AND Recombinante

Técnica utilizada para facilitar el estudio de los genes

AislarAmplificar

Inserción del gen de intéres en otra molécula de DNA que sirve como vector: Molécula de DNA recombinante

Historía del AND Recombinante

Historia del DNA Recombinante

• Salvador Luria: Resctricción y Modificación

• Restricción: Fagos solo crecen en un tipo especifico de bacteria.

• Moficación: Si un fago tiene la capacidad de crecer en dos varios tipos de bacterias.

• Sistema de Restricción: Arber and otros nucleasa que distingue entre DNA residente o extranjero.

• Meselson y Yuan caracterizan una enzima que cliva de manera especifica . Enzimas de restricción porque previenen la infeccion viral.

• Adición de grupos metilo.

Como Cortar y Pegar el DNA

Enzimas de restricción o endonucleasas de restricción:

Reconocen una secuencia específica, corta de nucleótidos en hebra doble DNA denominada sitio de restricción.

Enzima Ligasa: Une dos piezas de DNA mediante la formación de enlances fosfodiester.

Enzimas de Restricción

Tres clasesTipos de secuencias que

reconocenLa naturaleza del corte que

hacen en la hebra de DNAEstructura de la enzima

Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas

Reconocen secuencias simetricas de DNA de 4-6pb

Secuencias Palindromicas: secuencia 5’>3’ es la misma de la dirección 3’>5’

Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas

Terminaciones

EscalonadosSticky cohesivos

RomosBlunt

Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas

Union y Clivaje del DNA por Enzimas de Restriccion

DNA Ligasas Catalizan la formación de un enlace fosfodiester entre el

fosfato 5’ de un nucleotido de un fragamento de DNA y el grupo 3’ hidroxilo de otro fragmento

Requieren ATP como cofactor Ligasa mas usada es del fago T4

DNA Ligasas

Clonación

Generación de fragmentos de DNA usando enzimas de restricción

Ligación de fragmentos de DNA a otra molécula de DNA denominada vector

Tranferencia de la molécula recombinante a una célula hospedara

Recuperación de los fragmentos de DNA clonados

Purificación y Analisis.

Clonación

Vectores

• Moléculas transportadoras de DNA• Pueden replicarse de manera

independiente• Poseen sitios de restricción que estan

presentes una sola vez en el vector• Poseen un marcador de selección• Faciles de recuperar de la célula

hospedera

Plásmidos

DNA circulares extracro;:mosomales que tienen un origen de replicación y que se replican de manera autonoma dentro de las bacterias

pBR322: p:plasmido, BR: Bolivar & Rodriguez, 322:número de identificación.

Poseen un gen de resistencia a antibioticosPoseen un polylinker con multiples sitios de

restricción

Plasmidos