ÇANAKKALE LİMAN BÖLGESİNDEKİ DENİZ SUYUNDA

HALOFİLİK BAKTERİ VE MAYALARIN İZOLASYONU

GRUP: EXTREM

Tamer GÖK Yahya Kaptan Anadolu Lisesi

Esra ŞENBABAOĞLU

Özel Gebze Lisesi

Hazım BOZKURT Rıza Malatyalı İlköğretim Okulu

DANIŞMANLAR

Prof. Dr. Turan GÜVEN Prof. Dr. Sezai TÜRKEL Prof. Dr. Ahmet AKSOY

TÜBİTAK-BİDEB Fen ve Teknoloji – Fizik, Kimya, Biyoloji Bilim Danışmanlığı Çalıştayı

6-16 Temmuz 2008

(ÇANAKKALE FEN LİSESİ)

2

PROJENİN ADI: Çanakkale liman bölgesindeki deniz suyunda halofilik bakteri ve

mayaların izolasyonu

GRUBUN ADI: EXTREM

GRUP ÜYELERİ: Tamer GÖK, Esra ŞENBABAOĞLU, Hazım BOZKURT

DANIŞMAN: Prof.Dr.Turan GÜVEN, Prof.Dr.Sezai TÜRKEL, Prof.Dr.Ahmet AKSOY

PROJENİN AMACI: Bu çalışmada biyoelektronik ve biyoteknolojik uygulamalarda

önemli bir yer tutan halofilik bakteri ve mayaların Çanakkale liman bölgesindeki durumunun

tespiti amaçlanmaktadır.

3

ÖZET:

Bu çalışmada Çanakkale liman bölgesinde deniz yüzeyi, dip çamuru ve yosunlu

bölgelerden alınan örneklerde biyoteknolojik öneme sahip halofilik bakteri ve maya varlığı

saptanmıştır. Bunun için zenginleştirilmiş besiyerlerinin yanında halofilik

mikroorganizmaların yaşayabildiği tuzlu ortamlara ekimler yapılmıştır. Bakteri ve maya

örnekleri morfolojik özelliklerine göre değerlendirildi. Analiz edilen deniz suyu örneklerinde

deniz suyu zonlarında farklı miktarlarda bakteri ve maya örnekleri olduğu bulundu. En çok

mikroorganizmaya dip çamurunda rastlandı. İzole edilen maya ve bakteri örneklerinin

bazılarının halofililk olduğu belirlendi

4

GİRİŞ:

Enzimler, hücrelerde biyokimyasal reaksiyonları katalize eden protein yapısında

moleküllerdir. Hücrelerde çok önemli metabolik görevleri olan enzimler çeşitli amaçlarla

kullanılmak üzere günlük ve ekonomik hayata girmiştir (Wiseman, 1987). Enzimler ile

katalizlenen reaksiyonların 0 – 40 oC arasında reaksiyon hızı yükselir. Fakat 40 oC de enzim

zarar görmeye başlar. Böylece reaksiyon yavaşlar ve 60 oC de enzim tamamen bozulur. 40 oC

bu enzim için optimum ısıdır Bu noktada çözüm olarak

mikroorganizmalardan elde edilen enzimler büyük ilgi çekmektedir. (Bhat, 2000).

Son yıllarda yapılan çalışmalar mikrobiyal yaşamın spesifik çevrelerle sınırlı

olmadığını, mikrobiyal komünitelerin yüksek sıcaklık, yüksek tuz, düşük sıcaklık, asidik ve

alkali pH, yüksek basınç gibi ekstrem olarak tabir edilen çevrelerde de bulunabileceğini

ortaya koymuştur. Bu ekstrem çevrelerde yaşayan mikroorganizmalar ekstremofiller olarak

adlandırılırlar (Van den Burg, 2003). Ekstremofilik mikroorganizmaların, yüksek tuz

konsantrasyonlarında yaşayan üyeleri halofillerdir (Horikoshi and Grant, 1998).

Halofiller Kushner’e göre (1978, 1993); halofilik olmayanlar (0-1M NaCl), az

halofiller (0,2-2,0M NaCl), ılımlı halofiller (0,4-3,5M NaCl), ekstreme yakın halofiller(1.4-

4.0 M NaCl), ekstrem halofiller(2,0-5,2M NaCl), halotolerantlar (0->1M NaCl) ve değişken

halofiller (0- >3M NaCl) olarak sınıflandırılırlar.

Halofilik mikroorganizmalarIn yüksek tuz konsantrasyonlarInda nasıl yaşamlarını

sürdürülebildikleri Halobacterium gibi model organizmalarla yapılan çalışmalarla ortaya

konulmuştur. Bu tip mikroorganizmaların çevrelerindeki yüksek ozmotik basınçta yaşabilmek

için temel olarak iki strateji geliştirdiği kabul edilmektedir.

Bunlardan iç tuz stratejisinde hücre içinde K+ veya bazı hücrelerde Na+ akümüle

edilir ve böylece tüm hücre içi sistemler dış ortamdaki yüksek tuz konsantrasyonu

nedeniyle oluşan basınca karşı adapte olabilirler. İkinci strateji olan “compatible

solute” stratejisinde hücre kendisinin ürettiği stabilite edici organik maddeler ile

(ektoin, glisin, betain gibi) hücre içi sistemlerin yüksek tuz koşullarına adaptasyonu

gerekmeksizin hücre ile ortamın ozmotik basıncını dengeler ve yaşamını sürdürür.

(Oren, 1999).

Halofilik mikroorganizmalar diğer ekstremofilik mikroorganizmalarla

karşılaştırıldıklarında basit besiyerlerinde kolay üretilebilmelerinden dolayı biyoteknolojik

olarak büyük bir potansiyele sahiptirler. Ancak Ekstremofilik mikroorganizmalarla ilgili

alınan patent uygulamalarının sadece %20’si halofilik mikroorganizmalara aittir (Horiskoshi

and Grant, 1998).

5

Bu uygulamalardan bazıları bakteriyorodopsin (biyosensör yapımı, bilgilerin

holografik olarak depolanması, elektronik sanayi), halorodopsin (deniz suyunun

desalinizasyonu),biyopolimerler (polihidroksialkonatlar, parçalanabilir plastik üretimi) 84

kda’luk bir protein (myc onkogenin saptanması). Bunların dışında, fermente gıdaların ve gıda

katkı maddelerinin hazırlanmasında, biyosürfektanlar petrol kontamineli toprak ve suların

temizlenmesinde kullanılmaktadır (Margesin and Schinner, 2001).

Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan

elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal

kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, istenmeyen yan ürün

oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleridir

(Wiseman, 1987).

Ekstremofilik mikroorganizmalar; volkanların yüksek sıcaklıklarında, kutupların

düşük sıcaklıklarında, çok düşük ve çok yüksek pH değerlerinde (pH 0-3 veya pH 10-

12) veya çok yüksek tuz konsantrasyonlarında (%5-30) yaşamak için adapte olmuşlardır

(Niehaus ve ark., 1999).

Bu şekilde farklı ekolojik koşullarda yaşayan mikroorganizmalar termofilik, asidofilik,

alkalifilik ve halofilik bakteriler şeklinde sınıflandırılmıştır (Zeikus, 1979).

Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve

ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile

ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır. Özellikle son yıllarda

stratejik alan şeklinde değerlendirilen rekombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak enzim

üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998).

Halobakterilerin plazma zarlarında bulunan bakteriyorodopsin ışığa duyarlı bir protein

molekülü olup biyoelektronik ve geleceğin moleküler bilgisayarlarında kullanılmaya aday

moleküllerden biridir. Buharlaşma göllerinde tuzlu su buharlaştırılır ve tuz elde edilir ki; bu

durumda su azalır, bunu takiben suda çözünen oksijen suyla aynı oranda azalır, oksijen

azalınca oksijenli solunum şansı ortadan kalkar ve bakteriyorodopsin sentezlenerek zara

yerleştirilir. Bu pigment pembe ışık hariç görünen ışığın tüm dalga boylarını absorblar. Bunun

sonucunda halofilikler mor-pembe görünürler, bu pigment sayesinde hem enerji hem de

fotosentezle organik madde sentezlenmiş olur.

Halobacteriales’in bir çok üyesi, çözünür oksijen miktarı düşük olan tuzlu sularda

oksijen ve ışık alımını arttıran ve yüzme olanağı sağlayan gaz vezikülleri içermektedirler.

6

Bunların UV ışınlarının zararlı etkilerine karşı koruyucu kalkan oldukları belirtilmiştir

(DasSarma 1993, Beard et al. 1997).

Şekil-1:Birinci fotoğraf bir alt paragrafta bahsedilecek olan California,San Francisco'daki Owens Gölüne ait,ikinci fotoğraf ise Owens Gölü’nün ve bir tuz işletmesinin buharlaşma göllerine aittir.

7

ARAÇ VE GEREÇLER:

1.Nutrient agar besiyeri (250 gr)

2.Nutrient broth besiyeri (250 gr)

3. Steril petri kapları ( disposable, plastik) 8 cm lik (40 adet)

4. Cam tüpler - yaklaşık ebatlar 15mmX150 mm ( 10 adet)

5. Cam pipet 5 mililitrelik pipet ( 5 adet)

6.Erlenmayer ( 250 mililitrelik) ( 10 adet)

7.Cam baget ( 5 adet)

8. Sarı uç-otomatik pipet için (1 torba)

9. Mavi uç-otomatik pipet ( 1 torba)

10.Yeast ekstrakt (Maya özütü) ( 250 gram)

11.Pepton ( 250 gram)

12.Glikoz ( 250 gram)

13.Agar agar( 250 gram)

14.NaCl ( 250 gram)

15.Alüminyum folyo (2 kutu)

16..Konik tabanlı santrifüj tüpü ( 20 adet) (15x100 mm)

8

METOD :

Çanakkale liman bölgesinden numune alınacak üç bölge belirlendi. Halofilik bakteri

ve mayaları çoğaltmak için gerekli besiyerleri aşağıda verildiği şekilde hazırlandı:

I. erlenmayere 150 ml su ve 3 gr Nutrient Agar eklendi. Ağzı alüminyum folyo ile

kapatılarak sterilizasyon için hazırlandı. II. Erlenmayere 150 ml su ve 1,2 gr Nutrient Broth

eklendi. Ağzı alüminyum folyo ile kapatıldı. III . erlenmayere ise 150 ml su, 1.5 gr pepton ve

1.5 gr Yeast Ekstrakt eklenip manyetik karıştırıcıda çözüldü. Daha sonra 3 gr Agar Agar

eklenerek sterilizasyona bırakıldı. Sterilizasyon işleminden sonra III. Erlenmayere 3 gr glukoz

eklendi. Glukoz çözeltisi katılaşmayı önlemek için sterilizasyondan sonra seyreltilerek

eklendi.

Tuza dirençli bakteri ve mayaları izole etmek için I. ve III. erlenmayere NaCl

eklenerek 0.1 M lık tuzlu ortam sağlandı. Aynı şekilde sterilizasyona bırakıldı. Diğer cam

malzemelerde aynı şekilde sterilizasyon işleminden geçirildi.

Erlenmayerde hazırlanan ve sterilizasyondan geçirilen besiyerleri petri kaplarına

dökülerek ekime hazır hale getirildi.

Çanakkale liman bölgesinde deniz yüzeyi, dip çamuru ve yosunlu bölgeden alınan

örnekler sterilize edilmiş besiyerlerine ekildi. Santrifüj edilerek (3 dakika 2000rpm)

çöktürülen örnekler YPD (Yeast Pepton Dekstroz) besiyerine ekildi. Örnekler üremenin daha

çok olması için Nutrient Agar Broth besiyerine 5 ml glikoz ilave edilerek ekildi.1 gün

boyunca inkübasyona bırakıldı. Sıvı besiyeri Nutrient agar broth besiyerine ekilen örnekler 1

gün sonra katı besiyerine ekildi.

İnkübasyon sonucu bakteri ve mayaların üremeleri morfolojik olarak incelendi.

9

BULGULAR

Araştırmalarımızda Çanakkale liman bölgesinde yüzey, yosunlu bölge ve dip çamuru

olmak üzere üç farklı örnek alındı. Bu örneklerdeki bakteri ve maya türlerinin analizi için

standart mikrobiyolojik yöntemler kullanılarak ekimler yapıldı. Araştırmamızın amacı

halofilik bakteri ve maya örneklerini izole etmek olduğundan , alınan örnekler hem normal

hem de 1 M NaCl içeren üreme ortamlarına ekim yapıldı. Deney sonuçları analiz edildiğinde

yüzey suyunda normal besiyerinde üç farklı bakteri türü görülürken halofilik ortamda üreme

olmadığı görüldü (Tablo 1)

Dip çamuru analiz edildiğinde koloni morfolojisine göre beş farklı türe ait toplam 243

cfu/ml bakteri olduğu belirlendi. Fakat bu bakterilerden dört farklı türe ait 16 bakterinin

halofilik olabileceği belirlendi.

Yosunlu bölgeden alınan örnekte ise normal besi yerinde iki farklı türe ait 6 bakteri

türü olduğu bulundu. Fakat bu bakteri örneklerinde sadece 2 bakterinin halofilik olduğu

belirlendi.

Tablo 1: Alınan örneklerin farklı besiyerlerine ekimleri sonucu üreyen bakteri kolonileri sayıları (Parantez içindeki rakamlar farklı türlerin koloni sayısını vermektedir.)

Mayalar için yapılan deney sonuçları analiz edildiğinde yüzey suyunda normal

besiyerinde üç farklı maya türü görülürken halofilik ortamda tek çeşit maya ürediği görüldü

(Tablo 2)

Dip çamuru analiz edildiğinde koloni morfolojisine göre dört farklı türe ait toplam 62

cfu/ml maya olduğu belirlendi. Fakat bu mayalardan iki farklı türe ait 3 mayanın halofilik

olabileceği belirlendi.

cfu/ ml cfu/ ml Üreme birimi

Örnekler

NA besiyeri

NA+NaCl besiyeri

Yüzey suyu 6 ( 3+2+1 ) ÜREME YOK

Dip çamuru 243 (13+10+2+5+212) 16 (2+2+3+9)

Yosunlu bölge 6 (5+1) 2

10

Yosunlu bölgeden alınan örnekte ise normal besi yerinde iki farklı türe ait 6 maya türü

olduğu bulundu. Fakat bu maya örneklerinde 5 mayanın halofilik olduğu belirlendi .

Tablo 2: Alınan örneklerin farklı besiyerlerine ekimleri sonucu üreyen maya kolonileri sayıları (Parantez içindeki rakamlar farklı türlerin koloni sayısını vermektedir.) (Cfu/ml: Colony forming units/ml., mililitre örnekte koloni oluşturan maya sayısı)

cfu/ml cfu/ml Üreme birimi

Örnekler

YPD

besiyeri

YPD+NaCl

besiyeri Yüzey suyu

332 ( 244+68+20) 1

Dip çamuru 62 (3+1+10+48) 3 (1+2)

Yosunlu bölge 6 (4+2) 5 (2+3)

11

Şekil:2.Maya kolonilerinin mikroskopik görüntüsü

Şekil 3: Tüm besiyerlerinde üreyen bakteri ve maya kolonleri

Yapılan çalışmalar sonucunda alınan örneklerde normal tuzlu ortamda bakteri ve

mayalar ürerken NaCl eklenmiş besiyerlerinde bakteri ve koloni sayısının azaldığı görüldü.

Halofilik olmayan bakterilerin tuzlu ortamda üreyemedikleri, görüldü. Çanakkale liman

bölgesinde halofilik bakteri izolasyonunun mümkün olduğu sonucuna varıldı.

12

TARTIŞMA

Halofilik mikroorganizmalar çeşitli tuz konsantrasyonlarında üreyebilen

mikroorganizmalar olup hem bilimsel hem de teknolojik açıdan önemi olan canlı gruplarıdır.

Bazı halofilik mikroganizmalar kaya tuzları gibi katı ortamlarda bulunurken bir grup halofilik

mikroorganizma ise tuzlu deniz sularında ve tuz göllerinde bulunabilmektedir (Horokoshi ve

Grant 1998). Halofilik bakteri ve mayalar endüstriyel önemi olan ve ekstrem şartlar olan 1 M

NaCl gibi yüksek tuz içeren ortamlarda biyokimyasal özelliklerini ve aktivitelerini

kaybetmeyen çeşitli enzimler içermektedir. Bu tür mikroorganizmalardan aşırı şartlarda

aktivite gösteren değişik enzimlerin saflaştırılması endüstriyel açıdan çok önemlidir. (KSU.

Journal of Science and Engineering 9(1), 2006)

Araştırmamızın amacı Çanakkale liman bölgesindeki deniz suyunun farklı deniz suyu

örnekleri hem normal hem de yüksek konsantrasyonlarda tuz içeren üreme ortamlarına

ekilerek mikroorganizma profilleri belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre liman bölgesinden

alınan deniz suyu örneklerinin yüzey sularında çok az sayıda mikroorganizma olduğu

belirlendi. Yüzey suyunda az sayıda mikroorganizma bulunması boğaz akıntıları nedeni ile

sürekli olarak boğaz suyunun temizlenmesi, ayrıca Çanakkale yerleşim merkezi evsel

endüstriyel atıklarının liman suyuna karışmaması veya çok iyi derecede arıtılarak verilmesi

olabilir. Benzer sonuçlar yosunlu bölgeden alınan deniz suyu örneklerinden elde edildi.

Çanakkale liman bölgesi deniz dibi çamur örneklerinin mikrobiyolojik analizi ise bu

bölgede önemli çeşitlikte normal ve halofilik bakteri ve maya türlerinin bulunduğunu

gösterdi. Bu bölgeden elde edile örneklerin yaklaşık % 10’unun halofilik bakteri ve

mayalardan oluştuğu bulundu. Bu halofilik mikroorganizmaların türlerinin kesin olarak

belirlenebilmesi için daha ayrıntılı araştırmalar yapılması gerekmektedir. Bununla birlikte

üreme ortamlarındaki koloni morfolojilerine göre analiz edildiklerinde toplam sekiz farklı

halofilik bakteri ve maya türü olduğu belirlendi. (Özcan 2004)

13

KAYNAKLAR :

1) Beard, S. J., Hayes, P. K. and Walsby, A. E. 1997. Growth competetion between

Halobacterium salinarum strain PHH1 and mutants affected in gas vesicle

2) synthesis. Microniology UK, 143; 467-473.

3) Bhat, M.K., 2000. Cellulases and Related Enzymes in Biotechnology. iotechnology

Advances 18, 355-383.

4) DasSarma, S. 1993. Identification and analysis of the gas vesicle gene cluster on an

unstable plasmid of Halobacterium halobium. Experientia, 49; 482-486.

5) Gessesse, A., 1998. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline

Xylanases From an Alkaliphilic Bacillus sp. Applıed and Envıromental Microbiology .

p. 3533-3535.

6) Horikoshi, K., Grant, W.D. (1998). Extremophiles, sayfa 93-.133

7) Niehaus, F., Bertoldo, C., Kahler, M., Antranikian, G., 1999. Extremophiles As a

Source of Novel Enzymes For Indusrtial Application. Appl Microbiol Biotechnol. 51:

711-729Zeikus, J.G., 1979. Enzyme Microb. Technol. 1,243.

8) Van den Burg, B. (2003) Extremophiles as a source for novel enzymes. 9) Current Opinion in Microbiology, 6, sayfa 213-218

10) Wiseman, A., 1987. Handbook of Enzymes Biotechnology. Second Edition. Chapter

3. The Application of Enzymes in Industry p. 274-373.

14

TEŞEKKÜR

Çalışmamız boyunca desteğini bizden esirgemeyen başta Prof. Dr. Sezai TÜRKEL

olmak üzere, Prof. Dr. Turan GÜVEN ve Prof. Dr. Ahmet AKSOY hocalarımıza, çalıştayda

varlıkları ile moralimizi yüksek tutan arkadaşlarımıza teşekkür ederiz.