ANALISIS DE LA PRESENCIA DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN

ANALISIS DE LA PRESENCIA DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS EN MUESTRAS DE ALIMENTOSEXTRACCION Y PURIFICACION DE ADNMETODO DE EXTRACCION Y PURIFICACION CON CTABI.B.Q. NORBERTO DANIEL VAZQUEZ TINAJERO

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)El protocolo del (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980. El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en gentica molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validacin para detectar OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Se han elaborado algunas variantes adicionales para adaptar el mtodo a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin transformar (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001).

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol.

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)PracticaInstrumentalInstrumental reductor (hoja de bistur estril, mortero, etc.) Bao mara o calentador Microcentrifuga Micropipetas Mezclador de torbellino Tubos para microcentrifuga de 1,5 ml .Bandejas de pesar o equivalente Esptulas Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g Asas Soporte para tubos de microcentrifuga Optativo: desecador en vaco para secar los sedimentos de ADNMtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)PracticaReactivos Bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB)N CAS 124-03-8Cloroformo Isopropanol Na2EDTAN CAS 6381-92-6Etanol NaCl Proteinasa K Ribonucleasa A Trometamol (Tris-HCl) Agua desionizada esterilizada

Tampn a base de CTABCTAB 20 g/l4 gNaCl 1,4 M16,4 gTris-HCl 0,1 M3,15 gNa2EDTA 20 mM1,5 gAadir 100 ml de agua desionizada; ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M; completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave; conservar el Tampon a 4C (seis meses como mximo). Aadir 100 ml de agua desionizada; ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M; completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave; conservar el Tampon a 4C (seis meses como mximo).

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)PracticaSolucin de precipitacin a base de CTABCTAB 5 g/l1 gNaCl 0,04 M0,5 gNaCl 1,2 MDisolver 7,0 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada; esterilizar en autoclave y conservar a temperatura ambiente. Solucin de etanol al 70 % (v/v)Mezclar 70 ml de etanol puro y 30 ml de agua desionizada estril.Ribonucleasa A 10 GM/ml: conservar a 20C.Endopeptidasa K 20 GM/ml: conservar a 20C.

Aadir 100 ml de agua desionizada; ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M; completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave; conservar la solucin a 4C (seis meses como mximo). Aadir 100 ml de agua desionizada; ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M; completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave; conservar la solucin a 4C (seis meses como mximo).

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)PracticaProcedimientoDebe efectuarse en condiciones estriles. La contaminacin durante la preparacin de la muestra puede evitarse empleando material desechable y soluciones de descontaminacin y evitando la formacin de polvo.Depositar 100 GM de muestra homognea en un tubo estril de 1,5 ml para microcentrfuga; aadir 300 l de agua desionizada estril y mezclar con un asa; aadir 500 l de tampn a base de CTAB y mezclar con un asa; aadir 20 l de proteinasa K (20 GM/ml), agitar e incubar a 65C durante 30-90 minutos*; aadir 20 l de ribonucleasa A (10 GM/ml), agitar e incubar a 65C durante 5-10 minutos*; Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)Practicacentrifugar durante 10 minutos a 16 000 g aproximadamente; trasladar el sobrenadante a un tubo de microcentrifugacin que contenga 500 l de cloroformo y agitar durante 30 segundos; centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases; trasladar 500 l de la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin que contenga 500 l de cloroformo y agitar; centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g; trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin; aadir 2 volmenes de solucin de precipitacin a base de CTAB y mezclar pipeteando; incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente; centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g; desechar el sobrenadante; disolver el precipitado en 350 l NaCl (1,2 M); aadir 350 l de cloroformo y agitar durante 30 segundos; centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases; trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin; aadir 0,6 volmenes de isopropanol y agitar; centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g;

Mtodo del Bromuro de Cetil-Trimetil Amonio (CTAB)Practicadesechar el sobrenadante; aadir 500 l de solucin de etanol al 70 % y agitar con cuidado; centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g; desechar el sobrenadante; secar los sedimentos y volver a disolver el ADN en 100 l de agua desionizada estril.