Aislamiento y caracterización de cepas de Bacillus asociadas alcultivo del arroz (Oryza sativa L.)Isolation and characterization of strains of the Bacillus associated to rice (Oryza sativaL.) crop.

BADÍA, Marcia M. Rojas1*, HERNÁNDEZ, Berto Tejera1,MURREL, Jeny A. Larrea 1, MAHILLON,Jacques 2 , PÉREZ Mayra Heydrich1.

1 Dpto. de Microbiología y Virología, Facultad de Biología, Universidad de la Habana, Habana-Cuba.2Laboratory of Food and Environmental Microbiology, Université Catholique de Louvain, Louvain-la-Neuve- Belgium*Autor para la correspondencia: Marcia M. Rojas Badía. e-mail: marcia@fbio.uh.cu

RESUMOEl presente trabajo muestra el aislamiento y la caracterización de bacterias del género Bacillusprovenientes de la rizosfera del cultivo del arroz (Oryza sativa L.) variedad J-104 utilizando el modelomicrocosmos. Se realizaron además aislamientos directos del suelo que se encontraba cultivado con lavariedad INCA LP-5. Se llevó a cabo la caracterización fisiológica de 13 aislados en cuanto a laproducción de compuestos indólicos, la determinación de antagonismo frente a hongos fitopatógenos delarroz (Alternaria solani, Pyricularia grisea, Fusarium sp. y Curvularia sp.), la capacidad de solubilizaciónde fosfatos y la determinación cualitativa de la fijación de nitrógeno. Teniendo en cuenta los resultadosobtenidos se seleccionaron a través de un análisis de conglomerado (cluster), los aislados máspromisorios para su identificación utilizando las pruebas morfológicas, tintoriales y bioquímicaspropuestas por el Manual de Bergey y la secuenciación del ADN ribosómico 16S.

PALAVRAS-CHAVE: Bacillus, arroz, control biológico, promoción del crecimiento vegetal

ABSTRACTThis work shows the isolation and characterization of Bacillus strains from rhizosphere of rice crop (Oryzasativa L.). Two isolation methods were used, microcosm model to isolates bacteria from variety J-104 anddirect isolation from soil cultivated with INCA LP-5 variety. Physiological characterization of 13 isolateswas carried out, considering indole compounds production, phosphate solubilization, qualitative nitrogenfixing ability and antagonistic effect against phytophogenic fungi of rice (Alternaria solani, Pyriculariagrisea, Fusarium sp. and Curvularia sp.). A conglomerated cluster analysis was performed to select thebest isolates to be identified by biochemical test and 16SrDNA sequencing.

KEY WORDS: Bacillus, rice, biological control, plant growth promotion

Revista Brasileira de AgroecologiaRev. Bras. de Agroecologia. 6(1): 90-99 (2011)ISSN: 1980-9735

Correspondências para: marcia@fbio.uh.cuAceito para publicação em 03/03/2011

Introducción:El arroz es uno de los cereales más

importantes en el mundo y particularmente enCuba constituye un alimento básico en la dieta dela población. En muchos países como Tailandia,India, Viet-Nam, China y Perú y en el mundo engeneral se ha incrementado la producción anualde arroz en los últimos años (FAO, 2008). Sinembargo, hace más de una década se estáobservando un descenso en la productividad y enla calidad del suelo de muchas áreas arroceras enlas que se lleva cabo un cultivo intensivo(NEZARAT and GHOLAMI, 2009).

Considerando la importancia para laalimentación del ser humano y que los procesosnaturales constituyen alternativas ecológicas yeconómicas para la sustitución parcial o total defertilizantes químicos, se trabaja en función deutilizar los microorganismos con el objetivo deelevar las producciones de los cultivos agrícolas, ya la vez, contrarrestar el impacto negativo sobre elmedio ambiente.

Las bacterias promotoras del crecimientovegetal (PGPB) representan una gran variedad demicroorganismos endófitos y rizosféricos, loscuales estimulan el crecimiento de sushospederos. Estas bacterias pueden incrementar elcrecimiento de las plantas a través de la fijación denitrógeno, la solubilización de fosfatos, laproducción de fitohormonas, sideróforos, 1-aminociclopropanil-1-carboxilato (ACC)desaminasa, (KHAN et al., 2009).

Por otra parte, las PGPB son potencialesagentes de control biológico, un importante métodoque resurge para el manejo de las enfermedadesde las plantas y a su vez, numerosos hongos sonfitopatógenos de este cultivo, causando grandespérdidas en las cosechas (COMPANT et al.,2005).

El género Bacillus, tiene una amplia distribuciónen diferentes tipos de ambientes como el suelo(ASLIM et al., 2002), los ecosistemas de aguadulce (MANDAL et al., 2005) y los marinos

(Miranda et al., 2008), así como en ecosistemasextremos (KAYODE-ISOLA et al., 2008). Se haaislado a partir de cultivos de importanciaeconómica como el arroz (THAKURIA et al.,2004), demostrándose que cepas de este génerotienen la capacidad de solubilizar fósforo(SOUCHIE et al., 2006), fijar nitrógeno(BENEDUZI et al., 2008), producir auxinas(GUTIERREZ-MAÑERO et al., 1996) y sustanciasantagónicas contra diferentes hongosfitopatógenos (WIPPS et al., 2001). Por otra parte,los miembros de este género presentancaracterísticas como las endosporas que leconfiere resistencia a la desecación y al calor, espor ello que es un candidato ideal para formularproductos estables y su utilización en laBiotecnología Agrícola (LIU et al., 2006). Teniendoen cuenta estos antecedentes y la importancia decontar con cepas que presenten estaspotencialidades para ser utilizadas posteriormenteen la Agrobiotecnología, nos propusimos en estetrabajo aislar y caracterizar representantes delgénero Bacillus con potencialidades para lapromoción del crecimiento y el control biológico depatógenos en el cultivo del arroz.

Materiales y MétodosAislamientos de rizobacterias del género

BacillusEn este estudio se realizaron muestreos en

campos sembrados con arroz pertenecientes a lasparcelas del Instituto de Investigaciones del Arroz(Bauta, Provincia La Habana). Los aislamientos serealizaron a partir de suelos de diferentesvariedades utilizando dos métodos: el modelomicrocosmos (KABIR et al., 1995) para la variedadJ-104 y aislamiento directo de suelo para lavariedad INCA LP-5.

Se tomó 1 g de las raíces o el suelo segúncorresponda y se hicieron diluciones decimalesseriadas hasta 10-6 que se calentaron a 80°C

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durante 30 minutos y se sembraron 0.1 mL pordiseminación en medio Agar Triptona Soya (TSA).

De las placas de TSA con crecimiento setomaron muestras de las colonias concaracterísticas diferentes y se pasaron a placaspor agotamiento para su purificación. Se le realizóuna observación microscópica con tinción de Grampara comprobar la pureza y determinar lascaracterísticas micromorfológicas y tintoriales delos mismos, así como la presencia de esporas. Losaislados puros se conservaron en tubos de agarnutriente y glicerol al 15 %.

Determinación de la producción de compuestosindólicos

Para la determinación cuantitativa de laproducción de compuestos indólicos se utilizó elmedio líquido Caldo Triptona Soya ajustando laconcentración celular al 108 células.mL-1, según laescala McFarland (NCCLS, 1993) y se incubarondurante 24 horas, bajo condiciones de agitación auna temperatura de 30°C. La determinación serealizó mediante el método de Salkowski(GLICKMANN and DESSAUX, 1994). Posterior ala reacción se determinó la absorbancia de lasmuestras a una longitud de onda de 535 nmutilizando un espectrofotómetro (Genesys 20). Esteexperimento se realizó con tres réplicas poraislado y como control negativo se utilizó el mediocorrespondiente sin inocular. Previamente serealizó una curva patrón de AIA sintético.

Determinación de la capacidad de solubilizarfosfatos inorgánicos

Se inocularon placas de medio NBRIP(NAUTIYAL et al., 1999) sólido con 10μL de lospreinóculos y se incubaron a 30oC durante 48horas. Se calculó la capacidad de solubilización defosfatos para cada cepa para lo que se restaron losdiámetros de las zonas de crecimiento y desolubilización de cada cepa (SILVA et al., 2007).

Determinación cualitativa de la capacidad de

fijación de nitrógenoPara la realización de ensayo se preparó medio

semisólido libre de nitrógeno (WILSON, andKNIGHT, 1952) y se inocularon con los aisladosobtenidos con el objetivo de determinar si estostenían la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico.Como control negativo se utilizó medio sininocular. Se observó la capacidad de los aisladospara crecer en medio sin nitrógeno, lo cual seindica como positivo o negativo según la presenciao no de crecimiento.

Determinación del efecto antagónicoSe utilizaron cuatro cepas de hongos

fitopatógenos del cultivo del arroz. Estos hongosfueron Pyricularia grisea, Alternaria solani,Fusarium sp. y Curvularia sp. Se realizaronbioensayos in vitro con el objetivo de determinar elefecto antagónico siguiendo la metodologíapropuesta por BASHAN et al. (1996).

Se realizaron tres réplicas por aislado,incubando a 30°C durante 11 días. La actividadantagónica de los aislados se determinó a travésde la medición del diámetro de crecimiento delhongo patógeno en presencia del antagonistabacteriano. Como control negativo se utilizarontres placas donde se encontraba solamente elhongo. Con las mediciones obtenidas se procedióal cálculo del porcentaje de inhibición, el cual sedeterminó por la siguiente ecuación:

Porcentaje de inhibición = (( D.C.C –D.C.P)/D.C.C) * 100 donde:

D.C.C: diámetro de la colonia control.D.C.P: diámetro de la colonia problema.

Análisis biométricosPara los análisis biométricos se realizaron

pruebas de normalidad y homogeneidad devarianza a todas las variables de los experimentosy después del ANOVA se aplicaron métodosparamétricos o no paramétricos según el caso

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utilizando el programa Statistica para Windowversión 6.0. El agrupamiento de las cepas serealizó mediante un análisis de conglomeradoaplicando la distancia Euclidiana.

Identificación preliminar de los aisladosseleccionados

Se realizaron las pruebas de identificaciónrecomendadas en el Manual de Bergey para laFamilia Bacillaceae (CLAUS and BERKELEY,1986). Posteriormente se seleccionaron cuatroaislados para la secuenciación parcial de gen quecodifica para el ARN ribosómico 16S para lo quese tomaron colonias de 18 horas de crecimiento enmedio LB. La amplificación se llevó a caboutilizando los cebadores universales Univ1:5`ACTCCTACGGGAAGGCAG y Bact4:5`GGCGTGTGTACAAGGCCCGG y en un volumenfinal de 50 μL compuesto por una mezcla dereacción con concentraciones de 200 μM de dNTP,1 μM de cada cebador, 1.5 mM de MgCl2 y 0.02unidades. μL-1 de enzima GoTaq polimerasa. Elprograma de PCR se inició con un ciclo de 5`a 94ºC, seguido de 30 ciclos de 30`` a 94 ºC, 30`` a 55ºC y 1` a 72 ºC y un ciclo de elongación final de 7`a 72 ºC. Los productos de PCR obtenidos sesecuenciaron el Servicio de secuenciación de laUniversidad Católica de Lovaina (Lovaina laNueva, Bélgica).

Resultados y Discusión:A partir de los aislamientos realizados se

obtuvieron siete aislados de la rizosfera de lavariedad J-104 y seis del suelo de la variedadINCA LP-5 que tenían forma bacilar, respondíanpositivamente a la tinción de Gram, presentabanendospora y resistieron el calentamiento a 80°C aque se sometieron las muestras durante el procesode aislamiento.

Renche and Fiuza (2005), al analizar ladiversidad de bacterias en aguas de irrigación delos campos sembrados con arroz en diferentes

etapas del cultivo obtuvieron que el géneroBacillus representaba el 39% de los 315 aislados,lo que denota la predominancia de éste en lapoblación bacteriana total.

Empleando el método de Salkowski secuantificaron las auxinas producidas por losaislados obtenidos (Fig. 1). Se destacan losaislados JRRB8 y JRRB9 con los mejoresresultados, los cuales concuerdan con losobtenidos por Swain et al. (2007).

En la figura 1 se observa un resultadointeresante y es que las mayores concentracionesde AIA son producidas por los aislados rizosféricosasociados a la variedad J-104, lo que podríaindicar que en los exudados radicales de estavariedad se liberan precursores que favorecen lasíntesis de compuestos indólicos yespecíficamente AIA, cuando se establece unainteracción activa entre la bacteria y la planta. Esimportante destacar que estos aislados seobtuvieron a partir de muestras de suelo sembradocon plantas jóvenes, donde se aprovechan losbeneficios de la interacción planta-microorganismo.

En este sentido, Brencic and Winans (2005)señalaron que la capacidad de producir auxinasresponsables de la elongación de las raíces, apartir del triptófano, es común entre losmicroorganismos del suelo, por lo que muchosautores consideran que la síntesis de estecompuesto es dependiente del triptófano presenteen los exudados radicales liberados por lasplantas.

Otra forma a través de la cual las bacteriaspueden contribuir al crecimiento de las plantas esproporcionando nutrientes como los fosfatos deuna manera asequible para la misma. Lacapacidad de solubilizar fosfatos inorgánicos sepuso de manifiesto por la formación de un halotransparente en el medio NBRIP con un diámetroentre 2 y 4 mm para los aislados RRB1, RRB3,RRB6, RRB7, LSB3, LSB4, LSB9, LSB10 yLSB11, a las 48 horas de incubación, o sea cuatro

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de los aislados obtenidos no tienen esta capacidad(Tabla 1). Otros autores habían obtenidoresultados similares para este género asociado ahierbas de forraje (SOUCHIE et al., 2006) ybasado en esta capacidad se han utilizado para laproducción de inoculantes (TRIVERDI et al., 2007).

El aislado LSB11 produce cambio de coloracióndel indicador de pH (bromofenol azul) en el mediode cultivo de azul a amarillo, por lo que se puedeafirmar que la solubilización de fosfatos de esteaislado se lleva a cabo mediante un mecanismoque involucra la producción de ácidos orgánicos, loque se ha descrito para bacterias de la especieBacillus megaterium  y Pseudomonas fluorescens(ALIKHANI et al., 2007).

Por otra parte, los aislados se cultivaron enmedio semisólido libre de nitrógeno obteniendocrecimiento en once aislados (Tabla1), lo que

constituye una prueba cualitativa presuntiva de lacapacidad de fijar dinitrógeno. Este hecho se hadescrito en algunas cepas del género Bacillus(BENEDUZI et al., 2008) y otros asociados. Se haobservado que algunas especies de este génerotales como B. fusiformis aisladas de maíz, trigo yarroz presentan una alta actividad nitrogenasa, loque implica que sean buenos fijadores dedinitrógeno (PARK et al., 2005).

En el presente trabajo se analizó el efectoantagónico de los aislados obtenidos contra cuatrohongos fitopatógenos del cultivo del arroz,obteniendo en la mayoría de los casos inhibicióndel crecimiento de los mismos (Fig. 2). En el casode P. grisea, el mejor efecto antagónico lo ejerce elaislado LSB4 con 91,8% de inhibición delcrecimiento (Fig. 2A); para el hongo A. alternata,los mayores porcentajes de inhibición se verificanen los aislados LSB4 y LSB10 con 87,28 y 85,61%

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Fig. 1: Producción de auxinas por aislados asociados al cultivo del arroz (Oryza sativa L.). Lasbarras de error señalan la desviación estándar de tres repeticiones. Letras no comunes indicandiferencias significativas entre tratamientos.

respectivamente (Fig. 2B); Fusarium sp. es inhibidomayoritariamente por LSB9 (90,42%) y LSB4(90,04%) (Fig. 2C); y en el caso de Curvularia lamejor inhibición la ejercen LSB4, LSB9 y LSB10con un porcentaje de 91,95% cada uno (Fig. 2D).

De manera general, los mejores resultadoscorresponden a los aislados LSB4, LSB9 y LSB10,los cuales inhiben el crecimiento de los cuatrohongos en mayores porcentajes, los cuales seencuentran entre el 85 y el 92%.

El efecto protector de los miembros del géneroBacillus utilizados en el control de enfermedadesfúngicas, puede deberse a la presencia dediferentes mecanismos para antagonizar de formadirecta el crecimiento de patógenos (ZAHIR et al.,2004). Varios autores han informado la actividadantagónica del género Bacillus contra diferenteshongos fitopatógenos del cultivo del arroz (BERG

et al., 2005, WU et al., 2005), lo que se atribuye ala producción de antibióticos (ZHAO et al., 2008),enzimas (IDRISS et al., 2002), entre otros.

Para la selección de los mejores aisladosintegralmente se realizó un análisis deconglomerado (Fig. 3). Considerando el 20% comopunto de corte en la distancia de unión, se puedeobservar que se forman cuatro grupos biendefinidos, uno del aislado JRB8 con el controlnegativo, otros dos que tienen valores intermediosen sus potencialidades y formados por dos ycuatro cepas respectivamente, y un cuarto, en elque se agrupan cuatro aislados con el controlpositivo, formado por los mayores valores de cadaexperimento. Por otra parte, los aislados JRRB9 yLSB11 no se agrupan con ninguno de losmencionados. Teniendo en cuenta estosresultados se seleccionaron los aislados LSB4,

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Tabla 1: Solubilización de fosfatos inorgánicos en medio NBRIP y fijación de nitrógeno por aislados deBacillus obtenidos del cultivo del arroz.

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Fig. 2: Efecto antagónico de aislados asociados al cultivo del arroz (Oryza sativa L.) contra hongosfitopatógenos del mismo. A: Pyriculaia grisea, B: Alternaria alternata, C: Fusarium sp., D: Curvulariasp.. Letras no comunes para un mismo hongo indican diferencias significativas entre el porcentaje deinhibición producido por los aislados.

LSB6, LSB9 y LSB10 para su identificación.A estos aislados se les realizaron las pruebas

morfológicas y fiosiológico-bioquímicascorrespondientes y se identificaron las cepasLSB4, LSB6, LSB9 y LSB10 como pertenecientesal género Bacillus de acuerdo al Manual de Bergey(CLAUS and BERKELEY, 1986). Estas cepas sedepositaron en el Cepario del Laboratorio deEcología Microbiana de la Facultad de Biologíapara la determinación de su efecto en la planta.Teniendo en cuenta la complejidad actual en laclasificación de este género (EUZEBY, 2009) esnecesaria su identificación con técnicasmoleculares.

Los resultados de la secuenciación del ADNr16S y su comparación con secuencias similares enel GenBank para la determinación del nivel deespecie se identificaron LSB4 y LSB10 como

Bacillus subtilis, LSB6 como B. cereus y LSB9como Bacillus sp.

Los miembros de este género tienen un granpotencial para su uso en la agricultura. Muchascepas tienen la capacidad de producir metabolitosantimicrobianos para el control de patógenos, fijandinitrógeno, presentan una alta velocidad decrecimiento, forman endosporas resistentes a ladesecación, el calor y las radiaciones ultravioletasy sobreviven en diversas condiciones (LIU et al.,2006), lo que ofrece perspectivas en la obtenciónde biopreparados eficientes. Si contamos concepas que tengan, a la misma vez, la capacidadde ejercer efecto antagónico contra un ampliogrupo de hongos fitopatógenos y de promover elcrecimiento de la planta a través de diferentesmecanismos, se podría obtener un bioproducto apartir de estas bacterias que sustituya fertilizantes

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Fig. 3: Dendrograma para el agrupamiento de las cepas de acuerdo a la capacidad de producirauxinas, fijar nitrógeno, solubilizar fosfatos e inhibir el crecimiento de hongos patógenos.Dendrograma calculado a partir de los valores obtenidos en los experimentos. El control positivo estáformado por los valores más altos obtenidos en cada uno de los experimentos y el control negativopor los más bajos.

químicos y fungicidas, lo que contribuiría a laobtención de alimentos y la preservación del medioambiente.

En este trabajo se obtuvieron trece cepas apartir del cultivo del arroz con potencialidades parala promoción del crecimiento y el control biológicode hongos fitopatógenos. Se demostró queproducen auxinas estimuladoras del crecimientovegetal, solubilizan fosfatos y fijan nitrógeno, lo quepudiera actuar en la promoción del crecimiento delcultivo del arroz. A la vez ejercen efecto antagónicocontra cuatro hongos, entre ellos Pyricularia grisea,el principal devastador de este cultivo, lo quepermitiría su utilización en el control biológico.

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