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I N F E C T I O N AND I M M U N I T Y , F e b . 1 9 8 1 , p . 5 3 6 - 5 4 6 V o l . 3 1 , N o . 20 0 1 9 - 9 5 6 7 / 8 1 / 0 2 0 5 3 6 - 1 1 $ 0 2 . 0 0 / 0
P u r i f i c a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n sD e l t a - T o x i nJOSEPH E . ALOUF* AND COLETTE JOLIVET-REYNAUD
U n i t e d e s A n t i g e n e s B a c t e r i e n s ( C e n t r e N a t i o n a l d e l a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e , E q u i p e d e R e c h e r c h eA s s o c i e e 7 9 4 ) I n s t i t u t P a s t e u r , 7 5 7 2 4 P a r i s C e d e x 1 5 , F r a n c eD e l t a - t o x i n , a n e x t r a c e l l u l a r h e m o l y s i n r e l e a s e d b y C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n st y p e C , w a s p u r i f i e d f r o m c u l t u r e s u p e r n a t a n t f l u i d b y s e q u e n t i a l ammoniums u l f a t e p r e c i p i t a t i o n , t h i o l - S e p h a r o s e g e l c h r o m a t o g r a p h y , i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ,a n d S e p h a d e x G - 7 5 g e l f i l t r a t i o n . The p u r i f i e d p r e p a r a t i o n h a d a s p e c i f i c a c t i v i t yo f 3 2 0 , 0 0 0 h e m o l y t i c u n i t s p e r mg o f p r o t e i n a n d was h o m o g e n e o u s , a s d e t e r m i n e db y i m m u n o c h e m i c a l a n d e l e c t r o p h o r e t i c t e s t s . T h i s t o x i n was c h a r a c t e r i z e d a s a
s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n c o m p o s e d o f 3 9 1 a m i n o a c i d r e s i d u e s , 3 0 % o f w h i c h w e r eh y d r o p h o b i c . The m o l e c u l a r w e i g h t w a s f o u n d t o b e 4 2 , 0 0 0 , a n d t h e i s o e l e c t r i cp o i n t w a s pH 9 . 1 . D e l t a - t o x i n a p p e a r e d t o b e a m p h i p h i l i c b y c h a r g e s h i f t e l e c t r o -p h o r e s i s i n a t h r e e - d e t e r g e n t s y s t e m . I t was i m m u n o g e n i c i n r a b b i t s a n d l e t h a l t om i c e a t a d o s e o f 0 . 1 2 , I g . The l y t i c a c t i v i t y o f d e l t a - t o x i n was r e s t r i c t e d t oe r y t h r o c y t e s o f e v e n - t o e d u n g u l a t e s ( s h e e p , g o a t s , a n d p i g s ) . T h i s a c t i v i t y wasi n h i b i t e d b y G M 2 g a n g l i o s i d e b u t n o t b y o t h e r g a n g l i o s i d e s , c h o l e s t e r o l , l e c i t h i n ,o r s p h i n g o m y e l i n .C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s d e l t a - t o x i n i s o n e o ft h e t h r e e e x t r a c e l l u l a r h e m o l y t i c t o x i n s r e l e a s e d ,a l o n g w i t h many o t h e r e x o t o x i n s a n d e x o e n -z y m e s , b y a n u m b e r o f t y p e C s t r a i n s a n d a l s o
p o s s i b l y b y t y p e B s t r a i n s ( 7 , 1 4 , 3 0 , 3 2 , 4 0 , 4 3 ) .I n c o n t r a s t t o a l p h a - t o x i n a n d t h e t a - t o x i n ( h e -m o l y s i n s ) , w h i c h h a v e b e e n p u r i f i e d a n d s t u d i e dw i d e l y ( 2 8 , 4 1 ) , d e l t a - t o x i n w a s l i t t l e s t u d i e du n t i l o u r f i r s t a t t e m p t t o p u r i f y a n d c h a r a c t e r i z ei t ( 4 6 ) . P r e v i o u s i n v e s t i g a t o r s e s t a b l i s h e d t h a tt h i s t o x i n w a s i m m u n o g e n i c a n d l y t i c f o r t h ee r y t h r o c y t e s o f e v e n - t o e d u n g u l a t e s ( s h e e p , c a t -t l e , g o a t s , a n d s w i n e ) b u t n o t f o r t h e e r y t h r o c y t e so f o t h e r s p e c i e s s u c h a s h u m a n s , r a b b i t s , a n dh o r s e s ( 7 , 3 0 , 4 9 ) . T h e e f f e c t s o f d e l t a - t o x i n o no t h e r c e l l s a r e n o t k n o w n , a n d t h e p o s s i b l e l e t h a la c t i o n o f t h i s t o x i n h a s n o t b e e n d e m o n s t r a t e dw i t h c e r t a i n t y ( 1 5 ) . O p t i m a l p r o d u c t i o n o f d e l t a -t o x i n w a s s h o w n t o o c c u r w i t h i n a n a r r o w pHr a n g e ( p H 7 . 5 t o 8 . 0 ) ( 3 3 ) .We r e p o r t h e r e a n i m p r o v e d m e t h o d f o r p u -r i f y i n g d e l t a - t o x i n , w h i c h r e s u l t e d i n r e l a t i v e l yg o o d y i e l d s f r o m c u l t u r e s u p e m a t a n t f l u i d s o b -t a i n e d i n p H - c o n t r o l l e d f e r m e n t o r s . The s t u d yo f t h i s t o x i n may b e o f i n t e r e s t f o r a b e t t e re v a l u a t i o n o f t h e p a t h o l o g i c a l r o l e o f c l o s t r i d i a lt o x i n s a n d v i r u l e n c e f a c t o r s ( 4 0 ) . D e l t a - t o x i nmay a l s o p r o v e t o b e u s e f u l a s a m e m b r a n ep r o b e s i m i l a r t o o t h e r c y t o l y t i c t o x i n s ( 1 3 ) , e s -p e c i a l l y b e c a u s e o f i t s r e s t r i c t e d h e m o l y t i c s p e c -t r u m .
MATERIALS AND METHO DSB a c t e r i a l s t r a i n . C . p e r f r i n g e n s t y p e C s t r a i n CW8 w a s k i n d l y p r o v i d e d b y A . H . W . H a u s c h i l d , B u r e a uo f M i c r o b i a l H a z a r d s , O t t a w a , C a n a d a . T h i s s t r a i n
p r o d u c e s l a r g e a m o u n t s o f d e l t a - t o x i n ( 3 3 ) .C u l t u r e m e d i u m . T h e medium u s e d c o n s i s t e d o fa d i f f u s a t e o f 2 5 g o f p r o t e o s e p e p t o n e 3 ( D i f c o L a b o -r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) a n d 6 g o f y e a s t e x t r a c t( D i f c o ) w h i c h w e r e d i s s o l v e d i n 1 5 0 m l o f d i s t i l l e dw a t e r a n d d i a l y z e d f o r 3 d a y s i n t h e c o l d a g a i n s t 1 l i t e ro f w a t e r . Th e d i f f u s a t e ( 1 , 0 0 0 m l ) was s u p p l e m e n t e dw i t h 1 0 g o f s o d i u m b i c a r b o n a t e , 2 g o f c y s t e i n e h y d r o -c h l o r i d e , 9 . 9 g o f N a 2 H P O 4 . 1 2 H 2 0 , 0 . 4 g o f K H 2 P O 4 ,a n d 2 0 g o f d e x t r i n ( D i f c o ) a n d a d j u s t e d t o pH 8 . 0 w i t h3 N NaOH. I t w a s s t e r i l i z e d a t 1 1 5 0 C f o r 1 5 m i n i n a1 . 2 - l i t e r f e r m e n t o r ( B i o l a f i t t e , P o i s s y , F r a n c e ) . T h ef e r m e n t o r w a s a l l o w e d t o c o o l a n d t h e n m a i n t a i n e du n t i l i n o c u l a t i o n u n d e r a s t r e a m o f n i t r o g e n .Growth a n d t o x i n p r o d u c t i o n . Th e l y o p h i l i z e db a c t e r i a l s t r a i n w a s i n o c u l a t e d a n a e r o b i c a l l y i n t o 2 0m l o f T G Y medium ( 2 1 ) a n d t h e n i n c u b a t e d f o r 1 6 ha t 3 7 0 C ( e n d o f l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e ) . T h i s c u l -t u r e w a s t r a n s f e r r e d t o t h e f e r m e n t o r a n d a l l o w e d t og r o w a t 3 7 0 C w i t h a c o n t i n u o u s n i t r o g e n f l o w a n dm o d e r a t e s t i r r i n g . The pH w a s s t r i c t l y m a i n t a i n e dt h r o u g h o u t g r o w t h b e t w e e n pH 8 a n d 8 . 3 b y u s i n g a na u t o m a t i c pH c o n t r o l d e v i c e c o n n e c t e d t o a n a u t o -m a t i c a l l y o p e r a t e d v a l v e w h i c h a d m i t t e d 3 N NaOH.T h i s pH i s c r i t i c a l f o r t h e p r o d u c t i o n o f d e l t a - t o x i n( 3 3 ) . No a n t i f o a m a g e n t w a s a d d e d . A f t e r 6 h o fg r o w t h , t h e c u l t u r e w a s r e m o v e d a n d c e n t r i f u g e d a t1 0 , 0 0 0 x g a n d 4 0 C f o r 2 0 m i n . Th e s u p e r n a t a n t ( c r u d et o x i n ) w a s s e p a r a t e d a n d k e p t f r o z e n u n t i l f r a c t i o n a -
t i o n . T h e t i t e r o f d e l t a - t o x i n r a n g e d f r o m 8 , 0 0 0 t o5 3 6
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C . PERFRINGENS DELTA-TOXIN 5 3 71 2 , 0 0 0 h e m o l y t i c u n i t s ( H U ) p e r m l .E q u i n e a n t i s e r a . D i a g n o s t i c s t a n d a r d s e r a a g a i n s tC . p e r f r i n g e n s t y p e A ( 8 0 0 I U / m l ) a n d t y p e C ( 7 0 0I U / m l ) , w h i c h w e r e o b t a i n e d f r o m I n s t i t u t P a s t e u rP r o d u c t i o n , P a r i s , F r a n c e , w e r e f r o m h o r s e s t h a t h a dr e c e i v e d s e v e r a l c o u r s e s o f i n j e c t i o n o f t y p e A a n d Cc u l t u r e s u p e r n a t a n t f l u i d s .I m m u n i z a t i o n o f r a b b i t s w i t h d e l t a - t o x i n . A n -t i s e r a a g a i n s t p u r i f i e d d e l t a - t o x i n ( s t e p 5 o f t h e p u r i -f i c a t i o n s c h e m e ) w e r e p r e p a r e d i n t h r e e w h i t e B o u s c a tr a b b i t s ( I n s t i t u t P a s t e u r P r o d u c t i o n , G a r c h e s , F r a n c e )w e i g h i n g 2 t o 2 . 3 k g . E a c h r a b b i t r e c e i v e d t h r e e s u b -c u t a n e o u s i n j e c t i o n s a t 3 - w e e k i n t e r v a l s o f 1 mg o ft o x i n e m u l s i f i e d w i t h 2 mg o f F r e u n d c o m p l e t e a d j u -v a n t ( D i f c o ) . T h e r a b b i t s w e r e b l e d a s e p t i c a l l y 7 d a y sa f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n . A f t e r c l o t t i n g , t h e s e r a w e r ec l a r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 , 5 0 0 x g f o r 1 0 m i n , a n dt h e s u p e r n a t a n t w a s s t o r e d i n p o r t i o n s a t - 2 0 C .A s s a y o f d e l t a - t o x i n . The l y t i c e f f e c t o f d e l t a -t o x i n o n s h e e p e r y t h r o c y t e s ( S R B C ) a t pH 8 . 0 ( o p t i -m a l f o r l y s i s ) w a s u s e d f o r a n a s s a y o f t h i s t o x i n . S h e e pb l o o d ( I n s t i t u t P a s t e u r P r o d u c t i o n , G a r c h e s ) w a s c e n -t r i f u g e d , a n d t h e e r y t h r o c y t e s w e r e c o l l e c t e d a f t e rc e n t r i f u g a t i o n a t 1 , 5 0 0 x g f o r 2 0 m i n a n d r e m o v a l o ft h e p l a s m a a n d b u f f y l a y e r b y a s p i r a t i o n . T h e c e l lp e l l e t w a s s u s p e n d e d i n 2 0 t i m e s i t s v o l u m e o f pH 8 . 0i s o t o n i c b o r a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( B B S ) ( N a 2 B 4 0 7 .1 0 H 2 0 , 2 . 5 9 g ; H 3 B O 4 , 4 . 5 g ; N a C l , 9 g ; a n d d i s t i l l e dw a t e r t o m a k e 1 l i t e r ) a n d c e n t r i f u g e d a g a i n a t 1 , 5 0 0x g f o r 2 0 m i n . The w a s h i n g p r o c e s s w a s r e p e a t e dt w i c e . F i n a l l y , t h e SRBC w e r e s u s p e n d e d ( - 5 % , v o l /v o l ) i n BBS s u c h t h a t 0 . 5 m l o f t h e s u s p e n s i o n a f t e rl y s i s p l u s 1 4 . 5 m l o f a 0 . 1 % ( w t / v o l ) N a 2 C O 3 s o l u t i o ng a v e a n a b s o r b a n c e a t 5 4 1 nm o f 0 . 2 0 0 . T h i s s t a n d a r dSRBC s u s p e n s i o n ( - 6 x 1 0 8 c e l l s p e r m l ) w a s k e p t a t4 0 C a n d u s e d w i t h i n 4 d a y s . T e s t s o l u t i o n s o f d e l t a -t o x i n w e r e d i l u t e d i n BBS c o n t a i n i n g 0 . 1 % b o v i n es e r u m a l b u m i n ( S e r v a , H e i d e l b e r g , G e r m a n y ) . V o l -u m e s o f a p p r o p r i a t e l y d i l u t e d t o x i n d e c r e a s i n g i n 0 . 1 -m l a m o u n t s f r o m 1 t o 0 . 1 m l w e r e p l a c e d i n t o t u b e s( 1 2 b y 7 5 mm) a l o n g w i t h 2 5 p l o f C . p e r f r i n g e n s t y p eA a n t i s e r u m i n o r d e r t o i n h i b i t t h e p o s s i b l e h e m o l y t i ce f f e c t s o f a l p h a - t o x i n a n d p e r f r i n g o l y s i n 0 ( t h e t a -t o x i n ) . T h e v o l u m e i n a l l t u b e s w a s b r o u g h t t o 1 m l b ya d d i n g B B S . T h e t u b e s w e r e m a i n t a i n e d f o r 1 0 m i n a troom t e m p e r a t u r e , a n d t h e n 0 . 5 m l o f t h e SRBCs u s p e n s i o n was a d d e d t o e a c h t u b e . T h e t u b e s w e r ei n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 4 5 m i n a n d t h e n c e n t r i f u g e db r i e f l y . The p e r c e n t a g e o f h e m o l y s i s was e s t i m a t e d b yt h e o p t i c a l a b s o r b a n c e o f t h e h e m o g l o b i n i n t h e s u -p e r n a t a n t f l u i d a t 5 4 1 nm c o m p a r e d w i t h t h e a b s o r b -a n c e o f s t a n d a r d s ; 1 HU w a s d e f i n e d a s t h e amount o ft e s t m a t e r i a l n e e d e d t o r e l e a s e t h e h e m o g l o b i n f r o m5 0 % o f t h e c e l l s . V a l u e s w e r e e s t i m a t e d g r a p h i c a l l y b yp l o t t i n g o n a l o g - p r o b i t g r a p h ( 2 ) t h e p e r c e n t a g e o fl y s i s v e r s u s t h e v o l u m e o f t h e s a m p l e o f t o x i n p r e p a -r a t i o n u s e d i n t h e a s s a y .A s s a y s o f p e r f r i n g o l y s i n 0 and a l p h a - t o x i n .D e t e r m i n a t i o n s o f p e r f r i n g o l y s i n 0 ( 4 ) a n d a l p h a - t o x i n( p h o s p h o l i p a s e C ) i n d e l t a - t o x i n p r e p a r a t i o n s werep e r f o r m e d b y h e m o l y t i c t e s t s . The l y t i c a c t i v i t y o fp e r f r i n g o l y s i n 0 was d e t e r m i n e d w i t h a r a b b i t e r y t h -r o c y t e s u s p e n s i o n ( 3 x 1 0 8 c e l l s p e r m l ) i n 0 . 1 5 8 MN a C l ( p H 6 . 8 ) a f t e r a c t i v a t i o n w i t h 4 0 mM c y s t e i n e ,a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y f o r s t r e p t o l y s i n 0 ( 2 ) . I n t e r f e r -
e n c e b y a l p h a - t o x i n w a s p r e v e n t e d b y u s i n g 4% s o d i u mc i t r a t e i n 0 . 1 5 8 M N a C l ( p H 6 . 8 ) f o r d i l u t i o n o f t e s ts o l u t i o n s ; 1 HU o f p e r f r i n g o l y s i n 0 a c t i v i t y w a s d e -f i n e d a s t h e d i l u t i o n o f t o x i n s o l u t i o n t h a t c a u s e d 5 0 %h e m o l y s i s . T o x i n t i t e r s w e r e c a l c u l a t e d a s d e s c r i b e da b o v e f o r d e l t a - t o x i n .The l y t i c a c t i v i t y o f a l p h a - t o x i n w a s d e t e r m i n e dw i t h t h e s a m e r a b b i t e r y t h r o c y t e s u s p e n s i o n ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n 0 . 5 % v o l / v o l ) ; t e s t s a m p l e s w e r e i n c u -b a t e d p r e v i o u s l y w i t h a d i s p e r s i o n o f 5 0 0 , u g o f c h o l e s -t e r o l i n 0 . 1 5 8 M N a C l f o r 2 0 m i n t o i n h i b i t p e r f r i n g o -l y s i n 0 . H e m o l y s i s w a s d e t e r m i n e d o n t w o f o l d d i l u -t i o n s o f t e s t s o l u t i o n i n 0 . 1 5 8 M N a C l b u f f e r e d w i t h0 . 0 2 M t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ( T r i s ) h y -d r o c h l o r i d e ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g 1 mM C a C l 2 a f t e r 1 ho f i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C , f o l l o w e d b y s t a n d i n g f o r 2 h a t4 0 C ( h o t - c o l d h e m o l y s i s ) ; 1 HU w a s d e f i n e d a s t h ea m o u n t o f t o x i n c a u s i n g 5 0 % h e m o l y s i s u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ( 2 9 ) .API-ZYM t e s t s . T h e API-ZYM s y s t e m ( S o c i e t eA n a l y t a b P r o d u c t s , I n c . , M o n t a l i e u , F r a n c e ) , w h i c ha l l o w s d e t e c t i o n o f 1 9 d i f f e r e n t e n z y m a t i c r e a c t i o n s( s e e T a b l e 1 ) , i s a s t a n d a r d c o m m e r c i a l d e v i c e r e a d yf o r u s e ( 2 0 ) . C u p u l e s o f API-ZYM s t r i p s c o n t a i n i n gt h e d i f f e r e n t s u b s t r a t e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h 6 5 p l o ft e s t s o l u t i o n a n d i n c u b a t e d f o r 4 h a t 3 7 0 C . T h er e a c t i o n s w e r e r e a d a f t e r a d d i n g 1 d r o p e a c h o f APIr e a g e n t s A a n d B . T h e i n t e n s i t i e s o f t h e r e a c t i o n sw h i c h d e v e l o p e d w e r e g r ad e d f r o m 0 t o 5 b y u s i n g t h eAPI-ZYM c o l o r r e a c t i o n c h a r t . B y u s i n g t h i s c h a r t t h er e a c t i o n s o b t a i n e d c o u l d b e d i v i d e d i n t o n e g a t i v e( g r a d e 0 ) , w e a k p o s i t i v e ( g r a d e s 1 a n d 2 ) , a n d s t r o n gp o s i t i v e ( g r a d e s 3 t o 5 ) .P r o t e i n d e t e r m i n a t i o n . P r o t e i n c o n t e n t w a sm e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y e t a l . ( 2 7 ) , u s i n gc r u d e a n d p u r i f i e d f r a c t i o n s a f t e r e x t e n s i v e d i a l y s i so v e r n i g h t a g a i n s t q u a r t z - d i s t i l l e d w a t e r . B o v i n e s e r u ma l b u m i n w a s u s e d a s a s t a n d a r d .I E F . P r e p a r a t i v e i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ( I E F ) w as p e r -f o r m e d w i t h a 1 1 0 - m l c o l u m n ( L K B P r o d u k t e r , S t o c k -h o l m , S w e d e n ) , a s d i r e c t e d i n t h e L KB m a n u a l ; weu s e d a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 % c a r r i e r a m p h o l y t e s( L K B A m p h o l i n e s ) w h i c h h a d a pH r a n g e o f 3 . 5 t o 1 1( p H 3 t o 1 0 A m p h o l i n e s , 0 . 5 m l ; pH 4 t o 6 A m p h o l i n e s ,1 m l ; pH 9 t o 1 1 A m p h o l i n e s , 1 m l ) i n a s u c r o s e d e n s i t yg r a d i e n t . T h e l e s s d e n s e s o l u t i o n c o n t a i n e d t h e s a m p l ea n d 0 . 8 m l o f a 4 0 % A m p h o l i n e s m i x t u r e . The mored e n s e s u c r o s e s o l u t i o n c o n t a i n e d 1 . 7 m l o f t h e A m p h o -l i n e s m i x t u r e . The c e n t r a l e l e c t r o d e c o m p a r t m e n t ( a n -o d e ) c o n t a i n e d 1 % s u l f u r i c a c i d i n 6 0 % s u c r o s e . Th ec a t h o d e , w h i c h c o n s i s t e d o f 0 . 2 m l o f e t h y l e n e d i a m i n ei n 1 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r , w a s l a y e r e d o n t h e t o p o ft h e g r a d i e n t . A f i n a l p o t e n t i a l o f 1 , 6 0 0 V w as a p p l i e df o r 1 6 h ; t h e g r a d i e n t w as c o o l e d b y c i r c u l a t i n g w a t e ra t 2 0 C . A t t h e e n d o f t h e r u n , 2 - m l f r a c t i o n s werec o l l e c t e d b y d r a i n i n g d r o p w i s e i nt o a f r a c t i o n c o l l e c t o r .The pH ( a t 4 0 0 ) , o p t i c a l d e n s i t y a t 2 8 0 n m , a n dh e m o l y t i c a c t i v i t y o f e a c h f r a c t i o n were d e t e r m i n e d .The A m p h o l i n e s - s u c r o s e g r a d i e n t w as n o t i t s e l f h e -m o l y t i c .T h i o p r o p y l - S e p h a r o s e 6B c o l u m n . A t o t a l o f 8g o f f r e e z e - d r i e d t h i o p r o p y l - S e p h a r o s e 6B ( P h a r m a c i a ,U p p s a l a , S w e d e n ) was w a s h e d t w i c e w i t h 1 0 0 m l o f0 . 0 5 M T r i s - f o r m i c a c i d b u f f e r ( p H 8 . 0 ) c o n t a i n i n g 1 5 8mM N a C l . The wet p o w d e r w as a l l o w e d t o s w e l l i n
V O L . 3 1 , 1 9 8 1
8/7/2019 Alouf 1981
3/11
538 A L O U F AND JOLIVET-REYNAUDt h i s b u f f e r f o r 2 h . The s l u r r y w as p o u r e d i n t o ac o l u m n ( 2 . 5 b y 3 0 cm; P h a r m a c i a ) , a n d t h i s w as e q u i l -i b r a t e d b y w a s h i n g w i t h 1 0 0 m l o f b u f f e r . E l u t i o n w asp e r f o r m e d w i t h b u f f e r a t a f l o w r a t e o f 5 m l / h .D i s c SDS-PAGE. U s i n g d i s c s o d i u m d o d e c y l s u l -f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) ,we d e t e r m i n e d t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f d e l t a - t o x i n( s e e F i g . 5 ) b y t h e method o f Swank a n d Munkres( 4 5 ) ; t h e g e l c o n t a i n e d 1 2 . 5 % ( w t / v o l ) a c r y l a m i d e ,1 . 2 5 % b i s a c r y l a m i d e , a n d 8 M urea. T e s t s a m p l e s ( 2 5 0t o 5 0 0 , u g o f p r o t e i n pe r m l ) a n d s t a n d a r d p r o t e i n s ( 2m g / m l ) o f known m o l e c u l a r w e i g h t s ( P h a r m a c i a ) w e r ed i s s o l v e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1% S D S , 8 M u r e a ,1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , a n d 0 . 0 1 M H 3 P O 4 , which wasa d j u s t e d t o pH 6 . 8 w i t h T r i s . A l l SDS-PAGE r e a g e n t swere f r o m S e r v a . P r o t e i n s a m p l e s were h e a t e d f o r 9 0s i n b o i l i n g w a t e r a n d l a y e r e d ( 5 0 p l ) on t h e t o p s o fg e l s . B r o m o t h y m o l b l u e was u s e d as t r a c k i n g d y e .E l e c t r o p h o r e s i s was p e r f o r m e d a t pH 6 . 8 t o w a r d t h ea n o d e i n a d i s c g e l a p p a r a t u s ( m o d e l 1 2 7 0 ; I s c o , L i n -c o l n , N e b . ) a t 5 m A / t u b e . G e l s were s t a i n e d w i t h0 . 2 5 % C o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e R - 2 5 0 i n a s o l u t i o nc o n t a i n i n g a c e t i c a c i d , m e t h a n o l , a n d w a t e r ( 8 : 4 5 : 4 7 ;v o l / v o l ) . E x c e s s d y e was r e m o v e d b y u s i n g t h e sames o l v e n t .S l a b SDS-PAGE. T o x i n p r e p a r a t i o n s ( 1 t o 5 mg o fp r o t e i n per m l ) were a n a l y z e d b y s l a b SDS-PAGE asd e s c r i b e d b y L a e m m l i ( 2 5 ) , u s i n g 0 . 0 2 5 M T r i s - 0 . 2 Mg l y c i n e b u f f e r ( p H 8 . 4 ) c o n t a i n i n g 0 . 1 % SDS. T o x i ns a m p l e s ( 2 0 t o 5 0 j i d ) c o n t a i n i n g 1 . 5 % S D S , 1 0 % g l y c -e r o l , 5% 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , a n d 0 . 0 0 1 % b r o m o t h y m o lb l u e ( t r a c k i n g d y e ) i n T r i s - g l y c i n e b u f f e r w e r e b o i l e df o r 9 0 s i n a w a t e r b a t h b e f o r e b e i n g l o a d e d o n t o t h eg e l . E l e c t r o p h o r e s i s was on a 7 . 5 t o 20% g r a d i e n t s l a bp o l y a c r y l a m i d e g e l ( 1 0 b y 1 4 cm; 2 cm t h i c k ) a t 7 mAf o r 2 4 h u n t i l t h e d y e r e a c h e d t h e b o t t o m o f t h e g e l .S a m p l e wells w e r e made f r o m 3% p o l y a c r y l a m i d e con-t a i n i n g 0 . 1 % S D S . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s , t h e g e l s w e r es t a i n e d a n d d e s t a i n e d as d e s c r i b e d a b o v e f o r d i s c SDS-PAGE.Charge s h i f t e l e c t r o p h o r e s i s . The t e c h n i q u e o fH e l e n i u s a n d S i m o n s ( 1 6 ) was u s e d f o r t e s t i n g t h ea m p h i p h i l i c p r o p e r t i e s o f p u r i f i e d t o x i n . E l e c t r o p h o -r e s i s was p e r f o r m e d w i t h an L KB M u l t i p h o r a p p a r a t u sa t room t e m p e r a t u r e i n 1 % agarose ( I n d u b i o s e A 3 7 ;I n d u s t r i e B i o l o g i q u e F r a n c a i s e , G e n n e v i l l i e r s , F r a n c e )a t pH 9 on g l a s s p l a t e s ( 1 1 b y 2 0 . 5 c m ) i n t h e p r e s e nc eo f t h e n o n i o n i c d e t e r g e n t T r i t o n X - 1 0 0 ( E . M e r c k A G ,D a r m s t a d t , G e r m a n y ) , a m i x t u r e o f T r i t o n X - 1 0 0 a n dt h e c a t i o n i c d e t e r g e n t c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o -m i d e ( S e r v a ) , a n d a m i x t u r e o f T r i t o n X - 1 0 0 a n d t h ea n i o n i c d e t e r g e n t s o d i u m d e o x y c h o l a t e ( M e r c k ) .T o x i n m i g r a t i o n a f t e r e l e c t r o p h o r e s i s was d e t e c t e d byi m m u n o d i f f u s i o n a g a i n s t a n t i - d e l t a - t o x i n a n t i s e r u m( s e e F i g . 4 ) . D i p h t h e r i a t o x i n , w h i c h was k i n d l y pro-v i d e d b y P . B o q u e t f r o m t h i s l a b o r a t o r y , was u s e d asa h y d r o p h i l i c c o n t r o l p r o t e i n ( 5 ) .Amino a c i d a n a l y s e s . Amino a c i d a n a l y s e s werep e r f o r m e d b y t h e method o f Spackman e t a l . ( 4 2 ) w i t ha Beckman M u l t i c h r o m B a n a l y z e r , u s i n g t h e mono-c o l u m n p r o c e d u r e o f D e v e n y i ( 1 0 ) . S a m p l e s ( 1 mg) o ft h e p u r i f i e d t o x i n were d i a l y z e d a g a i n s t water an dt h e n h y d r o l y z e d f o r 2 4 , 4 8 , a n d 7 2 h a t 1 1 0 0 C w i t h 6 NHC l i n s e a l e d P y r e x t u b e s a f t e r e v a c u a t i o n an d d e -g a s s i n g . The h y d r o l y s a t e s were d r i e d u n d e r a i r b e f o r e
a n a l y s i s . T h e t r y p t o p h a n c o n t e n t was e s t i m a t e d b yt h e m e t h o d o f L i u a n d C h a n g ( 2 6 ) . T h e s a m p l e s w e r eh y d r o l y z e d i n 4 N m e t h a n e s u l f o n i c a c i d . Th e h a l f -c y s t i n e c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d a s c y s t e i c a c i d b y t h ep e r f o r m i c a c i d o x i d a t i o n m e t h o d d e s c r i b e d b y H i r s( 1 7 ) .H e m o l y t i c a c t i v i t y o f d e l t a - t o x i n i n t h e p r e s -e n c e o f v a r i o u s l i p i d s . C h o l e s t e r o l ( 5 - c h o l e s t e n - 3 / 3 -o l ) , b o v i n e s p h i n g o m y e l i n , e g g l e c i t h i n , a n d m i x e db r a i n g a n g l i o s i d e s w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a ; G M ,g a n g l i o s i d e [ g a l a c t o s y l - N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n y l - ( N -a c e t y l n e u r a m i n y l ) - g a l a c t o s y l g l u c o s y l c e r a m i d e ] , G M 2g a n g l i o s i d e [ N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n y l - ( N - a c e t y l n e u r a -m i n y l ) - g a l a c t o s y l g l u c o s y l c e r a m i d e ] , G D I , g a n g l i o s i d e[ N - a c e t y l n e u r a m i n y l g a l a c t o s y l - N - a c e t y l g a l a c t o s a m i -n y l - ( N - a c e t y l n e u r a m i n y l ) - g a l a c t o s y l g l u c o s y l c e r a m -i d e ] , a n d G T I g a n g l i o s i d e [ N - a c e t y l n e u r a m i n y l g a l a c -t o s y l - N- a c e t y l g a l a c t o s a m i n y l - ( N - a c e t y l n e u r a m i n y l -N- a c e t y l n e u r a m i n y l ) - g a l a c t o s y l g l u c o s y l c e r a m i d e ]w e r e p u r c h a s e d f r o m S u p e l c o , B e l l e f o n t e , P a . A l l l i p i d sw e r e d i s s o l v e d ( 1 m g / m l ) i n c h l o r o f o r m - m e t h a n o l( 2 : 1 ) , e x c e p t c h o l e s t e r o l , w h i c h w a s d i s s o l v e d i n 9 9 %( v o l / v o l ) e t h a n o l .The e f f e c t s o f l i p i d s o n d e l t a - t o x i n a c t i v i t y w e r ed e t e r m i n e d b y p l a c i n g v a r y i n g a m o u n t s o f t e s t l i p i d( 1 t o 1 , 0 0 0 , g ) i n t o s m a l l t e s t t u b e s ( 1 2 b y 7 5 m m ) .T h e s o l v e n t w a s r e m o v e d b y b u b b l i n g n i t r o g e n i n t ot h e t u b e s . Th e l i p i d s w e r e t h e n d i s p e r s e d b y b l e n d i n gw i t h a V o r t e x m i x e r f o r 2 m i n w i t h 7 0 0 I l I o f BBS ( p H8 . 0 ) c o n t a i n i n g 0 . 1 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n. A t o x i ns o l u t i o n i n t h e same b u f f e r ( 3 0 0 , u l , c o n t a i n i n g 1 H U ;e q u i v a l e n t t o 3 n g o f p r o t e i n ) w a s a d d e d , a n d t h em i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 1 0 m i n a t 3 7 C . T h e SRBCs u s p e n s i o n ( 0 . 5 m l ) w a s t h e n a d d e d w i t h s t i r r i n g t o a l lt u b e s , a n d i n c u b a t i o n w a s c o n t i n u e d f o r 4 5 m i n a t3 7 C . C o n t r o l t u b e s c o n t a i n e d BBS i n s t e a d o f l i p i d f o re a c h s e r i e s t e s t e d . H e m o l y s i s w a s m e a s u r e d b y a b -s o r b a n c e a t 5 4 1 nm a f t e r r e m o v a l o f t h e c e l l s b yc e n t r i f u g a t i o n . P e r c e n t i n h i b i t i o n w a s e x p r e s s e d r e l a -t i v e t o t h e h e m o l y s i s o b s e r v e d w i t h t h e c o n t r o l s . T h e5 0 % o i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ( t h e c o n c e n t r a t i o n r e -q u i r e d t o i n h i b i t 5 0 % o f t h e a c t i v i t y o f d e l t a - t o x i n ) w a se s t i m a t e d f r o m a p l o t o f h e m o l y s i s v e r s u s c o n c e n t r a-t i o n o f t e s t c o m p o n e n t .P r o t e o l y t i c a c t i v i t y . P r o t e o l y t i c a c t i v i t y w a s a s -s a y e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e A z o c o l l s u b s t r a t em e t h o d d e s c r i b e d b y J a c k s o n a n d M a t s u e d a ( 2 2 ) . Thep r o t e a s e a s s a y r e a c t i o n m i x t u r e , w h i c h c o n t a i n e d 1 mgo f i n s o l u b l e A z o c o l l ( C a l b i o c h e m , L o s A n g e l e s , C a l i f . )i n 1 m l o f 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) , 1 0 t o 5 0 0I 1 o f t e s t s o l u t i o n , a n d b u f f e r t o a f i n a l v o l u m e o f 2 m l ,w a s i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n a t 3 7 C . The r e a c t i o n w a ss t o p p e d b y i m m e r s i o n i n a n i c e b a t h , a n d t h e m i x t u r ew a s c e n t r i f u g e d a t 0 C . Th e a b s o r b a n c e o f t h e d y er e l e a s e d f r o m t h e i n s o l u b l e c a r r i e r w a s m e a s u r e d i nt h e s u p e r n a t a n t f l u i d a t 5 2 0 nm r e l a t i v e t o a b l a n k t ow h i c h n o t o x i n f r a c t i o n w a s a d d e d . A l i n e a r r a t e o fi n c r e a s e w a s o b t a i n e d u p t o a n a b s o r b a n c e a t 5 2 0 nmo f a p p r o x i m a t e l y 0 . 3 5 ; 1 U o f a c t i v i t y w a s d e f i n e d a st h e a m o u n t o f m a t e r i a l r e q u i r e d t o i n c r e a s e t h e a b -s o r b a n c e a t 5 2 0 nm b y 0 . 0 0 1 a b s o r b a n c e u n i t . T r y p s i n( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) w a s u s e d a s as t a n d a r d .C a r b o h y d r a t e a n a l y s e s . C a r b o h y d r a t e a n a l y s e sw e r e p e r f o r m e d o n 1 0 0 - a n d 2 0 0 - u g s a m p l e s o f p u r i f i e d
I N F E C T . I M M U N .
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C . PERFRINGENS DELTA-TOXIN 539t o x i n b y t h e a n t h r o n e m e t h o d ( 3 7 ) .D e t e r m i n a t i o n o f t h e n e u t r a l i z i n g t i t e r o f i m -mune sera. The n e u t r a l i z a t i o n o f t h e h e m o l y t i c a c t i v -i t y o f d e l t a - t o x i n b y a n t i s e r a was m e a s u r e d by i n c u -b a t i o n ( 3 7 C , 1 0 m i n ) o f a s e r i e s o f t u b e s c o n t a i n i n g2 5 HU o f p u r i f i e d t o x i n i n 0 . 2 m l o f BBS and i n c r e a s i n gv o l u m e s ( 0 . 1 t o 1 m l ) o f an a p p r o p r i a t e d i l u t i o n o f t e s tserum; t o t a l v o l u m e s were a d j u s t e d t o 1 ml w i t h BBS.SRBC ( 0 . 5 m l ) were a d d e d t o e a c h t u b e , t h e c o n t e n t sw e r e b l e n d e d w i t h a V o r t e x m i x e r , a n d t h e m i x t u r ewas m a i n t a i n e d a t 3 7 0 C f o r 4 5 m i n . The percentage o fh e m o l y s i s was d e t e r m i n e d as d e s c r i b e d a b o v e f o r t h et o x i n assay. The n e u t r a l i z i n g t i t e r o f a serum wasd e f i n e d as t h e r e c i p r o c a l o f t h e h i g h e s t serum d i l u t i o nf o r w h i c h 5 0 % l y s i s was o b s e r v e d .
RESULTSC h a r a c t e r i s t i c s o f t h e crude t o x i n . Thes u p e r n a t a n t f l u i d u s e d f o r t o x i n p u r i f i c a t i o n con-t a i n e d 1 0 , 0 0 0 HU o f d e l t a - t o x i n pe r m l , 2 , 7 5 0HU o f p e r f r i n g o l y s i n 0per m l , a n d 9 4 0 HU o fa l p h a - t o x i n pe r m l . T e s t i n g b y t h e API-ZYMs y s t e m ( T a b l e 1 ) r e v e a l e d t h e presence o f t h ef o l l o w i n g e n z y m a t i c a c t i v i t i e s : a l k a l i n e p h o s p h a -t a s e , e s t e r a s e , e s t e r a s e - l i p a s e , a c i d p h o s p h a t a s e ,p h o s p h o a m i d a s e , a - g a l a c t o s i d a s e , f l - g a l a c t o s i d -
a s e , a - g l u c o s i d a s e , f i - g l u c o s i d a s e , a n d a - m a n n o s -i d a s e . No s i g n i f i c a n t p r o t e o l y t i c a c t i v i t y wasf o u n d b y t h e A z o c o l l t e s t . S l a b SDS-PAGE o f ac u l t u r e s u p e r n a t a n t c o n c e n t r a t e d 2 5 - f o l d i n as t i r r e d c e l l e q u i p p e d w i t h a PM-10 membrane( A m i c o n ) r e v e a l e d a b o u t 2 0 e x t r a c e l l u l a r p r o d -
u c t s w h i c h were s t a i n e d b y C o o m a s s i e b r i l l i a n tb l u e ( F i g . 1 ) .P u r i f i c a t i o n o f d e l t a - t o x i n . A l l s t e p s o f t h ep u r i f i e d s c h e m e ( T a b l e 2 ) were c a r r i e d out a t4 0 C u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d .( i ) Ammonium s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n . Thec u l t u r e s u p e r n a t a n t f l u i d ( 1 , 2 0 0 m l ) was a d j u s t e d
t o 6 0 % s a t u r a t i o n w i t h ( N H 4 ) 2 S 0 4 , a d j u s t e d t opH 8 . 0 w i t h a m m o n i a , a n d a l l o w e d t o p r e c i p i t a t eo v e r n i g h t b e f o r e c e n t r i f u g a t i o n a t 1 6 , 0 0 0 xg f o r1 0 m i n . The p r e c i p i t a t e was d i s s o l v e d i n a b o u t7 5 ml o f 0 . 0 5 M T r i s - f o r m i c a c i d b u f f e r ( p H 8 . 0 )containing 1 5 8 mM N a C l . The p r o t e i n s o l u t i o no b t a i n e d was c e n t r i f u g e d a t 1 6 , 0 0 0 x g f o r 1 0m i n t o e l i m i n a t e a s m a l l i n s o l u b l e r e s i d u e . Ther e s u l t i n g s u p e r n a t a n t l i q u i d was d e s i g n a t e d f r a c -t i o n F l .( i i ) T h i o l - S e p h a r o s e g e l c h r o m a t o g r a -p h y . F r a c t i o n F l was r e d u c e d a t room t e m p e r -a t u r e b y a d d i n g 5 0 mM d i t h i o t h r e i t o l a n d t h e na p p l i e d i n t h r e e s u c c e s s i v e f r a c t i o n s t o a B i o g e lP 4 ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C a l i f . )c o l u m n ( 2 . 6 b y 3 8 c m ) e q u i l i b r a t e d w i t h T r i s -f o r m i c a c i d b u f f e r c o n t a i n i n g N a C l . The c o l u m nwas e l u t e d w i t h t h i s b u f f e r . The p r o t e i n e l u a t ei n t h e v o i d v o l u m e was t h e n a p p l i e d t o a t h i o -p r o p y l - S e p h a r o s e 6B c o l u m n a t a f l o w r a t e o f 5m l / h . T h i s c o l u m n was w a s h e d a t t h e same f l o wr a t e w i t h 1 0 0 m l o f b u f f e r . D e l t a - t o x i n a n d o t h e rp r o t e i n s w e r e n o t r e t a i n e d b y t h e c o l u m n ,w h e r e a s some S H - c o n t a i n i n g p r o t e i n s , i n c l u d i n g
T A B L E 1 . T e s t i n g b y t h e API-ZYM s y s t e m f o r 1 9 e n z y m a t i c a c t i v i t i e s i n c r u d e a n d p u r i f i e d t o x i np r e p a r a t i o n sR e a c t i o n g r a d e 'T e s t r e a c t i o n C r u d e t o x i n F r a c t i o n F l b F r a c t i o n F 2 b F r a c t i o n F 3 b F r a c t i o n F 4 '
A l k a l i n e p h o s p h a t a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 3 3 0E s t e r a s e ............................... 1 3 2 2 0E s t e r a s e l i p a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 2 2 0Lipase....... 0 0 0 0 0iae.............................OOOOOL e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e ......0.......... O 0 0V a l i n e a m i n o p e p t i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0C y s t i n e a m i n o p e p t i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0T r y p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . . . . . . . . . . . . . .O0 0 0C h y m o t r y p s i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0A c i d p h o s p h a t a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 3 5 4 0P h o s p h o a m i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 4 1 0a - G a l a c t o s i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 3 0 0f i - G a l a c t o s i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 5 5 0B - G l u c u r o n i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0a - G l u c o s i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 3 1 0 0B - G u c o s a s e .......................... 0 1 0 0 0, 8 - N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e . . . . . . . . . . . . . . 0 1 0 0 0a - M a n n o s i d a s e ......................... 2 5 5 5 0a - F u c o s i d a s e ........................... 0 0 0 0 0
a N u m e r i c a l v a l u e s f r o m 1 t o 5 i n d i c a t e i n c r e a s i n g c o l o r i n t e n s i t y .b S e e T a b l e 2 .c P u r i f i e d d e l t a - t o x i n .
V O L . 3 1 , 1 9 8 1
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5 40 ALOUF AND JO LI V ET- R EY N A U Dp e r f r i n g o l y s i n 0, r e m a i n e d f i x e d t h r o u g h a t h i o l -d i s u l f i d e i n t e r c h a n g e r e a c t i o n , a s r e p o r t e d f o rs t r e p t o l y s i n 0 ( 3 4 ) a n d m a n y S H - c o n t a i n i n g e n -zymes ( 6 ) . The e n t i r e e f f l u e n t ( 2 2 0 m l ) f r o m t h ec o l u m n was c o n c e n t r a t e d t o a b o u t 1 5 ml b yu l t r a f i l t r a t i o n w i t h a PM-10 membrane ( f r a c t i o nF 2 ) .( i i i ) I E F . F r a c t i o n F 2 w as s u b m i t t e d t o p r e -p a r a t i v e IEF i n a pH 3 . 5 t o 1 1 g r a d i e n t . As F i g .2 s h o w s , t h e h e m o l y t i c m a t e r i a l f o c u s e d a r o u n da p I o f 9 . T h i s m a t e r i a l was c o l l e c t e d and c o n -c e n t r a t e d b y u l t r a f i l t r a t i o n ( f r a c t i o n F 3 ) .( i v ) G e l f i l t r a t i o n . F r a c t i o n F3 w a s a p p l i e dt o a S e p h a d e x G - 7 5 c o l u m n ( 2 . 5 b y 1 0 0 c m )e q u i l i b r a t e d w i t h T r i s - f o r m i c a c i d b u f f e r con-t a i n i n g N a C l . The column was e l u t e d w i t h t h i s
a- 6 s78* sK s: ss s
. . . . . . ..w0..... .-.
. . * g s 4 > : ; . g * f "wf i wb c d e
F I G . 1 . S l a b SDS-PAGE o f p u r i f i c a t i o n f r a c t i o n s( T a b l e 2 ) . T h e a n o d e was a t t h e b o t t o m o f t h e g e l s .Lane a , 2 0 - f o l d c o n c e n t r a t e o f c u l t u r e f l u i d ; l a n e b ,f r a c t i o n F l ; l a n e c , f r a c t i o n F 2 ; l a n e d , F r a c t i o n F 3 ;l a n e e , f r a c t i o n F4 ( p u r i f i e d t o x i n ) .
b u f f e r . The t o x i n e m e r g e d as a s y m m e t r i c a l p e a k( F i g . 3 ) , w h i c h was c o l l e c t e d a n d c o n c e n t r a t e db y u l t r a f i l t r a t i o n ( f r a c t i o n F 4 ) . T h i s f r a c t i o nc o n s t i t u t e d t h e p u r i f i e d t o x i n . The o v e r a l l r e c o v -ery o f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e s s w a s 1 6 % .C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p u r i f i e d t o x i n .F r a c t i o n F 4 was h o m o g e n e o u s on t h e b a s i s o fe l e c t r o p h o r e t i c a n d i m m u n o c h e m i c a l t e s t s . As i n g l e b a n d was r e v e a l e d b y s l a b SDS-PAGE( F i g . 1 ) . A s i n g l e i m m u n o d i f f u s i o n b a n d waso b s e r v e d w i t h t h e t w o r a b b i t a n t i s e r a r a i s e da g a i n s t t h i s f r a c t i o n ( F i g . 4 ) , w h i c h a l s o n e u t r a l -i z e d t o x i n a c t i v i t y ( 7 5 a n d 1 6 0 U o f a n t i t o x i n perm l ) . No i m m u n o p r e c i p i t a t i o n was f o u n d w i t h ac o m m e r c i a l a n t i - C . p e r f r i n g e n s t y p e C e q u i n eserum. T h i s s e r u m e x h i b i t e d a h i g h n e u t r a l i z i n gt i t e r ( 1 , 0 0 0 U / m l ) .The a p p a r e n t s p e c i f i c a c t i v i t y o f f r a c t i o n F 4was 3 2 0 , 0 0 0 HU/mg o f p r o t e i n . H o w e v e r , t h ea c t u a l s p e c i f i c a c t i v i t y m u s t b e h i g h e r f o r t h en a t i v e t o x i n , as some d e n a t u r a t i o n o c c u r r e d i ns t e p 4 ( T a b l e 2 ) , w h i c h was r e f l e c t e d b y t h ed e c r e a s e i n t h e r e l a t i v e a c t i v i t y o f t h e prepara-t i o n .The maximum a b s o r b a n c e o f t h e p u r i f i e dt o x i n w a s a t 2 8 0 nm. The E0 m , , 1 cm was 9 . 6 .The t o x i n p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d no h e m o l y t i ca c t i v i t y a t t r i b u t a b l e t o p e r f r i n g o l y s i n 0a n d a l -p h a - t o x i n . None o f t h e e n z y m a t i c a c t i v i t i e s r e -v e a l e d b y t h e API-ZYM t e s t i n t h e c r u d e t o x i na n d i n t e r m e d i a t e f r a c t i o n s ( T a b l e 1 ) was d e -t e c t e d a t a l e v e l o f 2 0 , u g ( 6 4 , 0 0 0 HU) o f p u r i f i e dt o x i n . No p r o t e o l y t i c a c t i v i t y was f o u n d f o r t h esame amount w i t h A z o c o l l r e a g e n t . No c a r b o -h y d r a t e s w e r e d e t e c t e d i n t o x i n s a m p l e s c o n t a i n -i n g 1 0 0 , u g o f p r o t e i n .M o l e c u l a r w e i g h t and i s o e l e c t r i c p o i n t .D i s c SDS-PAGE o f f r a c t i o n F 4 i n t h e p r e s e n c eo f u rea a n d m e r c a p t o e t h a n o l y i e l d e d a s i n g l es h a r p b a n d , i n d i c a t i n g t h a t t h e t o x i n i s a s i n g l ep o l y p e p t i d e o f 4 2 , 0 0 0 d a l t o n s ( F i g . 5 ) . A s i n -f e r r e d f r o m I E F ( F i g . 2 ) , d e l t a - t o x i n a p p e a r e d t ob e a b a s i c p r o t e i n w i t h a p I o f 9 . 1 . The two f o r m s( p I - 8 . 8 a n d 9 . 4 ) r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 4 6 ) weren o t o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t w o r k .A m p h i p h i l i c c h a r a c t e r o f d e l t a - t o x i n .F r a c t i o n F 4 was s u b m i t t e d t o c h a r g e s h i f t e l e c -t r o p h o r e s i s i n t h e t h r e e - d e t e r g e n t system ( 1 6 )d e s c r i b e d a b o v e . F i g u r e 6 s h o w s t h e p a t t e r n s
TABLE 2 . P u r i f i c a t i o n o f C . p e r f r i n g e n s d e l t a - t o x i nStep u r i f i c a t i o n s t a g e F r a c - T o t a l V o l T o t a l T o t a l a c t i v i t y S p . a c t R e l a t i v et e p P u r i f i c a t i o n s t a g e t i o n ( m l ) p r o t e i n ( H U ) (HU/mg) a c t i v i t y % Y i e l d( m g )
1 C u l t u r e s u p e m a t a n t 1 , 2 0 0 7 , 8 0 0 1 2 , 0 0 0 , 0 0 0 1 , 5 3 8 1 1 0 02 Ammonium s u l f a t e ( 6 0 % ) F l 8 3 3 0 5 1 1 , 4 0 0 , 0 0 0 3 7 , 3 7 7 2 4 . 3 9 53 T h i o p r o p y l - S e p h a r o s e F 2 1 5 . 2 6 5 1 0 , 8 6 0 , 0 0 0 1 6 7 , 0 7 7 1 0 9 9 0 . 54 I E F F 3 9 . 5 2 3 2 , 4 0 0 , 0 0 0 1 0 4 , 3 4 7 6 7 . 8 2 05 S e p h a d e x G - 7 5 F 4 2 2 6 1 , 9 2 0 , 0 0 0 3 2 0 , 0 0 0 2 0 8 1 6
.-4ommmm
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0-0-1-mwINMN~
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E
za a0a 0
F R A C T I O N S ( i m n I )F I G . 2 . IEF o f f r a c t i o n F2 ( T a b l e 2 ) . S y m b o l s : 0 , o p t i c a l a b s o r b a n c e ; 0 , pH a t 4 C ; , h e m o l y t i c a c t i v i t y .
Eoz0- 4
0
60F R A C T I O N S ( 3 m l )
F I G . 3 . G e l f i l t r a t i o n o n S e p h a d e x G - 7 5 c o l u m n o f f r a c t i o n F 3 ( T a b l e 2 ) . S y m b o l s : 0 , o p t i c a l a b s o r b a n c e ;U , h e m o l y t i c a c t i v i t y .o b t a i n e d f o r d e l t a - t o x i n a n d t h e h y d r o p h i l i c pro-t e i n d i p h t h e r i a t o x i n ( 5 ) , w h i c h was u s e d as ac o n t r o l . The e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y o f t h e l a t -t e r was n o t a f f e c t e d , w h e r e a s d e l t a - t o x i n wasa m p h i p h i l i c . I t s h i f t e d a n o d a l l y ( 2 4 mm) i n t h eT r i t o n X - 1 0 0 - d e o x y c h o l a t e s y s t e m a n d c a t h o d -a l l y ( 4 mm) i n t h e T r i t o n X - 1 0 0 - c e t y l t r m e t h -ylammonium b r o m i d e s y s t e m c o m p a r e d w i t h i t sm o b i l i t y i n T r i t o n X - 1 0 0 a l o n e .Amino a c i d c o m p o s i t i o n . The amino a c i da n a l y s i s o f d e l t a- t o x i n i s g i v e n i n T a b l e 3 . Thev a l u e s f o r s e r i n e c o n t e n t a n d t h r e o n i n e c o n t e n t
w e r e d e t e r m i n e d b y e x t r a p o l a t i n g t o z e r o h y -d r o l y s i s t i m e . T h e v a l u e s f o r v a l i n e a n d i s o l e u -c i n e a r e f r o m t h e 7 2 - h h y d r o l y s i s . No d e t e c t a b l ec a r b o h y d r a t e s w e r e f o u n d when t h e a n t h r o n em e t h o d w a s u s e d . C a l c u l a t i o n s f r o m t h e a m i n oa c i d c o m p o s i t i o n s h o w e d t h a t t h e t o x i n c o n -t a i n e d a t o t a l o f 3 9 1 a m i n o a c i d r e s i d u e s .The b a s i c a m i n o a c i d r e s i d u e s ( a r g i n i n e , l y -s i n e , h i s t i d i n e ) a n d t h e a c i d i c r e s i d u e s ( a s p a r t i ca c i d , g l u t a m i c a c i d ) a c c o u n t e d f o r 1 1 a n d 2 3 % ,r e s p e c t i v e l y , o f t h e t o t a l r e s i d u e s . H o w e v e r , a st h e p I o f t h e t o x i n i s h i g h ( p H 9 . 1 ) , a s u b s t a n t i a l
V O L . 3 1 , 1 9 8 1 5 4 1
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5 4 2 ALOUF A N D JOLIVET-REYNAUD
F I G . 4 . D o u b l e i m m u n o d i f f u s i o n a n a l y s i s o f p u r i -f i e d d e l t a - t o x i n . W e l l 1 , D i a g n o s t i c s t a n d a r d e q u i n es e r u m a g a i n s t C . p e r f r i n g e n s t y p e A ; w e l l 2 , r a b b i ts e r u m r a i s e d a g a i n s t p u r i f i e d d e l t a - t o x i n ; w e l l 3 ,p u r i f i e d d e l t a - t o x i n ( 4 0 p g / m l ) . Each w e l l c o n t a i n e d2 5 j i l o f r e a g e n t . T h e s e r a w e r e u n d i l u t e d .7 0 , 0 0 0 -Bovine Serum6 0 , 0 0 0 \ A l b u m i n5 0 , 0 0 0
Ovalbumin4 0 , 0 0 0 -D e l t a - T o x i n
S 30,000_CarbonicAnhy d raseB\4 2 0 , 0 0 0 - S o y b e a n T r y p s i nI n h i b i t o rO (x L a c t a l b u m i n
I I I I I Iu0 0.1 0 . 2 0 . 3 OA 0 . 5 0 . 6 0 . 7 0. 8RELATIVE MOBILITY
F I G . 5 . E s t i r n a t i o n o f m o l e c u l a r w e i g h t o f p u r i f i e dd e l t a - t o x i n ( s t e p 5 o f T a b l e 2 ) b y SDS-PAGE. Them o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e m a r k e r p r o t e i n s were 6 8 , 0 0 0 ,4 3 , 0 0 0 , 3 0 , 0 0 0 , 2 0 , 1 0 0 , and 1 4 , 4 0 0 f o r b o v i n e seruma l b u m i n , o v a l b u m i n , c a r b o n i c a n h y d r a s e , s o y b e a nt r y p s i n i n h i b i t o r , and a - l a c t a l b u m i n , r e s p e c t i v e l y .
n u m b e r o f t h e a s p a r t i c a c i d a n d g l u t a m i c a c i dr e s i d u e s m u s t o c c u r a s u n c h a r g e d a s p a r a g i n ea n d g l u t a m i n e . The h y d r o p h o b i c n o n p o l a ra m i n o a c i d r e s i d u e s ( a l a n i n e , l e u c i n e , i s o l e u c i n e ,v a l i n e , p r o l i n e , p h e n y l a l a n i n e , t r y p t o p h a n , m e -t h i o n i n e ) a c c o u n t e d f o r 2 9 % o f t h e t o t a l r e s i d u e s( 3 0 % o n a w e i g h t b a s i s ) .S e n s i t i v i t y o f e r y t h r o c y t e s t o l y s i s . T h ep u r i f i e d d e l t a - t o x i n s o l u t i o n ( 5 0 , 0 0 0 H U / m l ) wast i t r a t e d w i t h s u s p e n s i o n s o f e r y t h r o c y t e s f r o mv a r i o u s s p e c i e s , w h i c h w e r e m a d e u p t o c o n t a i nt h e s a m e c o n c e n t r a t i o n o f h e m o g l o b i n a s t h es t a n d a r d SRBC s u s p e n s i o n . T h e v a r i a t i o n s i nt h e s e n s i t i v i t i e s o f e r y t h r o c y t e s t o t o x i n w e r ev e r y g r e a t ( T a b l e 4 ) , i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u sr e p o r t s ( s e e a b o v e ) . O n l y s h e e p , g o a t , a n d , t o al e s s e r e x t e n t , p i g e r y t h r o c y t e s w e r e l y s e dw h e r e a s human e r y t h r o c y t e s a n d e r y t h r o c y t e sf r o m v a r i o u s o t h e r s p e c i e s w e r e p r a c t i c a l l y i n -
T A B L E 3 . Amino a c i d c o m p o s i t i o n o f d e l t a - t o x i nN o . o f r e s i d u e sAmino a c i d p e r m o l e c u l e o ft o x 3 i n a
A s p a r t i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2T h r e o n i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9S e r i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8G l u t a m i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9P r o l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2G l y c i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2A l a n i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7V a l i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0M e t h i o n i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7I s o l e u c i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0L e u c i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7T y r o s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0P h e n y l a l a n i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1L y s i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5H i s t i d i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8A r g i n i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1H a l f - c y s t i n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2T r y p t o p h a n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
a B a s e d o n a m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 2 , 0 0 0 .R
I
F I G . 6 . C h a r g e s h i f t e l e c t r o p h o r e s i s o f p u r i f i e d d e l t a - t o x i n i n the presence of detergents. Well s b and cc o n t a i n e d 2 an d 5 pg o f d e l t a - t o x i n , r e s p e c t i v e l y , and well acontained 25 , g of purified diphtheria toxin,w h i c h was u s e d a s a h y d r o p h i l i c p r o t e i n c o n t r o l . Th e anode wasat the r i g h t . (A ) Migra ti on in T r it o n X -1 0 0 -s o d i u m d e o x y c h o l a t e . ( B ) M i g r a t i o n i n T r i t o n X - 1 0 0 a l o n e . ( C ) Migration i n Triton X - 1 0 0 - c e t y l t r i m e t h y l a m -monium b r o m i d e . T h e sera u s e d were u n d i l u t e d .
5
I N F E C T . I M M U N .
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C . PERFRINGENS DELTA-TOXIN 543T A B L E 4 . S e n s i t i v i t y o f e r y t h r o c y t e s o f d i f f e r e n ta n i m a l s p e c i e s t o t h e l y t i c a c t i v i t y o f a s o l u t i o n o fp u r i f i e d d e l t a - t o x i n '
Amt ( n g )L y t i c a c - o f t o x i n r e - R e l a t i v eS p e c i e s t i v i t y q u i r e d t o s e n s i t i v i t y( H U / m l ) c a u s e 5 0 % ( % ) bl y s i s
S h e e p ............ 5 0 , 0 0 0 3 1 0 0G o a t ............. 1 2 , 5 0 0 1 2 2 5P i g . . . . . . . . . . . . . 4 , 1 6 0 3 6 8F r o g . . . . . . . . . . . . . 1 , 0 0 0 1 5 0 2C h i c k e n .......... 1 0 0 1 , 5 0 0 0 . 2Human . . . . . . . . . . 2 0 7 , 5 0 0 0 . 0 4R a b b i t . . . . . . . . . . . 1 0 1 5 , 0 0 0 0 . 0 2H o r s e ............ 8 1 8 , 0 0 0 0 . 0 1 5M o u s e . . . . . . . . . . . 8 1 8 , 0 0 0 0 . 0 1 5G u i n e a p i g ....... 5 3 0 , 0 0 0 0 . 0 1R a t . . . . . . . . . . . . . 5 3 0 , 0 0 0 0 . 0 1M o n k e y .......... < 1 > 1 0 < 0 . 0 0 2a T h e d e n s i t y o f e a c h e r y t h r o c y t e s u s p e n s i o n w a sa d j u s t e d s o t h a t i t c o n t a i n e d t h e s a m e h e m o g l o b i nc o n t e n t a s t h e s t a n d a r d SRBC s u s p e n s i o n ( - 6 x l o lc e l l s p e r m l ) . By d e f i n i t i o n , 1 HU w a s t h a t a m o u n t o ft o x i n n e e d e d t o r e l e a s e t h e h e m o g l o b i n f r o m 5 0 % o fSRBC u n d e r t h e c o n d i t i o n s s p e c i f i e d . F r o g ( X e n o p u sl a e v i s ) c e l l s w e r e k i n d l y p r o v i d e d b y P . B o q u e t . H u -man c e l l s w e r e f r o m b l o o d b a n k s , a n d t h e c e l l s o f o t h e rs p e c i e s w e r e s u p p l i e d b y P a s t e u r I n s t i t u t e F a c i l i t i e s ,G a r c h e s , F r a n c e .b C o m p a r e d w i t h SRBC s e n s i t i v i t y .G M 2 G a 1 N A C 1 4 G a l 1 * 4 G k C 1 - c e r a m i d e3
2 N A N AGMI 3GalNAc 1-*4
t p D1 G a l
GD, a 3 GalNAc 1 + 4t pD1 Gal
312
NANAD
G T i 3 GalNAc -*tp1 G a l
312NANA
G a l 1 4 G l c 1 P * ceramide32 NANA
n DG a l 1 * 4 G l c 1 -+ ceramide32NANA
p DG a l 1 * 4 G l c 1 -* ceramide3t2 NANA 812 NANA
F I G . 7 . Code names an d s t r u c t u r e s o f t h e g a n g l i o -s i d e s t e s t e d . Code names a r e f r o m S v e n n e r h o l m ( 4 4 ) .A b b r e v i a t i o n s : NANA, N - a c e t y l n e u r a m i n i c a c i d ;G a l , g a l a c t o s e ; G a l N A c , N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n e ; G l c ,g l u c o s e ; G l c N A c , N - a c e t y l g l u c o s a m i n e ; c e r a m i d e , N-a c y l s p h i n g o s i n e .
s e n s i t i v e . H o w e v e r , l y s i s o f t h e l a t t e r c e l L s w a so b s e r v e d w i t h a m o u n t s o f t o x i n w h i c h w e r e1 , 0 0 0 - t o 1 0 , 0 0 0 - f o l d l a r g e r t h a n t h e a m o u n tr e q u i r e d f o r l y s i s o f SRBC. L y s i s u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s w a s n o t a t t r i b u t a b l e t o t r a c e s o f a l -p h a - t o x i n o r p e r f i i n g o l y s i n , a s t e s t i n g w a s u n -d e r t a k e n a f t e r p r i o r i n c u b a t i o n o f d e l t a - t o x i nw i t h 7 5 0 I U o f C . p e r f i n g e n s t y p e A a n t i t o x i n .L e t h a l e f f e c t s . D e l t a - t o x i n w a s i n j e c t e d i n -t r a v e n o u s l y ( 0 . 1 m l ) i n t o S w i s s m i c e w e i g h i n g 2 0t o 2 5 g a t d o s e s b e t w e e n 4 , 0 0 0 a n d 1 0 HU ( 1 2 t o0 . 0 3 j i g o f p r o t e i n ) . The t o x i n w a s l e t h a l , a n d i nt e r m s o f l y t i c a c t i v i t y , t h e minimum l e t h a l d o s e( a l l f o u r m i c e t e s t e d d i e d ) w a s e q u i v a l e n t t o 4 0HU ( 0 . 1 2 A g o f p r o t e i n ) p e r m o u s e . D e a t h o c -c u r r e d w i t h i n 1 t o 2 m i n . The s y m p t o m s p r o -d u c e d i n c l u d e d r e s p i r a t o r y d i s t r e s s w i t h t h eh e a d i n e x t r e m e e x t e n s i o n . The a n i m a l s r e c e i v -i n g s u b l e t h a l d o s e s w e r e s i c k f o r a b o u t 1 h a n dt h e n r e c o v e r e d . P r i o r i n c u b a t i o n o f t h e t o x i n f o r1 0 m i n w i t h r a b b i t o r e q u i n e a n t i s e r u m p r e -v e n t e d t h e l e t h a l e f f e c t s .D e r m o n e c r o t i c t e s t s . D e r m o n e c r o t i c t e s t sw e r e p e r f o r m e d o n s h a v e d H a r t l e y g u i n e a p i g s( 2 0 0 t o 3 0 0 g ) ; 0 . 1 m l o f d e l t a - t o x i n ( 3 0 0 t o 3 , 0 0 0HU) o r c o n t r o l b u f f e r w a s i n j e c t e d i n t r a d e r m a l l yi n t o t h e d o r s a l s k i n . No a p p a r e n t l e s i o n s w e r eo b s e r v e d u p t o 9 6 h a f t e r i n j e c t i o n .E f f e c t s o f v a r i o u s l i p i d s on h e m o l y t i c a c -t i v i t y . T h e l y t i c e f f e c t o f d e l t a - t o x i n ( 1 HU ,e q u i v a l e n t t o 3 n g i n t h e t e s t s y s t e m ) o n SRBCw a s m e a s u r e d a f t e r i n c u b a t i o n w i t h a v a r i e t y o fl i p i d s u s p e n s i o n s . No i n h i b i t i o n o f l y s i s w a s o b -s e r v e d w i t h c h o l e s t e r o l ( 1 m g ) , e g g l e c i t h i n ( 1m g ) , a n d s p h i n g o m y e l i n ( 2 0 0 j i g ) . I n c o n t r a s t ,i n h i b i t i o n o f t o x i n a c t i v i t y w a s o b s e r v e d w i t hG M 2 , G M 1 , G D 1 , a n d G s r g a n g l i o s i d e s ( F i g . 7 ) a n dm i x e d b r a i n g a n g l i o s i d e s . H o w e v e r , we f o u n dm a r k e d d i f f e r e n c e s i n 5 0 % i n h i b i t o r y c o n c e n t r a -t i o n s b e t w e e n G M 2 ( 6 , u g / m l , e q u i v a l e n t t o 4 . 5, u m o l / l i t e r ) o n t h e o n e h a n d a n d m i x e d b r a i ng a n g l i o s i d e s ( 2 5 0 j i g / m l ) , G D 1 a ( 6 0 , u g / m l ) , G M 1( 7 0 t g . / m l ) , a n d G T 1 ( 1 8 0 , u g / m l ) o n t h e o t h e r .E f f e c t o f m e t a l l i c i o n s a n d o t h e r a g e n t son h e m o l y t i c a c t i v i t y . We u s e d t h e p r o c e d u r ed e s c r i b e d a b o v e f o r t h e s t u d y o f l i p i d e f f e c t s ont h e l y t i c a c t i v i t y o f d e l t a - t o x i n a g a i n s t S R B C .F e 2 + , C u 2 + , M g 2 + , a n d p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t ea t c o n c e n t r a t i o n s a s h i g h a s 1 0 - ' M h a d no e f f e c to n a c t i v i t y . A t t h e same c o n c e n t r a t i o n s i n h i b i -t i o n was p a r t i a l w i t h Z n 2 + a n d t o t a l w i t h C a 2 .e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e , c i t r a t e , a n d t a r -t r a t e i o n s . T o x i n a c t i v i t y w as n o t a f f e c t e d b yc y s t e i n e o r d i t h i o t h r e i t o l a t c o n c e n t r a t i o n s o f u pt o 5 x 1 0 - 2 M.
DISCUSSIONA l t h o u g h C . p e r f r i n g e n s d e l t a - t o x i n w as r e c -o g n i z e d 4 7 y e a r s a g o ( 1 4 ) a s a d i s t i n c t h e m o l y s i n
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5 4 4 ALOUF AND JOLIVET-REYNAUDamong t h e e x t r a c e l l u l a r p r o d u c t s o f t y p e Cs t r a i n s , t h i s t o x i n r e m a i n e d p r a c t i c a l l y u n k n o w nu n t i l o u r p r e v i o u s r e p o r t ( s e e a b o v e ) . T h i s p a p e rp r o v i d e s f o r t h e f i r s t t i m e a d e t a i l e d b i o c h e m i c a la n d b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f d e l t a - t o x i n .The c u l t u r e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d a b o v e a l -l o w e d u s t o o b t a i n l a r g e a m o u n t s o f t o x i n i n t h ee x t r a c e l l u l a r f l u i d ( - 1 0 , 0 0 0 H U / m l , e q u i v a l e n tt o 3 1 mg o f p r o t e i n p e r l i t e r ) . A 2 0 0 - f o l d p u r i f i -c a t i o n w a s a c h i e v e d b y u s i n g a f o u r - s t e p p r o c e s s( T a b l e 2 ) . Some d e n a t u r a t i o n o c c u r r e d d u r i n gt h e I E F s t e p . E x p e r i m e n t s a r e now i n p r o g r e s st o o v e r c o m e t h i s d r a w b a c k .The t o x i n w a s o b t a i n e d w i t h a r e a s o n a b l ey i e l d ( 5 mg f r o m 1 l i t e r o f c r u d e m a t e r i a l ) i n a na p p a r e n t l y h o m o g e n e o u s s t a t e , a s a s s e s s e d b yi m m u n o l o g i c a l a n d e l e c t r o p h o r e t i c t e s t s . Them o l e c u l a r w e i g h t o f 4 2 , 0 0 0 d e t e r m i n e d b y S D S -PAGE w a s s u b s t a n t i a l l y h i g h e r t h a n t h e m o l e c -u l a r w e i g h t ( - 2 5 , 0 0 0 ) e s t i m a t e d f r o m t h e e l u t i o nv o l u m e o f t h e t o x i n o n a S e p h a d e x G - 7 5 c o l u m n( F i g . 3 ) c a l i b r a t e d w i t h s e v e r a l m a r k e r p r o t e i n s .A s t h e t o x i n i s a m p h i p h i l i c a n d h a s a t e n d e n c yt o a d s o r b n o n - s p e c i f i c a l l y o n s u r f a c e s ( 4 6 ) , i t i sl i k e l y t h a t t h e a p p a r e n t l o w m o l e c u l a r w e i g h tf o u n d b y g e l f i l t r a t i o n i s i n c o r r e c t a n d may h a v eb e e n d u e t o r e t a r d e d e l u t i o n o n d e x t r a n g e l s .S i n c e a r t i f a c t s o f t h i s t y p e a r e r a r e i n d i s c S D S -PAGE, i t i s p r o b a b l e t h a t t h e 4 2 , 0 0 0 - d a l t o nv a l u e i s m o r e a c c u r a t e .
D e l t a - t o x i n i s a b a s i c p r o t e i n ( p I - 9 . 1 ) ; t h i s i si n c o n t r a s t t o m o s t b a c t e r i a l c y t o l y s i n s ( 2 ) , a sw e l l a s n o n c y t o l y t i c p r o t e i n t o x i n s , w h i c h a r er a t h e r a c i d i c o r n e u t r a l ( p I - 4 . 8 t o 7 . 6 ) ( A l o u f ,m a n u s c r i p t i n p r e p a r a t i o n ) . The o t h e r b a s i cp r o t e i n t o x i n s w i t h p I v a l u e s o f >9 k n o w nt o d a t e a r e s t a p h y l o c o c c a l l e u c o c i d i n F a n d a l -p h a - , b e t a - , g a m m a - , a n d d e l t a - t o x i n s ( 3 6 , 4 8 ) ,C o r y n e b a c t e r i u m o v i s e x o t o x i n ( 3 1 ) , a n d s t r e p -t o c o c c a l p y r o g e n i c e x o t o x i n B ( 3 ) .C h a r g e s h i f t e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e t o x i n i n t h et h r e e - d e t e r g e n t s y s t e m o f H e l e n i u s a n d S i m o n s( 1 6 ) s h o w e d i m p o r t a n t a n o d a l a n d m o d e r a t ec a t h o d a l s h i f t s ( F i g . 6 ) , i n d i c a t i n g t h a t d e l t a -t o x i n i s a n a m p h i p h i l i c p r o t e i n ; t h i s w a s a l s os h o w n f o r d i p h t h e r i a t o x i n f r a g m e n t B b y t h es a m e t e c h n i q u e ( 5 ) . The a m p h i p h i l i c c h a r a c t e ro f d e l t a - t o x i n c o n f i r m s t h e t e n d e n c y o f t h i s p r o -t e i n t o a d s o r b s t r o n g l y o n p l a s t i c s u r f a c e s ( 4 6 ) .U s i n g h y d r o p h o b i c a l k y l a g a r o s e g e l s ( S e p h a r o s eC - 9 ) ( 3 9 ) , we h a v e o b s e r v e d t h e t o t a l r e t e n t i o no f t h e t o x i n a n d i t s d e s o r p t i o n b y 0 . 5 M N a C l( G . T i x i e r a n d J . E . A l o u f , u n p u b l i s h e d d a t a ) .The a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f d e l t a - t o x i n ( T a -b l e 3 ) s h o w s t h a t h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d r e s i -d u e s a c c o u n t f o r 3 0 % o f t h e t o t a l r e s i d u e s . T h i sf i g u r e i s n o t u n u s u a l l y h i g h , s i n c e many h y d r o -p h i l i c p r o t e i n s h a v e s i m i l a r o r g r e a t e r p r o p o r -
t i o n s o f h y d r o p h o b i c r e s i d u e s ( f o r e x a m p l e ,d i p h t h e r i a t o x i n f r a g m e n t A [ 3 4 % ] [ 9 ] ) . How-e v e r , i t h a s b e e n s t a t e d t h a t a m p h i p h i l i c p r o t e i n s( w h i c h b y d e f i n i t i o n c o n t a i n d e f i n e d p o l a r a n dn o n p o l a r r e g i o n s [ 1 6 ] ) h a v e p o l y p e p t i d e c h a i n sm a d e u p o f l o n g h y d r o p h o b i c s e q u e n c e s o r r e -g i o n s ( 1 9 ) . I n m o s t c a s e s t h e h y d r o p h o b i c r e -g i o n s a r e t h o u g h t t o s e r v e a s m e m b r a n e a n c h o r s( 1 9 ) .We t e s t e d t h e e f f e c t s o f v a r i o u s l i p i d s on t h el y t i c a c t i v i t y o f d e l t a - t o x i n a g a i n s t SRBC s i n c em e m b r a n e l i p i d s a r e k n o w n o r t h o u g h t t o b ei n v o l v e d i n t h e a c t i o n o f a n u m b e r o f b a c t e r i a lc y t o l y t i c t o x i n s ( 1 , 4 , 1 3 ) . C h o l e s t e r o l , l e c i t h i n ,a n d s p h i n g o m y e l i n , w h i c h a r e t h e r e c e p t o r s o rs u b s t r a t e s o f S H - a c t i v a t e d t o x i n s , c l o s t r i d i a l a l -p h a - t o x i n , a n d s t a p h y l o c o c c a l b e t a - t o x i n , r e -s p e c t i v e l y ( 1 ) , d i d n o t i n h i b i t d e l t a - t o x i n a t c o n -c e n t r a t i o n s a s h i g h a s 1 0 0 , u g t o 1 mg o f l i p i d p e rHU ( e q u i v a l e n t t o 3 . 1 n g o r 7 . 2 x 1 0 - 5 n m o l o fp r o t e i n ) . U n d e r t h e same c o n d i t i o n s , G M 2 g a n -g l i o s i d e , b u t n o n e o f t h e o t h e r g a n g l i o s i d e st e s t e d ( F i g . 7 ) , a p p e a r e d t o b e a s i g n i f i c a n t a n dp o s s i b l y s p e c i f i c i n h i b i t o r . T h e i n h i b i t i o n b yl a r g e a m o u n t s o f m i x e d b r a i n a n d g a n g l i o s i d e sa n d b y G M 1 , G 1 8 , a n d G T 1 g a n g l i o s i d e s s u g g e s t se i t h e r a n o n s p e c i f i c e f f e c t , a s d e s c r i b e d b y C o w -e l l a n d B e r n h e i m e r f o r c e r e o l y s i n ( 8 ) , s t r u c t u r a ls i m i l a r i t i e s t o G M 2 g a n g l i o s i d e , o r p o s s i b l e c o n -t a m i n a t i o n b y G M 2 g a n g l i o s i d e . I t s h o u l d b en o t e d t h a t t h e 5 0 % i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n s o ft h e g a n g l i o s i d e s t e s t e d d o n o t r e f l e c t t h e a c t u a lc o n c e n t r a t i o n s o f g a n g l i o s i d e s r e q u i r e d f o r i n h i -b i t i o n . T h e s e v a l u e s m i g h t b e much l o w e r f o rt h e f o l l o w i n g t w o r e a s o n s : ( i ) t h e c r i t i c a l m i c e l l ec o n c e n t r a t i o n s a r e v e r y l o w ( 1 0 8 t o 1 0 ` 0 M)( 1 2 ) a n d g a n g l i o s i d e m o l e c u l e s a r e m i c e l l a r a tt h e 5 0 % i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n s o b s e r v e d , a n d( i i ) s e r u m a l b u m i n , w h i c h w a s p r e s e n t i n t h e t e s ts y s t e m , i s r e p o r t e d t o i n t e r a c t w i t h g a n g l i o s i d e s( 1 2 ) , w h e r e a s g e l a t i n d o e s n o t . H o w e v e r , g e l a t i nc o u l d n o t b e u s e d i n o u r w o r k s i n c e i t s h o w e ds o m e i n a c t i v a t i o n o f t h e t o x i n . F o r t h e s e r e a s o n s ,a n y c a l c u l a t i o n o f t h e a p p a r e n t m o l a r r a t i o o fG M 2 g a n g l i o s i d e t o t o x i n p r o d u c i n g i n h i b i t i o n i sm e a n i n g l e s s . I f G M 2 g a n g l i o s i d e i s a s p e c i f i c i n -h i b i t o r o f d e l t a - t o x i n , w e may i n f e r t h a t t h em o l e c u l a r b a s i s o f t h i s s p e c i f i c i t y i s d u e t o a no l i g o s a c c h a r i d e s e q u e n c e t e r m i n a t i n g i n a f r e eN - a c e t y l g a l a c t o s a m i n y l r e s i d u e ( F i g . 7 ) .V a r i o u s g a n g l i o s i d e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d a st h e r e c e p t o r s o f l i g a n d s o f many h o r m o n e s , i n -t e r f e r o n , a n d w h e a t g e r m a g g l u t i n i n ( 1 2 ) , a s w e l la s o f s e v e r a l b a c t e r i a l p r o t e i n t o x i n s ( e . g . , c h o l -e r a t o x i n a n d E s c h e r i c h i a c o l i t h e r m o l a b i l e e n -t e r o t o x i n [ 3 5 ] , t e t a n u s t o x i n [ 4 7 ] , b o t u l i n u mt o x i n [ 2 4 ] , s t a p h y l o c o c c a l a l p h a - t o x i n [ 2 3 ] ,g r o u p A s t r e p t o c o c c a l p y r o g e n i c t o x i n [ 3 8 ] , a n d
I N F E C T r . I M M U N .
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C . PER F R I N G E N S DELTA-TOXIN 545V i b r i o c h o t e r a e h e m o l y s i n [ 1 8 ] . A G M 2 g a n g l i o -s i d e - l i k e g l y c o c o n j u g a t e h a s b e e n r e p o r t e d a sr e c e p t o r f o r t h e CFA/I a n d K 9 9 h e m a g g l u t i n i no f E . c o l i ( 1 1 ) .A s T a b l e 4 s h o w s , t h e r e a r e l a r g e d i f f e r e n c e si n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e e r y t h r o c y t e s o f d i f f e r e n ta n i m a l s p e c i e s t o t h e l y t i c a c t i o n o f d e l t a - t o x i n .The m o s t s e n s i t i v e s p e c i e s w e r e s h e e p a n d , t o al e s s e r e x t e n t , o t h e r e v e n - t o e d u n g u l a t e s ( g o a t sa n d p i g s ) . E r y t h r o c y t e s f r o m many o t h e r s p e c i e sw e r e p r a c t i c a l l y i n s e n s i t i v e . A l e v e l o f 1 HU o ft o x i n , w h i c h i s c a p a b l e o f l y s i n g 5 0 % o f 3 x 1 0 8SRBC ( 2 8 0 m o l e c u l e s o n t h e a v e r a g e l y s e o n ec e l l ) , l y s e d l e s s t h a n 0 . 1 % o f s i m i l a r p o p u l a t i o n so f h u m a n , r a b b i t , a n d h o r s e e r y t h r o c y t e s . C e l l sw i t h v e r y p o o r s e n s i t i v i t y m i g h t l a c k s p e c i f i cr e c e p t o r s ( p o s s i b l y G M 2 g a n g l i o s i d e ) f o r d e l t a -t o x i n , o r t h e r e c e p t o r s may b e v e r y l o w i n n u m -b e r o r h i d d e n , a s s u g g e s t e d b y t h e c o r r e l a t i o nb e t w e e n b i n d i n g o f r a d i o l a b e l e d t o x i n o n t o c e l l sa n d t h e i r d e g r e e o f s e n s i t i v i t y ( m a n u s c r i p t i np r e p a r a t i o n ) . T h e c e l l s m i g h t a l s o d i f f e r i n t h e i rr e l a t i v e d i s t r i b u t i o n s o f m e m b r a n e l i p i d s a n dp r o t e i n s c o m p a r e d w i t h s e n s i t i v e e r y t h r o c y t e s .Work i s n o w i n p r o g r e s s o n d e l t a - t o x i n i n t e r a c -t i o n s w i t h s e n s i t i v e a n d i n s e n s i t i v e e r y t h r o c y t e s .
A CK NOWLED G MEN TST h i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p p o r t e d b y g r a n t 7 7 . 7 . 1 2 6 4 f r o mt h e D e l e g a t i o n G 6 n e r a l e a l a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e e t T e c h -
n i q u e .We t h a n k P a t r i c e B o q u e t a n d Mary K . J o h n s o n f o r t h e i rv a l u a b l e a d v i c e a n d c o m m e n t s a n d B o r i v o j K e i l a n d N g u y e nT h a n h T o n g f o r a m i n o a c i d a n a l y s e s . Th e t e c h n i c a l a s s i s t a n c eo f D a n i e l l e Ahu w a s a p p r e c i a t e d .LITERATURE CITED
1 . A l o u f , J . E . 1 9 7 7 . C e l l m e m b r a n e s a n d c y t o l y t i c b a c t e r i a lt o x i n s , p . 2 1 9 - 2 7 0 . I n P . C u a t r e c a s a s ( e d . ) , T h e s p e c i f i c -i t y a n d a c t i o n o f a n i m a l , b a c t e r i a l a n d p l a n t t o x i n s .R e c e p t o r s a n d r e c o g n i t i o n , s e r i e s B , v o l . 1 . Chapmana n d H a l l , L o n d o n .2 . A l o u f , J . E . , a n d M . R a y n a u d . 1 9 6 8 . A c t i o n d e l a s t r e p -t o l y s i n e 0 s u r l e s m e m b r a n e s c e l l u l a i r e s . I . F i x a t i o n s u rl a m e m b r a n e e r y t h r o c y t a i r e . A n n . I n s t . P a s t e u r P a r i s1 1 4 : 8 1 2 - 8 2 7 .3 . B a r s u m i a n , E . L . , C . M . C u n n i n g h a m , P . M . S c h l i e v -e r t , a n d D . W. W a t s o n . 1 9 7 8 . H e t e r o g e n e i t y o f g r o u pA s t r e p t o c o c c a l p y r o g e n i c e x o t o x i n t y p e B . I n f e c t . I m -m u n . 2 0 : 5 1 2 - 5 1 8 .4 . B e r n h e i m e r , A . W. 1 9 7 6 . S u l f h y d r y l - a c t i v a t e d t o x i n s , p .8 5 - 9 7 . I n A . W. B e r n h e i m e r ( e d . ) , M e c h a n i s m s i n b a c -t e r i a l t o x i n o l o g y . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .5 . B o q u e t , P . 1 9 7 9 . I n t e r a c t i o n o f d i p h t h e r i a t o x i n f r a g m e n t sA , B a n d p r o t e i n c r m 4 5 w i t h l i p o s o m e s . E u r . J . B i o -c h e m . 1 0 0 : 4 8 3 - 4 8 9 .6 . B r o c k l e h u r s t , K . , J . C a r l s s o n , M. P . J . K i e r s t a n , andE . M . C r o o k . 1 9 7 4 . C o v a l e n t c h r o m a t o g r a p h y b y t h i o l -d i s u l f i d e i n t e r c h a n g e . M e t h o d s E n z y m o l . 3 4 B : 5 3 1 - 5 4 4 .7 . B r o o k s , M . E . , M . S t e r n , an d G . H . W a r r a c k . 1 9 5 7 . Ar e - a s s e s s m e n t o f t h e c r i t e r i a u s e d f o r t y p e d i f f e r e n t i a -t i o n o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s . J . P a t h o l . B a c t e r i o l .7 4 : 1 8 5 - 1 9 5 .8 . C o w e l l , J . L . , an d A . W. B e r n h e i m e r . 1 9 7 8 . R o l e o fc h o l e s t e r o l i n t h e a c t i o n o f c e r e o l y s i n o n m e m b r a n e s .
A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 9 0 : 6 0 3 - 6 1 0 .9 . D e L a n g e , R . J . , R . E . D r a z i n , and R . J . C o l l i e r . 1 9 7 6 .A m i n o a c i d s e q u e n c e o f f r a g m e n t A , a n e n z y m i c a l l ya c t i v e f r a g m e n t f r o m d i p h t h e r i a t o x i n . P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U . S . A . 7 3 : 6 9 - 7 2 .1 0 . D e v e n y i , T . 1 9 6 9 . M o d i f i e d s i n g l e - c o l u m n p r o c e d u r e o ft h e a u t o m a t i c a n a l y s i s o f a m i n o a c i d s . A c t a B i o c h i m .B i o p h y s . A c a d . S c i . H u n g . 4 : 2 9 7 - 2 9 9 .1 1 . F a r i s , A . , M . L U n d a h l , and T . W a d s t r 6 m . 1 9 8 0 . GM2-l i k e g l y c o c o n j u g a t e a s p o s s i b l e e r y t h r o c y t e r e c e p t o r f o rt h e CFA/1 a n d K 9 9 h a e m a g g l u t i n i n s o f e n t e r o t o x i g e n i cE s c h e r i c h i a c o l i . FEMS M i c r o b i o l L e t t . 7 : 2 6 5 - 2 6 9 .1 2 . F o r m i a n o , S . , M . L J o h n s o n , G . L e e , S . M . A l o j , a n dH .d e l h o c I 1 9 7 9 . C r i t i c a l m i c e l l e c o n c e n t r a t i o n s o fg a n g l i o s i d e s . B i o c h e m i s t r y 1 8 : 1 1 1 9 - 1 1 2 4 .1 3 . F r e e r , J . H E , a n d J . P . A r b u t h n o t t . 1 9 7 6 . B i o c h e m i c a la n d m o r p h o l o g i c a l t e r a t i o n s o f m e m b r a n e s b y b a c t e r i a lt o x i n s , p . 1 6 9 - 1 9 3 . I n A . W . B e r n h e i m e r ( e d . ) , M e c h a -n i s m s i n b a c t e r i a l t o x i n o l o g y . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . ,New Y o r k1 4 . G l e n n y , A . T . , M L B a r r , M . L l e w e l l y n - J o n e s , T . D a l l -i n g , a n d H . E . R o s s . 1 9 3 3 . M u l t i p l e t o x i n s p r o d u c e db y s o m e o r g a n i s m s o f t h e C l o s t r i d i u m w e l c h i i g r o u p . J .P a t h o l . B a c t e r i o l . 3 7 : 5 3 - 7 4 .1 5 . H a u s c h i l d , i H . W. 1 9 7 0 . C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s t o x -i n s t y p e s B , C , D a n d E , p . 1 5 9 - 1 8 8 . I n S . K a d i s , T . C .M o n t i e , a n d S . J . A j l ( e d . ) , M i c r o b i a l t o x i n s , v o l . I I A .A c a d e m i c P r e s s , I n c . , New Y o r k .1 6 . H e l e n i u s , A . , a n d K . S i m o n s . 1 9 7 7 . C h a r g e s h i f t e l e c t r o -p h o r e s i s : s i m p l e m e t h o d f o r d i s t i n g u i s i n g b e t w e e n a m -p h i p h i l i c a n d h y d r o p h i l i c p r o t e i n s i n d e t e r g e n t s o l u t i o n .P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 4 : 5 2 9 - 5 3 2 .1 7 . H i r s , C . H . W. 1 9 6 7 . D e t e r m i n a t i o n o f c y s t i n e a s c y s t e i ca c i d . M e t h o d s E n z y m o l . 1 1 : 5 9 - 6 2 .1 8 . H o n d a , T . , an d R . A . F i n k e l s t e i n . 1 9 7 9 . P u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a h e m o l y s i n p r o d u c e d b y V i b r i oc h o l e r a e b i o t y p e E l T o r : a n o t h e r t o x i c s u b s t a n c e p r o -d u c e d b y c h o l e r a v i b r i o s . I n f e c t . I n n u m . 2 6 : 1 0 2 0 - 1 0 2 7 .
1 9 . H u g h e y , R . P . , a n d N . P . C u r t h o y s . 1 9 8 0 . A m p h i p a t i cp r o t e i n s , p . 2 3 5 - 2 5 9 . I n H . B i s s w a n g e r a n d E .S c h m i n c k e - O t t ( e d . ) , M u l t i f u n c t i o n a l p r o t e i n s . J o h nW i l e y & S o n s , I n c . , New Y o r k .2 0 . H u m b l e , M . W . , A . K i n g , and L . P h i l l i p s . 1 9 7 7 . A P I -ZYM: a s i m p l e r a p i d s y s t e m f o r t h e d e t e c t i o n o f b a c -t e r i a l e n z y m e s . J . C l i n . P a t h o l . 3 0 : 2 7 5 - 2 7 7 .2 1 . I n o u e , K . , and H . I d a . 1 9 7 0 . C o n v e r s i o n o f t o x i n o g e n i c i t yi n C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m t y p e C . J p n . J . M i c r o b i o l . 1 4 :8 7 4 9 .2 2 . J a c k s o n , R . L , a n d G . R . M a t s u e d a . 1 9 7 0 . M y x o b a c t e rA L - 1 p r o t e a s e . M e t h o d s E n z y m o l . 1 9 : 8 2 1 - 8 3 4 .2 3 . K a t o , I . , a n d M . N a i k i . 1 9 7 6 . G a n g l i o s i d e a n d r a b b i te r y t h r o c y t e m e m b r a n e r e c e p t o r f o r s t a p h y l o c o c c a l a l -p h a - t o x i n . I n f e c t . I m m u n . 1 3 : 2 8 9 - 2 9 1 .2 4 . K i t a m u r a , M . , M . I w a m o r i , and Y . N a g a i . 1 9 8 0 . I n t e r -a c t i o n b e t w e e n C l o s t r i d i u m b o t u l i n u m n e u r o t o x i n a n dg a n g l i o s i d e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 2 8 : 3 2 8 - 3 3 5 .2 5 . L a e m m l i , U . K . 1 9 7 0 . C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n sd u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f t h e b a c t e r i o p h a g eT 4 . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 : 6 8 0 - 6 8 5 .2 6 . L i u , T . Y . , and Y . H . C h a n g . 1 9 7 1 . H y d r o l y s i s o f p r o t e i n sw i t h p - t o l u e n e s u l f o n i c a c i d . D e t e r m i n a t i o n o f t r y p t o -p h a n . J . B i o l . C h e m . 2 4 6 : 2 8 4 2 - 2 8 4 8 .2 7 . L o w r y , 0 . H . , N . J . R o s e b r o u g h , A . L . F a r r , a n d R . J .R a n d a l l . 1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i np h e n o l r e a g e n t . J . B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .2 8 . M o l l b y , R . 1 9 7 8 . B a c t e r i a l p h o s p h o l i p a s e s , p . 3 6 7 - 4 2 4 . I nJ . J e l j a s z e w i c z a n d T . W a d s t r o m ( e d . ) , B a c t e r i a l t o x i n sa n d m e m b r a n e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , New Y o r k .2 9 . M o l l b y , R . , a n d T . W a d s t r o m . 1 9 7 3 . P u r i f i c a t i o n o fp h o s p h o l i p a s e C ( a l p h a - t o x i n ) f r o m C l o s t r i d i u m p e r -f r i n g e n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 2 1 : 5 6 9 - 5 8 4 .3 0 . O a k l e y , C . L . , an d G . H . W a r r a c k . 1 9 5 3 . R o u t i n e t y p i n go f C l o s t r i d i u m w e l c h i i . J . H y g . 5 1 : 1 0 2 - 1 0 7 .
V O L . 3 1 , 1 9 8 1
8/7/2019 Alouf 1981
11/11
546 A L O U F AND JOLIVET-REYNAUD3 1 . O n o n , E . 0 . 1 9 7 9 . P u r i f i c a t i o n a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a -t i o n o f t h e e x o t o x i n o f C o r y n e b a c t e r i u m o v i s . B i o c h e m .J . 1 7 7 : 1 8 1 - 1 8 6 .3 2 . O r l a n s , E . S . , a n d V . E . J o n e s . 1 9 5 8 . S t u d i e s o n s o m es o l u b l e a n t i g e n s o f C l o s t r i d i u m w e l c h i i t y p e s B , C a n dD . I m m u n o l o g y 1 : 2 6 8 - 2 9 0 .3 3 . P i v n i c k , H . , A . F . S . A . H a b e e b , B . G o r e n s t e i n , P . F .S t u a r t , a n d A . H . W. H a u s c h i l d . 1 9 6 4 . E f f e c t o f pHo n t o x i n o g e n e s i s b y C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s t y p e C .C a n . J . M i c r o b i o l . 1 0 : 3 2 9 - 3 4 4 .3 4 . P r i g e n t , D . , C . G e o f f r o y , a n d J . E . A l o u f . 1 9 7 8 . P u r i -f i c a t i o n d e l a s t r e p t o l y s i n e 0 p a r c h r o m a t o g r a p h i e c o -v a l e n t e s u r g e l d e t h i o l - a g a r o s e . C . R . A c a d . S c i . S e r . D2 8 7 : 9 5 1 - 9 5 4 .3 5 . R i c h a r d s , K . L . , a n d S . D . D o u g l a s . 1 9 7 8 . P a t h o p h y s i -o l o g i c a l e f f e c t s o f V i b r i o c h o l e r a e a n d e n t e r o t o x i g e n i cE s c h e r i c h i a c o l i a n d t h e i r e x o t o x i n s o n e u c a r y o t i c c e l l s .M i c r o b i o l . R e v . 4 2 : 5 9 2 - 6 1 3 .3 6 . R o g o l s k y , M . 1 9 7 9 . N o n e n t e r i c t o x i n s o f S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s . M i c r o b i o l . R e v . 4 3 : 3 2 0 - 3 6 0 .3 7 . S c h i e l d , R . , a n d W. B u r n e t t . 1 9 6 0 . D e t e r m i n a t i o n o f
p r o t e i n - b o u n d c a r b o h y d r a t e i n s e r u m b y a m o d i f i e da n t h r o n e m e t h o d . A n a l . C h e m . 3 2 : 8 8 5 - 8 8 6 .3 8 . S c h l i e v e r t , P . M . , D . J . S c h o e t t l e , a n d D . W. W a t s o n .1 9 8 0 . G a n g l i o s i d e a n d m o n o s a c c h a r i d e i n h i b i t i o n o fn o n s p e c i f i c l y m p h o c y t e m i t o g e n i c i t y b y g r o u p A s t r e p -t o c o c c a l p y r o g e n i c e x o t o x i n s . I n f e c t . I m m u n . 2 7 : 2 7 6 -2 7 9 .3 9 . S h a l t i e l , S . 1 9 7 4 . H y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y . M e t h -o d s E n z y m o l . 3 4 B : 1 2 6 - 1 4 0 .
4 0 . S m i t h , L . D S . 1 9 7 9 . V i r u l e n c e f a c t o r s o f C l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n s . R e v . I n f e c t . D i s . 1 : 2 5 4 - 2 6 0 .4 1 . S m y t h , C . J . , a n d J . L . D u n c a n . 1 9 7 8 . T h i o l - a c t i v a t e d( o x y g e n - l a b i l e ) c y t o l y s i n s , p . 1 2 9 - 1 8 3 . I n J . J e l j a s z e w i c za n d T . W a d s t r o m ( e d . ) , B a c t e r i a l t o x i n s a n d mem-b r a n e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , New Y o r k .4 2 . S p a c k m a n , D . H . , W. H . S t e i n , a n d S . M o o r e . 1 9 5 8 .A u t o m a t i c r e c o r d i n g a p p a r a t u s f o r u s e i n t h e c h r o m a -t o g r a p h y o f a m i n o a c i d s . A n a l . C h e m . 3 0 : 1 1 9 0 - 1 2 0 6 .4 3 . S t e r n e , M . , an d G . H . W a r r a c k . 1 9 6 4 . T h e t y p e s o fC l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s . J . P a t h o l . B a c t e r i o l . 8 8 : 2 7 9 -2 8 3 .4 4 . S v e n n e r h o l m , L 1 9 6 3 . C h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o fhuman b r a i n g a n g l i o s i d e s . J . N e u r o c h e m . 1 0 : 6 1 3 - 6 2 3 .4 5 . S w a n k , R . T . , a n d K . D . M u n k r e s . 1 9 7 1 . M o l e c u l a rw e i g h t a n a l y s i s o f o l i g o p e p t i d e s b y e l e c t r o p h o r e s i s i np o l y a c r y l a m i d e g e l w i t h s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e . A n a l .B i o c h e m . 3 9 : 4 6 2 4 7 7 .4 6 . T i x i e r , G . , a n d J . E . A l o u f . 1 9 7 6 . E s s a i d e p u r i f i c a t i o n e tp r o p r i e t e s d e l a t o x i n e d e l t a d e C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n st y p e C . A n n . M i c r o b i o l . 1 2 7 B : 5 0 9 - 5 2 4 .4 7 . van H e y n i n g e n , W. E . 1 9 7 4 . G a n g l i o s i d e s a s m e m b r a n er e c e p t o r s f o r t e t a n u s t o x i n , c h o l e r a t o x i n a n d s e r o t o n i n .N a t u r e ( L o n d o n ) 2 4 9 : 4 1 5 4 1 7 .4 8 . W a d s t r o m , T . 1 9 7 8 . A d v a n c e s i n t h e p u r i f i c a t i o n o f s o m eb a c t e r i a l p r o t e i n t o x i n s , p . 9 - 5 7 . I n J . J e l j a s z e w i c z a n dT . W a d s t r o m ( e d . ) , B a c t e r i a l t o x i n s a n d c e l l mem-b r a n e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , New Y o r k .4 9 . W i l l i s , A . T . 1 9 7 0 . C l o s t r i d i u m w e l c h i i , p . 4 1 - 1 5 6 . I n A .T . W i l l i s ( e d . ) , C l o s t r i d i a o f w o u n d i n f e c t i o n . B u t t e r -w o r t h s , L o n d o n .
I N F E C T . I M M U N .
