el punto de vista de los caracteres sexuales primarios, los “intersexo macho”, muestran un patrón gonadal idéntico al de los machos (testículos y vasos deferentes funcionales y pares). Histológicamente, este tipo de intersexo presenta lóbulos testiculares en diferentes estadios (variando la proporción de éstos según el estadio de madurez del animal) y de similar diámetro que el reportado para machos. Por otra parte, también se observó la presencia de espermatozoides en el

Tabla 5.2: Caracterización macroscópica y microscópica de los distintos estadios de diferenciación ovárica en intersexos hembra de C. quadricarinatus y su relación con la talla evaluada como, (LT) largo total del cefalotórax, (LPO) largo post-orbital y peso (g). Todas las variables se expresan como media ± error estándar y para el diámetro de los oocitos el también se incluyen el valor mínimo y máximo.


vaso deferente, limitados por la capa primaria y empaquetados en el espermatóforo (ver figuras del Capítulo 4).

5.4.4 Intersexo TIPO III

A este tipo de intersexo se lo denominó “macho-hembra”. Estos individuos

presentan un par de gonoporos femeninos, y en la base del quinto par de pereiópodos se observó de un lado el gonoporo masculino y del otro lado el appendix masculino desarrollado. Estos tipos de intersexos pueden presentar o no red patch, dependiendo de la talla (Fig. 5.1c).

Desde el punto de vista macroscópico, se observó que estos tipos de intersexos desarrollaron ambos sistemas reproductores. Del lado que sólo se diferencia el gonoporo masculino, se encontró ovario inmaduro de color crema pálido, poco desarrollado, con oviducto y lóbulo anterior diferenciado; mientras que del lado donde se desarrolla el appendix masculino, se encontró testículo y vaso deferente de color blanco (con espermatóforo), característico del sistema reproductor masculino funcional (Fig. 5.2 a y Tabla 5.1).

Histológicamente, presentan un ovario con oocitos arrestados en vitelogénesis primaria, y lóbulos testiculares maduros, con diámetro similar al de los machos. Dentro del vaso deferente se distinguió la presencia de diferentes secciones del cordón espermático con espermatozoides empaquetados en el espermatóforo, similares a los observados en el intersexo Tipo II (Fig. 5.2 b, c y d).


Fig 5.1: Esquema de los cuatro tipos de intersexos observados. (a). Intersexo Tipo I. (b). Intersexo Tipo II. (c). Intersexo Tipo III. (d). Intersexo Tipo IV.

(C) (d)


Fig 5.2: (a). Intersexo Tipo III con ovario en vitelogénesis primaria y testiculo desarrollado con vaso deferente blanco. (b). Corte transversal de ovario. (c). Corte transversal de testículo maduro. (d). Corte tranversal de vaso deferente conteniendo espermatóforo. (CF) células foliculares, (CP) capa primaria del espermatóforo, (CS) capa secundaria del espermatóforo, (ESPZ) espermatozoides, (LE) lóbulos evacuados, (LI) lóbulo inmaduro, (LM) lóbulos maduros, (OP) oocito vitelogénico primario.


5.4.5 Intersexo TIPO IV Estos intersexos presentan un gonoporo femenino y un par de appendices

masculinae. Al igual que los intersexos de Tipo III, se los denomina intersexo “macho-hembra” y pueden presentar o no red patch, dependiendo de la talla (Fig. 5.1 d y Tabla 5.1). Macroscópicamente, se observó sistema reproductor masculino, con testículo par y vaso deferente transparente. Microscópicamente, presentan el típico sistema reproductor masculino, con lóbulos testiculares en diferentes estadios y un tubo colector conteniendo espermatozoides. La diferencia con los otros tipos de intersexualidad, es la presencia en los diferentes cortes transversales de al menos un oocito vitelogénico primario ubicado entre los lóbulos testiculares (Fig. 5.3 a, b y Tabla 5. 1)

En el presente trabajo, no se ha observado ningún caso de individuo tipificados como “intersexos hembra” (Intersexo Tipo I) con vestigios de sistema reproductor masculino, excepto en los casos donde se observó la presencia de appendices masculinae (Intersexo Tipo II, III y IV).


Fig 5.3: (a). Corte transversal de testículo de intersexo Tipo IV con tubo colector. (b). Corte transversal de testículo con oocito primario. (LI) lóbulo inmaduro, (LM) lóbulos maduros, (OP) oocito vitelogénico primario, (TC) tubo colector


5. 5 DISCUSION El presente estudio muestra la presencia de individuos intersexos hembra

en la especie C. quadricarinatus, en la que la intersexualidad ha sido vinculada a la presencia de intersexos como machos funcionales (Sagi et al. 1996; Khlaila et al. 1999). Tales machos funcionales se caracterizan por la presencia de un ovario arrestado en vitelogénesis primaria y un sistema reproductor masculino funcional del lado opuesto (Khalila et al. 1999), mientras que los intersexos caracterizados en el presente trabajo presentaron oviductos y ovarios pares con oocitos en vitelogénesis primaria y secundaria.

Un punto importante para destacar en esta especie, es que pese a ser gonocórica presenta una importante plasticidad sexual. Trabajos previos indican que la proporción de individuos intersexos en criadero es entre un 13% y 17% (Parnes et al. 2003), además de ser un tipo de sexualidad común en los crustáceos (Mc Curdy et al. 2004; Turra 2004), y en especial en la familia Parastacidae (Sagi et al. 1996; De Almeida y Backup 1999; Rudolph et al. 2001; Rudolph 2002; Sagi et al. 2002; Ford et al. 2003; Parnes et al. 2003).

Observaciones realizadas en nuestro laboratorio indican que los intersexos de C. quadricarinatus son machos sólo cuando se observa la presencia de uno ó ambos appendices masculinae. Sólo en esos casos y aunque el animal intersexo diferencie gonoporos en la base del tercer par de pereiópodos, presentará un sistema reproductor masculino par si presenta ambos appendices o impar si presenta sólo un appendix. Por otra parte, los intersexos machos usualmente presentan “red patch” diferenciado en uno o ambos quelípedos.

El análisis de las observaciones macroscópicas y microscópicas de todos los individuos intersexos seleccionados en este trabajo han demostrado que C. quadricarinatus presenta diferentes patrones de intersexualidad, en los que se observan claramente cuatro posibles combinaciones de aberturas genitales con presencia/ausencia de “red patch”, como así también presencia/ausencia de appendices masculinae. Resulta interesante la comparación dentro de la misma especie con los individuos intersexos informados por Sagi et al. (1996), dado que además de encontrar seis tipos de combinaciones de gonoporos, no indica intersexos hembra, sino que los clasifica como “hembras masculinizadas” (comunicación personal Dr.Sagi, 2007), dado que carecen de appendices masculinae. En contraste, este trabajo reporta un patrón dominante de intersexualidad como hembra funcional, con ovarios maduros y oocitos vitelogénicos secundarios.

Los crustáceos decápodos son típicamente organismos gonocóricos (Turra 2004) pero existen diversas especies con individuos intersexos que son clasificados por diversos autores como machos funcionales, hermafroditas verdaderos, hermafroditas no-funcionales y hermafroditas rudimentarios (Sagi et al. 1996; Rudolph y de Almeida 2000; Turra 2004; Fantucci et al. 2007).

Dentro de los Parastacidae, la intersexualidad de Parastacus pugnax, P. pilimanus y P. varicosus no se encontraría ligada al hermafroditismo (aunque existen diferencias de opinión entre autores) mientras que la inersexualidad de P.


deffosus, P. saffordi y P. nicoleti se hallaría vinculada al hermafroditismo protándrico parcial (con individuos de tipo intersexo transicional) (Tabla 5.3).

Samastacus spinofrons también es considerada una especie gonocórica, pero existen individuos intersexos e individuos intersexo con hermafroditismo parcial. Trabajos previos demostraron que estos cambios de sexualidad dentro de la misma especie están directamente relacionados con el hábitat y la densidad poblacional (Tabla 5.3).

También se han identificado individuos intersexos en al menos tres especies de cangrejo ermitaño (Anomura), Clibanarius antillensis, Clibanarius vittatus y Clibarius sclopetaruis que pueden presentar diferentes combinaciones de gonoporos (Turra 2004; Fantucci et al. 2007) y en camarones Caridea una significativa variedad de patrones sexuales incluyendo la intersexualidad (Bauer 2002a; Bauer 2002b; Baeza y Bauer 2004; Bauer 2006; Baeza et al. 2007; Baeza 2008; Braga et al. 2009).

Desde el punto de vista filogenético, existen diversas hipótesis planteadas sobre la evolución de la sexualidad de los crustáceos y la relación entre el hermafroditismo y el gonocorismo. Según Juchault (1999), el gonocorismo habría aparecido por integración en el genoma del hospedador de un elemento de ADN parásito xenógeno, el cual inhibiría la expresión de los genes masculinos. El sexo femenino sería anterior al sexo masculino y los machos heterogaméticos pueden ser vistos como producto de un “conflicto intragenómico” en una especie en el que el sexo heterogamético ancestral son las hembras. En cuanto al hermafroditismo secuencial, éste sería un hermafroditismo secundario, resultado de la interacción entre los genes del hospedador y genes heterocromosómicos represores, pudiendo ser originado por un ADN parasítico xenógeno (Juchault 1999).

Desde un punto de vista genético, y en lo que respecta a la determinación sexual en intersexos de C. quadricarinatus, trabajos previos sostienen que los intersexos macho de esta especie (Sagi et al. 1996) son funcionalmente machos y genéticamente hembras (Parnes et al. 2003). Esto contrasta en cierta forma lo reportado en el presente trabajo, donde gran parte (90 % aproximadamente) de los intersexos encontrados fueron funcionalmente hembras. En este contexto sería necesario realizar mayores estudios genéticos para lograr una mejor aproximación al entendimiento de la sexualidad en esta especie.

El estudio de los patrones de sexualidad y diferenciación sexual de otros Parastacidae de América del Sur y australianos probablemente sea la clave para entender el rol de la intersexualidad en esta familia y para determinar si es una característica derivada o ancestral del grupo.

Desde el punto de vista aplicado al cultivo de la especie y considerando la separación de sexos como herramienta para aprovechar el rendimiento de carne, los intersexos hembra son funcionalmente hembras y podrían incluirse en el cultivo monosexo como hembras.


Tabla 5.3: Tipos de intersexualidad con ó sin hermafroditismo en diferentes especies de Parastacidae. (H) hembras, (ISX) intersexos, (ISX H) intersexo hembra, (ISX M) intersexo macho, (ISX Trans) intersexo transicional, (M) machos.


CAPITULO 6

“Relaciones morfométricas en hembras, machos e intersexos hembra de la

langosta de agua dulce, Cherax quadricarinatus (von Martens, 1898) (Decapoda, Parastacidae)”

6.1 INTRODUCCIÓN

Los crustáceos decápodos muestran generalmente un importante dimorfismo sexual tanto a nivel de grado de desarrollo de alguna estructura corporal relacionada con la reproducción, como es el caso de los quelípedos, y/ó diferencias de tamaño entre sexos (Minagawa y Higuchi 1997).

Las diferencias sexuales observadas en el crecimiento de las diferentes partes del cuerpo en relación con el largo del caparazón, han sido utilizadas para examinar las diferencias morfométricas entre sexos, poblaciones ó especies (Hartnoll 1978; Hartnoll 1982; Minagawa y Higuchi 1997).

Uno de los parámetros más importantes en el estudio de la dinámica de las poblaciones de animales sometidos a comercialización es el crecimiento. En los artrópodos y en particular en los crustáceos el crecimiento de las dimensiones externas se observa como un proceso discontinuo debido a que el exoesqueleto “rígido” que recubre al animal no permite que el aumento en largo o peso se manifieste de forma contínua (Petriella y Boschi 1997).

El crecimiento de los crustáceos se advierte entonces como un incremento de talla, y/ó cambio de forma casi “instantáneos” al producirse la muda o ecdisis y el tamaño que alcanza una especie está determinado por la cantidad de estadios de muda y el incremento de tamaño en cada muda (Hartnoll 1982).

Además del crecimiento “absoluto”, es decir lo que crece un animal de una muda a la siguiente, los crustáceos también experimentan variaciones en el crecimiento “relativo” de una parte de su cuerpo respecto a otra, lo que se denomina crecimiento relativo (Hartnoll 1974: Hartnoll 1982). El crecimiento de una parte del cuerpo respecto a otra puede ser de tipo isométrico o alométrico (del griego allos -diferente, otro- y metron –medida).

Desde los primeros trabajos de Teissier (1933 y 1935) el estudio del crecimiento relativo de las partes del cuerpo ó apendices vinculados con la reproducción en referencia a una variable de tamaño corporal ha sido utilizado como indicativo de inicio de madurez sexual que ha sido referida como madurez “morfométrica” (López Greco 1997; López Greco y Rodríguez 1999; Bueno y Shimizu 2009 entre otros) y puede o no coincidir con la madurez gonadal (también denomina “histológica”) referida a la presencia de oocitos maduros y


espermatozoides y funcional asociada al inicio de las cópulas y puestas de huevos (López Greco y Rodríguez 1999; Viau et al. 2006; Bueno y Shimizu 2009).

La diferenciación del tamaño de los quelípedos entre los sexos tiene un significativo rol en la defensa territorial, combates, desplazamiento y cortejo en los crustáceos y es éste carácter el que habitualmente se utiliza en los estudios de madurez morfométrica (Collins 2001; Bueno y Shimizu 2009) referido a alguna variable de tamaño corporal como el largo o ancho del caparazón (Hartnoll 1982; Hartnoll 2001). Tanto en machos como hembras de C quadricarinatus, las quelas ejercen un rol importante en el apreamiento. Tanto en la fase de precopula como en la cópula, estas estructuras son utilizadas para ponerse en contacto con el otro sexo y comenzar con el cortejo (Barki y Karplus, 1999).

La estimación del tamaño al inicio de la madurez sexual (“talla de madurez”), en términos de alguna de las medidas de referencia mencionadas, es uno de los parámetros básicos utilizados para la descripción de la estructura y dinámica de una población (Petriella y Boschi 1997; Bueno y Shimizu 2008; Bueno y Shimizu 2009; Cházaro-Olvera 2009), así como para determinar tallas mínimas de pesca o cosecha en un criadero. También la relación entre las variables de tamaño (largo o ancho del caparazón) y peso (total o de la parte comestible) ha sido evaluada en crustáceos de interés comercial (Smith y Addison 2003; Amaro Pinheiro y Fiscarelli 2009).

En C. quadricarinatus solo se han estudiado las relaciones entre el largo total y largo postorbital en función del peso total del animal o del peso del pleon y tales estudios se realizaron sin discernir entre sexos ni stocks de población naturales o criaderos, en un intervalo acotado de tallas próximas a la talla de interés comercial (Austin, 1995; Sagi et al. 1996). Para esta especie no se han realizado estudios morfométricos relacionados a la estimación de madurez sexual.

6.2 OBJETIVO

El presente capitulo tiene por objetivo establecer la relación entre el crecimiento alométrico y su vinculación con el inicio de madurez sexual en hembras, machos e intersexos hembra de la langosta de agua dulce C. quadricarinatus.

En el marco de este objetivo se plantearon las siguientes hipótesis:

Hipótesis 1: Los intersexos hembra representan un tipo sexual morfométricamente diferenciado de hembras y machos.

Hipótesis 2: Los cambios en las relaciones morfométricas de los caracteres seleccionados muestran una vinculación con el inicio de la funcionalidad reproductiva para los tres sexos.


6.3 MATERIALES Y MÉTODOS

Se seleccionaron 388 machos, 184 hembras y 185 intersexos hembra provenientes del criadero San Mateo S. A. (Entre Ríos, Argentina) en un intervalo de peso de 0,25-158 g, 0,25-110,25 g y 0,25-134,65 g para los tres sexos respectivamente. Los valores mínimos de estos tres intervalos corresponden a los pesos a los cuáles comienzan a diferenciarse los caracteres sexuales secundarios, y por lo tanto los juveniles pueden ser sexados externamente (Capítulo 2).

Luego de la determinación del peso, cada uno de los ejemplares fue medido mediante un calibre digital de 0,01 mm de precisión, determinándose las siguientes variables, según se muestra en la Fig. 6.1 en el caparazón: largo máximo del cefalotórax (LT) y largo post-orbital (LPO), en los quelípedos: largo (LP), alto (ALP), ancho máximo del própodo (ANP).

Para evaluar, en cada sexo, los posibles cambios en el crecimiento relativo de las variables con función reproductiva consideradas en la presente Tesis, los datos fueron analizados mediante el programa MATURE 2 desarrollado por Somerton (1980). Mediante un proceso iterativo, este método asigna sistemáticamente los datos a rectas distintas, hasta seleccionar el par de rectas que muestre el mejor ajuste al conjunto de los datos. Finalmente, y como validación del método, se evalúa la bondad de ajuste de todos los datos a ambas rectas seleccionadas, en comparación con el ajuste a una sola recta (Somerton, 1980). Validado este supuesto, los datos que se ajusten a la recta inferior corresponderían a juveniles, mientras que los datos que se ajusten a la restante serían de adultos, pudiéndose considerarse al punto de intersección de ambas rectas como la talla de primera madurez, medida sobre la variable somática de referencia (LT ó LPO). Finalmente, se graficó el par de rectas que ha cumplido con todos los requisitos mencionados, en escala logarítmica. Esta escala se utiliza para linealizar la ecuación de crecimiento alométrico, a saber:

Y = a. X b

Donde: Y= medida morfométrica con función reproductiva X= medida somática de referencia a y b = constantes, siendo b el denominado coeficiente de alometría (pendiente de la recta, una vez realizada la transformación logarítmica)


Fig 6.1: Foto de C. quadricarinatus, ALP (alto de própodo), ANP (ancho de própodo,) LP (largo de própodo), LPO (largo post-orbital), LT (largo total de cefalotórax).


6.4 RESULTADOS 6.4.1 Comparación entre sexos

Dado la alta correlación detectada entre LT y LPO (coeficiente de correlacion de 0,99 para los tres sexos), se consideraron solo las regresiones para LPO. 6.4.2 Crecimiento alométrico entre sexos

Los datos obtenidos en cada sexo de las variables reproductivas LP, ALP, ANP, fueron analizados con el programa MATURE 2 (Tabla 6.1), en función de las variables de referencia LT y LPO. Los resultados obtenidos de dicho análisis mostraron que, en hembras, la única relación entre ambos grupos de variables que mostró un cambio significativo en el crecimiento relativo (mejor ajuste a dos rectas que a un sóla) fue ANP versus LT, siendo el punto de intersección de ambas rectas ajustadas de 17 mm LT (Tabla 6.1; Fig 6.2).


Sexo

Variables

N

Test de Somerton

Estadístico F LT1

(mm)

LPO2

(mm)

Hembra LP vs LT 137 0,12

ALP vs LT 137 1,66

ANP vs LT 137 3,55* 17

LP vs LPO 137 2,04

ALP vs LPO 137 0,81

ANP vs LPO 137 1,15

Intersexos Hembra LP vs LT 135 2,48

ALP vs LT 135 12,11* 23

ANP vs LT 135 2,94

LP vs LPO 135 1,82

ALP vs LPO 135 12,79* 17,50

ANP vs LPO 135 3,13* 18

Machos LP vs LT 592 35,20* 24,50

ALP vs LT 592 2,89

ANP vs LT 592 2,40

LP vs LPO 592 28,59* 22,50

ALP vs LPO 592 1,92

ANP vs LPO 592 1,95

Tabla 6.1: Relaciones morfométricas entre variables reproductivas y de referencia de talla. Todos los valores F indicados con* corresponden a diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). LT1 y LPO2 corresponden a la intercepción de las rectas de juveniles y adultos, estimadas por el test de Somerton. (A) adulto, (ALP) alto de própodo, (ANP) ancho de própodo, (J) juvenil, (LT) largo máximo del cefalotórax (LP) largo de própodo, (LPO) largo post-orbital.


En individuos intersexo hembra, las relaciones que mostraron cambios

significativos en el crecimiento relativo fueron las siguientes, indicándose entre paréntesis el punto de intersección correspondiente, medido sobre la correspondiente variable de referencia (LT ó LPO): ALP versus LT (23 mm LT); ALP versus LPO (17,50 mm) y ANP versus LPO (18 mm ) (Tabla 6.1; Fig 6.3 a, b y c).

En machos, los cambios significativos (p<0,05) en el crecimiento relativo fueron detectados para las siguientes relaciones de variables (se indica entre paréntesis el punto de intersección correspondiente, medido sobre LT ó LPO): LP versus LT (24,5 mm), y LP versus LPO (22,5 mm LPO) (Tabla 6.1; Fig 6.4 a y b).

Fig 6.2: Crecimiento relativo del ancho del própodo (ANP) versus largo total del cefalotórax (LT) en hembras (H).

LT (mm)2 4 8 16 32 64 128

AN

P (m

m)

0,2

0,4

0,8

1,6

3,2

6,4

12,8

JuvenilesAdultos

yJ= 6,6408x + 5,705

yA= 7,8138x + 8,2305


LT(mm)2 4 8 16 32 64 128

ALP

(mm

)

0,2

0,4

0,8

1,6

3,2

6,4

12,8

25,6

JuvenilesAdultos

(a)

(c)

LPO (mm)2 4 8 16 32 64 128

ALP

(mm

)

0,2

0,4

0,8

1,6

3,2

6,4

12,8

25,6

JuvenilesAdultos

(b)

yJ= 3,4513x + 8,1675

yA= 4,119x + 8,3634

yJ= 2,4542x + 5,9169

yA= 2,9365x + 5,8051


LPO (mm)2 4 8 16 32 64 128

AN

P (m

m)

0,2

0,4

0,8

1,6

3,2

6,4

12,8

25,6

JuvenilesAdultos

(c)

Fig 6.3: (a) Crecimiento relativo del alto del própodo (ALP) en función del largo total del cefalotórax (LT)). (b) Crecimiento relativo del alto del própodo (ALP) en función del largo post-orbital (LPO. (c) Crecimiento relativo del ancho del própodo (ANP) en función del largo post-orbital (LPO) en intersexos hembras (ISX).

(a)

yJ= 4,1839x + 6,097

yA= 5,4394x + 5,8254


(b)

Fig 6.4: (a) Crecimiento relativo del largo del própodo (LP) en función del largo total del cefalotórax (LT). (b) Crecimiento relativo del largo del própodo (LP) en función del largo post-orbital (LPO) en machos (M).

LPO (mm)2 4 8 16 32 64 128

LP

(mm

)

1,6

3,2

6,4

12,8

25,6

51,2

102,4

JuvenilesAdultos

LT (mm)2 4 8 16 32 64 128

LP

(mm

)

1,6

3,2

6,4

12,8

25,6

51,2

102,4JuvenilesAdultos

LPO

LT

(a)

(b)

yJ= 1,5794x + 2,4694

yA= 0,9552x + 16,046

yJ= 1,0369x + 2,4961

yA= 1,2744x + 18,074


6.5 DISCUSIÓN

Los estudios realizados sobre relaciones morfométricas son usualmente utilizados para evaluar, comparar y seleccionar especies de interés comercial en función de su crecimiento y rendimiento en carne (Austin 1995; Sagi et al. 1996).

Los primeros resultados de este estudio morfométrico en C. quadricarinatus muestran que los intersexos hembra representan un tipo sexual morfométricamente diferenciado de hembras y machos, aunque desde el punto de vista gonadal son hembras funcionales (Capítulo 6).

En el caso de los intersexos macho (no evaluados en este ensayo) Sagi et al (1996) observaron que la pendiente de la regresión LP versus LT no difirió de la de machos o hembras. Tales intersexos presentaron “red patch” diferenciado, de características morfométricas similares a los machos, como así también sus características reproductivas funcionales (Sagi et al. 1996; Sagi et al. 2002).

El análisis del crecimiento relativo en cada sexo, es decir, los resultados obtenidos a partir del análisis realizado con el programa MATURE 2, mostraron que en hembras, el punto de intersección que diferencia entre sí a las poblaciones de juveniles y de adultos ocurre a 17 mm LT, considerando a ANP como variable reproductiva. De acuerdo a lo descripto en el Capítulo 3, esta talla coincide con la correspondiente al comienzo de la diferenciación ovárica (estadio I) y por lo tanto este cambio en el tamaño relativo de los quelípedos no estaría relacionado con el inicio de la madurez sexual.

En los intersexos hembra se encontraron varias estimaciones significativas del punto de intersección entre las rectas de regresión de juveniles y adultos: 23 mmLT considerando ALP como variable reproductiva; 17,5 mm LPO, considerando también ALP y 18 mm LPO utilizando ANP. Estas tallas están comprendidas dentro del estadio II de diferenciación sexual (Capítulo 5) y por lo tanto con el inicio de la madurez sexual desde el punto de vista histológico.

En los machos, los cambios significativos que se han detectado entre las diferentes variables analizadas, indican dos estimaciones de talla de madurez morfométrica: 24,5 mm LT y 22,5 mm LPO, en ambos casos en relación al LP. El primero de estos valores corresponde al estadio II de diferenciación sexual en machos que abarca el inicio de la madurez sexual (Capítulo 4). El valor de 22,5 mm de LPO, que expresado en referencia a LT (mediante la regresión ajustada entre ambas variables), sería de 34 mm de LT y también estaría comprendido en el rango de tamaño de inicio de la madurez sexual. En los machos, entonces, se observa que el largo del quelípedo es una variable que se encuentra estrechamente vinculada a cambios relacionados con el inicio de la madurez sexual.

En resumen, en los machos y en los intersexos hembra de C. quadricarinatus los cambios morfométricos de los quelípedos se relacionan con el inicio de la madurez sexual en base al estudio histológico mientras que en las hembras ninguno de los caracteres de los quelípedos evaluados sería indicativo del inicio de la madurez sexual. Aunque los estudios realizados en aspectos morfométricos de la madurez sexual en langostas son escasos, estos primeros resultados en C. quadricarinatus serían similares, en los machos, a los obtenidos


en la langosta de agua dulce Astacus leptodactylus (Selcuk et al. 2010) y en la langosta marina Ibacus peronii (Stewart et al. 1997).

Para lograr una aproximación integral al concepto de madurez sexual en C. quadricarinatus será necesario determinar algunos parámetros indicativos de la capacidad de copular en condiciones competitivas en el caso de los machos y de portación de huevos viables en el caso de las hembras o diferenciación de sedas “plumosas” en los pleópodos (Sagi et al. 1996) y relacionarlos con las características histológicas evaluadas en la presente Tesis. Resultados de observaciones de laboratorio indicarían que las puestas viables (con crías que llegan a independizarse) pueden ocurrir desde los 14-15 g, en similar peso, los machos pueden impregnar a las hembras (al menos en ausencia de machos mayores y de hembras mayores).


CAPITULO 7

7.1 DISCUSION GENERAL

La diferenciación sexual en hembras, machos e intersexos de C. quadricarinatus, fue abordada desde el punto de vista macro y microscópico, incluyendo un posible efecto de la temperatura sobre la diferenciación. Los resultados obtenidos fueron comparados con estudios realizados en otros Parastacidae como así también con Astacidae, Cambaridae, Anomura y Brachyura destacándose varios aspectos de esta Tesis como novedosos y dejando planteadas nuevas preguntas.

Para el estudio de la caracterización de la morfología gonadal y de la madurez sexual, se requirió del análisis previo del sistema reproductor y de la identificación de los caracteres sexuales secundarios. En este trabajo se identificó claramente el momento en el que se produce la diferenciación de los caracteres sexuales secundarios (estadio VI-VII), y dicho estadio pudo ser comparable con la diferenciación sexual de la langosta Pontastacus leptodactylus leptodactylus (Astacidae) (Payen 1973). La identificación temprana del sexo permite la separación manual de los juveniles para el cultivo monosexo, optimizando de este modo el crecimiento en estanques.

El estudio de la morfología gonadal en hembras y la descripción de los denominados “conectores” constituyó un abordaje novedoso para la especie en estudio, dado que dichas estructuras, que unen ambas porciones del ovario, favorecerían la evacuación individual de los oocitos maduros desde los lóbulos anteriores y sustituirían a la red de fibras musculares que rodean a los folículos presentes en la teca ovárica de las langostas marinas Homarus americanus y Jasus frontalis (Talbot 1981; Elorza y Dupré 1999). Es importante destacar que hasta el momento no se han hallado áreas no germinales en los ovarios de ningún Astacidae ni en otras especies de Brachyura ó Anomura de agua dulce.

Esta Tesis describe por primera vez el tipo de intersexo denominado intersexo hembra que además de presentar diferencias en cuanto al patrón de gonoporos y tipo de gónada respecto de los intersexos machos, constituye un tipo morfométricamente distinto a los machos, hembras e intersexos machos previamente descriptos. Este tipo de intersexo hembra se comporta anatómica y “funcionalmente” como hembra pero con rasgos morfométricos diferentes.

El análisis de las observaciones macro y microscópicas de todos los individuos intersexos seleccionados en el presente trabajo ha demostrado que C. quadricarinatus presenta diferentes patrones de intersexualidad, observándose claramente cuatro posibles combinaciones de aberturas genitales ó gonoporos que guardan una relación directa con el sistema reproductor observado.

La plasticidad sexual que presenta C.quadricarinatus pudo ser observada en base a los diferentes tipos de intersexos estudiados; sin embargo no pudo


demostrarse bajo las condiciones y el diseño experimental utilizado, el efecto modulador de la temperatura (y por lo tanto sus posibilidades de manipulación en cultivo) sobre la diferenciación sexual.

Los cambios morfométricos analizados muestran su vinculación con el inicio de la madurez sexual evaluada desde el punto de vista histológico en los machos e intersexos hembra. En el caso de las hembras se requeriría la evaluación morfométrica de algún otro carácter como indicativo de inicio de madurez sexual. Dado que la madurez sexual abarca también factores comportamentales y “sociales” la estimación de la madurez sexual integral requerirá de ensayos de selección de pareja bajo distintas condiciones de competencia.

El presente estudio muestra además el valor teórico y comparativo de la anatomía y la diferenciación del sistema reproductor, que podría vincularse con aspectos filogenéticos de los Astacidea. Las diferencias a nivel familia y la similitud con especies “más lejanas” desde el punto de vista taxonómico, plantean el interrogante sobre el valor de las estructuras copulatorias para el análisis filogénético en Decapoda y la necesidad de abordar estudios sobre los mecanismos de cópula para entender posibles relaciones de convergencia. 7.2 CONCLUSIONES La diferenciación sexual de los caracteres sexuales secundarios en C.

quadricarinatus ocurre tempranamente (estadio de juvenil VI o VII) de modo similar en hembras, machos e intersexos hembra. La diferenciación de los caracteres sexuales primarios ocurre

tempranamente y en tamaños similares en hembras, machos e intersexos hembra, probablemente en uno o dos estadios anteriores a la diferenciación de los caracteres sexuales secundarios. Las hembras presentan, tres morfotipos ováricos en su ontogenia y se

pueden reconocer cuatro estadios en función de la coloración, la estructura histológica y la proporción de los distintos tipos y tamaños celulares. Se describe por primera vez la estructura denomina “conector” como parte

de los ovarios y se propone como función la evacuación de los oocitos de los lóbulos ováricos anteriores. En los machos se identificaron al menos tres estadios de desarrollo con

distinta morfología a nivel testicular, grado de desarrollo de vaso deferente y características de los appendices masculinae. Aunque las características evaluadas en los machos permiten inferir la

talla de inicio de la funcionalidad reproductiva, se requieren ensayos de apareamiento en condiciones competitivas para su confirmación.


Las características anatómicas comparadas del sistema reproductor masculino con otras especies de langostas de agua dulce y marinas muestran una gran diversidad no exclusivamente relacionadas con las diferencias entre los Astacoidea y Parastacoidea. C. quadricarinatus presenta diferentes patrones de intersexualidad,

observándose cuatro posibles combinaciones de aberturas genitales o gonoporos que guardan relación directa con el sistema reproductor. En particular, se describe por primera vez el tipo denominado intersexo hembra. Los cambios en las relaciones de las dimensiones de los quelípedos

estarían mostrando una vinculación directa con el inicio de la madurez sexual desde el punto de vista histológico en C. quadricarinatus para los intersexos hembra y machos, pero no para las hembras.


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