A m plif ie d F rag m ent Leng th

P oly m orphis m 기법을 이용한

L is t e r ia m onocy tog enes 의

유전자형 분석

연세대학교 대학원

임상병리학과

진 현 석

A m plif ie d F rag m ent Leng th

P oly m orphis m 기법을 이용한

L is t e r ia m onocy tog enes 의

유전자형 분석

지도 김 종 배 교수

이 논문을 석사 학위논문으로 제출함

200 1년 12월 일

연세대학교 대학원

임상병리학과

진 현 석

진 현 석의 석사 학위논문을 인준함

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

연세대학교 대학원

200 1년 12월 일

감 사 의 글

대학원 입학이 바로 엊그제 같은데 어느새 석사 졸업이라는 문 앞에 섰습니다.

실로 길게만 느껴지던 지난 2년의 시간이 단 하루만에 지나버린 것 같은 느낌을

지울 수가 없습니다. 항상 학문에 대한 열정으로 졸업하는 순간까지 끊임없는 조

언과 질책으로 이끌어주신 김종배 교수님께 존경의 마음과 함께 감사를 드립니다.

그리고 대학원 과정에서 많은 가르침으로 지도해주신 양용석 교수님, 오옥두 교수

님, 김태우 교수님, 박용석 교수님께 감사드리며 임병혁 선생님에게도 감사의 마음

을 전합니다. 대학원을 먼저 졸업하고 힘든 사회에서 큰 일을 하고 계시는 대학원

선배님들과 바쁘신 와중에도 박사 과정에서 열심히 공부하면서 모범을 보여주고

계신 박사 과정 선생님들에게 감사의 마음을 전하고 싶습니다. 대학원 생활 동안

궂은 일, 좋은 일들을 함께 하면서 너무나도 정이 들었던 대학원 동기들과 지금의

후배들에게도 고마움을 표하고, 실험으로 힘들 때마다 옆에서 위로와 용기를 주셨

던 우리 방 박사 과정 용빈형과 상욱형들과 함께 동고동락하며 저의 커다란 버팀

목이 되어준 우리 방 영삼이형, 진연누나와 종철이에게도 진심으로 감사의 마음을

전하고 싶습니다. 지친 생활 속에서 휴식과 같은 편안함을 선사해 준 저의 92 학

번 동기들과 학부 때부터 항상 잘 챙겨주신 학부 선배님들, 그리고 저를 잘 따라

준 학부 후배들에게 감사의 마음을 전합니다. 10여년만에 만나서 큰 기쁨을 선사

해 준 영림중학교 3학년 5반 친구들에게도 고마움을 전합니다. 또한, 어느덧 10년

지기를 넘겨버린 승진이, 순욱이, 영환이에게도 언제나 변치 않는 우정을 잊지 않

고 있습니다. 항상 저를 걱정하시며 잘 되기를 바라시는 친할머니와 외할머니, 그

리고 작은 아버지와 작은 어머니, 고모부와 고모, 이모들께도 진심으로 감사의 마

음을 전하고, 티없이 맑게 자라는 사촌 동생들에게도 고마움을 전합니다. 무엇보다

도 지금까지 저를 믿어주시고, 못난 자식을 위해서 언제나 고생하신 존경하는 아

버지와 사랑스런 어머니 그리고 인생의 친구이자 든든한 동생 은숙, 범석, 홍주와

언제나 옆에서 힘이되어준 나래에게 깊은 감사의 마음을 전하며 모든 분들께 저

의 작은 결실을 바칩니다. 2001년 12월 진 현 석 드림

목 차

표 및 그림 목차 ⅱ

약 기 호 표 ⅲ

국문 요약 ⅳ

제 1 장 서 론 1

제 2 장 재료 및 방법 4

1. 실험 균주와 배양 조건 4

2. DN A 정제, 제한 효소 처리 및 ad ap tor의 ligation 4

2-1. Gen om ic DN A의 정제 4

2-2. HindⅢ enzym e의 처리 5

2-3. 제한효소와 ligase의 ad ap tor에 대한 반응 5

3. P CR 반응과 전기영동 5

제 3 장 연구 성적 및 결과 7

1. Listeria sp p . 표준균주에 대한 AFLP 실험 7

2. 대표적인 En terobacter iaceae에 대한 AFLP 실험결과 8

3. 소와 돼지 유래 가공육과 포장육 시료를 대상으로 한 AFLP 실험결과 9

4. Listeria sp p . 표준균주와 시료에 대한 1D adv anced p rogram 을 이용한

근연도 분석 10

제 4 장 고 찰 12

제 5 장 결 론 16

참 고 문 헌 17

영 문 요 약 23

- i -

표 및 그림 목차

T able 1. A dapt or s and Prim er s U sed for P CR am plificat ion 6

F ig . 1. AF LP analy sis of r eference str ain s of L is ter ia spp. 7

F ig . 2. AF LP analy sis of st r ain s of select ed Ent erob act er iaceae 8

F ig . 3. AF LP analy sis of L is ter ia m on ocy tog en es isolates 9

F ig . 4. Den drogram of the sim ilar ity in dex am ong referen ce L is teria spp.

st r ain s w ith HI- T prim er 10

F ig . 5. Den drogram of the sim ilar ity in dex am ong referen ce str ain s an d isolat es

of L is ter ia m on ocy tog en es by AF LP an aly sis w ith HI- T prim er 11

- ii -

약 기 호 표

AF LP : am plified fr agm ent length polym orphism

ALF A : aut om at ed laser fluorescent analy sis

AT CC : Am erican T ype Culture Collection

BSA : bovine serum album in

E . coli : E s cher ichia coli

H . py lori : H elicobacter py lori

L . g ray : L is ter ia g ray

L . inn ocua : L is ter ia inn ocua

L . m onocy tog en es : L is ter ia m onocy tog en es

PA GE : sodium dodecyl sulfat e - poly acrylam ide g el electrophoresis

P CR : polym erase ch ain react ion

RAP D : random am plified polym orphic DNA

RF LP : rest r ict ion fr agm ent len gth polym orphism

S . dy s en teriae : S hig ella dy s en ter iae

SE - AF LP : sin gle - en zym e am plified fr agm ent len gth polym orphism

S SR : sim ple sequ ence repeat

ST EM S : sequence- t ag ged m icrosat ellit e sit e

S . typ hi : S alm on oella typ hi

Y . en terocolitica : Y ers in ia en terocolit ica

Y . p s eud otuberculos is : Y ers in ia p s eudotuberculos is

- iii -

국문요약

A m plif ie d F rag m e nt L e n g th P oly m orph i s m

기법을 이용한

L is t e r ia m onocy t og e ne s 의 유전자형 분석

L is ter ia m onocy tog en es는 건강에 위협을 주는 미생물로서, 식생활 양식의 변

화로 가공식품의 종류가 다양해지면서 그 위험성이 증가하고 있다. L .

m on ocy tog en es는 육류, 조개, 채소, 살균되지 않은 우유, 치즈 등에서 발견될 수

있으며, 낮은 온도에서도 살아 있는 세균이기 때문에 이러한 냉장온도에 보관하였

던 음식물을 섭취하기 전에 충분한 열처리 하지 않을 경우 감염의 가능성을 내재

하고 있다. A F LP 분석은 adapt or를 제한 효소 처리한 DNA 단편에 ligation시킨

후, 특정 prim er를 사용하여 P CR 반응을 하는 유전자 분석법이다. 증폭된 DNA

단편은 전기영동을 통한 분리로 균주별로 특이적인 양상을 나타낸다. 이 실험을

통하여 고가의 장비와 시약이 필요 없는 하나의 제한 효소로 L . m onocy tog en es의

유전자 분석에 대한 AF LP 방법을 실행하였다.Sin gle - en zym e am plified fr agm ent

length polym orphism (SE - AF LP ) 분석을 S alm on ella, S hig e lla, Y ers in ia 그리고

E . coli에 적용해 보았는데, 적절한 prim er의 사용으로 재현성과 감별력이 뛰어나

실제 임상분리주에 적용할 수 있는 가능성을 살펴 볼 수 있었다. L .

m on ocy tog en es에 대한 AF LP 실험결과 표준균주들간의 상관관계를 살펴 볼 수

있었고, 소와 돼지유래 가공육과 포장육 시료를 대상으로 한 실험결과 채취장소에

따른 각 시료들간의 유연관계를 나타내었다. SE - AF LP은 일반적인 젤 전기영동에

서 분석할 수 있으며, 이 방법에 의한 유전분석이 복잡한 양상을 나타내지 않기

때문에 쉽게 가시적으로 분석이 가능하였다.

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

핵심되는 말 : L . m onocy tog en es , AF LP , P CR , 유전자 분석

- v -

제 1 장 서 론

병원성 미생물 감염은 치료와 예방방법의 발전에도 불구하고 공중 보건위생분

야에서 중요한 위치를 차지하고 있다. 캔 상품 제조 과정에서의 보툴리눔증 (28),

냉장 처리하지 않은 아이스크림이나 햄, 고기 등으로 인한 포도상구균성 식중독 (3,

12), 오염된 고기에서의 살모넬라증 등이 발견되었고 (27, 31, 34), 방균 노력을 기

울였음에도 불구하고 새로운 식중독 원인균에 의한 또 다른 문제점이 야기되고

있다.

음식물 매개성 질병의 원인균으로는 S tap hy lococcus aureus (1, 3, 12),

E s cher ichia coli O157:H7 (8,23), Salm onella spp .(27, 31), S hig ella spp.(14), V ibrio

p arahaem oly t icus (15), Y ers in ia en terocolitica (29) 등이 비교적 잘 알려져 있고, 최

근에는 식생활 변화에 따른 냉동식품 등에서의 L . m on ocy tog enes (2)에 의한 질병

이 사회적인 관심의 대상이 되고 있다.

L . m on ocy tog en es는 모양이 고른 간균으로 크기는 0.4∼0.5 ㎛×0.5∼2.0 ㎛이

다. 낱개로, 연쇄로, V자 형으로 혹은 평행으로 배열된다. 오래된 배양에서는 사상

형을 볼 수 있다. 그람양성이고, 협막이나 아포가 없다. 20℃나 25℃ 에서 배양하

면 운동성이 있고, 편모는 1∼4개이다. 반고체 배지에서는 우산 모양의 증식이 특

징이다 (2).

L . m onocy tog en es는 어류, 조류 및 사람을 포함한 포유동물에 감염을 일으키

며, 이러한 list er ia 증은 식품매개 감염으로 생각된다. 이 감염은 산발적으로, 또는

집단적으로 발생한다. 장기이식, 림프종, AIDS 환자 등 세포매개성 면역부전인 사

람이 감염되기 쉽지만 기존질환이 없는 사람도 드물게 감염될 수 있다. 패혈증, 뇌

염 및 수막염도 유발 할 수 있다 (2).

A F LP ( am plified fr agm ent len gth polym orphism ) 법은 최근들어 새롭게 대두

되기 시작한 DNA fin gerprint in g 기법으로서 RF LP ( rest r ict ion fragm ent len gth

polym orphism )와 RAPD ( random am plified polym orphic DNA )의 유용한 특성들

만 간추려 설계된 새로운 분석 방법으로서 1995년 Vos 등(33)에 의해 개발되었다.

- 1 -

AF LP는 염기서열에 대한 사전정보 없이도 한번의 P CR 증폭으로도 50∼100개의

매우 많은 DNA 단편을 생성하므로 높은 민감도의 DNA 지문분석을 분석할 수

있는 유용한 수단으로 평가되고 있다(21). AF LP 분석법은 고도의 재현성 및 확실

성을 갖춘 강력한 분석기술로서, 제한효소 및 prim er의 다양한 조합으로 고도의

다형성과 다수의 polym orphic DNA m arker를 신속하게 검출할 수 있는 m olecular

typin g 기법으로서 식물과 미생물의 typing을 위한 새로운 기법으로 유용하게 이

용되고 있다 (13, 31).

최근에 유전형 분석을 위한 분자생물학적 기법들이 미생물 균주간의 감별에

널리 이용되고 있다. 본 연구에서는 냉동식품에서 문제시 되는 L . m on ocy tog en es

st r ain s을 유전자 분석하기 위해 P CR 방법을 기반으로 한 AF LP 기법을 확립하였

다.

본래 AF LP 기법은 식물의 품종개량을 위해 사용하던 것이 지금은 동물과 원

핵동물의 DNA 분석에도 사용한다 (6, 11, 13, 16, 19). 보통은 6개염기에 대한 인식

부위를 가지는 제한효소와 4개염기에 대한 인식부위를 가지는 제한효소 두 종류

를 가지고 AF LP를 적용시키나, 본 실험에서는 실험의 편이성과 비용적인 면을

고려하려 한 개의 제한효소를 이용하였다.

SE - AF LP (Single - en zym e am plified fr agm ent len gth polym orphism ) 방법에

대해서는 이미 L eg ion ella p n eum op hila (30), H elicobacter py lori (9), Chlam y d ia

p s it taci (4), M y cop lasm a cap r icolum (5), V ibr io v uln if icus (7) Campy lobacter

j ej uni (10), Clos trid ium p erf ring ens (18)등에 대해 st r ain 수준에서의 감별에 사용

하였다. 이 방법은 복잡하고 비용이 높은 장비나 소프트웨어가 불필요하고, 결과

분석에 있어서도 패턴 분석에 다른 장비 도움이 없이도 가능하다. 이러한 장점들

로 인해 SE - AF LP를 병원성 세균 동정 가능성에 대해 많은 실험실에서 시도되고

있다(32).

다양한 형태의 많은 AF LP 분석법이 개발되었다(11, 17, 19, 30). 이 실험에 사

용한 A F LP 방법은 크게 다음과 같이 네 가지 과정으로 구성된다: (1) 추출한

DNA를 한 종류의 제한효소로 반응시킨다. (2) 제한효소 인식부위에 맞추어 제작

한 adapt or를 제한효소 처리된 DNA에 ligat ion시킨다. (3) A dapt or에 상보적인

- 2 -

prim er를 가지고 P CR 반응을 통해 adapt or - t agg ed fr agm ent를 증폭시킨다. (4)

ag arose g el에 전기영동을 한다. 모든 adapt or - t agg ed fr agm ent가 증폭되지는 않

는데, 이것은 prim er의 3’말단부위에 특정 염기를 하나 더 첨가함으로써 여기에

상보적인 염기서열을 가진 단편들만이 증폭이 되기 때문이다.

본 연구에서는 L . m on ocy tog enes 표준균주에 대해 SE - AF LP 분석법에 대한

실험 기준을 잡고, 실제 검체에서 분리된 L . m on ocy tog enes에 대해 AF LP 분석법

에 의한 유전형 판독함으로써 임상적용 가능성 여부에 대하여 알아보고, 더 나아

가 다른 병원성 미생물에 대해서도 향후 SE - AF LP 분석법의 응용 가능성을 알아

보고자 하였다.

- 3 -

제 2 장 재료 및 방법

1 . 실험 균주와 배양조건

본 실험에 이용한 표준 균주는 미국의 A m erican T ype Culture Collection

(A T CC)에 주문하여 구입한 L . m on ocy tog enes AT CC15313와 경상대에서 분양받

은 L . m on ocy tog en es #53, L . m onocy tog en es #54, L . m on ocy tog en es #55와 L .

m on ocy tog en es #3, L . inn ocua HPB #14, L . g ray HPB #29를 사용하였다. 그리

고, 소와 돼지 유래 가공육과 포장육 시료 총 812개의 검체에서 분리·동정한 총

12개주의 L . m onocy tog en es를 실험 대상으로 하였다. 또한, 실험실에서 보유하고

있는 Ent erobat eriaceae에 속하는 E . coli, E . coli O157:H7, Y . enterocolit ica , Y .

p s eud otuberculos is , S . typ hi, S . dy s en ter iae의 6개 균종을 대상으로 하였다.

세균은 brain heart infu sion (Difco, Detroit , MI, U .S .A .) broth 3 ㎖에 접종하

여 호기성 상태로 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다.

2 . D N A 정제 , 제한 효소 처리 및 adapt or의 lig at ion

2 - 1 . Gen om ic D N A 의 정 제

세균의 gen om ic DNA는 전통적인 alkaline ly sis 방법과 DNA isolat ion

kit (QIA amp Blood Kit and QIA amp T issu e Kit , QIA GEN In c., Chat sw orth , CA ,

U .S .A .)를 사용하여 추출, 정제하였다. 정제된 DNA의 농도는 A 2 60에서 흡광도를

측정하여 계산하였다.

2 - 2 . H indⅢ en zy m e의 처 리

정제된 1 ㎍의 DNA를 제한효소 20 U의 H indⅢ (Prom eg a Co., M adison , W I,

U .S .A .)를 BSA가 25%농도로 첨가된 1×One - P hor - All buffer (Am er sham

Pharm acia Biot ech , Piscat aw ay , NJ , U .S .A .)에 멸균 증류수로 최종 반응 양이 30

㎕가 되로록 하여 37℃에서 5시간 반응시켰다.

- 4 -

2 - 3 . 제한 효 소 와 li g a s e의 adaptor에 대한 반 응

제한효소 반응이 5시간 지난 후 각각의 반응액에 5 pm ol의 adapt or , 10 m M

AT P 1 ㎕, 5× OPA , 10 W eis s unit s의 T 4 ligase (T akara Shuzo Co., Ot su ,

Shiga , Japan )에 멸균 증류수로 10 ㎕가 되도록 한 다음에 반응액에 첨가하였다.

2- 2과정과 같은 조건에서 5시간 반응시킨 후, 다른 조건에는 변화가 없는 상태에

서 온도 조건만 16℃로 바꾼 상태에서 10시간 반응시켰다. 반응액의 효소들을 불

활성화 시키고, DNA를 선택적으로 얻기 위해 에탄올 침전법을 이용하여 P CR반

응에 사용할 t em plete DNA를 제작하였다.

3 . P CR 반응과 전기영동

P CR에 사용되는 prim er는 T able 1에서와 같이 네 종류로 사용하였다. 실험에

사용한 adapt or와 prim er는 Gib son 등(9)이 사용한 것과 같은 염기서열을 주문 제

작 (Bioneer Co., T aejun , Korea )하여 사용하였다. 증폭 반응은 2 ㎕의 t em plate

DNA , 1.5 mM M g Cl2 , 20 pm ol single prim er , 0.2 mM dNT P , 1×buffer , 0.5 U

T aq DNA polym erase (T akara Shu zo Co., Ot su , Shig a , Japan )에 멸균증류수로

전체 20 ㎕로 맞춘 다음 th erm al cy cler (Hybrid Lt d., Middlesex , U .K .)에서 DNA

의 증폭을 시도하였다. P CR 반응은 총 35 cy cle을 시행하였으며 첫 cy cle이 시작

하기 전에 94℃에서 4분간 가온 하여 denaturation 한 후, 매 cy cle 당 94℃에서 1

분 동안 den aturat ion , 60℃에서 1분 동안 annealing , 72℃에서 2분간 ex t ent ion 반

응을 시행하였다. 그리고 완전한 ex t en sion을 위해 72℃에 15분간 지속하였다. 반

응이 종료된 후 T BE buffer (90 m M T ris , 90 m M boric acid, 2 m M EDT A )에

0.5 ㎍/ ㎖의 ethidium brom ide를 첨가한 1.5% agarose g el에 전기 영동하여 UV

tran sillum inat or (Vilb er Lourm at , M arne La V allee, F rance)에서 관찰되는 DNA

증폭상을 1D adv anced program (A dv anced Am erican Biot echn ology , F uller t on ,

C.A ., U .S .A .)을 사용하여 결과를 분석하였다.

- 5 -

T able 1. A daptor s an d Prim er s U sed for P CR Am plification

S equence (5 ' to 3 ' ) T m (℃)Reference

num ber

A dapt orADH 1 A CGGT AT GCGA CA G 37.1 9

ADH 2 A GCT CT GT CGCAT A CCGT GA G 56.6 9

Prim er

HI- A GGT AT GCGA CA GA GCT T A 45.3 9

HI- T GGT AT GCGA CA GA GCT T T 47.0 9

HI- C GGT AT GCGA CA GA GCT T C 47.3 9

HI- G GGT AT GCGA CA GA GCT T G 48.3 9

- 6 -

제 3 장 연구 성적 및 결과

1 . L is t e r ia s pp . 표준균주에 대한 A F LP 실험

5종의 L . m on ocy tog en es와 L . g ray , L . inn ocua에 대해 각 4종류의 prim er에

대해 특정한 양상의 증폭산물을 얻을 수 있었다 (F ig . 1).

M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7

F ig . 1 (a ). HI- A F ig . 1 (b ). HI- C

M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7

F ig . 1 (c ). HI- T F ig . 1 (d). HI- G

F ig . 1. AF LP analy sis of r eference str ain s of L is ter ia spp. Lan e M , pBH 20

m arker ; lane 1, L . m on ocy tog enes #3; lan e 2, L . m on ocy tog en es #53; lane 3, L .

m on ocy tog en es #54; lane 4, L . m onocy tog en es #55; lan e 5, L . m on ocy tog en es

AT CC15313; lane 6, L . g ray HPB #29; lan e 7, L . innocua HPB #14.

- 7 -

2 . 대표적인 En terob ac teri ac e ae에 대한 A F LP 실험결과

대표적인 장내세균에 대하여 A F LP 기법의 적용여부를 알아보기 위하여 각 4

종류의 prim er를 사용한 결과, 특정한 증폭양상을 확인할 수 있었다 (F ig . 2).

M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

F ig . 2 (a ). HI- A F ig . 2 (b ). HI- C

M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

F ig . 2 (c ). HI- T F ig . 2 (d ). HI- G

F ig . 2. AF LP an aly sis of st r ain s of select ed Ent erobacter iaceae .Lane M , pBH 20

m arker ; lane 1, E . coli; lane 2, E . coli O157:H7; lane 3, Y . p s eud otuberculos is ;

lane 4, Y . enterocolit ica ; lan e 5, S . typ hi; lane 6, S . dy s en teriae

- 8 -

3 . 소와 돼지 유래 가공육과 포장육 시료를 대상으로 한

A F LP 실험결과

소와 돼지 유래 가공육과 포장육 시료에서 L . m onocy tog en es로 동정된 12개의

시료에 대하여 AF LP 실험을 하여 특정한 증폭 양상을 확인할 수 있었다 (F ig .3 ).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

F ig . 3 (a ). HI- A F ig . 3 (b ). HI- C

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

F ig . 3 (c ). HI- T F ig . 3 (d ). HI- G

F ig . 3. AF LP analy sis of L is ter ia m on ocy tog en es isolat es . Lan e M , pBH 20

m arker ; lane 1 to 12, isolat es 1 to 12.

- 9 -

4 . L is t e r ia s pp . 표준균주와 시료에 대한 1D adv an c e d

pro g ram 을 이용한 근연도 분석

5종의 L . m on ocy tog en es와 L . g ray , L . inn ocua에 대해 각 4종류의 prim er에

대해 특정한 양상의 증폭산물을 얻을 수 있었는데, 이 중에서도 HI- T prim er를

사용한 것을 선택하여 근연도를 확인하였다 (F ig . 4). 그 결과 기본적으로 L .

m on ocy tog en es 간의 밀접한 근연도가 있음을 나타내었고, 또한 분양처에 따라 밀

접한 근연도가 있다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 소와 돼지 유래 가공육과 포

장육 시료에 대해서도 HI- T prim er를 사용한 AF LP결과에 대해 근연도를 살펴본

결과 시료의 종류에 따라 근연도가 있음을 확인 할 수 있었다(F ig . 5).

F ig . 4. Den drogram of the sim ilar ity in dex am on g referen ce L is ter ia spp.

st r ain s w ith HI- T prim er . Lan e 1, L . m on ocy tog enes #3; lane 2, L .

m on ocy tog en es #53; lane 3, L . m onocy tog en es #54; lan e 4, L . m on ocy tog enes

#55; lan e 5, L . m onocy tog en es A T CC15313; lan e 6, L . g ray HP B #29;

lane 7, L . innocua HP B #14

- 10 -

F ig . 5. Dendrogram of th e sim ilar ity in dex am ong reference str ain s and isolat es

of L is teria m on ocy tog en es by AF LP an aly sis w ith HI- T prim er .

- 1 1 -

제 4 장 고 찰

유전자 분석법에 있어서 AF LP의 존재는 최근에 개발된 방법으로서 다른 유전

자 분석법들과 비교하여 볼 때 많은 장점을 지니고 있다(33).

대표적인 유전자 분석법에는 대표적으로 RF LP (rest r ict ion fr agm ent length

polym orphism ), RAPD (random ly am plified polym orphic DNA ), S SR (simple

sequ ence repeat ), ST EM S (sequ en ce- tagg ed microsat ellit e sit e )등이 있다. 이들

방법들에 비해서 AF LP 분석법의 장점으로는 P CR을 이용하기 때문에 소량의

DNA로 가능하고, 재현성이 높아서 실험 결과에 대한 신뢰성이 높으며, 실험 대상

에 대한 염기서열 정보가 없어도 가능하며, 동일한 prim er에 대해 응용성이 높고,

실험의 방향에 따라 장비와 비용의 잇점을 가져 올 수 있어 다른 유전자 분석법

들과 비교하여 볼 때 많은 장점을 지니고 있다 (22, 33).

Lin 등(13)에 의하면, AF LP 기법을 이용하여 E scherichia coli와

A g robacterium tum efaciens에 대하여 적용하였다. 이 연구에서의 관점은 A F LP

기법의 미생물에 대한 적용여부에 있어서, 동일한 세균내에서도 plasmid의 유무에

따라 감별 할 수 있는지가 관심의 대상이였다. 그리고, 대상이 되는 plasm id는 주

로 병원성과 연관된 것으로 궁극적으로는 병원성 세균과 비병원성 세균의 감별에

대한 연구이다.

V elappan 등 (32)에 의하면, 날로 심각성을 더해가는 병원성 미생물을 대상으로

신속하고, 정확한 동정의 필요성이 증가함에 따라 SE - AF LP (single - enzym e

am plified fr agm ent len gth polym orphism ) 기법에 대한 연구를 하였다. AF LP 기

법의 재현성에 대한 실험결과를 제시하여, AF LP 방법의 신뢰성을 뒷받침하였고,

한 종류의 제한 효소만으로도 AF LP 기법을 적용할 수 있음을 증명하였으며, 다양

한 세균들에 대한 감별결과를 제시하였다. 또한 무엇보다도 인위적으로 적은 수의

ban d 패턴 결과를 유도함으로써 부가적인 분석장비의 도움이 불필요하다는 것이

장점이다.

A art s 등 (2)에 의하면, list er iosis를 유발하는 L . m on ocy tog en es의 혈청형에 따

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른 AF LP 기법을 확립하였다. 혈청형 사이의 유사도를 계산한 결과 대상으로 한

1/ 2a , 1/ 2c, 3a , 4a , 1/ 2b , 3b , 4ab , 4b , 4e와 1 등이 크게 2군으로 분류가 되었으며,

이 중에서도 1/ 2a , 1/ 2b와 4b형이 list er iosis를 일으키는 주요한 혈청형임을 밝혀

냈다. 또한 이 논문에서는 A F LP 기법에 의한 감별력과 ALF A (aut om at ed laser

flu orescent analy sis )에 의한 결과 해석의 자동화부분이 결합하여, L .

m on ocy tog en es의 혈청형 분석에 매우 효과적임을 나타내었다.

Gib son 등(9)에 의하면, AF LP 기법을 H . p y lori의 유전자 지문 분석과 감별에

이용하였다. 이 논문의 특징은 단일 제한 효소의 사용, 한 번의 P CR 반응과

ag arose g el에서의 전기 영동이라고 할 수 있다. 즉, 이제까지의 AF LP기법을 최

대한 단순화시키고 비용·장비면에서도 간소화시켰다. Ribotyping과 urease

genotypin g으로 대조 실험을 하여 각 typin g에 대한 결과를 비교하였다.

실험결과에 대한 가장 신뢰성 있는 결과를 산출하는 실험법은 DNA

sequ encin g으로서 어떠한 방법들 보다도 확실한 방법이기는 하지만, 비용과 시간

적인 면에서 효율성이 떨어져 실제 임상적용에 어려움이 있다 (21, 24). 이러한

DNA sequ encing의 실제 과정상의 어려움에 비해, AF LP 기법은 많은 장점들로

인해 이미 다양한 미생물을 대상으로 연구가 되었다 (20, 25, 26).

실제로 미생물분야에 있어서도 전제 g en om e이 밝혀진 것은 극히 소수에 불과

하다. 이러한 사정에 비추어 볼 때 AF LP 분석법이 다른 실험기법들과의 연계를

통해 미생물 분야에서 병원성 세균의 신속한 동정과 역학적인 관점에서 감염원의

추적에 이용할 여지가 충분히 있음을 이 연구를 통해 알아보았다.

본 연구에서는 A F LP 분석법에서도 본래 식물에서 처음 사용하였던 방법을 실

험실 여건에 맞게 변형하였다. 먼저, 사용하는 제한 효소를 한 가지로 했다. 그 다

음은 대부분의 AF LP 분석법에서는 전기영동을 DNA sequen cing이 가능한

PA GE - g el에 하고 있으나, 본 연구에서는 보편적인 ag arose g el electrophoresis를

사용하였다. 이러한 방법적인 변형이 가능한 것은 먼저 식물의 g enom e과 미생물

의 g enom e을 비교해 볼 때 크기에 있어서 많은 차이가 있어서, 식물을 대상으로

는 실험방법의 변형이 적용되기 힘드나, 미생물 분야에 있어서는 적용이 가능하며,

시간적, 비용적으로 절약이 되며, 장비와 시약에 있어서도 간편화 할 수 있다.

- 13 -

A F LP 분석법에 있어서 무엇보다 지켜져야 할 조건은 P CR 반응에 있어서의

엄격성이다. 본 연구에서 사용한 prim er간에도 살펴보면 3 말단의 염기 하나만 차

이가 있는 것이기 때문에 non - specific한 DNA 염기배열에 annealin g이 될 경우

그 실험결과에 대해서 신뢰 할 수가 없다. 따라서 이러한 점을 배제시키기 위해서,

본 연구에서 사용한 방법은 ann ealin g 온도를 60℃로 높여 특이도를 향상시켰다.

이 온도의 의미는 먼저 adapt or로 사용되는 ADH 1과 ADH 2가 prim er로 작용

할 가능성에 대해 살펴 볼 때, ADH 2는 연장되는 방향이 반대로 되어 ann ealing이

되더라도 ext en sion은 되지 않으나, ADH 1은 방향성도 맞고, 염기 서열도 완전히

상보적이여서 prim er의 역할을 할 수 있다. 이에 ann ealin g 온도를 살펴보면

ADH 1이 37.1℃이고, prim er s들이 45℃- 48℃로 되어 있는데 ann ealin g 온도를 6

0℃에서 시행함으로 인해 ADH 1이 prim er로의 작용가능성을 최소화하였다.

A nn ealing 온도를 대상 prim er의 온도보다 큰 폭으로 올려 줌으로써 ADH 1에

의한 간섭현상을 많은 부분 없앨 수 있었으나, pr im er간의 하나의 염기 차이 만으

로 P CR 반응에 엄격함을 부여 할 수 있느냐 하는 점에서는 확실한 진위 여부를

파악할 수가 없다. 다만 그러한 점을 개선하기 위해 앞으로 본 연구의 실험방법에

변화를 준다면, hot - start P CR을 이용하여 비특이적 DNA 증폭을 최소화한다든지,

proof - reading 기능을 가지고 있는 T aq DNA polym erase를 이용하는 방법 등이

시도 될 수 있을 것이다.

실험 결과상 DNA 추출법에 따른 문제점이 제기 되었는데, 본 연구에서 사용

한 방법뿐만 아니라 다른 방법에 의한 genomic DNA를 추출하는 방법들에 대한

비교 분석이 이루어져야 할 것이며, adaptor와 절단된 genomic DNA의 lig ation후

효소를 불활성화 시키고, DNA를 얻기 위한 방법으로 에탄올 침전법을 이용하였

는데, 고온 상태 (80℃나 65℃)에서 일정시간 처리를 통해 효소를 불활성화 시킨후

DNA를 얻는 방법에 대해서도 고려할 필요가 있다.

또한 임상적으로 이용하기 위해선 시간 단축의 관점에서, 본 연구를 통해 확립

된 실험방법들이 결과에 대해서 영향을 미치지 않으면서, 최대한 시간을 줄일 수

있는 방향으로 개선해 나가야 할 것이다.

여러 가지 실험과정상의 개선을 통해 SE - AF LP 기법이 다른 병원성 세균들에

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대해서도 확립이 된다면, 병원성 세균의 검출에도 응용성을 가지고 있다. 예를 들

면, P CR을 이용한 병원성 미생물의 신속한 검출에 있어서 주로 이용되는 g en e이

미생물의 16S rRNA를 표적으로 하여 prim er를 제작하여 사용하는데, 이 16S

rRNA 자체가 미생물 간의 유사성이 너무 커서 종 (species ) 이하의 수준에서 분류

에 있어 어려움이 있는 경우가 발생한다.

이러한 경우에 genu s까지는 16S rRNA 유전자를 이용하여 분류를 하고, 그 이

하의 수준에서는 SE - AF LP법을 이용한다면 병원성 세균의 검출에 가능성을 보인

다.

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제 5 장 결 론

최근에 유전형 분석을 위한 분자생물학적 기법들이 미생물 균주간의 구별에

널리 이용되고 있다. 본 연구에서는 L . m on ocy tog enes st r ain s을 유전자 분석하기

위해 P CR 방법을 기반으로 한 SE - AF LP 기법을 확립하였다. 4종류의 prim er에

대해 A F LP 방법에 대한 각각의 DNA 단편들을 얻을 수 있었다. 이 중에서 str ain

간의 분별에 용이하며, DNA 단편 형태에 있어서의 비교 분석을 통해 적절한 L .

m on ocy tog en es의 유전자 분석이 용이한 prim er로 HI- T 를 선택하였다. 5균주의

L . m on ocy tog enes 중에서 L . m on ocy tog en es AT CC 15313이 다른 것들과 차이

점을 나타내주고 있다. 여기에 L . g ray 와 L . innocua의 DNA fragm ent 형태도 L .

m on ocy tog en es와의 차이점을 나타내주고 있다. 그리고, 소와 돼지유래 가공육과

포장육 시료에서 분리된 L . m on ocy tog en es 4번, 7번 시료들은 전체적으로

genomic DNA자체가 손실되어 나온 결과를 나타내고 있으나, 다른 10개의 시료에

대해선 통계적인 유효성을 가지기에는 부족한 수치이나, 시료종류에 따라 혹은 채

취 장소에 따라 시료들간의 연관관계를 파악에 대한 가능성을 확인하였다. 대표적

인 Ent erobat eriaceae를 대상으로 한 실험에서는 두 가지 사실을 나타내고 있는데,

첫째는 L . m onocy tog en es 뿐만 아니라 다른 미생물을 대상으로도 SE - AF LP 분

석법의 적용 가능성을 제시하여 주었고, 두 번째로는 그 적용에 있어서, E . coli와

E . coli O157:H7의 관계와 Y . p s eud otuberculos is , Y . en terocolitica의 관계에서

살펴보면 모든 prim er에 대해 차이점을 보인다는 것이다. 따라서 같은 종의 세균

이라 하더라도 병원성 세균과 비병원성 세균간의 차이점을 나타낼 수 있다는 것

과, 동일한 속 (g enu s )에 있는 세균들 간의 구별에 이용가능성을 제시하였다. 결론

적으로 기존의 AF LP 방법을 일부 변형하여 고가 장비와 비용면에서 장점을 보이

는 SE - AF LP 분석법은 유전자지문분석에 있어서 유용한 방법으로, 미생물의 유전

형 분석과 임상적 응용에 적용 가능성을 본 연구를 통하여 확인하였다.

- 16 -

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A b s trac t

F in g e rprint in g of L is t e r ia m onocy t og e ne s

b y A m plif ie d F rag m e nt Le n g th

P o ly m o rp h is m A n aly s i s

Jin , H y u n S e ok

D e pt . of B iom e dic al L ab orat ory S c ien c e

T h e Gra du at e S ch ool

Y on s e i U n iv ers ity

L is teria m onocy tog en es poses an increasing health risk , w hich in part is

due t o in creasing health risk , con sum ption of r eady - to- eat food product s and

the in trodu ct ion of increa sin g num ber s of food product s from region s w ith

different diet ary h abit s . L . m on ocy tog enes can be present in m eat , sh ellfish ,

v eg et ables , unpast eurised m ilk an d soft ch eese an d poses a risk if food

cont ain in g th ese produ ct s is stored at r efrigeration t em perature and is not

properly heated before con sum ption , as L . m onocy tog en es is psy chrophilic.

Am plified- fr agm ent len gth polym orphism (A F LP ) analy sis is the m ethod of

genotypic t echin ique in w hich adapt or oligonu cleot ides are ligat ed to rest r ict ion

en zym e fragm ent s and then u sed as t arget sit es for prim er s in a P CR

am plification . T he am plified fr agm ent s are electrophoret ically separated to giv e

str ain - specific band profiles . Single - en zym e approach th at did not r equir e

cost ly equipm ent or r eagent s for th e fing erprin ting of st r ain s of L is ter ia

- 2 3 -

m on ocy tog en es w as dev eloped. Sin gle - en zym e amplified fr agm ent length

polym orphism (SE - AF LP ) analy sis w as u sed t o perform species and str ain

identificat ion of S alm onella, S hig ella, Y ers in ia and E . coli. By careful select ion

of AF LP prim er s , it w a s possible to obtain reproducible and sen sit iv e

identificat ion to str ain lev el. T he AF LP pat t ern s of L . m on ocy tog enes are

div ided by the kin ds of specim en s in w hich w ere isolated. SE - A F LP fragm ent s

can be analy zed u sin g st andard g el electrophoresis , an d can be easily scored

by visu al in spect ion , due to th e low complex ity of the fing erprin t obt ained by

this m ethod. T hese features m ake SE - AF LP suit able for u se in eith er field or

laborat ory applicat ion s .

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Key w ords : L . m on ocy tog en es , A F LP , P CR, F in gerprin t

- 24 -