Date post: | 01-May-2015 |
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ANTICORPI MONOCLONALIANTICORPI MONOCLONALI
Pure single Ab
After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen.If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture.Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody.Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody.
Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58
1
23
4
mm
mm
1
2 34
1 2 3 4
Monoclonalantibodies
Cell fusion
Spleen cells
+Myeloma
x
Antiseum
Antigen
Immunization
A mixture of all Ab
1 23 4
BALB/c
1 2 3 4
1 23 4
B cell
Antibodies
Polyclonal Monoclonal
Antibodies that are collected from sera of exposed animal
recognize multiple antigenic sites of injected biochemical.
Individual B lymphocyte hybridoma is cloned and cultured.
Secreted antibodies are collected from culture media
recognize ONE antigenic site
of injected biochemical
Hybridoma
1975 Kohler and Milstein
http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.gif
Multiple myeloma (human disease)
Bence Jones proteins in urine
Fusions generated by Sendai virus
or PEG
Creation of monoclonal antibodies (mAb’s)
1. Hyperimmunize mouse with Ag
2. Fuse B cells with tumor fusion partner (+ PEG)
3. Limiting dilution (96 wells) to fractionate fused cells in HAT media selection
B cells die (mortal, HGPRT-positive)Tumor cells die (HGPRT deficient and cannot utilise salvage pathway)
Fusions live (HAT Resistant and immortal)
HAT media (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
Hybridoma selection (HAT media) The de novo pathway can be inhibited using
aminopterin, which inhibits the transfer of methyl groups
from activated dihydrofolic acid.
cells need Hypoxanthine and Thymine as sources of purines and pyrimidines
for the salvage pathway.
Myeloma cells are HGPRT- and cannot create nucleotides in the salvage pathway.
Plasma cells are HGPRT+ and can utilize hypoxanthine in the salvage pathway.
Expand in mice or expand in vitro
in vitro material is less concentrated
and contains bovine serum
ascites fluid contain high [mAb]
and minor contaminationwith mouse Ig
How to purify your MAb
Monospecific antibodies
Affinity Purification•
Or use Ag or epitope to make
affinity column
http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/pwpt/17_mab.pdf
IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALIMONOCLONALI
• Protein purification• Identification and isolation of cell sub-
populations using fluorescence cell sorting.• Tumor detection and imaging• Tumor killing• Diagnostic reagents.• Drug Detoxification• Catalytic antibodies
IMMUNODIFFUSIONE
Immunoprecipitation
• At appropriate ratio of antigen:antibody, complex forms an insoluble aggregate.
• Technique can be used to purify specific protein from a mixture
• Co-immunoprecipitation – interacting proteins also found in the immunoprecipitate
• Determinazione delle concentrazioni relative di anticorpi o di antigeni
• Confrontare diversi antigeni tra loro
• Stabilire la purezza di un preparato antigenico
Impieghi dell’immunoprecipitazioneImpieghi dell’immunoprecipitazione
Immunodiffusione
• Quando l'immunoprecipitazione avviene all'interno di un gel si parla più propriamente di immunodiffusione.
• Immunodiffusione radialeImmunodiffusione radiale
• Immunodiffusione doppiaImmunodiffusione doppia
• immunoelettroforesiimmunoelettroforesi
Diagrammi di possibiliModelli di precipitazionecon la doppia immuno-diffusione eseguita su un antisiero e 2 diversi preparati antigenici
A: epitopi identiciB:nessun epitopo in comuneC:identità parziale
IMMUNOELETTROFORESI
Archi di precipitazione
Separazione elettroforetica degli Ag
• Determinare se un paziente produce quantità troppo basse di Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze
• Si può vedere se produce se produce un eccesso di alcune proteine, quali albumina, immunoglobuline
Immunoelettroforesi quantitativaImmunoelettroforesi quantitativa
Ponendo in grafico l’altezza degli archi contro la concentrazioneSi otterrà una retta di taratura che può servire per determinare
la concentrazione di Ag in un campione incognito
TEST DI GRAVIDANZA: ES. DI INIBIZIONE DI AGGLUTINAZIONE
(Presenza o assenza di gonadotropina)
IMMUNOFLUORESCENZA
Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti
• Le molecole fluorescenti assorbono luce a una determinata lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).
• Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi, possono essere rilevati attraverso la valutazione della luce colorata emessa in seguito all’eccitazione a una determinata lunghezza d’onda
• La luce emessa può essere rivelata con un microscopio a fluorescenza
• I coloranti possono essere coniugati alla regione Fc di una molecola senza modificarne la specificità
• Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina
Immunofluorescense
Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction
IFA of Ehrlichia chaffeensis in DH82 cells, 400X
Very good rapid diagnostics
Citofluorimetria e fluorescenza
• Queste tecniche si basano sull’impiego di Ab fluorescenti a hanno carattere qualitativo
• FACS (fluorescence-activated cell sorter)• Quando una cellula passa davanti al raggio laser, la luce viene
deviata dal rilevatore e questa interruzione del segnale laser viene registrata. Le cellule che possiedono l’Ab fluorescente legato ai loro Ag di membrana vengono eccitate dal laser ed emettono luce, che viene registrato da un secondo sistema, localizzato ad angolo retto rispetto al raggio laser.
• Lo strumento conta ogni cellule quando passa davanti al raggio laser e registra i livelli di fluorescenza emessa dalla cellula
• Un computer collegato crea i diagrammi con il numero delle cellule in ordinata e la loro intensità di fluorescenza in ascissa
SEPARAZIONE DI CELLULE MARCATE CON Ab
DIAGNOSTICA
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Test antigenTest antiserum
Visualization of reaction
ELISA to test MAb production itself
www.ch.tum.de/wasser/weller/ formerprojects_im...
The dark blue spot represents a positive clone. The light blue spots are positive controls,
the next two wells to the right are negative controls
SAGGIOELISPOT
Saggio radio-immunologico• Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa
dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti
anticorpali. – Ab + Ag* Ab/Ag*
– Ab/Ag* + Ag Ab/Ag Ab/Ag*
• E' necessario costruire prima di tutto una curva di taratura, % conc. Ag
Marcato legato a Ab
Conc. Ag non marcato
Tratto lineare
FRAZIONI DI Ab
The Fab fragment contains the antigen binding site Could be cleaved out by papain digest;
pepsin digestion even better, as it produces F(ab’)2
www-structure.llnl.gov/ fab/fab_tutl.htm
Often it is enough for diagnostic purposes – and it is easier to produce
Anti Botulinum toxin
Equine FAB fragment product made by DoD at time of Gulf War,
anti-ABCDEFGHinge region
Single chain Fv fragments
http://www.gene-therapeutics.com/Service/custom%20scFv%20antibodies/Abb-scFv.gif
The size and specificity of the ScFv fragment
may allow for attachment to cryptic sites
IMPIEGHI COME FARMACI
About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor
Determination of HER2-protein overexpression (semiquantitative DAKO Hercep Test™)
Fluorescence in situ hybridisation (FISH)of HER2 amplification
www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm
http://www.roche.com/pages/facets/9/herc1.jpg
Herceptin (TrastuzuMAb) anti-HER MAbs
Approved!
Problemi con la terapia basata su mAb
• Gli Ab di topo sono visti come estranei dal sistema immunitario umano
• Innesco della risposta immunitaria contro gli HAMA (human anti-mouse antibody)
• Danni nell’ospite
• mAb causerebbero meno problemi
• (volontari cercasi??!!)
• Soluzione: anticorpi ibridi uomo-topo
• Anticorpi chimerici: Combinazione della regione variabile di topo con la regione costante di uomo
• Anticorpi umanizzati: Ab combina solo gli aa della regione ipervariabile di topo con il resto di Ab umano
Anticorpi umanizzati
Clone those genes and express them
as a recombinant protein in the protein expression system
Sales of Rituxan/MabThera by Year
http://www.sh.lsuhsc.edu/intragrad/micro/micro297/4
Topi transgenici con segmenti genici di anticorpi umani
http://www.sh.lsuhsc.edu/intragrad/micro/micro297/4
Xenomouse(topo con IgH e Igk umani)
Abgenix
Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate
waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif
ricin from the castor bean (Ricinus communis).
Antibody is tumor-specific
Only the targeted tumor cells are killed by the toxin
Common side effect –Vascular leak syndrome.
Could be relieved by usage of mutated toxin
Bunch of other toxins could be used
Saponin (from soapwort)
: www.som.soton.ac.uk/.../members/ DFlavell/djf2.htm
potent single chain ribosome inactivating protein
Goal: treatment of leukemias
and lymphomas
For T-cell leukemia could be targeted via CD7
OctreoScan in a patient with metastatic small cell carcinoma of the prostate
www.stjosephs-marshfield.org/
Monoclonal antibodies, which are specific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer,
which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells