Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System - Life Technologies

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Guida reagenti

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Guida reagenti

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

© Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved.

Information in this document is subject to change without notice. Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document.

APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF.

NOTICE TO PURCHASER: Label License

The StepOne™ Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-US counterparts, owned by Applied Biosystems. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5′ nuclease methods. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

NOTICE TO PURCHASER:

PLEASE REFER TO THE USER'S GUIDE OR PRODUCT INSERT OF THE REAGENTS NAMED HEREIN FOR LIMITED LABEL LICENSE OR DISCLAIMER INFORMATION.

TRADEMARKS:

Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MultiScribe, NED, ROX, StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries.

AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

All other trademarks are the sole property of their respective owners.

N. di cat. 4377717 Rev. B06/2010

Indice Front Cover

iiiGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

PremessaCome utilizzare questa guida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

Come ottenere ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

Come ottenere assistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

Capitolo 1 IntroduzioneInformazioni sul sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

Selezione del tipo di esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

Capitolo 2 Descrizione generale dei reagentiDescrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reagenti TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reagenti SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

Selezione del tipo di reagente appropriato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-8

Capitolo 3 Esperimenti di quantificazione

Sezione 3.1: Informazioni sugli esperimenti di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4

Selezione di un metodo di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

Selezione della RT-PCR one-step o two-step . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8

Selezione PCR singleplex o multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Sezione 3.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17

Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

Saggi di espressione genica TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20

Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

Disegno dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

iv Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Saggi personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express® . . . . . . 3-23

Selezione dei reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-25

Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-27

Ottimizzazione delle concentrazioni primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30

Ottimizzazione della concentrazione della sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-34

Per ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-36

Capitolo 4 Esperimenti di genotipizzazione

Sezione 4.1: Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . . 4-3


Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6

Sezione 4.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

Saggi pre-disegnati/convalidati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

Saggi genotipizzazione SNP TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . 4-11

Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan® per discriminazione allelica . . . . . . 4-12




Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15



Capitolo 5 Esperimenti di presenza/assenza

Sezione 5.1: Informazioni sugli esperimenti di presenza/assenza . . . . . . . . . . . . . . 5-3


Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-5

Sezione 5.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9

Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Saggi di espressione genica TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12

Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13




vGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Appendice A FormulaFormula per esperimenti con CT comparativo (ΔΔCT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1

Appendice B Limitazione dei primer nella PCR multiplex

Appendice C Linee guida disegno saggi

Bibliografia

Glossario

Indice

vi Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

viiGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

Come utilizzare questa guida

Scopo dellaguida

La guida fornisce le informazioni sui reagenti che è possibile utilizzare sul sistema PCR Real-Time StepOne™ Applied Biosystems (sistema StepOne™). Informazioni contenute nella guida:

• Introduzione ai reagenti TaqMan® e SYBR® Green• Descrizioni e linee guida disegno per i seguenti tipi di esperimento:

– Esperimenti di quantificazione– Esperimenti di genotipizzazione– Esperimenti di presenza/assenza

A chi si rivolge Questa guida è pubblicata per il personale di laboratorio e per i ricercatori principali che eseguono esperimenti con curva standard con il sistema StepOne.

Ipotesi assunte La guida prevede che l'utente:

• Abbia una conoscenza professionale del processo della reazione a catena della polimerasi (PCR).

• Conosca le modalità di manipolazione dei campioni DNA e/o RNA e della loro preparazione per la PCR.

Convenzionidel testo

La guida utilizza le seguenti convenzioni:

• Il testo in Grassetto indica un azione dell'utente. Ad esempio:Digitare 0, quindi premere Enter (Invio) per ognuno dei campi rimanenti.

• Il testo in Corsivo indica parole nuove o importanti e viene utilizzato anche per enfatizzare. Ad esempio:Prima di un'analisi, preparare sempre matrice fresca.

• Un simbolo di freccia a destra ( ) separa i comandi successivi selezionati da un menu a discesa o da un menu a scelta rapida. Ad esempio:Selezionare File Open (Apri).

viii Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

Messaggi diattenzione per

l'utente

Nella documentazione per l'utente Applied Biosystems compaiono due tipi di messaggi di attenzione. Ciascun messaggio presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito:

Nota: – Fornisce informazioni che potrebbero essere di interesse o di aiuto ma non di importanza critica per l'uso del prodotto.

IMPORTANTE! – Fornisce informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto chimico.

Alcuni esempi dei messaggi di attenzione sono indicati qui di seguito:

Nota: La funzione Calibrate (Calibra) è anche disponibile nella Control Console (Console di comando).

IMPORTANTE! Per verificare la propria connessione client, è necessario un ID utente valido.

Messaggi disicurezza

Nella documentazione per l'utente di Applied Biosystems appaiono quattro diversi messaggi di attenzione in punti del documento dove risulta necessario essere ben consapevoli della possibilità di pericoli rilevanti. Ciascun messaggio—IMPORTANTE, ATTENZIONE, AVVERTENZA, PERICOLO—presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito.

Definizioni

IMPORTANTE! – Indica informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto chimico.

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe causare lesioni di minore o moderata entità. Può inoltre essere utilizzata per mettere in guardia l'utente nei confronti di pratiche non sicure.

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe causare lesioni gravi o morte.

– Indica una situazione di pericolo incombente che, se non evitata, causerà morte o lesioni gravi. Questo messaggio viene utilizzato esclusivamente nelle situazioni di estremo pericolo.

Ad eccezione di IMPORTANTE, ogni messaggio di sicurezza in un documento Applied Biosystems appare accanto a un figura di triangolo aperto contenente un simbolo di pericolo. Questi simboli di pericolo sono identici a quelli posizionati sugli strumenti Applied Biosystems.

ixGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

Esempi

IMPORTANTE! Creare un foglio elettronico separato di immissione campioni per ogni piastra di reazione a 96-pozzetti.

PERICOLO CHIMICO. TaqMan® Universal PCR Master Mix può provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare, indumenti e guanti di protezione.

PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento dello strumento, il pannello di copertura riscaldato e il blocco campione possono raggiungere temperature che superano anche i 100 °C.

PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a terra è vitale per il funzionamento in sicurezza. Non mettere mai in funzione il sistema con il conduttore di messa a terra scollegato.

Come ottenere ulteriori informazioni

Documentazionecorrelata

La documentazione seguente è allegata al sistema StepOne:

Documento n. di cat. inglese

n. di cat. italiano

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Genotyping Experiments

4376786 4377729

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments 4376787

—

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT Experiments

43767854377742

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Standard Curve Experiments

4376784 4377736

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation, Maintenance, and Networking Guide

4376782 4377798

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Quick Reference Card

4376783 4377792

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site Preparation Guide

4376768 4378359

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software Help

— —

x Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

La documentazione di supporto seguente è disponibile presso Applied Biosystems:

Nota: Per ulteriori documentazioni, consultare “Come ottenere assistenza” a pagina xi.

Informazioni dallaGuida Software

(Help)

La Guida (Help) software del sistema PCR Real-Time StepOne™ Applied Biosystems (software StepOne™ ) descrive la modalità di utilizzo di ogni funzione dell'interfaccia utente. Accedere alla voce Help (Guida) dal software StepOne in uno dei modi seguenti:

• Premere F1.• Fare clic su nella barra degli strumenti.• Selezionare Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne).

Documento n. di cat.

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Performance Verification Protocol

4376791

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Qualification-Operation Qualification Protocol

4376790

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance Protocol

4376788

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 4367218

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965

SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 4310251

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol 4351891

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol 4304449

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note

127AP08

xiGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

Per trovare argomenti di interesse nella voce Help (Guida):

• Esaminare l'indice.• Cercare un argomento specifico.• Cercare un indice alfabetico.

Invio di commenti Applied Biosystems è lieta di ricevere i commenti e i suggerimenti dei clienti allo scopo di migliorare la propria documentazione per l'utente. È possibile inviare commenti tramite e-mail a:

[email protected]

IMPORTANTE! Utilizzare l'indirizzo e-mail sopra indicato esclusivamente per inoltrare commenti e suggerimenti relativi alla documentazione. Per ordinare documenti, scaricare file PDF o per aiuto su questioni tecniche, visitare il sito web all'indirizzo http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic sul link per il Support (assistenza). (Vedere “Come ottenere assistenza” qui di seguito).

Come ottenere assistenzaPer le informazioni relative a servizi e assistenza tecnica più recenti per tutte le sedi, visitare il sito web all'indirizzo http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic sul link Support.

Nella pagina dell'assistenza clienti, è possibile:

• Ricercare argomenti attraverso le domande frequenti (FAQ)• Inviare una domanda direttamente al servizio di assistenza tecnica• Ordinare documenti per l'utente Applied Biosystems, MSDS, certificati di

analisi e altri documenti correlati• Scaricare documenti in PDF• Ottenere informazioni sull'addestramento del cliente• Scaricare aggiornamenti e patch del software

Inoltre, la pagina dell'assistenza clienti fornisce l'accesso ai numeri di telefono e di fax in tutto il mondo per contattare l'assistenza tecnica e i punti vendita Applied Biosystems.

IMPORTANTE! Contattare il Servizio clienti Applied Biosystems (Customer Care Center) quando suggerito da questa guida o in caso di necessità per programmare le operazioni di manutenzione (quali, manutenzione pianificata annuale o verifica/calibrazione della temperatura) per il proprio strumento StepOne™. Per ottenere un numero di telefono o un indirizzo e-mail del servizio clienti, andare su http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.

mailto:[email protected]

http://www.appliedbiosystems.com

http://www.appliedbiosystems.com

http://www.appliedbiosystems.com/support/contact

xii Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

1-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

1Introduzione 1

Questo capitolo comprende i paragrafi:

Informazioni sul sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

Selezione del tipo di esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

Selezione del tipo di saggio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

1-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Capitolo 1 Introduzione

Informazioni sul sistema StepOne™

Il sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™) utilizza reagenti fluorescenti della reazione a catena della polimerasi (PCR) per fornire:

• Rilevamento quantitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target) utilizzando l'analisi in tempo reale.

• Rilevamento qualitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target) utilizzando analisi end-point e con curva di melting.

Informazionisull'acquisizione

dei dati

Il sistema StepOne acquisisce dati di fluorescenza non elaborati in punti diversi durante una PCR, in dipendenza del tipo di esecuzione:

Indipendentemente dal tipo di esecuzione, un punto di acquisizione dati o di lettura consiste in tre fasi:

1. Eccitazione – Lo strumento StepOne™ illumina tutti i pozzetti della piastra di reazione all'interno dello strumento StepOne, eccitando i fluorofori in ogni reazione.

2. Emissione – L'ottica dello strumento StepOne focalizza la fluorescenza residua emessa dai pozzetti della piastra di reazione. L'immagine risultante acquisita dal dispositivo consiste unicamente nella luce che corrisponde al range delle lunghezze d'onda di emissione.

3. Acquisizione – Lo strumento StepOne assembla una rappresentazione digitale della fluorescenza residua acquisita durante un intervallo dalla durata fissa. Il software StepOne™ memorizza l'immagine fluorescente non elaborata per l'analisi.

Tipo di esecuzione Punto di acquisizione dati

Sessioni di analisi in tempo reale

Curva standard Lo strumento acquisisce dati dopo ogni fase di estensione della PCR.

Curva standard relativa

CT comparativo (ΔΔCT)

Sessioni di analisi end-point

Genotipizzazione Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR. Lo strumento può inoltre acquisire dati durante la sessione di analisi (in tempo reale); l'acquisizione di dati durante la sessione di analisi è utile per la risoluzione di eventuali problemi.

Presenza/assenza Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la PCR.



Dopo una sessione di analisi, il software StepOne utilizza i dati di calibrazione (spaziale, del fluorocromo e di background) per determinare la posizione e l'intensità dei segnali fluorescenti in ogni lettura, il fluorocromo associato a ogni segnale fluorescente e il significato del segnale.

Materiali diconsumo

supportati

Il sistema StepOne supporta i materiali di consumo elencati qui di seguito. È possibile utilizzare tali materiali di consumo sia con i reagenti/protocolli standard sia con quelli veloci.

Materiale di consumo Numero di catalogo

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film

• 4375816• 4375323

• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips

• 4358293• 4323032

• MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps • 4358297

• MicroAmp™ Fast 48-Well Trays• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor• MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base

• 4375282• 4375284• 4312063

G

A

C

D

A

C

F

B

C

# Materiale di consumo

A MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

B MicroAmp™ Fast 48-Well Tray

C MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base

D MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

E MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip

F MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps

G MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film

E

B



Per ulterioriinformazioni

Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce Help (Guida) nel software del sistema Real-Time PCR StepOne™ Applied Biosystems premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure selezionando Help (Guida) StepOne Help (Guida StepOne).

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne™

Flusso di lavorogenerale

Prima dell'esecuzione degli esperimenti sul sistema StepOne, eseguire la preparazione degli esperimenti come segue:

1. Selezionare un tipo di esperimento (pagina 1-5).

2. Selezionare il tipo di reagente (pagina 1-6).

3. Selezionare il tipo di saggio (pagina 1-7).

Informazionicontenute nella

guida:

Questo capitolo fonisce informazioni generali sui tipi di esperimento, i tipi di reagente e i tipi di saggio che è possibile utilizzare con il sistema StepOne.

I capitoli seguenti forniscono informazioni specifiche:

Capitolo Descrizione

Capitolo 2, Descrizione generale dei reagenti

• Descrive e compara i reagenti TaqMan® e SYBR® Green.

• Fornisce informazioni sulla riduzione al minimo della contaminazione di DNA.

Capitolo 3, Esperimenti di quantificazione

• Spiega la modalità di funzionamento del tipo di esperimento.

• Fornisce un flusso di lavoro specifico per il tipo di esperimento.

• Fornisce le linee guida per il disegno per ogni tipo di saggio.

Capitolo 4, Esperimenti di genotipizzazione

Capitolo 5, Esperimenti di presenza/assenza



Selezione del tipo di esperimentoÈ possibile eseguire i seguenti tipi di esperimento sul sistema StepOne:

• Quantificazione, inclusi:– Curva standard– Curva standard relativa– CT comparativo (ΔΔCT)

• Genotipizzazione• Presenza/assenza

Nota: Sul sistema StepOne è inoltre possible eseguire l'analisi della curva di melting.

Esperimenti end-point rispetto aquelli in tempo

reale

È possibile categorizzare i tre tipi di esperimento in esperimenti in tempo reale e end-point, come descritto qui di seguito.

Categoria Proprietà Tipo di esperimento

Tempo reale • Lo strumento monitora gli sviluppi della PCR durante il suo svolgimento.‡

• I dati vengono acquisiti durante lo sviluppo della PCR.

• Le reazioni sono caratterizzate dal punto temporale durante la fase ciclica in cui l'amplificazione di un target viene rilevata la prima volta.§

‡ Kwok and Higuchi, 1989.§ Saiki et al., 1985.

Quantificazione

End-point • I dati vengono acquisiti al termine del processo PCR.

• Le reazioni sono caratterizzate dalla quantità del target accumulata al termine della PCR.§

• Il datapoint rappresenta l'intensità normalizzata del fluorocromo reporter oppure dell'Rn.

Nota: È possibile che alcuni esperimenti end-point includano datapoint pre-PCR. In caso affermativo, il sistema calcola il valore del delta Rn (ΔRn) attraverso la formula seguente:

Rn post-PCR – Rn pre-PCR = ΔRn

Genotipizzazione

Presenza/assenza



Selezione del tipo di reagenteÈ possibile utilizzare i seguenti tipi di reagenti (chimiche) sul sistema Step One:

• Reagenti TaqMan®

• Reagenti SYBR® Green• Altri reagenti fluorescenti

Reagenti TaqMan I reagenti TaqMan includono i saggi TaqMan® (miscele pre-formulate contenenti i set di sonde e primers) e le Master Mix TaqMan®. È possibile utilizzare i reagenti TaqMan per i seguenti tipi di esperimento:

• Quantificazione, inclusi:– Curva standard– Curva standard relativa– CT comparativo (ΔΔCT)


IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA™ come reporter o quencher con il sistema StepOne.

Reagenti SYBRGreen

I reagenti SYBR Green includono primer e Master Mix contenenti il fluorocromo SYBR® Green. È possibile utilizzare i reagenti SYBR Green per gli esperimenti di quantificazione:

• Curva standard• Curva standard relativa• CT comparativo (ΔΔCT)

Nota: Non è possibile eseguire PCR multiplex utilizzando reagenti SYBR Green. Per ulteriori informazioni, vedere “Selezione PCR singleplex o multiplex” a pagina 3-10.

Altri reagenti È possibile utilizzare altri reagenti fluorescenti sul sistema StepOne, ma:

• Il software StepOne calcola automaticamente i volumi di reazione per i reagenti TaqMan e SYBR Green, ma non fa altrettanto per gli altri reagenti.

• È necessario disegnare il proprio esperimento utilizzando il flusso di lavoro dell'impostazione avanzata invece del flusso di lavoro del Design Wizard.



Selezione del tipo di saggioNel software StepOne, è possibile selezionare i seguenti tipi di saggi per esperimenti di quantificazione, presenza assenza e di genotipizzazione:

Esperimenti diquantificazione e

di presenza/assenza

Saggi inventariati/prodotti su ordine

Per gli esperimenti di quantificazione o di presenza/assenza, selezionare il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software StepOne utilizzato:

• Saggi di espressione genica TaqMan®, inventariati – Sonda TaqMan MGB (minor groove binder) marcata con fluorocromo FAM e set di primers pre-disegnati venduti pronti all'uso. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 205 , singola e pre-formulata.

• Saggi di espressione genica TaqMan®, prodotti su ordine – Sonda TaqMan MGB marcata con fluorocromo FAM e set di primers prodotti al momento dell'ordine. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 205, singola e pre-formulata.

• Saggi di espressione genica personalizzati TaqMan® – Sonda TaqMan marcata con fluorocromo FAM e set di primers disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici personalizzati TaqMan® sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20✕ oppure in una provetta 60✕ singola e pre-formulata.

Nota: Per selezionare il tipo di saggio nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Inventoried/Made to Order (Inventariato/Prodotto su ordine) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio).

Tipo di esperimento Tipo di saggio Vedere...

Quantificazione‡

‡ Gli esperimenti di quantificazione includono quelli con curva standard, curva standard relativa e con CT comparativo.

• Inventariati/Prodotti su ordine• Personalizzati

qui di seguito

Presenza/assenza

Genotipizzazione • Pre-disegnati/Convalidati• Personalizzati• Disegnati dall'utente

pagina 1-8



Saggi personalizzati

Per gli esperimenti di quantificazione e di presenza/assenza, selezionare il tipo personalizzato nel software StepOne nel caso sia in atto il disegno dei propri saggi (primer e sonde) con il software Primer Express® e i reagenti TaqMan o SYBR Green. Nel disegno dei propri saggi, seguire le linee guida per il disegno dei saggi Applied Biosystems per l'ottimizzazione dei risultati.


Nota: Per selezionare il tipo di saggio nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Custom (Personalizzato) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio).

Esperimenti digenotipizzazione

Saggi pre-disegnati/Convalidati

Per gli esperimenti di genotipizzazione, il tipo di saggio pre-disegnato/convalidato include:

• Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® – Sonde TaqMan MGB (minor groove binder) marcate con fluorocromi FAM e VIC e set di primers pre-disegnati etichettati con fluorocromo FAM™ e VIC® disponibili in due categorie:– Saggi di genotipizzazione TaqMan® convalidati e codificati SNP,

acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20✕, singola e pre-formulata.

– Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® pre-disegnati, prodotti al momento dell'ordine (Prodotti su ordine). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20✕, singola e pre-formulata.

• Saggi di genotipizzazione TaqMan® per il metabolismo di farmaci –Sonde TaqMan MGB marcate in FAM e in VIC e primers pre-disegnati etichettati con fluorocromo FAM e VIC acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 20✕, singola e pre-formulata.

• Saggi TaqMan® pre-sviluppati per discriminazione allelica (PDAR TaqMan® per AD) – Sonde TaqMan MGB marcate in FAM e in VIC e primers pre-disegnati etichettati con fluorocromo FAM e VIC acquistabili standardizzati (inventariati). L'Assay Mix è disponibile in una provetta 10✕, singola e pre-formulata.

Nota: Per selezionare un saggio SNP nel software StepOne, andare alla schermata SNP Assays (Saggi SNP) nel flusso di lavoro del Design Wizard oppure alla schermata Plate Setup (Imposta piastra) nel flusso di lavoro avanzato. Nella schermata SNP Assays (Saggi SNP) o nella schermata Plate Setup (Imposta piastra), è possibile selezionare un saggio dalla libreria oppure creare un nuovo saggio.




Per gli esperimenti di genotipizzazione, il tipo di saggio personalizzato include i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® personalizzati. I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati sono costituiti da set di sonde TaqMan MGB e primer marcati in FAM e in VIC disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici personalizzati TaqMan® sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. L'Assay Mix è disponibile in una provetta 40✕ oppure in una provetta 80✕ singola e pre-formulata.


Saggi disegnati dall'utente

Per disegnare le proprie sonde e e i primer per saggi SNP, fare riferimento alla guida Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide.





2Descrizione generale dei reagenti 2


Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reagenti TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reagenti SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

Selezione del tipo di reagente appropriato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-8


Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti

Descrizione generaleApplied Biosystems ha sviluppato due tipi di reagenti (chimiche) che è possibile utilizzare per la rilevazione dei prodotti della PCR sul sistema PCR Real-Time StepOne™ Applied Biosystems:

• Reagenti TaqMan® (qui di seguito)• Reagenti SYBR® Green (pagina 2-4)

Reagenti TaqMan®

Tipi diesperimento

I reagenti TaqMan® includono i saggi TaqMan® (miscele pre-formulate contenenti set di sonde e primer) e le Master Mix TaqMan®. I saggi sono specifici per il target di interesse. Le Master Mix contengono i componenti rimanenti necessari per la reazione PCR. È possibile utilizzare i reagenti TaqMan per i seguenti tipi di esperimento:

• Quantificazione, inclusi:

– Curva standard– Curva standard relativa– CT comparativo (ΔΔCT)



Sviluppo deireagenti TaqMan

Inizialmente, venivano utilizzati i fluorocromi intercalanti per misurare i prodotti della PCR in tempo reale. Lo svantaggio principale di questo metodo di rilevamento consiste nel fatto che esso rileva l'accumulo sia dei prodotti specifici sia dei prodotti non specifici della PCR.

I sistemi per PCR in tempo reale sono stati migliorati con l'introduzione di sonde fluorogeniche-marcate che utilizzano l'attività 5′ nucleasica della Taq DNA polimerasi. La disponibilità di tali sonde fluorogeniche ha reso possibile lo sviluppo di un metodo in tempo reale per il rilevamento dei soli prodotti specifici di amplificazione.

Come agiscono ireagenti TaqMan

I reagenti TaqMan utilizzano una sonda fluorogenica per il rilevamento di uno specifico prodotto della PCR accumulatosi durante la PCR. Questo è il modo in cui essa agisce:

1. Viene costruita una sonda oligonucleotidica con un fluorocromo reporter fluorescente legato all'estremità 5′ e un quencher sulla estremità 3′. Quando la sonda è intatta, la vicinanza del quencher riduce fortemente la fluorescenza emessa dal fluorocromo reporter mediante il trasferimento spaziale dell'energia di risonanza di fluorescenza (FRET; Förster resonance, Förster, V. T. 1948).



2. Qualora sia presente il target, la sonda esegue un annealing nella zona tra i primer e viene spaccata dall'attività 5′ nucleasica della Taq DNA polimerasi durante l'estensione.

3. Tale scissione della sonda:– Separa il fluorocromo reporter dal quencher, aumentando il segnale del

fluorocromo reporter.– Rimuove la sonda dall'elica del target, consentendo all'estensione del primer

di continuare fino al termine dell'elica del templato. Perciò, l'inclusione della sonda non inibisce il processo della PCR nel complesso.

4. Altre molecole di fluorocromo reporter vengono separate dalle rispettive sonde in ogni ciclo, con un aumento dell'intensità della fluorescenza proporzionale alla quantità di amplicone prodotto. Tanto più alto il numero di copie iniziali di DNA target, tanto prima si osserverà un aumento significativo della fluorescenza.

Figura 2-1 illustra il processo.

Figura 2-1 Come agiscono i reagenti TaqMan

Sonde TaqManMGB

Applied Biosystems raccomanda l'utilizzo generale delle sonde TaqMan® MGB, specialmente quando le sonde convenzionali TaqMan® superano i 30 nucleotidi. Le sonde TaqMan MGB contengono:

• Un fluorocromo reporter alla estremità 5′ – Genera un segnale quando viene separato dall'attività 5′ nucleasica della DNA polimerasi.

• Un quencher non fluorescente (NFQ) alla estremità 3′ – Consente ai sistemi PCR in tempo reale di eseguire la misurazione degli apporti del fluorocromo reporter più precisamente grazie alla non fluorescenza del quencher.

• Un minor groove binder (MGB) alla estremità 3′ – Aumenta la temperatura di melting (Tm) delle sonde senza aumentare la lunghezza della sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), consentendo in tal modo il disegno di sonde più corte. Di conseguenza, le sonde MGB TaqMan presentano una maggiore differenza nei valori della Tm tra le sonde abbinate e non abbinate; differenze maggiori nei valori della Tm forniscono una genotipizzazione accurata.

RQ

RIMOZIONE ELICA

3'3'5'

5'5'

5'

3'

QR

SCISSIONE

3'3'5'

5'5'

5'

3'

RR = REPORTER

Q Q = QUENCHER

POLIMERIZZAZIONE

SONDA3'

3'5'

5'5'

5'

3'

REVERSE PRIMER

FORWARD PRIME

QR

POLIMERIZZAZIONE COMPLETATA

3'

3'5'

5'5'

5'

3'

Fase 1: Un reporter (R) e un quencher (Q) vengono legati alle estremità 5′ e 3′ di una sonda TaqMan®.

Fase 3: Durante ogni ciclo di estensione, la Taq DNA polimerasi separa il fluorocromo reporter dalla sonda.

Fase 4: Una volta separato dal quencher, il fluorocromo reporter emette la caratteristica fluorescenza.

Fase 2: Quando entrambe le etichette sono legate alla sonda, l'emissione del fluorocromo reporter viene attenuata.



Applied Biosystems offre le seguenti sonde TaqMan MGB pre-disegnate con NFQ per l'utilizzo con il sistema StepOne™:


Reagenti SYBR® Green

Tipi diesperimento

I reagenti SYBR® Green includono primer e Master Mix contenenti il fluorocromo SYBR® Green. È possibile utilizzare i reagenti SYBR Green per gli esperimenti di quantificazione:

• Curva standard• Curva standard relativa• CT comparativo (ΔΔCT)

Nota: Non è possibile eseguire PCR multiplex utilizzando reagenti SYBR Green. Per ulteriori informazioni, vedere “Selezione PCR singleplex o multiplex” a pagina 3-10.

Sviluppo deireagenti SYBR

Green

È possibile dividere le piccole molecole che si legano al DNA a doppia elica in due classi: quelle che si intercalano nel DNA e quelle che si legano al minor groove del DNA. Higuchi (Higuchi et al., 1992) ha utilizzato l'intercalante bromuro di etidio per il rilevamento in tempo reale della PCR. L'Hoechst 33258 rappresenta un esempio di fluorocromo che si lega al minor groove la cui fluorescenza aumenta quando esso si lega al DNA a doppia elica (Higuchi et al., 1993).

Senza tener conto del metodo di binding, è necessario che il fluorocromo che si lega al DNA per il rilevamento in tempo reale dei prodotti della PCR presenti almeno le seguenti due caratteristiche:

• Aumento della fluorescenza quando esso si lega al DNA a doppia elica• Assenza di inibizione della PCR

Applied Biosystems ha sviluppato le condizioni che consentono l'utilizzo del fluorocromo SYBR® Green I nella PCR in assenza di inibizione della PCR e con una sensibilità di rilevamento aumentata in confronto al bromuro di etidio.

Etichetta fluorocromo 5' Etichetta fluorocromo 3'

Altre caratteristiche

Saggi TaqMan® (sonda MGB TaqMan®)

Espressione genica Fluorocromo FAM™ NFQ MGB

Genotipizzazione SNP Fluorocromi FAM™ e VIC® NFQ MGB

Saggi personalizzati TaqMan® (sonda MGB TaqMan® )

Espressione genica Fluorocromo FAM™ NFQ MGB

Genotipizzazione SNP Fluorocromi FAM™ e VIC® NFQ MGB

Sonde personalizzate Sonda MGB personalizzata TaqMan®

Fluorocromo FAM™, TET™, NED™ o VIC®

NFQ MGB



Come agiscono ireagenti SYBR

Green

I reagenti SYBR Green utilizzano il fluorocromo SYBR Green I per il rilevamento dei prodotti della PCR attraverso il legame al DNA a doppia elica durante la PCR. Questo è il modo in cui essa agisce:

1. Quando la Master Mix PCR SYBR® Green viene aggiunta a un campione, il fluorocromo SYBR Green I si lega immediatamente a tutti i DNA a doppia elica.

2. Durante la PCR, la DNA polimerasi AmpliTaq Gold® amplifica il target, creando il prodotto della PCR, o “amplicone.”

3. Il fluorocromo SYBR Green I quindi si lega ad ogni nuova copia di DNA a doppia elica.

4. Con il progredire della PCR, viene creata una maggiore quantità di amplicone.Poichè il fluorocromo SYBR Green I si lega a tutto il DNA a doppia elica, si ottiene un aumento di intensità della fluorescenza proporzionale alla quantità di prodotto della PCR a doppia elica che viene prodotto.

Figure 2-2 qui di seguito si illustra il processo.

Figura 2-2 Come agiscono i reagenti SYBR Green

FORWARDPRIMER

REVERSEPRIMER

Fase 1: Impostazione reazioneIl colorante SYBR® Green 1 dà luogo a fluorescenza quando si lega al DNA a doppia elica.

Fase 2: DenaturazioneQuando il DNA viene denaturato, il fluorocromo SYBR® Green 1 viene rilasciato e la fluorescenza drasticamente ridotta.

Fase 3: PolimerizzazioneDurante l'estensione, i primer si legano al DNA e viene generato il prodotto della PCR.

Fase 4: Polimerizzazione completataIl colorante SYBR® Green 1 si lega al prodotto a doppia elica, con un netto aumento della fluorescenza rilevata dallo strumento.



Selezione del tipo di reagente appropriatoÈ possibile utilizzare i reagenti TaqMan e SYBR Green per i tipi di esperimento elencati qui di seguito.

Tipo di esperimento

Tipo di reagente Quantificazione‡ (Capitolo 3)

‡ Include gli esperimenti con curva standard, con curva standard relativa e con CT comparativo.

Genotipizzazione (Capitolo 4)

Presenza/ Assenza

(Capitolo 5)

Reagenti SYBR® Green Sì Non raccomandato

Non raccomandato

Reagenti TaqMan® Sì Sì Sì



Considerazioniper gli

esperimenti diquantificazione

È possibile eseguire gli esperimenti di quantificazione sia con reagenti TaqMan sia con reagenti SYBR Green Nella scelta tra due tipi di reagenti considerare che:


Tipo di reagente Processo

Reagenti o kit TaqMan®

Descrizione

I reagenti TaqMan utilizzano una sonda fluorogenica per l'abilitazione al rilevamento di uno specifico prodotto della PCR accumulatosi durante i cicli PCR.

Vantaggi

• Con una sonda aumenta la specificità. L'ibridazione specifica tra la sonda e il target genera il segnale di fluorescenza.

• Rende possibili le multiplex.• Sono disponibili saggi pre-formulati,

ottimizzati per l'utilizzo sotto condizioni universali di ciclo termico.

• È possibile utlilizzarli sia nella RT-PCR in 1 fase sia nella RT-PCR in 2 fasi.

Limitazioni

Richiede la sintesi di una sonda unica


Descrizione

I reagenti SYBR Green utilizzano il fluorocromo SYBR® Green I, un fluorocromo legante il DNA a doppia elica, per il rilevamento dei prodotti della PCR accumulatisi durante i cicli PCR.

Vantaggi

• Economico (non è necessaria alcuna sonda).

• Consente la misurazione della Tm di tutti i prodotti della PCR per l'analisi della curva di melting.

• È possibile utlilizzarlo sia nella RT-PCR in 1 fase sia nella RT-PCR in 2 fasi.

Limitazioni

Si fissa non specificamente alle sequenze di DNA a doppia elica. Per prevenire falsi segnali positivi, verificare la formazione di un prodotto non specifico utilizzando la curva di melting oppure l'analisi del gel.

b. Templato denaturato e annealing dei componenti del saggio

Forward primer

Reverse primer

Q

MGB

F

LEGENDA

Random Primer

Colorante FAM™

Quencher

Minor GrooveBinder

AmpliTaq Gold®DNA Polymerase

Sonda

Primer

Templato

Primer esteso

RP

5' 3'

a. Componenti del saggio

Templato di cDNA

Forward primer

Reverse primer Sonda

Q

MGB

F

Sonda

Q

MGB

F

5' 3'

PCR e rilevamento di cDNA

cDNA

5' 3'

5' 3'

c. Generazione del segnale

Reverse primer

F Forward primer

5' 3'

3' 5'

5' 3'

MGB

Q

FORWARDPRIMER

REVERSEPRIMER

Fase 1: Impostazione reazioneIl colorante SYBR® Green 1 dà luogo a fluorescenza quando si lega al DNA a doppia elica.

Fase 2: DenaturazioneQuando il DNA viene denaturato, il fluorocromo SYBR® Green 1 viene rilasciato e la fluorescenza drasticamente ridotta.

Fase 3: PolimerizzazioneDurante l'estensione, i primer si legano al DNA e viene generato il prodotto della PCR.

Fase 4: Polimerizzazione completataIl colorante SYBR® Green 1 si lega al prodotto a doppia elica, con un netto aumento della fluorescenza rilevata dallo strumento.



Riduzione al minimo delle contaminazione da DNALa capacità di amplificazione del DNA del processo PCR rende necessarie prassi speciali di laboratorio quando vengono eseguiti esperimenti utilizzando reagenti TaqMan o SYBR Green. La contaminazione potenziale può essere introdotta per mezzo di campioni con alte concentrazioni di DNA, sia da controlli del templato DNA sia dal carryover PCR.

Inoltre, a causa della natura non specifica del fluorocromo SYBR Green I, verrà rilevato eventuale DNA a doppia elica. Nell'utilizzo dei reagenti SYBR Green, verificare la formazione di prodotto non specifico utilizzando la curva di melting o l'analisi del gel. Prevenire la contaminazione con DNA target. I saggi di espressione genica che rilevano le giunzioni esone-esone riducono al minimo l'effetto delle contaminazioni da gDNA (DNA genomico).

Utilizzo dell'UNGper la riduzione al

minimo dellariamplificazionedei prodotti da

carryover

L'AmpErase® uracil-N-glycosylase (UNG) è un enzima ricombinante di 26-kDa codificato dal gene dell'uracil-N-glycosylase di Escherichia coli . Questo gene è stato inserito in un host E. coli per dirigere l'espressione della forma nativa dell'enzima (Kwok and Higuchi, 1989).

L'UNG agisce su DNA a singola o a doppia elica contenente dU.. Esso agisce idrolizzando i legami uracil-glycosidic in aree di DNA contenenti dU. L'enzima provoca il rilascio di uracile, creando in tal modo una area apyrimidic alcalino-sensibile nel DNA. L'enzima non presenta attività su RNA o DNA contenente dT (Longo et al., 1990).

Saggi TaqMan

Per i saggi TaqMan®, il trattamento con AmpErase® UNG può prevenire la riamplificazione di prodotti PCR da carryover provenienti da precedenti reazioni. Quando dUTP sostituisce dTTP nell'amplificazione PCR, il trattamento con AmpErase UNG può rimuovere fino a 200.000 copie di amplicone per 50-μl di reazione.

Nota: La TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix è disponibile con o senza AmpErase UNG. Nel caso si utilizzi la TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG, è necessario acquistare l'AmpErase UNG separatamente.

Saggi con fluorocromo SYBR Green I

Per i saggi con fluorocromo SYBR Green I, il trattamento con AmpErase UNG può prevenire la riamplificazione di prodotti PCR da carryover provenienti da precedenti reazioni PCR. Anche se la Master Mix Power SYBR® Green PCR e la Master Mix SYBR® Green PCR non contengono AmpErase UNG, esse contengono dUTP e sono perciò compatibili con AmpErase UNG. Nel caso si sospetti una contaminazione da carryover PCR, utilizzare AmpErase UNG per risolvere il problema.

Nota: È possibile acquistare AmpErase UNG individualmente o come parte del kit SYBR® Green PCR Core Reagents kit.



Prassi generaliPCR

Utilizzare le seguenti precauzioni per ridurre al minimo la contaminazione del campione e il carryover dei prodotti della PCR.

• Nella preparazione dei campioni per l'amplificazione PCR indossare un camice da laboratorio pulito (non utilizzato precedentemente nella manipolazione di prodotti della PCR amplificati oppure durante la preparazione del campione). Sostituire i guanti nel caso se ne sospetti la contaminazione.

• Mantenere aree separate, attrezzatura dedicata e forniture per:– Preparazione dei campioni. – Impostazione PCR. Non portare mai i prodotti della PCR amplificati

nell'area impostazione PCR.– Amplificazione PCR. – Analisi dei prodotti della PCR.

• Aprire e chiudere tutte le provette dei campioni con cautela. Evitare di spruzzare o di schizzare i campioni PCR.

• Utilizzare pipettatori positive-displacement o air-displacement con puntali con- filtro. Sostituire i puntali dopo ogni utilizzo.

• Mantenere le reazioni e i componenti tappati il più possibile.• Pulire i banchi da laboratorio e le attrezzature periodicamente con una soluzione

di candeggina al 10% o di etanolo al 70%.




3Esperimenti di quantificazione 3


Sezione 3.1 Informazioni sugli esperimenti di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

Sezione 3.2 Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17





Sezione 3.1 Informazioni sugli esperimenti di quantificazione

Questa sezione comprende i paragrafi:


Selezione di un metodo di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

Selezione della RT-PCR one-step o two-step . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8

Selezione PCR singleplex o multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Selezione del tipo di saggio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13



Descrizione generale

Che cos'è unesperimento di

quantificazione?

Un esperimento di quantificazione consiste in un esperimento in tempo reale che misura la quantità di una sequenza di acido nucleico target (target) durante ogni ciclo di amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR). Il target può essere DNA, cDNA o RNA.

In questa guida vengono discussi tre tipi di esperimenti di quantificazione:

• Curva standard (pagina 3-5)• Curva standard relativa (pagina 3-5)• CT comparativo (ΔΔCT) (pagina 3-6)

Come si svolgonogli esperimenti di

quantificazione

Negli esperimenti di quantificazione in tempo reale, le reazioni sono caratterizzate dal punto temporale durante la fase ciclica in cui l'amplificazione di un prodotto PCR raggiunge un livello fisso di fluorescenza, piuttosto che dalla quantità finale di prodotto della PCR accumulato dopo un numero fisso di cicli. Un plot di amplificazione visualizza graficamente la fluorescenza rilevata nel numero di cicli eseguiti.

Nei cicli iniziali della PCR, non si verifica alcuna modifica significativa nel segnale di fluorescenza. Tale range pre-definito di cicli PCR è chiamato linea di base. Innanzitutto, il software genera un plot di amplificazione sottratto della linea di base attraverso il calcolo della tendenza matematica del segnale del reporter fluorescente normalizzato (valori Rn corrispondenti ai cicli della linea di base). Successivamente, un algoritmo ricerca il punto nel plot di amplificazione nel quale il segnale del reporter fluorescente normalizzato corretto con la linea di base (valore delta Rn [ΔRn]) interseca la soglia. Il ciclo frazionario nel quale il valore ΔRn interseca la soglia viene definito CT.

Flusso di lavoro Prima dell'esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema PCR Real-Time StepOne™ Applied Biosystems, prepararsi per l'esperimento come segue:

1. Selezionare un metodo di quantificazione (pagina 3-5).

2. Selezionare la RT-PCR in 1 fase o in 2 fasi (pagina 3-8).

3. Selezionare reazioni PCR singleplex o multiplex (pagina 3-10).

4. Selezionare il tipo di reagente (pagina 3-13).

5. Selezionare il tipo di saggio (pagina 3-13).

6. Rivedere le linee guida per il tipo di saggio selezionato (Sezione 3.2 a pagina 3-17).



Selezione di un metodo di quantificazione

Informazioni sugliesperimenti concurva standard

Gli esperimenti con curva standard determinano la quantità assoluta di un target in un campione. Per l'ottenimento dei risultati viene utilizzata una curva standard costruita da una serie di diluizioni di una quantità nota.

Componenti

Le reazioni PCR per gli esperimenti con curva standard includono i seguenti componenti:

• Campione – Il campione nel quale la quantità del target è non nota.

• Standard – Un campione dalla quantità nota.

• Serie di diluizioni standard – Un set di diluizioni dello standard (ad esempio, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) utilizzate per la costruzione di una curva standard.

• Replicati – Reazioni identiche contenenti componenti e volumi identici.

• Controlli negativi – Campioni contenenti acqua o buffer invece del templato; conosciuti anche come no template controls (controlli assenza templato) (NTC). I controlli negativi non devono amplificarsi.

Informazioni sugliesperimenti concurva standard

relativa

Gli esperimenti con curva standard relativa determinano la modifica di espressione di un target in un campione rispetto allo stesso target in un campione di riferimento. Per l'ottenimento dei risultati viene utilizzata una curva standard costruita da una serie di diluizioni di una quantità nota.

Gli esperimenti con curva standard relativa vengono utilizzati comunemente per:

• Comparare i livelli di espressione di un gene in tessuti differenti.

• Comparare i livelli di espressione di un gene in un campione trattato rispetto ad uno non trattato.

• Comparare i livelli di espressione di alleli wild-type rispetto ad alleli mutati.

Componenti

Le reazioni PCR per gli esperimenti con curva standard relativa includono i seguenti componenti:


• Campione di riferimento – Il campione utilizzato come base per i risultati comparativi. Ad esempio, in uno studio sugli effetti dei farmaci sull'espressione genica, un controllo non trattato costituisce un campione di riferimento appropriato.

• Standard – Un campione dalla quantità nota.



• Serie di diluizioni standard – Un set di diluizioni dello standard (ad esempio, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) utilizzate per la costruzione di una curva standard. Per tutti i campioni, la quantità target viene determinata per interpolazione dalla curva standard e successivamente dividendo per la quantità target del campione di riferimento. Poiché il campione di riferimento è il campione 1✕, tutte le altre quantità vengono espresse come n-volte la differenza relativa ad esso. Inoltre, l'unità dalla curva standard viene cancellata poiché la quantità del campione viene divisa per la quantità del campione di riferimento. Di conseguenza, ciò che si richiede degli standard è che siano note le diluizioni relative di essi. È possibile utilizzare qualunque stock di cDNA, RNA o DNA contenente il target appropriato per la preparazione degli standard.

• Controllo endogeno – Un gene presente in tutti i campioni a un livello di espressione consistente. Il controllo endogeno viene utilizzato per normalizzare possibili variazioni nella quantità di cDNA aggiunta ad ogni reazione derivanti da inaccuratezza nel pipettaggio.



Informazioni sugliesperimenti conCT comparativo

Gli esperimenti con CT (ΔΔCT) comparativo determinano la modifica di espressione di un target in un campione relativa allo stesso target in un campione di riferimento. Per l'ottenimento dei risultati vengono utilizzate formule aritmetiche (vedere “Formula per esperimenti con CT comparativo (ΔΔCT)” a pagina A-1).

Gli esperimenti con CT comparativo vengono comunemente utilizzati per:

• Comparare i livelli di espressione di un gene in tessuti differenti.

• Comparare i livelli di espressione di un gene in un campione trattato rispetto ad uno non trattato.

• Comparare i livelli di espressione di alleli wild-type rispetto ad alleli mutati.

Componenti

Le reazioni PCR per gli esperimenti con CT comparativo includono i seguenti componenti:


• Campione di riferimento – Il campione utilizzato come base per i risultati comparativi. Ad esempio, in uno studio sugli effetti dei farmaci sull'espressione genica, un controllo non trattato costituisce un campione di riferimento appropriato.

• Controllo endogeno – Un gene presente in tutti i campioni a un livello di espressione consistente. Il controllo endogeno viene utilizzato per normalizzare possibili variazioni nella quantità di cDNA aggiunta ad ogni reazione derivanti da inaccuratezza nel pipettaggio.





Confronto deimetodi di

quantificazione

Nella scelta tra esperimenti con curva standard, curva standard relativa e esperimenti con CT comparativo, tenere in considerazione:


Per ulteriori informazioni sui metodi di quantificazione, fare riferimento al User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Tipo di esperimento Descrizione Vantaggio Limitazione

Curva standard Utilizzare una curva standard per determinare la quantità assoluta di target in un campione. Utilizzata tipicamente per la quantificazione della carica virale.

Consente il confronto con quantità standard note.

È necessario costruire una curva standard per ogni target e questo richiede una quantità maggiore di reagenti e di spazio nella piastra di reazione.

Curva standard relativa

Utilizzare una curva standard per determinare la modifica di espressione di un target in un campione relativa allo stesso target in un campione di riferimento. Metodo migliore per quei saggi che hanno efficienza di PCR sub-ottimale.

Richiede la una minima validazione poiché non è necessario che le efficienze PCR del target e del controllo endogeno siano equivalenti.

È necessario costruire una curva standard per ogni target e questo richiede una quantità maggiore di reagenti e di spazio nella piastra di reazione.

CT comparativo (ΔΔCT)

Utilizzare formule aritmetiche per determinare la modifica di espressione di un target in un campione rispetto allo stesso target in un campione di riferimento. I migliori risultati si ottengono per misurazioni di massa dell'espressione genica di molti geni in molti campioni.

• È possibile determinare i livelli relativi di target nei campioni senza l'utilizzo di una curva standard, assunto che le efficienze del target e del controllo endogeno siano relativamente equivalenti.

• Utilizzo del reagente ridotto.• Maggiore spazio disponibile

nella piastra di reazione.

• Saggi sub-ottimali (bassa efficienza PCR) possono produrre risultati inaccurati.

• Prima dell'utilizzo del metodo con CT comparativo, Applied Biosystems raccomanda che venga determinato che l'efficienza PCR per il saggio target sia approssimativamente uguale a quella del saggio controllo endogeno.



Selezione della RT-PCR one-step o two-stepViene utilizzata la trascrizione inversa-reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) per la quantificazione dell'RNA. La RT-PCR può essere eseguita come procedura in 1 fase o in 2 fasi.

Informazioni sullaRT-PCR in 1 fase

Nella RT-PCR in 1 fase, la trascrizione inversa e la PCR vengono eseguite in un singolo sistema buffer (Figura 3-1). La reazione procede senza aggiunta di reagenti tra le fasi RT e PCR. La RT-PCR in 1 fase offre la convenienza di una preparazione a provetta singola per l'amplificazione RT e PCR. Comunque, non è possibile utilizzare l'enzima di prevenzione da carryover, AmpErase® uracil-N-glycosylase (UNG), con una RT-PCR in 1 fase. Nella RT-PCR in 1 fase, la presenza dell'UNG distruggerebbe il cDNA appena prodotto. Per informazioni sull'UNG, vedere “Utilizzo dell'UNG per la riduzione al minimo della riamplificazione dei prodotti da carryover” a pagina 2-8.

Figura 3-1 Rappresentazione schematica di RT-PCR in 1 fase

Informazioni sullaRT-PCR in 2 fasi

L'RT-PCR in 2 fasi viene eseguita in due reazioni separate: una per l'RT e una per la PCR (Figura 3-2). L'RT-PCR in 2 fasi è utile per il rilevamento di trascitti multipli da una singola reazione cDNA oppure per la conservazione di cDNA per un utilizzo successivo. Nell'esecuzione di una PCR utilizzando dUTP come una delle basi, è possibile utilizzare l'enzima AmpErase® UNG per prevenire la contaminazione da carryover. Per informazioni sull'UNG, vedere “Utilizzo dell'UNG per la riduzione al minimo della riamplificazione dei prodotti da carryover” a pagina 2-8.

Provetta singola



Figura 3-2 Rappresentazione schematica di RT-PCR in 2 fasi

Primer utilizzatiper la sintesi del

cDNA

Per la RT-PCR in 1 fase, è possibile utilizzare reverse primer specifici per la sequenza per la sintesi del cDNA.

Per la RT-PCR in 2 fasi, è possibile utilizzare i seguenti primer per la sintesi del cDNA.

• Oligo d(T)16

• Random primer• Reverse primer specifici per la sequenza

La scelta dei primer per la trascrizione inversa può essere effettuata con maggiore efficacia dopo aver valutato sperimentalmente tutti e tre i sistemi di priming. Per sequenze brevi di RNA non contenenti alcun hairpin loop, uno qualunque dei tre sistemi di priming funziona ugualmente bene. Per trascritti di RNA più lunghi o sequenze contenenti hairpin loop, tenere in considerazione le seguenti linee guida:

Provetta 1

Provetta 2 Fase PCR

Oligo d(T) o hexamer random

Primer Linee guida selezione

Oligo d(T)16 • Da utilizzare solo per la retrotrascrizione di mRNA eucariotici e retrovirus con code poly-A

• Evitare lunghi trascritti di mRNA e ampliconi lunghi più di 2 kilobasi a monte della coda di Poly-A

Random primer • Da utilizzare con trascritti inversi lunghi oppure con trascritti inversi contenenti hairpin loop

• Da utilizzare per la trascrizione tutti gli RNA (rRNA, mRNA e tRNA)

Reverse primer specifici per la sequenza

• Da uilizzare unicamente per la trascrizione inversa di contenenti sequenze complementari

• Da utilizzare nella RT-PCR in 1 fase



Confronto deimetodi RT-PCR

Selezione PCR singleplex o multiplexÈ possibile eseguire una reazione PCR utilizzando:

• PCR singleplex – Per esperimenti con curva standard, curva standard relativa e con CT comparativo. Nella PCR singleplex è presente un singolo set di primer nella provetta di reazione o nel pozzetto. È possibile amplificare un solo target o controllo endogeno per reazione.

oppure

• PCR multiplex – Per esperimenti con CT comparativo. Nella PCR multiplex, sono presenti due o più set di primer nella provetta o nel pozzetto di reazione. Ogni set amplifica un target specifico o un controllo endogeno. Tipicamente, una sonda etichettata con fluorocromo FAM™ rileva il target e una sonda etichettata con fluorocromo VIC® rileva il controllo endogeno.IMPORTANTE! Non è possibile utilizzare reagenti SYBR® Green per la PCR multiplex.


PCR multiplexper esperimenti

con CTcomparativo

Allo scopo di eseguire una PCR multiplex per esperimenti con CT comparativo, è necessario:

• Verificare che il controllo endogeno selezionato sia più abbondante (CT più basso) di tutti i target che si sta cercando di quantificare sotto tutte le condizioni.

• Eseguire il saggio di controllo endogeno come un saggio limitato per il primer. È necessario che il saggio di controllo endogeno (per il templato più abbondante) in ogni reazione sia limitato per il primer per evitare la PCR competitiva che potrebbe alterare il CT del templato meno abbondante.

Metodo Primer per la sintesi del cDNA Commenti

RT-PCR in 1 fase

Reverse primer specifico per la sequenza

Richiede miscela di reazione singola.

Non è possibile utilizzare AmpErase® UNG

RT-PCR in 2 fasi

Random esameri Il cDNA può essere conservato per un utilizzo successivo

È possibile utilizzare AmpErase® UNG

Richiede due miscele di reazione.

Oligo d(T)16

Reverse primer specifici per la sequenza

GR2331

Set primer del target

Set primer di controllo endogeno

cDNASingleplex PCR Multiplex PCR

GR2331

Set primer del target

Set primer di controllo endogeno

cDNASingleplex PCR Multiplex PCR



Limitazione primer nella PCR multiplex

Per generare un saggio multiplex accurato, è importante che l'amplificazione di una sola specie non sia dominante sull'altra. In caso contrario, è possibile che l'amplificazione di una specie altamente abbondante impedisca la efficiente amplificazione della specie meno abbondante.

In caso di mancata amplificazione efficiente della specie meno abbondante, è possibile che l'esperimento produca risultati non accurati oppure, in casi gravi, è possibile che il rilevamento della specie meno abbondante sia completamente inibito. È possibile evitare questa situazione limitando la concentrazione dei primer utilizzati per amplificare la specie più abbondante, “spegnendo” in tal modo l'amplificazione subito dopo che sia stato stabilito il CT. Comunque, è possibile che un saggio limitato per il primer sia più suscettibile a fluttuazioni in condizioni di reazione rispetto al saggio target non limitato per il target di cui è in atto la normalizzazione. Per ulteriori informazioni, vedere Appendice B, “Limitazione dei primer nella PCR multiplex.”

PCR singleplex rispetto a PCR multiplex

La limitazione dei primer nella PCR multiplex diventa progressivamente più complessa con l'aumentare del numero dei target che si desidera quantificare. Quando si analizzano numeri multipli di target, è possibile che sia più efficace l'utilizzo della PCR singleplex per le seguenti ragioni:

• Nella PCR multiplex, è possibile che sia difficile trovare un controllo endogeno adeguato, cioè che:– Sia più abbondante rispetto a tutti i target di cui è in atto la quantificazione.– Non modifichi i livelli di espressione con le condizioni sperimentali o nel

passaggio da un campione all'altro.È necessario prima che vengano eseguiti tutti i saggi target e i saggi controllo endogeno sia nel formato multiplex sia in quello singleplex, quindi comparare i valori CT derivanti da entrambi i formati per determinare se ci siano eventuali effetti relativi all'esecuzione multiplex sui valori CT.

• Nella PCR singleplex, è possibile utilizzare come controllo endogeno qualunque target che non provochi modifiche dei livelli di espressione con le condizioni sperimentali o nel passaggio da un campione all'altro. Quindi, quanti più target siano in formato singleplex, tanto maggiore sarà la probabilità di avere uno o più controlli endogeni adeguati rispetto a quelli per normalizzare i rimanenti target.

Nella scelta tra una PCR multiplex e una PCR singleplex per gli esperimenti con CT comparativo considerare quanto segue:



PCR Descrizione Vantaggio Limitazione

Singleplex Una reazione in cui un target singolo o un controllo endogeno viene amplificato nel pozzetto o nella provetta di reazione.

• Non è richiesta alcuna ottimizzazione per i saggi TaqMan®.

• È possibile utilizzare come controllo endogeno qualunque target che non subisca modifiche dei livelli di espressione con le condizioni sperimentali o nel passaggio da un campione all'altro.

• Flessibilità nell'utilizzo dei reagenti TaqMan® o SYBR® Green.

• Richiede il campione sia per il target sia per il controllo endogeno.

Multiplex Una reazione in cui più di un target o controllo endogeno vengono amplificati nel pozzetto o nella provetta di reazione.

• Riduce sia i costi di esecuzione sia la dipendenza da un accurato pipettaggio quando viene diviso un campione in due provette separate.

• È necessario che il controllo endogeno venga eseguito come un saggio limitato per il primer.

• Richiede validazione e ottimizzazione.

• È possibile che non sia altrettanto efficace quanto una PCR singleplex quando viene analizzato un numero multiplo di target.

• Non è possibile utilizzare reagenti SYBR® Green.



Selezione del tipo di reagente

Reagenti TaqManrispetto ai

reagenti SYBRGreen

È possibile eseguire gli esperimenti di quantificazione sul sistema StepOne con:


• Reagenti SYBR® Green

Per informazioni sulla scelta tra reagenti TaqMan e reagenti SYBR Green, vedere “Considerazioni per gli esperimenti di quantificazione” a pagina 2-7.

Selezione del tipo di saggioPer disegnare i propri esperimenti con il software StepOne, è possibile selezionare i seguenti tipi di saggi per gli esperimenti di quantificazione:

• Inventariati/Prodotti su ordine (pagina 3-14)• Personalizzati (pagina 3-15)

Questa sezione elenca i prodotti disponibili per ogni tipo di saggio.

Nota: I saggi sono specifici per il target di interesse. Le Master Mix contengono i componenti rimanenti necessari per la reazione PCR.



Saggiinventariati/

prodotti su ordine


Per le linee guida sul disegno degli esperimenti con saggi inventariati/prodotti su ordine, vedere pagina 3-18.

Prodotto Attributi

TaqMan® Gene Expression Assays

• Pre-disegnati, set di primer e sonde specifici per gene per geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus.

• Formato conveniente a provetta singola disponibile come saggi inventariati o prodotti su ordine.

TaqMan® Endogenous Control Assays

Nota: I saggi di controllo endogeno TaqMan vengono inclusi come saggi di espressione genica TaqMan inventariati.

• Saggi di controllo endogeno pronti per l'uso, pre-formulati, ottimizzati.

• Quantificazione di espressione genica efficace in termini di costo per uomo, topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila e alcune specie eucariotiche.

• Scelta della marcatura con fluorocromo FAM™ o con fluorocromo VIC® (limitata per i primer).

Custom TaqMan® Gene Expression Assays

• Qualunque specie o organismo.• Target della scelta.• Formato conveniente provetta-singola.

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con o senza AmpErase® UNG)

• Fornisce una prestazione ottimale per i saggi TaqMan® che utilizzano cDNA o DNA come templato.

• Contiene componenti che garantiscono una prestazione eccellente del saggio.

• L'utilizzo di un solo reagente per tutti i saggi semplifica il processo di implementazione del saggio.

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• Fornisce gli stessi attributi elencati sopra per la Master Mix PCR Universal TaqMan® 2✕.

• Consente l'esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema StepOne™ in circa 35 minuti.



Saggipersonalizzati


Per le linee guida sul disegno dei propri esperimenti con saggi personalizzati, vedere pagina 3-22.

Prodotto Attributi

Custom TaqMan® Probes and Primers

• Qualunque specie o organismo.• Scelta di fluorocromo, quencher e scale di sintesi.• Da utilizzare con il software Primer Express® e le linee

guida disegno saggi Applied Biosystems.

Primer Express® Software

Software per il disegno dei primer e delle sonde per la PCR in tempo reale.

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con o senza AmpErase® UNG)





• Fornisce gli stessi attributi elencati sopra per la Master Mix PCR Universal TaqMan® 2✕.

• Consente l'esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema StepOne™ in circa 35 minuti.

Power SYBR® Green PCR Master Mix

• La quantificazione altamente sensibile abilita il rilevamento di un basso numero di copie (due copie di un gene target).

• Rileva il DNA a doppia elica, quindi non sono necessarie sonde specifiche.

• Contiene la DNA polimerasi AmpliTaq Gold® LD per ridurre al minimo la formazione del prodotto non specifico (incluso primer-dimer).

• Da utilizzare con il software Primer Express® e le linee guida disegno saggi Applied Biosystems.

SYBR® Green PCR Master Mix

• Rileva il DNA a doppia elica, quindi non sono necessarie sonde specifiche.

• Per applicazioni standard quando non viene richiesta alta sensibilità.

• Contiene DNA polimerasi AmpliTaq Gold® per ridurre al minimo la formazione del prodotto non specifico (incluso primer-dimer).

• Da utilizzare con il software Primer Express® e le linee guida disegno saggi Applied Biosystems.





Sezione 3.2 Linee guida disegno


Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

Saggi di espressione genica TaqMan®. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21Disegno dell'esperimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Saggi personalizzati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express® . . . . 3-23Selezione dei reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-25Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate . . . . . . . . . . . . . . 3-27Ottimizzazione delle concentrazioni primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30Ottimizzazione della concentrazione della sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-34Per ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-36




Flusso di lavoro Nel caso venga selezionato il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software StepOne™, Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro indicato qui di seguito:

1. Selezionare il saggio:• Saggi di espressione genica TaqMan® (qui di seguito).• Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati (pagina 3-20).

2. Selezionare la Master Mix (pagina 3-21).

3. Disegnare l'esperimento utilizzando il software StepOne (pagina 3-22).

Saggi di espressione genica TaqMan®

Descrizione delprodotto

I saggi di espressione genica TaqMan® costituiscono una collezione completa di set di primer e sonde inventariati e prodotti su ordine che è possibile utilizzare per eseguire esperimenti di quantificazione su geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus.

Ogni saggio viene disegnato utilizzando un disegno automatico e una pipeline a qualità controllata. I saggi inventariati vengono prodotti e collocati nell'inventario; i saggi prodotti su ordine vengono pre-disegnati e prodotti al momento dell'ordine.

Proprietà delprodotto

Tutti i saggi di espressione genica TaqMan:

• Richiedono tre componenti:– Da 1 a 100 ng di campione di cDNA (convertito da RNA) per pozzetto, con

tutti i pozzetti di uno studio che presentano la stessa quantità di cDNA.– 20✕ Assay Mix di espressione genica (specifica per ogni target). Ogni Assay

Mix consiste in due primer PCR non etichettati e in una sonda MGB (minor groove binder) TaqMan® etichettata con fluorocromo FAM™ in una miscela pre-formulata 20✕. 1Le concentrazioni finali ✕ sono 250 nM per la sonda e 900 nM per ogni primer.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix (2✕) (con o senza AmpErase® UNG) oppure TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG.

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con una Master Mix TaqMan®, utilizzando condizioni universali di ciclo termico.

• Richiedono per l'ottenimento dei risultati una sola fase di amplificazione PCR e una lettura simultanea in tempo reale.

• Quando possibile, amplificare il cDNA target senza amplificare il DNA genomico (suffisso m nell'ID del saggio) attraverso il disegno di sonde che attraversano le giunzioni esone-esone.



Saggi disponibili I saggi di espressione genicaTaqMan sono disponibili per geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. I numeri di catalogo sono:

• N. di cat. 4331182 per i saggi inventariati• N. di cat. 4351372 per i saggi prodotti su ordine

Il prefisso del nome del saggio indica le specie per le quali è stato disegnato il saggio: Hs per Homo sapiens (umano), Mm per Mus musculus (topo), Rn per Rattus norvegicus (ratto), At per Arabidopsis thaliana, Dm per Drosophila melanogaster, Ce per C. elegans, Cf per C. familiares (cane), e Rh per Rhesus.

Il suffisso del nome del saggio indica il posizionamento del saggio, come descritto nella tabella qui di seguito.

Saggi di controllo endogeno TaqMan®

I saggi di controllo endogeno TaqMan® vengono inclusi come saggi di espressione genica TaqMan inventariati (N.di cat. 4331182). I saggi di controllo endogeno TaqMan sono:

• Disponibili come un saggio di espressione genica TaqMan con una sonda MGB TaqMan etichettata con fluorocromo FAM™ in una provetta 20✕ singola, preformulata.

• Disponibili per tutte le specie umana, topo e ratto, sia con sonde MGB TaqMan marcate con fluorocromo VIC® sia con sonde marcate con fluorocromo FAM™. I controlli endogeni TaqMan con etichette con fluorocromo VIC sono limitati per i primer.


Suffisso Descrizione

_m La sonda del saggio attraversa una giunzione esonica; il saggio non rileva DNA genomico.

_s I primer e le sonde del saggio vengono disegnate all'interno di un singolo esone; il saggio può rilevare DNA genomico.

_g È possibile che i primer e le sonde del saggio siano all'interno di un singolo esone; il saggio può rilevare DNA genomico.

_mH Il saggio è stato disegnato per un trascritto appartenente a una famiglia di geni con alta omologia di sequenza. Il saggio fornisce una differenza tra 10 CT e 15 CT tra il gene del target e il gene con la omologia di sequenza più vicina. Quindi, il saggio rileva un trascritto del target con discriminazione (sensibilità) maggiore da 1000 a 3000 volte rispetto alla trascrizione omologa più vicina, qualora esse siano presenti nello stesso numero di copie in un campione.

_sH

_gH

_u L'amplicone del saggio attraversa un giunzione esonica e la sonda risiede completamente in uno degli esone formati.




• Per informazioni sui più recenti prodotti disponibili e sugli utilizzi specifici dei prodotti, fare riferimento al sito web Applied Biosystems:

http://www.appliedbiosystems.com/

a. Nella pagina Home, sotto TaqMan® Products (Prodotti TaqMan), selezionare TaqMan® Gene Expression Assays (Saggi di espressione genica TaqMan).

b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e array di espressione genica), sotto Individual Assays (Saggi individuali), selezionare TaqMan® Gene Expression Assays (Saggi di espressione genica TaqMan).

• Per informazioni sui saggi di controllo endogeno TaqMan personalizzati, fare riferimento alla nota applicativa Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di espressione genica TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati


I saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati consistono in set di sonde TaqMan e primer disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici TaqMan® sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. I saggi di espressione genica TaqMan personalizzati consentono l'esecuzione di esperimenti di quantificazione su qualunque gene o variante accoppiata in qualunque organismo.

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare il target in campioni di cDNA. Tutti i saggi vengono sviluppati utilizzando il software di disegno saggi proprietario.


Tutti i saggi di espressione genica TaqMan personalizzati:

• Richiedono la creazione di un submission file (utilizzando software liberi File Builder) con la sequenza target e inoltrare il file all'assistenza saggi genomici TaqMan personalizzati.


tutti i pozzetti di uno studio che presentano la stessa quantità di cDNA.– Saggio di espressione genica 20✕ oppure saggio di espressione genica 60✕

(specifico per ogni target). Ogni saggio consiste in due primer specifici per il target e in una sonda MGB TaqMan etichettata con fluorocromo FAM™ in una miscela pre-formulata 20✕ o 60✕. 1Le concentrazioni finali ✕ sono 250 nM per la sonda e 900 nM per ogni primer.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix (2✕) (con o senza AmpErase® UNG) oppure TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con una Master Mix TaqMan, utilizzando condizioni universali di ciclo termico.

• Richiedono per l'ottenimento dei risultati una sola fase di amplificazione PCR e una lettura simultanea in tempo reale.








b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e array di espressione genica), sotto Individual Assays (Saggi individuali), selezionare Custom TaqMan® Gene Expression Assays (Saggi di espressione genica TaqMan personalizzati).

• Per informazioni sull'ordine di saggi di espressione genica TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Linee guida submission.

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di espressione genica TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

Selezione della Master Mix

Master Mixdisponibili

I saggi inventariati/prodotti su ordine per gli esperimenti di quantificazione Applied Biosystems vengono disegnati per l'utilizzo con le seguenti Master Mix TaqMan®:


Per informazioni sull'utilizzo dei reagenti TaqMan, fare riferimento a:

• Protocollo TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol

• Protocollo TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol

Master Mix Numero di catalogo

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG, 250 reazioni

4352042

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reazioni 4304437


10-Pack, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix 4305719

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 200 reazioni

4324018


4326614

10-Pack, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG

4324020




Disegno dell'esperimento

Utilizzo delsoftwareStepOne

Per i saggi inventariati/prodotti su ordine Applied Biosystems, utilizzare il software StepOne per il disegno dei propri esperimenti di quantificazione. Il software StepOne calcola automaticamente i volumi per:

• Componenti miscela di reazione• Diluizioni del campione• Serie di diluizioni standard (Solo per esperimenti con curva standard e curva

standard relativa)

Nota: Per selezionare il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Inventoried/Made to Order (Inventariato/Prodotto su ordine) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio).


Per informazioni sul disegno e sulla esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema StepOne, fare riferimento a:

• Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System per gli esperimenti con curva standard

• Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System per gli esperimenti con curva standard relativa e CT comparativo


Flusso di lavoro Nel caso venga selezionato il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne™ per un esperimento di quantizzazione (il disegno dei propri primer e delle proprie sonde), Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro per le linee guida disegno saggi Applied Biosystems:

1. Disegnare i primer e le sonde utilizzando il software Primer Express® (qui di seguito).

2. Selezionare i reagenti appropriati (pagina 3-25).


3. Utilizzare le condizioni di ciclo termico raccomandate (pagina 3-27).



4. Iniziare con le concentrazioni dei primer e delle sonde predefinite. Se necessario, ottimizzare le concentrazioni dei primer (pagina 3-30) e le concentrazioni delle sonde (pagina 3-34).

IMPORTANTE! Questi passaggi forniscono un sistema rapido e attendibile per il disegno e l'ottimizzazione dei saggi solo quando utilizzati nella loro interezza. Adottare il sistema nella sua globalità per ottenere il più alto livello di successo. Per una descrizione più dettagliata delle linee guida per il disegno di saggi Applied Biosystems, vedere Appendice C.

Nota: Per selezionare il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Custom (Personalizzato) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio).

Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express®

Il software Primer Express® utilizza i parametri raccomandati per la selezione di sonde e primer sulla base della sequenza DNA fornita.

Nel caso sia in atto il disegno del proprio saggio, attenersi al riepilogo delle linee guida per il disegno del primer e della sonda per gli esperimenti di quantificazione a pagina 3-25. Per una discussione dettagliata di queste linee guida vedere “Informazioni sulle linee guida disegno primer e sonda.” a pagina 3-24.


Nota: Sebbene non sia richiesta alcuna sonda per il rilevamento del fluorocromo SYBR® Green I, è preferibile utilizzare il software Primer Express per la selezione di due primers e di una sonda nel disegno di un saggio per i reagenti SYBR® Green. Anche se non sarà utilizzata alcuna sonda, i primer dovranno rispettare tutti i criteri richiesti; se è necessario convertire i saggi in reagenti TaqMan per ottenere maggiore specificità, è possibile trovare immediatamente la sonda nel documento originale del software Primer Express.

Selezione diun'area

dell'ampliconeper i saggi di

quantificazione

La selezione di una area ottimale per l'amplicone garantisce l'amplificazione del target mRNA/cDNA senza la co-amplificazione della sequenza genomica, di pseudo-geni o altri geni correlati. I reagenti SYBR Green sono utili per individuare le aree dell'amplicone per l'espressione genica.

Linee guida

• L'amplicone dovrebbe attraversare uno o più intron per consentire l'amplificazione del gene target nel DNA genomico.

• La coppia di primer dovrebbe essere specifica per il gene target per evitare l'amplificazione di pseudo-geni o di altri geni correlati.

• Disegnare i primer utilizzando le linee guida del software Primer Express.• Nel caso non fosse trovata una sequenza ottimale, è necessario esaminare la

sequenza e ridisegnare l'amplicone oppure semplicemente individuare altre aree.



Se il gene studiato non presenta intron, non è possibile disegnare un amplicone che amplifichi la sequenza mRNA senza amplificare la sequenza genomica. In tal caso, eseguire un controllo del campione RNA di cui non sia stata eseguita la trascrizione inversa (controlli meno RT).

Informazioni sullelinee guida

disegno primer esonda.

Selezioned di piccoli ampliconi

Un importante parametro predefinito nel software Primer Express è costituito dalla selezione di ampliconi nel range delle coppie di basi 50-150. Gli ampliconi piccoli sono favoriti poiché promuovono una amplificazione ad alta efficienza.

Inoltre, i saggi ad alta efficienza abilitano l'esecuzione della quantificazione relativa utilizzando il metodo con CT comparativo (ΔΔCT) (Livak and Schmittgen, 2001). Questo metodo aumenta la resa del campione eliminando la necessità di curve standard nell'osservazione dei livelli di espressione di un target relativamente a un campione di riferimento.

Contenuto G/C

Quando possibile, selezionare i primer e le sonde in una area con contenuto G/C da 30 a 80%. È possibile che le aree con contenuto G/C >80% non siano sottoposte a denaturazione ottimale durante il ciclo termico, ottenendo così una reazione meno efficiente. Le sequenze ricche di G/C sono suscettibili di interazioni non specifiche che possono ridurre l'efficienza della reazione e produrre un segnale non specifico nei saggi utilizzando reagenti SYBR Green. Evitare sequenze di primer e sonde contenenti stringhe di quattro o più basi G.

Temperatura di melting

Quando vengono selezionati primer e sonde con la temperatura di melting raccomandata (Tm), è possibile utilizzare condizioni di ciclo termico universali. Applied Biosystems raccomanda che la Tm della sonda sia 10 °C più alta di quella dei primer.

Estremità 5′ delle sonde

Il software Primer Express non seleziona sonde con una G sulla estremità 5′. L'effetto quenching di una base G in questa posizione sarà presente anche dopo la scissione della sonda, con ridotti valori di fluorescenza (ΔRn) che possono influenzare la prestazione del saggio. L'occorrenza di avere basi G in posizioni prossime alla estremità 5′, ma non su di essa, non ha mostrato di compromettere la prestazione del saggio.

Estremità 3′ dei primer

Per ridurre la possibilità di formazione di prodotto non specifico, verificare che le ultime cinque basi della estremità 3′ dei primer non contengano più di due basi C e/o G. In alcune circostanze, come una sequenza di template ricca di G/C, è possibile che sia necessario ridurre questa raccomandazione per mantenere l'amplicone sotto le 150 coppie di basi in lunghezza. In generale, evitare le estremità 3′ dei primer estremamente ricche di basi G e/o C.



Riepilogo dellelinee guida per il

disegno di primere sonde MGB

Selezione dei reagenti

Sono disponibili diversi reagenti TaqMan e SYBR Green per gli esperimenti di quantificazione. I reagenti utilizzati dipendono dal target:

• DNA o cDNA (qui di seguito).• RNA utilizzando una RT-PCR in 1 fase (pagina 3-26).• RNA utilizzando una RT-PCR in 2 fasi (pagina 3-26).

Nota: Nel caso si utilizzino reagenti SYBR Green, Applied Biosystems raccomanda fortemente i reagenti Power SYBR Green.

QuantificazioneDNA o cDNA

Linee guida sonde Linee guida primer

Selezionare prima la sonda, quindi disegnare i primer il più possibile vicino alla sonda evitando la sovrapposizione con la sonda (fortemente raccomandati ampliconi con lunghezze comprese tra 50 e 150 paia di basi.

Mantenere il contenuto di G/C nel range da 30 a 80%.

Evitare stringhe di un nucleotide identico, specialmente il guaninico, nel cui caso è da evitare l'esecuzione di quattro o più G.

Nel caso di utilizzo del software Primer Express®, è necessario mantenere la Tm tra 68 e 70 °C.

Nel caso di utilizzo del software Primer Express®, è necessario mantenere la Tm tra 58 e 60 °C.

Assenza G sull'estremità 5′. È necessario che i cinque nucleotidi alla estremità 3′ presentino non più di due basi G e/o C.Rendere le sonde MGB TaqMan® il più

corte possibile ma non più corte di 13 nucleotidi.

Reagente Kit Numero di catalogo

Reagenti TaqMan® TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG, 250 reazioni

4352042

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reazioni

4304437

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000 reazioni

4326708



4324018


4326614


4324020

TaqMan® PCR Core Reagents Kit, 200 reazioni N808-0228



QuantificazioneRNA utilizzando

la RT-PCRin 1 fase


la RT-PCRin 2 fasi


Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL), 40 reazioni

4368577

Power SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL), 200 reazioni

4367659

Power SYBR® Green PCR Master Mix (10 × 5-mL), 2000 reazioni

4368708

Power SYBR® Green PCR Master Mix (50 mL), 2000 reazioni

4367660

SYBR® Green PCR Master Mix (1-mL), 40 reazioni 4344463

SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL), 200 reazioni

4309155

SYBR® Green PCR Master Mix (50-mL), 2000 reazioni

4334973

SYBR® Green PCR Core Reagents, 200 reazioni 4304886



Reagenti TaqMan® TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit

4309169

TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents

Nota: Utilizzare i reagenti TaqMan® EZ RT-PCR Core nel caso in cui sia necessaria una fase RT ad alta temperatura.

N808-0236


Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit 4368711

SYBR® Green RT-PCR Reagents 4310179

Reagente Fase Kit Numero di catalogo

Reagenti TaqMan®

Solo fase PCR TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix

4304437


4352042

Solo fase RT High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

4374966

TaqMan® Reverse Transcription Reagents

N808-234

Sia fase RT sia fase PCR

TaqMan® Gold RT PCR kit N808-232



Informazioni sullaDNA polimerasiAmpliTaq Gold

L'utilizzo della DNA polimerasi hot start AmpliTaq Gold® è parte integrante delle linee guida disegno saggi Applied Biosystems sia per i reagenti TaqMan sia per i reagenti SYBR Green. La DNA polimerasi AmpliTaq Gold garantisce una reazione robusta e può drasticamente ridurre la quantità di prodotto non specifico formatosi. Un ulteriore beneficio è costituito dalla semplificazione dell'impostazione del saggio, che è possibile eseguire a temperatura ambiente.

Nota: La DNA polimerasi inclusa nella Master Mix TaqMan Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase UNG, è in grado di eseguire una PCR hot-start molto veloce. La prestazione è simile a quella della DNA polimerasi AmpliTaq Gold.

Informazioni sullatrascrittasi

inversaMultiScribe

La trascrittasi inversa MultiScribe™ consiste in una trascrittasi inversa di un virus Moloney Murine Leukemia (MuLV) ricombinante che esegue la trascrizione inversa dell'RNA in DNA complementare (cDNA).

Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate

Utilizzare le condizioni di ciclo termico raccomandate per il campione:

• DNA o cDNA (qui di seguito).• RNA utilizzando una RT-PCR in 1 fase (pagina 3-28).• RNA utilizzando una RT-PCR in 2 fasi (pagina 3-29).

Nota: Le condizioni di ciclo termico per i reagenti veloci differiscono dalle condizioni di ciclo termico per i reagenti standard.


Solo fase PCR Power SYBR® Green PCR Master Mix

4367659

SYBR® Green PCR Master Mix 4309155

Solo fase RT High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

4374966

TaqMan® Reverse Transcription Reagents

N808-234

Sia fase RT sia fase PCR

Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit

4368711

SYBR® Green RT-PCR Reagents 4310179

Reagente Fase Kit Numero di catalogo



QuantificazioneDNA o cDNA

Per la Master Mix TaqMan Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase UNG, attenersi alle seguenti condizioni:

Per la Master Mix TaqMan 2✕ Universal PCR e la Master Mix Power SYBR Green PCR, attenersi alle seguenti condizioni:


la RT-PCRin 1 fase

Per la Master Mix TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit oppure Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit, attenersi alle seguenti condizioni:

Nota: Queste condizioni non vengono applicate al kit TaqMan EZ RT-PCR. Vedere il protocollo TaqMan® EZ RT-PCR Kit Protocol per le condizioni appropriate.

Tempi e temperature

Fasi iniziali PCR (40 cicli)

Attivazione‡ AmpErase® UNG

‡ Richiesta solo se viene aggiunta alle reazioni AmpErase® UNG.

Attivazione Melting Annealing/Estensione

ATTESA ATTESA CICLO

2 min a 50 °C 20 sec a 95 °C 3 sec a 95 °C 30 sec a 60 °C

Tempi e Temperature


Attivazione‡ AmpErase® UNG

‡ Richiesta solo se viene aggiunta alle reazioni AmpErase® UNG oppure se essa viene inclusa alla Master Mix.

Attivazione della DNA polimerasi AmpliTaq Gold®

Melting Annealing/Estensione

ATTESA ATTESA CICLO

2 min a 50 °C 10 min a 95 °C 15 sec a 95 °C 1 min a 60 °C

Tempi e Temperature


Trascrizione inversa

Attivazione della DNA polimerasi AmpliTaq Gold®


ATTESA ATTESA 40 CICLI





la RT-PCRin 2 fasi

Per il kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription, attenersi alle seguenti condizioni:

IMPORTANTE! Per la maggior parte delle applicazioni e nel caso siano richieste grandi quantità di cDNA, Applied Biosystems raccomanda 120 minuti a 37 °C per la trascrizione inversa per ottenere una conversione ottimale.

Per la Master Mix TaqMan 2✕ Universal PCR (con AmpErase UNG), oppure Master Mix Power SYBR Green PCR, attenersi alle seguenti condizioni:

Fase Tempi e Temperature

1. Fase RT

Fase 1 Fase 2

ATTESA ATTESA

10 min a 25 °C 120 min a 37 °C

Dopo aver eseguito la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA (fase RT), è possibile conservare i campioni oppure utilizzarli per la fase PCR successiva descritta qui di seguito.


2. Fase PCR


Attivazione AmpErase®

UNG

Attivazione della DNA polimerasi AmpliTaq

Gold®


ATTESA ATTESA CICLO




Per la Master Mix TaqMan Fast Universal PCR (2✕), No AmpErase UNG, attenersi alle seguenti condizioni:

Ottimizzazione delle concentrazioni primer

Variando indipendentemente le concentrazioni del forward primer e del reverse primer, è possibile identificare le concentrazioni che forniscono una prestazione ottimale del saggio. I primer sono sempre in ampio eccesso molare durante la fase esponenziale dell'amplificazione PCR.

Nel caso si utilizzi la Master Mix TaqMan 2✕ Universal PCR, Applied Biosystems raccomanda le concentrazioni dei primer elencate in “Concentrazioni primer predefinite” qui di seguito. Seguono discussioni dettagliate per:

• Matrice ottimizzazione primer (qui di seguito)• Reagenti TaqMan (qui di seguito)• Reagenti SYBR Green (pagina 3-32)

Concentrazioniprimer predefinite

Le concentrazioni dei primer iniziali raccomandate elencate nella tabella qui di seguito sono per saggi di quantificazione DNA e cDNA.


2. Fase PCR


Attivazione‡ AmpErase®

UNG

‡ Richiesta solo se viene aggiunta alle reazioni AmpErase® UNG.

Attivazione della DNA polimerasi AmpliTaq

Gold®


ATTESA ATTESA CICLO

2 min a 50 °C 20 sec a 95 °C 3 sec a 95 °C 30 sec a 60 °C

ReagenteConcentrazioni (nM)

Forward Primer Reverse Primer

Reagenti TaqMan® 900 900

Reagenti SYBR® Green 50 50



Matriceottimizzazione

primer

Una matrice di ottimizzazione primer consente di determinare che la minima concentrazione di primer produce il minimo CT e il massimo ΔRn.

Una matrice di ottimizzazione primer può essere di aiuto nella compensazione del legame non specifico dei prime, con riduzione possibile della quantità del primer disponibile a legarsi alla sua area specifica.

Reagenti TaqMan Per i saggi di quantificazione, è possibile ottenere la prestazione ottimale selezionando le concentrazioni dei primer che forniscono il più basso CT e il più alto ΔRn per una quantità fissata di templato target.

Nota: Sebbene i valori CT costituiscano i parametri sulla base dei quali vengono assegnati i valori quantitativi nei saggi di quantificazione in tempo reale, i valori ΔRn possono essere altrettanto importanti quando si cerca di ottenere la massima sensibilità e riproducibilità.

I risultati di un esperimento tipico della matrice di ottimizzazione primer dei reagenti TaqMan sono mostrati in Figura 3-3 a pagina 3-32:

• LaFigura 3-3a mostra i plot di amplificazione per tutte le combinazioni delle concentrazioni dei primer in una visualizzazione lineare.

• LaFigura 3-3b mostra gli stessi dati nel formato di visualizzazione logaritmica.

La combinazione di forward primer e reverse primer di 50-nM (Plot gruppo C) fornisce sia il più basso ΔRn sia il più alto CT. Tutte le altre combinazioni di primer contenenti una concentrazione di 150-nM sia del forward primer sia del reverse primer (Plot gruppo B) forniscono un ΔRn ridotto. Tutte le combinazioni dei primer contenenti almeno 300-nM di forward primer e reverse primer (Plot gruppo A) forniscono sia il più alto ΔRn sia il più basso CT; come risultato, qualunque dei gruppi dei plot A o B fornisce una prestazione ottimale.



Figura 3-3 Risultati sperimentali di ottimizzazione primer che mostrano i plot di amplificazione (visualizzazioni lineare e logaritmica) delle combinazioni dei primer Chiave gruppo Plot:A: Combinazioni contenenti almeno 300 nM di forward primer e reverse primerB: Combinazioni contenenti almeno 150 nM di forward primer e reverse primerC: Combinazioni contenenti almeno 50 nM di forward primer e reverse primer

Reagenti SYBRGreen

L'ottimizzazione delle concentrazioni di primer è leggermente più complessa per i saggi di quantificazione utilizzando i reagenti SYBR Green. È necessario eseguire la stessa matrice di ottimizzazione primer dei reagenti TaqMan; comunque, è necessario includere i controlli negativi per i reagenti SYBR Green. Le concentrazioni dei primer selezionate forniscono un basso CT e un alto ΔRn quando eseguite rispetto al templato target, ma non danno luogo a formazione di prodotti non specifici con controlli negativi.

a) Visualizzazione lineare

ΔRn

Cycle

} Plot Group A

} Plot Group B

} Plot Group C

ΔRn

Cycle

} Plot Group B} Plot Group A

} Plot Group C

b) Visualizzazione logaritmica

Ciclo


ΔRn

Cycle

} Plot Group A

} Plot Group B

} Plot Group C

ΔRn

Cycle

} Plot Group B} Plot Group A

} Plot Group C


Ciclo

Ciclo



Le curve di melting o l'analisi del gel possono essere estremamente utili nel selezionare le concentrazioni ottimali dei primer per i saggi di quantificazione utilizzando i reagenti SYBR Green. La Figura 3-4 a pagina 3-33 mostra i risultati relativi a una matrice di ottimizzazione dei primer con le concentrazioni primer di 900-nM di forward primer e reverse primer:

• La Figura 3-4a mostra forte amplificazione dei pozzetti di controllo negativo, che indica che è in atto una significativa amplificazione non specifica.

• La Figura 3-4b mostra che la temperatura di melting del prodotto generato in assenza del templato è più bassa della temperatura di melting del prodotto specifico generato con il templato, il che indica che è in atto una significativa amplificazione non secifica.

I risultati mostrati in Figura 3-4 sono tipici della formazione di primer-dimer. Questi risultati indicano che le concentrazioni di primer più basse possono fornire i risultati migliori. Inotre, è possibile ridisegnare un altro set di primer al target di interesse.

Figura 3-4 Dati di amplificazione utilizzando reagenti SYBR® Green (a) Plot di amplificazione (visualizzazione lineare) che dimostra sospetta amplificazione non specifica nei pozzetti di controllo negativo (NC). (b) Analisi della curva di melting che conferma che il prodotto nei pozzetti NC presenta una temperatura di melting diversa dal prodotto specifico.

TargetAmplificazione

Amplificazione target

NC (amplificazione non specifica)

NC (amplificazione non specifica)

a) Plot di amplificazione, visualizzazione lineare

b) Analisi curva di melting

Numero di ciclo

Der

ivat

iva

(Flu

ores

cenz

a no

n el

abor

ata)

Temperatura ( C)



Ottimizzazione della concentrazione della sonda

Per il rilevamento con sonde TaqMan®, la concentrazione sonde raccomandata di 250 nM garantisce una eccellente prestazione del saggio. Comunque, in dipendenza dei requisiti del saggio, un esperimento di ottimizzazione sonde può mostrarsi utile.

Nota: Per il rilevamento del fluorocromo SYBR Green I non è necessaria alcuna sonda.

Concentrazionisonde

raccomandate

Le concetrazioni delle sonde raccomandate per saggi di quantificazione DNA e cDNA utilizzando reagenti TaqMan sono di 250 nM. La Figura 3-5 mostra i risultati di un esperimento di ottimizzazione sonde in cui la concentrazione di sonde viene variata da 50 a 250 nM:

• La Figura 3-5a mostra un aumento del ΔRn con l'aumento della concentrazione delle sonde.

• La Figura 3-5b mostra che il valore CT si modifica con concentrazioni di sonda sufficenti.

Per garantire la migliore riproducibilità, specialmente quando si vogliono rilevare bassi numeri di copie di un target, evitare concentrazioni con limitazione di sonde. Eseguire il saggio con una concentrazione delle sonde di 250 nM. Utilizzando una concentrazione di 250-nM, è possibile evitare la limitazione delle sonde e garantire ampi valori del ΔRn. Ampi valori del ΔRn indicano un saggio robusto in esecuzione con alta efficacia, fornendo alta generazione di prodotti e consentendo una accurata misurazione del picco.



Figura 3-5 Plot di amplificazione (visualizzazioni lineare e logaritmica) della titolazione della concentrazione della sonda da 50 a 250 nM

250 nM Probe

150 nM Probe

100 nM Probe

50 nM Probe

ΔRn

Cycle

250 nM Probe150 nM Probe100 nM Probe50 nM Probe

ΔRn

Cycle



Ciclo

Ciclo



Per ulteriori informazioni

Per informazioni su:

• Utilizzo dei reagenti TaqMan, fare riferimento a:– Protocollo TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol

– Protocollo TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol

• Utilizzo dei reagenti SYBR Green, fare riferimento a:– ProtocolloPower SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol

– ProtocolloSYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol

– ProtocolloSYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol

• Esecuzione degli esperimenti di quantificazione sul sistema StepOne, fare riferimento a:– Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time

PCR System per gli esperimenti con curva standard

– Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System per gli esperimenti con curva standard relativa e CT comparativo

• Esecuzione degli esperimenti di presenza/assenza sul sistema StepOne, fare riferimento alla guida introduttiva Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.


4Esperimenti di genotipizzazione 4


Sezione 4.1 Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . 4-3

Sezione 4.2 Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9





Sezione 4.1 Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione







Che cos'è unesperimento di

genotipizzazione?

Un esperimento di genotipizzazione è un esperimento end-point utilizzato per la determinazione del genotipo di campioni non noti. Con questo tipo di esperimento, è possibile differenziare un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP).

Un esperimento di genotipizzazione determina se i campioni non noti siano:

• Omozigoti (campioni che presentano solo l'allele 1)• Omozigoti (campioni che presentano solo l'allele 2)• Eterozigoti (campioni che presentano sia l'allele 1 sia l'allele 2)

Componenti

Le reazioni PCR per gli esperimenti di genotipizzazione includono i seguenti componenti:

• Campione – Il campione nel quale il genotipo del target è non noto.

• (Opzionale) Replicati – Reazioni identiche contenenti componenti e volumi identici.


• (Opzionale) Controlli positivi – Campioni contenenti genotipi noti (omozigoti per l'allele 1, omozigoti per l'allele 2 e eterozigoti per gli alleli 1 e 2).

Strumenti Gli esperimenti di genotipizzazione richiedono due fasi: ciclo termico (amplificazione PCR) seguito da rilevamento end-point dei segnali end-point risultanti. È possibile eseguire la fase di ciclo termico (amplificazione PCR) sul sistema PCR in tempo reale StepOne™ Applied Biosystems oppure su un termo-ciclatore indipendente.

In caso si utilizzi il sistema StepOne™:

• È possibile analizzare la PCR, con conseguenti vantaggi per la risoluzione di eventuali problemi.

• Eseguire la lettura della piastra end-point separatamente.

Come si svolgonogli esperimenti digenotipizzazione

Negli esperimenti di genotipizzazione, la PCR include una sonda specifica marcata con fluorocromo fluorescente per ogni allele. Le sonde contengono reporter fluorescenti differenti per differenziare ciascun allele.

È possibile utilizzare sonde minor groove binder (MGB) TaqMan® sul sistema StepOne. Ogni sonda MGB TaqMan® contiene:

• Un fluorocromo reporter alla estremità 5′ di ogni sonda– Il fluorocromo VIC® è legato alla estremità 5′ della sonda dell'allele 1– Il fluorocromo FAM™ è legato alla estremità 5′ della sonda dell'allele 2



• Un minor groove binder (MGB)Questa modifica aumenta la temperatura di melting (Tm) delle sonde senza aumentarne la lunghezza (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), consentendo in tal modo il disegno di sonde più corte. Di conseguenza, le sonde MGB TaqMan presentano una maggiore differenza nei valori della Tm tra le sonde appaiate e non appaiate; differenze maggiori nei valori della Tm forniscono una genotipizzazione accurata.

• Un quencher non fluorescente (NFQ) alla estremità 3′ della sonda.A causa della non fluorescenza del quencher, i sistemi PCR in tempo reale riescono a misurare gli apporti dei fluorocromi reporter con maggiore accuratezza.

Durante la PCR, ogni sonda esegue un annealing specificamente alla sua sequenza complementare tra le regioni del forward primer e del reverse primer. La DNA polimerasi AmpliTaq Gold® può degradare unicamente sonde che ibridano alla sequenza dell'allele (abbinamento). La scissione separa il fluorocromo reporter dal fluorocromo quencher, aumentando la fluorescenza del fluorocromo reporter. Perciò, i segnali di fluorescenza generati durante l'amplificazione PCR indicano gli alleli presenti nel campione.

Mismatch tra sonda e sequenze alleliche

I mismatch tra una sonda e l'allele (Figura 4-1) riducono l'efficienza dell'ibridazione della sonda. Inoltre, è probabile che la DNA polimerasi AmpliTaq Gold scalzi la sonda non ibridata piuttosto che degradarla per rilasciare il fluorocromo reporter.

Figura 4-1 Risultati dell'appaiamento e del mancato appaiamento tra le sequenze dell'allele e della sonda negli esperimenti di genotipizzazione.

Allele 1

appaiamento

V

Q

Mancato appaiamento

Mancato appaiamento

QV

FQ

Allele 2

appaiamento

Q

F

Legenda

AmpliTaqGold DNAPolymerase

FluorocromoVIC

FluorocromoFAM

QuencherQ

F

V

GR1556



Tabella 4-1 riepiloga i possibili risultati dell'esempio di esperimento di genotipizzazione mostrato sopra.

Flusso di lavoro Prima dell'esecuzione degli esperimenti di genotipizzazione sul sistema StepOne, prepararsi per l'esperimento come segue:

1. Selezionare il tipo di saggio (qui di seguito).


Selezione del tipo di saggioPer disegnare i propri esperimenti con il software StepOne, è possibile selezionare i seguenti tipi di saggi per gli esperimenti di genotipizzazione.

• Pre-disegnati/Convalidati (qui di seguito)• Personalizzati (pagina 4-7)



Nota: I reagenti TaqMan® Fast e I reagenti SYBR® Green non vengono supportati per gli esperimenti di genotipizzazione.

Tabella 4-1 Risultati esperimento di genotipizzazione

Un aumento sostanziale di… Indica…

Fluorescenza unicamente del fluorocromo VIC®

Omozigosità per l'allele 1.

Fluorescenza unicamente del fluorocromo FAM™

Omozigosità per l'allele 2.

Entrambi i segnali fluorescenti Eterozigosità.



Saggi pre-disegnati/

convalidati

Per le linee guida sul disegno dei propri esperimenti con saggi pre-disegnati/convalidati, vedere pagina 4-10.

Saggipersonalizzati


Prodotto Attributi

TaqMan® SNP Genotyping Assays

• Saggi pre-disegnati per la copertura di marcatori ad alta densità su tutto il genoma.

• Per studi di screening, di associazione, di regioni candidate, di geni candidati o di mappatura fine.

• Formato conveniente provetta-singola.

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays

• Rilevano i polimorfismi in 220 geni che codificano per vari enzimi del metabolismo di farmaci e trasportatori di farmaci.

• Per lo studio dei polimorfismi di un singolo nucleotide (SNP), inserzioni/delezioni (in/del) e polimorfismi multi-nucleotidi (MNP).

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination

• Eseguono la genotipizzazione di campioni di DNA purificati per mutazioni specifiche; la maggior parte dei saggi discriminano tra due alleli dei polimorfismi di un singolo nucleotide (SNP).

• Aggiunto minor groove binder (MGB) per una migliore esecuzione della genotipizzazione.

• Incluso DNA di controllo dell'allele 1 e dell'allele 2 per consentire la generazione di ciascun segnale omozigote in ciascuna esecuzione.

• Il sistema a provetta chiusa non richiede alcuna manipolazione post-PCR o gel.

Master Mix TaqMan® 2✕ Universal PCR (con o senza AmpErase® UNG)




Prodotto Attributi

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays

• Ogni polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP) in qualsiasi organismo.

• Rilevano inserimenti/delezioni (in/dels) di basi fino a numero massimo di sei.

• Rilevano polimorfismi multi-nucleotidi (MNP) di basi fino a numero massimo di sei.

• Formato conveniente provetta-singola.

Master Mix TaqMan® 2✕ Universal PCR (con o senza AmpErase® UNG)










Saggi pre-disegnati/convalidati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

Saggi genotipizzazione SNP TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan®. . . . . . . . . . 4-11Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan® per discriminazione allelica . . . . 4-12Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13Disegno dell'esperimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14


Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . 4-15Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16Disegno dell'esperimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17



Saggi pre-disegnati/convalidati

Flusso di lavoro Nel caso sia in atto il disegno di un esperimento di genotipizzazione utilizzando saggi pre-disegnati/convalidati Applied Biosystems, Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro indicato qui di seguito.

1. Selezionare il saggio:• Saggi genotipizzazione SNP TaqMan® (qui di seguito).• Saggi genotipizzazione metabolismo dei farmaci TaqMan® (pagina 4-11).• Reagenti saggi pre-sviluppati TaqMan® per discriminazione allelica

(pagina 4-12).


3. Disegnare l'esperimento utilizzando il software StepOne™ (pagina 4-14).

Saggi genotipizzazione SNP TaqMan®


I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® consistono in una collezione completa di set di sonde e primer per la genotipizzazione di polimorfismi di un singolo nucleotide (SNP) per studi umani.

I saggi utilizzano reagenti TaqMan® per amplificare e rilevare gli alleli SNP specifici in campioni di DNA genomico purificati. Tutti i saggi vengono disegnati utilizzando software e pipeline bioinformatici Applied Biosystems e le informazioni genomiche provengono da Celera Genomics e da banche dati pubbliche.


Tutti i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan:

• Richiedono tre componenti:– Da 1 a 20 ng di campione di DNA genomico purificato– Assay Mix di genotipizzazione SNP 20✕, 40✕ o 80✕ (specifica per ogni

polimorfismo). Ogni saggio consiste in forward primer e reverse primer specifici per la sequenza per l'amplificazione dell'SNP di interesse e in due sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo VIC® rileva la sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo FAM™ rileva la sequenza dell'allele 2.

– Master Mix TaqMan® 2✕ Universal PCR (con o senza AmpErase® UNG)

Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di ciclo termico.

• Richiedono l'amplificazione PCR e la lettura end-point per l'ottenimento dei risultati.



Saggi disponibili I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan sono disponibili in due categorie:




a. Nella pagina Home, sotto TaqMan® Products (Prodotti TaqMan), selezionare TaqMan® SNP Genotyping Assays (Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan).

b. Nella pagina SNP Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione SNP), sotto Pre-Designed/Validated Assays (Saggi pre-disegnati/convalidati), selezionare TaqMan® SNP Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione SNP TaqMan).

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol.

Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan®


I saggi di genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan® consistono in una collezione completa di set di primer e sonde inventariati per la genotipizzazione SNP, inserimenti e delezioni (in/dels) e polimorfismi multi-nucleotidi (MNP) nei geni correlati al metabolismo di farmaci.

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare i polimorfismi specifici in campioni di DNA genomico purificati. Tutti i saggi vengono disegnati utilizzando software e pipeline bioinformatici Applied Biosystems e le informazioni genomiche provengono da banche dati SNP pubbliche e da assemblies pubblici di genoma.


Tutti i saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan:

• Richiedono tre componenti:– Da 3 a 30 ng di campione di DNA genomico purificato– Assay Mix genotipizzazione del metabolismo di farmaci 20✕ (specifica per

ogni polimorfismo). Ogni saggio consiste in forward primer e reverse primer specifici per la sequenza per l'amplificazione della sequenza polimorfica di interesse e in due sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo VIC rileva la sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo FAM rileva la sequenza dell'allele 2.

Categoria Descrizione

Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® convalidati e codificati

• ~5000 saggi SNP in scala piccola, ~2000 dei quali sono saggi per SNP codificanti.

• Inventariati (mantenuti in inventario per l'acquisto standardizzato).

Saggi di genotipizzazione SNP pre-disegnati TaqMan®

• Più di 4,5 milioni di saggi SNP pre-disegnati, inclusi 3,5 milioni di saggi HapMap e ~68.000 saggi per SNP codificanti.

• Disponibili in scala piccola, media e grande.• Prodotti su ordine (prodotti al momento dell'ordine).




– TaqMan® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase® UNG)• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la Master Mix TaqMan 2✕

Universal PCR (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di ciclo termico.






b. Nella pagina SNP Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione SNP), sotto Pre-Designed/Validated Assays (Saggi pre-disegnati/convalidati), selezionare TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan).

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol.

Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan® per discriminazione allelica


I reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan® per discriminazione allelica (PDAR TaqMan® per DA) consistono in saggi inventariati ottimizzati per la discriminazione di alleli specifici.


I PDAR TaqMan per DA richiedono quattro componenti:

• Da 2 a 20 ng di campione di DNA genomico purificato• Assay Mix di discriminazione allelica 10✕ (specifica per ogni polimorfismo).

Ogni saggio consiste in forward primer e reverse primer specifici per la sequenza per l'amplificazione della sequenza polimorfica di interesse e in due sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo VIC rileva la sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo FAM rileva la sequenza dell'allele 2.

• TaqMan® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase® UNG)

Nota: Viene incluso con ogni saggio il DNA di controllo dell'allele 1 e dell'allele 2 per consentire la generazione di ogni segnale omozigote in ciascuna esecuzione.









b. Nella pagina SNP Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione SNP), sotto Pre-Designed/Validated Assays (Saggi pre-disegnati/convalidati), selezionare TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents for Allelic Discrimination (Reagenti saggi pre-sviluppati TaqMan per discriminazione allelica) (PDAR TaqMan® per AD).

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i PDAR per discriminazione allelica TaqMan, fare riferimento al protocollo Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol.



I saggi pre-disegnati/convalidati per gli esperimenti di genotipizzazione Applied Biosystems vengono disegnati per l'utilizzo con le seguenti Master Mix TaqMan®:

• I PDAR per AD TaqMan contengono TaqMan® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase® UNG)

• È possibile utilizzare i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan e i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati con:

Nota: Gli esperimenti di genotipizzazione non vengono supportati utilizzando Universal Fast PCR Master Mix TaqMan®.


Per informazioni sull'utilizzo di Master Mix TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.






4324018


4326614


4324020





Per i saggi pre-disegnati/convalidati Applied Biosystems, utilizzare il software StepOne per il disegno dei propri esperimenti di genotipizzazione. Il software StepOne calcola automaticamente i volumi per:

• Componenti miscela di reazione• Diluizioni del campione



Per informazioni sul disegno e sull'esecuzione degli esperimenti di genotipizzazione sul sistema StepOne, fare riferimento alla Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione.


Flusso di lavoro Nel caso sia in atto il disegno di un esperimento di genotipizzazione utilizzando saggi personalizzati Applied Biosystems, Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro indicato qui di seguito:

1. Ordine del saggio: Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® personalizzati (qui di seguito).

2. Selezione della Master Mix (pagina 4-16).

3. Disegno dell'esperimento utilizzando il software StepOne (pagina 4-17).



Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® personalizzati


I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® personalizzati consistono in set di sonde TaqMan e primer disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici TaqMan® sulla base delle informazioni di sequenza immesse. I saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati consentono di:

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare i polimorfismi specifici in DNA genomico purificato (gDNA). Tutti i saggi vengono sviluppati utilizzando il software di disegno saggi proprietario.


Tutti i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati:

• Richiedono la creazione di un submission file (utilizzando il software File Builder) con la propria sequenza SNP target e l'inoltro del file all'assistenza saggi genomici TaqMan®.

• Richiedono tre componenti:– Da 1 a 20 ng di campione di gDNA purificato per pozzetto

Nota: È possibile utilizzare campioni di cDNA; comunque, Applied Biosystems non fornisce raccomandazioni allo stato attuale per un utilizzo di cDNA con i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati.

– Saggio di genotipizzazione SNP 40✕ o saggio di genotipizzazione SNP 80✕ (specifico per ogni polimorfismo). Ogni saggio consiste in forward primer e reverse primer specifici per la sequenza per l'amplificazione dell'SNP di interesse e in due sonde MGB TaqMan: Una sonda marcata con fluorocromo VIC rileva la sequenza dell'allele 1; una sonda marcata con fluorocromo FAM rileva la sequenza dell'allele 2.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase® UNG)• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan® Universal PCR

Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di ciclo termico.


Azione Esempio

Eseguire studi di genotipizzazione con eventuali possibili polimorfismi di un singolo nucleotide (SNP) in eventuali organismi

AGTTCATCCATGGTCA --> AGTTCATACATGGTCA

Annotato come: AGTTCAT[C/A]CATGGTCA

Rilevare inserimenti/delezioni (in/dels) di basi fino a numero massimo di sei per studi di genotipizzazione

AGTTCATCCATGGTCA --> AGTTCATGGTCA

Annotato come: AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA

Rilevare polimorfismi multi-nucleotidi (MNP) di basi fino a numero massimo di sei per studi di genotipizzazione

AGTTCATCCGGTCA --> AGTTCATATGGTCA

Annotato come: AGTTCAT[CC/AT]GGTCA







b. Nella pagina SNP Genotyping Assays (Saggi genotipizzazione SNP), sotto Custom Assays (Saggi personalizzati), selezionare Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays (Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati).

• Per informazioni sull'ordine di saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines.

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di genotipizzazione SNP TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol.



I saggi prodotti su ordine per gli esperimenti di genotipizzazione Applied Biosystems vengono disegnati per l'utilizzo con le seguenti Master Mix TaqMan:

Nota: Gli esperimenti di genotipizzazione non vengono supportati utilizzando Master Mix PCR veloci TaqMan®.


Per informazioni sull'utilizzo di Master Mix TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.






4324018


4326614


4324020






Per i saggi personalizzati Applied Biosystems, utilizzare il software StepOne per il disegno dei propri esperimenti di genotipizzazione. Il software StepOne calcola automaticamente i volumi per:

• Componenti miscela di reazione• Diluizioni del campione



Per informazioni sul disegno e sull'esecuzione degli esperimenti di genotipizzazione sul sistema StepOne, fare riferimento alla Guida introduttiva del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System per gli esperimenti di genotipizzazione.




5Esperimenti di presenza/assenza 5


Sezione 5.1 Informazioni sugli esperimenti di presenza/assenza . . . . . . . . . . . . . . 5-3

Sezione 5.2 Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9





Sezione 5.1 Informazioni sugli esperimenti di presenza/assenza







Cos'è unesperimento di

presenza/assenza?

Un esperimento di presenza/assenza consiste in un esperimento end-point che indica la presenza o l'assenza di una specifica sequenza dell'acido nucleico (target) in un campione. La quantità attuale del target non viene determinata.

Gli esperimenti di presenza/assenza vengono comunemente utilizzati per rilevare la presenza o l'assenza di un patogeno, come un patogeno virale o batterico. Ad esempio, è possibile utilizzare un esperimento di presenza/assenza per determinare se batteri Salmonella siano presenti nella carne di un hamburger. I risultati indicheranno se i batteri Salmonella siano presenti o non presenti; la quantità di batteri non viene determinata.

Componenti

Le reazioni PCR per gli esperimenti di presenza/assenza includono i seguenti componenti:

• Campione – Il campione nel quale la presenza di un target è non nota.• Replicati – Reazioni identiche contenenti componenti e volumi identici.

• Controllo positivo interno (IPC) – Un templato di DNA sintetico di piccole dimensioni aggiunto alle reazioni PCR. È possibile utilizzare l'IPC per distinguere tra i risultati negativi e le reazioni influenzate dagli inibitori della PCR, dall'impostazione errata del saggio o da un problema del reagente o dello strumento.

• Pozzetti IPC bloccati a controllo negativo – Pozzetti che contengono agente bloccante IPC invece del campione nella reazione PCR. Nei pozzetti IPC bloccati a controllo negativo non deve verificarsi alcuna reazione di amplificazione in quanto la reazione non contiene alcun campione e l'amplificazione dell'IPC è bloccata.

• Pozzetti IPC a controllo negativo – Pozzetti che contengono templato IPC e buffer o acqua invece del campione nella reazione PCR. Solo il templato IPC dovrebbe amplificarsi nei pozzetti IPC a controllo negativo, in quanto la reazione non contiene campione.

Nota: È possibile eseguire gli esperimenti di presenza/assenza senza un IPC; comunque, l'IPC garantisce che una PCR non riuscita non venga confusa con un risultato negativo di un test.

Rilevazione end-point e lettura

della piastrapost-PCR

Gli esperimenti di presenza/assenza consistono in esperimenti end-point, nei quali i dati di fluorescenza vengono acquisiti dopo il completamento della PCR.

Come assistenza nella risoluzione problemi per gli esperimenti di presenza/assenza, è possibile utilizzare il sistema PCR Real-Time StepOne™ Applied Biosystems per eseguire la PCR in tempo reale. Nel caso venga utilizzato il sistema StepOne™ per l'amplificazione PCR, eseguire le sessioni di lettura pre-PCR e post-PCR separatamente.



Svolgimento degliesperimenti

di presenza/assenza

Durante la PCR, le sonde fluorogeniche eseguono un annealing al target complementare tra le regioni del forward primer e del reverse primer sul DNA del templato. Quindi durante l'estensione, la DNA polimerasi AmpliTaq Gold® degrada le sonde ibridate in ogni campione contenente il target. La degradazione di ogni sonda appaiata separa il fluorocromo reporter dal fluorocromo quencher, con aumento della fluorescenza del reporter.

Dopo la PCR ciclica, lo strumento StepOne™ legge la fluorescenza generata durante l'amplificazione PCR. I segnali fluorescenti vengono utilizzati per il rilevamento della presenza o dell'assenza del target in ogni campione. I segnali reporter vengono normalizzati alla emissione di un riferimento passivo, come segue:

Incorporamento di un IPC

Un IPC è costituito da un secondo set di sonde TaqMan® e primer aggiunto alla piastra di reazione per il rilevamento di acido nucleico costitutivo, a basso numero di copie. L'IPC e il target vengono amplificati simultaneamente nello stesso pozzetto di reazione. Qualora un pozzetto non presenti amplificazione, il software StepOne™ utilizza il segnale positivo proveniente dall'IPC per confermare la mancata amplificazione del pozzetto a causa di una mancanza di templato target, piuttosto che a causa di un errore di pipettaggio o inibizione.


Flusso di lavoro Prima dell'esecuzione degli esperimenti di presenza/assenza sul sistema StepOne, prepararsi per l'esperimento come segue:

1. Selezionare il tipo di saggio (qui di seguito).


Selezione del tipo di saggioPer disegnare i propri esperimenti con il software StepOne, è possibile selezionare i seguenti tipi di saggi per gli esperimenti di presenza/assenza:

• Inventariati/Prodotti su ordine (pagina 5-6)• Personalizzati (pagina 5-7)

Rn (TT) = Intensità di emissione della sequenza del templato

target

Intensità di emissione del riferimento passivo

Rn (IPC) = Intensità di emissione del controllo positivo interno

Intensità di emissione del riferimento passivo





Nota: I reagenti TaqMan® veloci e i reagenti SYBR® Green non vengono supportati per gli esperimenti di presenza/assenza.

Saggiinventariati/

prodotti su ordine


Per le linee guida sul disegno degli esperimenti con saggi inventariati/prodotti su ordine, vedere pagina 5-10.

Prodotto Attributi

TaqMan® Gene Expression Assays

• Pre-disegnati, set di primer e sonde specifici per gene per geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus.

• Formato conveniente a provetta singola disponibile come saggi inventariati o prodotti su ordine.

TaqMan® Endogenous Control Assays

Nota: I saggi di controllo endogeno TaqMan vengono inclusi come saggi di espressione genica TaqMan inventariati.

• Saggi di controllo endogeno pronti per l'uso, pre-formulati, ottimizzati.

• Quantificazione di espressione genica efficace in termini di costo per uomo, topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila e alcune specie eucariotiche.

• Scelta delle etichette con fluorocromo FAM™ o con fluorocromo VIC® (con primer limitanti).

Custom TaqMan® Gene Expression Assays

• Qualunque specie o organismo.• Target della scelta.• Formato conveniente provetta-singola.

TaqMan® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase® UNG)






Saggipersonalizzati



Prodotto Attributi

Custom TaqMan® Probes and Primers

• Alcune specie o organismo.• Scelta delle etichette con fluorocromo, di quencher e scale

di sintesi.• Da utilizzare con il software Primer Express® e le linee

guida disegno saggi Applied Biosystems.

Primer Express® Software

Software per il disegno dei primer e delle sonde per la PCR in tempo reale.

TaqMan® Universal PCR Master Mix 2✕ (con o senza AmpErase® UNG)










Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Saggi di espressione genica TaqMan®. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan®. . . . . . . . . . . . . . 5-13Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14Disegno dell'esperimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15





Flusso di lavoro Nel caso venga selezionato il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software StepOne™, Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro indicato qui di seguito:

1. Selezionare il saggio:• Saggi di espressione genica TaqMan® (qui di seguito).• Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati (pagina 5-12).

2. Utilizzare i reagenti di controllo positivo interno esogeno IPC TaqMan® (pagina 5-13).



4. Disegnare l'esperimento utilizzando il software StepOne (pagina 5-15).

Saggi di espressione genica TaqMan®


I saggi di espressione genica TaqMan® costituiscono una collezione completa di set di primer e sonde inventariati e prodotti su ordine che è possibile utilizzare per eseguire esperimenti di presenza/assenza su geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus.

Ogni saggio viene disegnato utilizzando un disegno automatico e una pipeline a qualità controllata. I saggi inventariati vengono prodotti e collocati nell'inventario; i saggi prodotti su ordine vengono pre-disegnati e prodotti al momento dell'ordine.


Tutti i saggi di espressione genica TaqMan:


tutti i pozzetti di uno studio che presentano la stessa quantità di cDNA.– Assay Mix di espressione genica 20✕ (specifica per ogni target). Ogni Assay

Mix consiste in due primer PCR non etichettati e in una sonda MGB TaqMan® etichettata con fluorocromo FAM™ in una miscela pre-formulata 20✕. Le concentrazioni finali 1✕ sono 250 nM per la sonda e 900 nM per ogni primer.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o senza AmpErase® UNG)• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan® Universal PCR

Master Mix (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di ciclo termico.

• Quando possibile, amplificare il cDNA target senza amplificare il DNA genomico (suffisso m nell'ID del saggio) attraverso il disegno di sonde che attraversano le giunzioni esone-esone.



Saggi disponibili I saggi di espressione genicaTaqMan sono disponibili per geni umani, di topo, ratto, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (cane) e Rhesus. I numeri di catalogo sono:

• N. di cat. 4331182 per i saggi inventariati• N. di cat. 4351372 per i saggi prodotti su ordine

Il prefisso del nome del saggio indica le specie per le quali è stato disegnato il saggio: Hs per Homo sapiens (umano), Mm per Mus musculus (topo), Rn per Rattus norvegicus (ratto), At per Arabidopsis thaliana, Dm per Drosophila melanogaster, Ce per C. elegans, Cf per C. familiares (cane), e Rh per Rhesus.

Il suffisso del nome del saggio indica il posizionamento del saggio, come descritto nella tabella qui di seguito.

Saggi di controllo endogeno TaqMan®

I saggi di controllo endogeno TaqMan® vengono inclusi come saggi di espressione genica TaqMan inventariati (N.di cat. 4331182). I saggi di controllo endogeno TaqMan sono:

• Disponibili come saggi di espressione genica con sonda TaqMan MGB marcata con fluorocromo FAM™ in una provetta 20✕ singola, preformulata.

• Disponibili per tutte le specie umana, topo e ratto, sia con sonde MGB TaqMan marcate con fluorocromo VIC® sia con sonde marcate con fluorocromo FAM™. I controlli endogeni TaqMan con marcati con VIC hanno concentrazioni limitanti di primers.


Suffisso Descrizione

_m La sonda del saggio attraversa una giunzione esonica; il saggio non rileva DNA genomico.

_s I primer e le sonde del saggio vengono disegnate all'interno di un singolo esone; il saggio può rilevare DNA genomico.

_g È possibile che i primer e le sonde del saggio siano all'interno di un singolo esone; il saggio può rilevare DNA genomico.

_mH Il saggio è stato disegnato a una trascrizione appartenente a una famiglia di geni con alta omologia di sequenza. Il saggio fornisce una differenza tra 10 CT e 15 CT tra il gene del target e il gene con la omologia di sequenza più vicina. Quindi, il saggio rileva la trascrizione del target con discriminazione (sensibilità) maggiore da 1000 a 3000 volte rispetto al trascritto omologa più vicina, qualora esse siano presenti nello stesso numero di copie in un campione.

_sH

_gH

_u L'amplicone del saggio attraversa una giunzione esonica e la sonda risiede completamente in uno degli esone formati.







b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e matrici di espressione genica), sotto Individual Assays (Saggi individuali), selezionare TaqMan® Gene Expression Assays (Saggi di espressione genica TaqMan).

• Per informazioni sui saggi di controllo endogeno TaqMan personalizzati, fare riferimento alla nota applicativa Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di espressione genica TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati


I saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati consistono in set di primers e sonde TaqMan disegnati, sintetizzati e formulati dall'assistenza saggi genomici TaqMan® sulla base delle informazioni di sequenza inoltrate. I saggi di espressione genica TaqMan consentono l'esecuzione di esperimenti di presenza/assenza su qualunque gene o variante di splicing in qualunque organismo.

I saggi utilizzano reagenti TaqMan per amplificare e rilevare il target in campioni di cDNA. Tutti i saggi vengono sviluppati utilizzando il software di disegno saggi proprietario.


Tutti i saggi di espressione genica TaqMan personalizzati:

• Richiedono la creazione di un submission file (utilizzando il software File Builder) con la sequenza target e l'inoltro del file all'assistenza saggi genomici TaqMan personalizzati.


tutti i pozzetti di uno studio che presentano la stessa quantità di cDNA.– Saggio di espressione genica 20✕ oppure saggio di espressione genica 60✕

(specifico per ogni target). Ogni saggio consiste in due primer specifici per il target e in una sonda MGB TaqMan marcata con fluorocromo FAM™ in una miscela pre-formulata 20✕ o 60✕. Le concentrazioni finali 1✕ sono 250 nM per la sonda e 900 nM per ogni primer.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o senza AmpErase® UNG)• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan Universal PCR

Master Mix (con o senza AmpErase UNG), utilizzando condizioni universali di ciclo termico.








b. Nella pagina Gene Expression Assays & Arrays (Saggi e matrici di espressione genica), sotto Individual Assays (Saggi individuali), selezionare Custom TaqMan® Gene Expression Assays (Saggi di espressione genica TaqMan personalizzati).

• Per informazioni sull'ordine di saggi di espressione genica TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines.

• Per informazioni sulla preparazione di reazioni PCR utilizzando i saggi di espressione genica TaqMan personalizzati, fare riferimento al protocollo Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan®


I reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan® Applied Biosystems contengono:

• Un controllo positivo interno (IPC) con primer e sonda pre-disegnati• Templato DNA IPC• Controllo bloccante IPC

I reagenti vengono disegnati per:

• Distinguere i tipi di risultati negativi:– Un segnale negativo per il target e un segnale positivo per l'IPC indica che

non è presente target.– Un segnale negativo per il target e un segnale negativo per l'IPC suggerisce

una inibizione della PCR.• Evitare l'amplificazione dei controlli endogeni.• Permettere la co-amplificazione dell'IPC e del target senza compromettere

l'amplificazione del target.• Rilevare l'IPC utilizzando una sonda etichettata con fluorocromo VIC®.• Rilevare il target utilizzando una sonda etichettata con fluorocromo FAM™.


I kit di reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan:

• Richiedono i seguenti componenti:– Campione DNA– Saggio TaqMan per il target di interesse– TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix

• Vengono disegnati e ottimizzati per l'utilizzo con la TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix , utilizzando condizioni universali di ciclo termico.




Kit disponibili Sono disponibili i seguenti kit di reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan di Applied Biosystems:


Per informazioni sulla preparazione delle reazioni PCR utilizzando reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol.



I saggi inventariati/prodotti su ordine per gli esperimenti di presenza/assenza Applied Biosystems vengono disegnati per l'utilizzo con le seguenti Master Mix TaqMan®:

Nota: In caso di acquisto di reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan® con kit Master Mix TaqMan® 2✕ Universal PCR (N. di cat. 4308320), non è necessario acquistare la Master Mix separatamente.

Nota: Gli esperimenti di presenza/assenza non vengono supportati utilizzando la Master Mix TaqMan® Universal PCR veloce.


Per informazioni sull'utilizzo di reagenti TaqMan, fare riferimento al protocollo TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix.

Kit Numero di catalogo

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con fluorocromo VIC®)

4308320

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents

Nota: Nel caso si utilizzi questo kit, è necessario acquistare uno di questi reagenti TaqMan® separatamente:

• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (N. di cat. 4304437)• TaqMan® PCR Core Reagents Kit (N. di cat. N808-0228)

4308323






4324018


4326614


4324020

TaqMan® PCR Core Reagents Kit N808-0228





Per i saggi inventariati/prodotti su ordine Applied Biosystems, utilizzare il software StepOne per il disegno dei propri esperimenti di presenza/assenza. Il software StepOne calcola automaticamente i volumi per:

• Componenti miscela di reazione• Controlli e campioni• Diluizioni del campione

Nota: Per selezionare il tipo di saggio inventariato/prodotto su ordine nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Inventoried/Made to Order (Inventariato/Prodotto su ordine) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio).


Per informazioni sul disegno e sull'esecuzione degli esperimenti di presenza/assenza sul sistema StepOne, fare riferimento alla guida Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.


Flusso di lavoro Nel caso venga selezionato il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne™ per un esperimento di presenza/assenza (il disegno dei propri primer e delle proprie sonde), Applied Biosystems raccomanda di attenersi al flusso di lavoro per le linee guida disegno saggi Applied Biosystems:

1. Disegnare i primer e le sonde utilizzando il software Primer Express® (pagina 3-23).

2. Selezionare i reagenti appropriati (pagina 3-25).


Nota: I reagenti TaqMan® veloci e i reagenti SYBR® Green non vengono supportati per gli esperimenti di presenza/assenza.

3. Utilizzare le condizioni di ciclo termico raccomandate (pagina 3-27).

4. Iniziare con le concentrazioni dei primer e delle sonde predefinite. Se necessario, ottimizzare le concentrazioni dei primer (pagina 3-30) e le concentrazioni delle sonde (pagina 3-34).

IMPORTANTE! Questi passaggi forniscono un sistema rapido e attendibile per il disegno e l'ottimizzazione dei saggi solo quando utilizzati nella loro interezza. Adottare il sistema nella sua globalità per ottenere il più alto livello di successo. Per una descrizione più dettagliata delle linee guida per il disegno di saggi Applied Biosystems, vedere Appendice C.

Nota: Per selezionare il tipo di saggio personalizzato nel software StepOne, andare alla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione) sia nel flusso di lavoro del Design Wizard sia in quello di impostazione avanzata, quindi selezionare Custom (Personalizzato) nel menu a discesa Assay Type (Tipo di saggio).



A-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

AFormula A

Formula per esperimenti con CT comparativo (ΔΔCT)

Formula La quantità di target, normalizzata a un controllo endogeno e rispetto a un campione di riferimento, viene calcolata nel modo seguente:

2 –ΔΔCT

Derivazione dellaformula

L'equazione che descrive l'amplificazione esponenziale della PCR è:

dove:

• xn = numero di molecole target al ciclo n• xo = numero iniziale di molecole target• Ex = efficienza dell'amplificazione del target• n = numero di cicli• Xo =numero iniziale delle molecole target

Il ciclo soglia (CT) indica il numero di ciclo frazionario al quale la quantità di target amplificato raggiunge una soglia specifica. Perciò,

dove:

• xT = numero soglia di molecole target• CT, X = ciclo soglia per l'amplificazione del target• KX = costante

Una equazione simile per la reazione di controllo endogeno è:

dove:

• RT = numero soglia delle molecole di riferimento• Ro = numero iniziale delle molecole di riferimento• ER= efficienza dell'amplificazione di riferimento• CT, R= ciclo soglia per l'amplificazione di riferimento• KR= costante

Xn Xo 1( EX )+× n=

XT Xo 1( EX )+× CT X, KX= =

RT Ro 1( ER )+× CT R, KR= =

A-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Appendice A Formula

Dividendo XT per RT si ottiene la seguente espressione:

I valori esatti di XT e RT dipendono da un certo numero di fattori, tra i quali:

• fluorocromo reporter utilizzato nella sonda• Effetti del contesto di sequenza sulle proprietà di fluorescenza della sonda• Efficienza della scissione della sonda• Purezza della sonda• Impostazione della soglia di fluorescenza.

Quindi, non è necessario che la costante K sia uguale ad 1.

Assumendo che le efficienze del target e del riferimento siano le stesse:

EX = ER = E

oppure

dove:

• XN = XO/RO, la quantità normalizzata di target• ΔCT = CT, X – CT, R, la differenza nei cicli soglia per il target e il riferimento

Riordinando si ottiene la seguente espressione:

Il passaggio finale è dividere l'XN di un campione qualunque (q) per l'XN del campione di riferimento (cb):

dove:

• ΔΔCT = ΔCT, q – ΔCT, cb

XTRT------

Xo 1( EX )CT X,+×

Ro 1( ER )CT R,+×

---------------------------------------- KXKR------ K===

XoRo----- 1( E ) K=

CT X, C– T R,+×

XN 1( E )CTΔ

+× K=

XN K 1 E+( )CTΔ–

×=

XN q,

XN cb,------------ K 1( E )

CT q,Δ–+×

K 1( E )CT cb,Δ–

+×----------------------------------------- 1(= E )

CTΔΔ–+= =

A-3Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Appendice A Formula

Per gli ampliconi disegnati e ottimizzati secondo le linee guida disegno saggi Applied Biosystems (dimensione amplicone <150 bp), l'efficienza è prossima a 1. Perciò, la quantità di target, normalizzata a un controllo endogeno e rispetto a un campione di riferimento, è data da:

2 –ΔΔCT

A-4 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Appendice A Formula

B-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

BLimitazione dei primer nella PCR multiplex B

Per generare un saggio multiplex accurato, è importante che l'amplificazione di una specie non sia dominante sull'altra. In caso contrario, è possibile che l'amplificazione di una specie altamente abbondante impedisca la efficiente amplificazione della specie meno abbondante. Qualora la specie meno abbondante non venga amplificata con efficienza, è possibile che l'esperimento produca risultati non accurati, oppure, in casi gravi, che il rilevamento della specie meno abbondante venga inibito completamente. È possibile evitare questa situazione limitando la concentrazione dei primer utilizzati per amplificare la specie più abbondante, “spegnendo” in tal modo l'amplificazione subito dopo che sia stato stabilito il CT.

La limitazione dei primer produce effetti sui componenti di reazione comuni a entrambi i saggi non esauriti, consentendo all'amplificazione della specie meno abbondante di andare avanti con alta efficienza. Qualora la specie più abbondante sia non nota, è necessario determinarla prima dell'esecuzione della PCR multiplex attraverso l'esecuzione di entrambi i target in provette separate. È necessario limitare i primer per entrambe le amplificazioni qualora nessuna specie sia più abbondante in maniera consistente.

Considerazionedell'abbondanza

relativa del targete del riferimento

Nell'applicazione della limitazione dei primer alle amplificazioni del target e del controllo endogeno, è necessario considerare l'abbondanza relativa delle due specie. Per gli esperimenti di quantificazione, è possibile utilizzare rRNA come controllo endogeno. La concentrazione dell'rRNA nell'RNA totale è sempre maggiore della concentrazione di qualunque mRNA target. Perciò, nell'amplificazione sia del target sia dell'rRNA nelle reazioni multiplex, è necessario limitare le concentrazioni solo dei primer rRNA.

B-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.


Matricelimitazione primer

Per la definizione delle concentrazioni di limitazione primer, eseguire una matrice delle concentrazioni di forward primer e reverse primer utilizzando il valore del templato iniziale minimo. Lo scopo è di identificare le concentrazioni dei primer che riducono il valore ΔRn del saggio senza influire sul valore CT. La tabella qui di seguito illustra una matrice raccomandata di forward e reverse primer con concentrazioni variabili tra 20 e 100 nM.

Nota: Sebbene tutti i criteri di disegno seguenti facilitino l'identificazione delle concentrazioni di limitazione dei primer, ciò potrebbe essere non possibile per tutti i saggi. Se un esperimento di limitazione dei primer non permette l'identificazione delle concentrazioni di limitazione dei primer, è necessario ridisegnare almeno un primer oppure eseguire le reazioni in provette separate.

Esempio I risultati di un esperimento con matrice limitazione dei primer vengono mostrati nella Figura B-1 a pagina B-3:

• La Figura B-1a mostra che solo se si abbassano le concentrazioni dei primer qui sotto circa 50 nM, il valore di Ct risulta influenzato significativamente. L'area plateau mostra la zona nella quale è possibile trovare le adeguate concentrazioni di limitazione dei primer In tale area, il CT (e quindi il corrispondente valore di quantificazione) resta invariato, mentre il valore ΔRn e la corrispondente generazione di prodotti vengono ridotti in modo significativo.

• La Figura B-1b mostra la relazione corrispondente tra le concentrazioni dei primer e il ΔRn. La figura dimostra che è possibile raggiungere una generazione di prodotti più bassa diminuendo le concentrazioni del forward primer e del reverse primer.

Per questo esempio, una selezione appropriata delle concentrazioni di limitazione dei primer è di almeno 50 nM per il forward primer e il reverse primer. È necessario mantenere la concentrazione della sonda a un livello ottimale anche quando un saggio è limitato per il primer per garantire che il segnale prodotto sia ampio abbastanza da consentire al software un multicomponenting accurato.

Forward:Reverse:

100 nM100 nM

100 nM80 nM

100 nM60 nM

100 nM40 nM

100 nM20 nM

Forward:Reverse:

80 nM100 nM

80 nM80 nM

80 nM60 nM

80 nM40 nM

80 nM20 nM

Forward:Reverse:

60 nM100 nM

60 nM80 nM

60 nM60 nM

60 nM40 nM

60 nM20 nM

Forward:Reverse:

40 nM100 nM

40 nM80 nM

40 nM60 nM

40 nM40 nM

40 nM20 nM

Forward:Reverse:

20 nM100 nM

20 nM80 nM

20 nM60 nM

20 nM40 nM

20 nM20 nM

B-3Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.


Figura B-1 Risultati esperimento con matrice di limitazione dei primer (a) Mostra come il valore CT sia influenzato dalle variazioni delle concentrazioni di forward primer e reverse primer. La zona plateau indica l'area in cui il valore CT rimane costante. (b) Mostra una riduzione dei valori con la diminuzione della concentrazione dei primer.

ΔRn

B-4 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.


C-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

CLinee guida disegno saggi C

Informazioni sullelinee guida

disegno saggi

Nel caso sia in atto il disegno dei propri saggi (primer e sonde), Applied Biosystems raccomanda di attenersi alle linee guida disegno saggi Applied Biosystems. Le linee guida disegno saggi specificano:

1. Disegno primer e sonde utilizzando il software Primer Express® – Il software Primer Express utilizza un set di parametri predefiniti per la selezione automatica dei set di primer e sonde.

2. Selezione reagenti appropriati – Sono disponibili diversi reagenti TaqMan® e SYBR® Green. I reagenti utilizzati dipendono dal tipo di saggio.

3. Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate – Utilizzare le condizioni di ciclo termico raccomandate per il campione (DNA/cDNA, RNA per PCR in 1fase e RNA per PCR in 2 fasi).

Nota: Le condizioni di ciclo termico per i reagenti fast differiscono dalle condizioni di ciclo termico per i reagenti standard.

4. Utilizzo delle concentrazioni predefinite dei primer e delle sonde o ottimizzazione delle concentrazioni dei primer e delle sonde – Nel caso si utilizzino le linee guida disegno saggi Applied Biosystems, è possibile utilizzare concentrazioni di sonde e di primer predefinite per saggi ottimizzati non-multiplex oppure è possibile ottimizzare le concentrazioni dei primer e delle sonde.

IMPORTANTE! Questi passaggi forniscono un sistema rapido e attendibile per il disegno e l'ottimizzazione dei saggi solo quando utilizzati nella loro interezza. Adottare il sistema nella sua globalità per ottenere il più alto livello di successo.

Nota: Le linee guida disegno saggi Applied Biosystems non garantiscono che tutti i saggi forniscano lo stesso livello di prestazioni e sensibilità. Anche i più scrupolosi parametri di disegno non possono tenere in considerazione tutte le possibili variazioni tra tra due sistemi diversi di saggi.

Conclusioni pergli esperimenti di

quantificazione

In generale, è possibile giungere alle seguenti conclusioni quando vengono utilizzate le linee guida disegno saggi per gli esperimenti di quantificazione.

• Per la maggior parte dei saggi TaqMan, una concentrazione primer di 900-nM e di sonde di 250-nM comporta un saggio altamente riproducibile e sensibile quando si utilizza DNA o cDNA come templato.

• A causa della natura non specifica del suo rilevamento, oltrepassare l'ottimizzazione dei primer con fluorocromo SYBR® Green I con molta cautela. Comunque, se vengono seguite tutte le linee guida, concentrazioni di forward primer e di reverse primer di 50-nM forniscono generalmente una amplificazione robusta con un buon livello di specificità quando si utilizza DNA o cDNA come templato. Verificare questo assunto controllando la formazione di prodotti non specifici sia con la curva di melting sia con l'analisi del gel.

C-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Appendice C Linee guida disegno saggi

• La maggior parte dei saggi TaqMan abilita il rilevamento e la quantificazione accurata di un target fino a un numero di copie <50 , con anche la maggiore sensibilità possibile.

• I saggi SYBR Green forniscono prestazioni simili; comunque, è possibile che la formazione di prodotti non specifici aumenti potenzialmente il limite minimo di rilevamento.

Conclusioni pergli esperimenti digenotipizzazione

In generale, è possibile giungere alla seguente conclusione quando vengono utilizzate le linee guida disegno saggi per gli esperimenti di genotipizzazione.

È possibile utilizzare primer di 900 nM, una sonda di 200 nM e da 1 a 20 ng di DNA genomico per ottenere risultati di saggi riproducibili e sensibili.

Bibliografia-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Bibliografia

Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., et al. 1997. Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res. 25:2657–2660.

Förster, V. T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physics (Leipzig) 2:55–75.

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10:413–417.

Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Kinetic PCR:Real time monitoring of DNA amplification reazioni. Biotechnology 11:1026–1030.

Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997. Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base composition and backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res. 25:3718–3723.

Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature 339:237–238.

Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2–ΔΔCT Method. Methods 25:402–408.

Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reazioni. Gene 93:125–128.

Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350–1354.

Bibliografia-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Bibliografia

Glossario-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Glossario

acquisizione dati Processo durante la sessione analitica in cui un componente dello strumento rileva i dati della fluorescenza provenienti da ogni pozzetto della piastra di reazione. Lo strumento trasforma il segnale in dati elettronici e i dati vengono salvati nel file dell'esperimento. Un punto di acquisizione dati viene indicato da un'icona nel profilo termico:

• Acquisizione dati attivata:

• Acquisizione dati disattivata:

agente bloccante IPC Reagente aggiunto alle reazioni PCR per bloccare l'amplificazione del controllo positivo interno (IPC).

AIF Abbreviazione per file con le informazioni del saggio (AIF, Assay Information File).

allele Rispetto a un determinato target, ognuna delle diverse sequenze che si verificano nella popolazione.

amplicone Segmento di DNA amplificato durante la PCR.

amplificazione Parte della sessione strumentale durante la quale si verifica la PCR per la produzione dell'amplificazione del target. Per gli esperimenti di quantificazione, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante l'amplificazione vengono visualizzati in un plot di amplificazione e utilizzati per calcolare i risultati. Se l'amplificazione viene inclusa nella sessione dello strumento StepOne™ per la genotipizzazione o per gli esperimenti di presenza/assenza, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante l'amplificazione vengono visualizzati in un plot di amplificazione ed è possibile utilizzarli per la risoluzione dei problemi.

Assay Mix Componente della reazione PCR in TaqMan® Gene Expression Assays e TaqMan® SNP Genotyping Assays di Applied Biosystems consistente in primer disegnati per l'amplificazione di un target e una sonda TaqMan® disegnata per il rilevamento dell'amplificazione del target.

AutoΔ Impostazione per aumentare o diminuire la temperatura e/o il tempo ad ogni ciclo successivo in una fase ciclica. Quando AutoΔ è abilitato, le impostazioni vengono indicate da un'icona nel profilo termico:

• AutoΔ attivato:

• AutoΔ disattivato:

Glossario-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemRISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Glossario

Avvio rapido Funzione nel sistema StepOne™ che consente l'esecuzione dell'esperimento senza immettere le informazioni relative alle impostazioni della piastra.

calibratore Vedere campione di riferimento.

calibrazione spaziale Tipo di calibrazione del sistema StepOne™ in cui il sistema mappa le posizioni dei pozzetti nel blocco campione. I dati della calibrazione spaziale vengono utilizzati in maniera tale che il software possa associare gli aumenti di fluorescenza durante una sessione analitica a pozzetti specifici nella piastra di reazione.

campione Il templato in corso di test.

campione di riferimento In esperimenti con curva standard relativa e CT (ΔΔCT) comparativo, il campione di riferimento viene utilizzato come base per i risultati di quantificazione relativa. Noto anche come calibratore.

Campione o Standard (10✕)

Componente della reazione visualizzato sulla scheda Reaction Mix Calculations (Calcoli miscela di reazione) della schermata Reaction Setup (Impostazione reazione). Il software presuppone che il campione o lo standard aggiunto alla miscela di reazione sia a una concentrazione 10✕. Ad esempio, se il volume della reazione è 20 μl, il volume calcolato del campione o dello standard per la reazione 1 è di 2 μl.

chimica Vedere reagenti.

ciclo soglia Vedere ciclo soglia (CT).

ciclo soglia (CT) Il numero del ciclo PCR in cui il ΔRn incontra la soglia nel plot di amplificazione.

coefficienti di regressione

Valori calcolati dalla linea di regressione nella curva standard, inclusi il valore R2, la pendenza e l'intercetta y. È possibile utilizzare i valori del coefficiente di regressione per valutare la qualità dei risultati provenienti dagli standard. Vedere anche curva standard.

colore del target Colore assegnato a un target per identificare il target nel layout piastra e nei plot di analisi.

Concentrazione del campione diluito (10✕ per Miscela di reazione)

Campo del software visualizzato sulla scheda Sample Dilution Calculations (Calcoli diluizione campione) della schermata Reaction Setup (Impostazione reazione). Per questo campo, immettere la concentrazione del campione che si desidera utilizzare da aggiungere alla miscela di reazione per tutti i campioni nell'esperimento. “10✕ per Miscela di reazione” indica che il software presuppone che il componente campione o standard della miscela di reazione si trovi in concentrazione 10✕. Ad esempio, se la concentrazione del campione diluito è di 50,0 ng/μl (10✕), la concentrazione finale del campione nella reazione è di 5 ng/μl (1✕).


Glossario

configurazione co-locata Disposizione del sistema in cui lo strumento StepOne™ è collegato direttamente a un computer co-locato dal cavo giallo del sistema StepOne™. In questa configurazione, lo strumento StepOne™ viene controllato attraverso il software StepOne™ presente sul computer co-locato.

configurazione indipendente

Disposizione del sistema in cui lo strumento StepOne™ non è collegato a un computer dal cavo giallo del sistema StepOne™. Viene invece utilizzata un'unità USB ( ) per il trasferimento dei dati tra i componenti del sistema StepOne™. In questa configurazione, lo strumento StepOne™ viene controllato attraverso il touchscreen dello strumento stesso.

controllo endogeno Target che deve essere agli stessi livelli in tutti i campioni da testare. Utilizzato negli esperimenti con curva standard relativa e CT (ΔΔCT) comparativo per la normalizzazione dei segnali di fluorescenza per il target in corso di quantificazione. Noto anche come gene di riferimento.

controllo negativo (NC) In esperimenti del sistema StepOne™, la task assegnata ai target o ai saggi SNP in pozzetti che contengono acqua o buffer invece di un templato di campione. Nei pozzetti di controllo negativi non deve verificarsi alcuna amplificazione del target.

controllo positivo Negli esperimenti di genotipizzazione, la task per il saggio SNP nei pozzetti che contengono un templato di campione con un genotipo noto.

controllo positivo interno (IPC)

Negli esperimenti di presenza/assenza, templato di DNA sintetico di piccole dimensioni che viene aggiunto alle reazioni della PCR. È possibile utilizzare l'IPC per distinguere tra i risultati negativi e le reazioni influenzate dagli inibitori della PCR, dall'impostazione errata del saggio o da un problema del reagente o dello strumento.

controllo senza amplificazione (NAC, No Amplification Control)

Vedere pozzetti IPC bloccati a controllo negativo.

controllo senza templato (NTC, No Template Control)

Vedere controllo negativo (NC, Negative Control).

CT Abbreviazione per ciclo soglia.

CT automatico Impostazione di analisi in cui il software calcola automaticamente la soglia e la linea di base nel plot di amplificazione. Il software utilizza la soglia e la linea di base per calcolare il ciclo soglia (CT).

CT manuale Impostazione di analisi in cui viene immesso il valore soglia e viene selezionato se utilizzare calcoli con linea di base automatica o linea di base manuale. Il software utilizza il valore soglia immesso e la linea di base per calcolare il ciclo soglia (CT).

curva di dissociazione Vedere curva di melting.


Glossario

curva di melting Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase della curva di melting. I picchi nelle curva di melting possono indicare la temperatura di melting (Tm) del target o possono identificare un'amplificazione della PCR non specifica. È possibile visualizzare la curva di melting come reporter normalizzato (Rn) rispetto alla temperatura o come reporter derivativo (−Rn′) rispetto alla temperatura.

curva standard Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa:

• La linea meglio interpolata in un plot dei valori CT provenienti dalle reazioni standard riportate rispetto alle quantità standard. Vedere anche linea di regressione.

• Un set di standard contenenti un range di quantità note. I dati provenienti dalle reazioni di curva standard vengono utilizzati per la generazione della curva standard. La curva standard viene definita dal numero di punti nelle serie, dal numero dei replicati standard, dalla quantità di partenza e dal fattore seriale. Vedere anche serie di diluizioni standard.

delta Rn (ΔRn) Abbreviazione per reporter normalizzato corretto sulla linea di base.

design wizard Funzione del software StepOne™ che aiuta nell'impostazione di un esperimento, indicando le migliori scelte da eseguire dal momento dell'immissione del disegno dell'esperimento.

diluente Reagente utilizzato per la diluizione di un campione o di uno standard prima di aggiungerlo alla reazione della PCR. Può essere rappresentato da acqua o da un buffer (soluzione tampone).

DNA campione (10✕) Componente della reazione visualizzato sulla schermata Reaction Setup (Impostazione reazione). Il software presuppone che il DNA del campione aggiunto alla miscela di reazione sia a una concentrazione 10✕. Ad esempio, se il volume della reazione è 20 μl, il volume calcolato del campione per la reazione 1 è di 2 μl.

EFF% Vedere efficienza di amplificazione (EFF%).

efficienza di amplificazione (EFF%)

Calcolo dell'efficienza dell'amplificazione della PCR. L'efficienza di amplificazione viene calcolata utilizzando la pendenza della linea di regressione nella curva standard. Una pendenza prossima a −3,3 indica una efficienza di amplificazione PCR ottimale, del 100%. Fattori che influenzano l'efficienza di amplificazione:

• Range delle quantità degli standard - Per misurazioni dell'efficienza più accurate e precise, utilizzare un range di quantità degli standard ampio, da 5 a 6 log (da 105 a 106 volte).

• Numero di replicati degli standard- Per misurazioni dell'efficienza più accurate, includere i replicati per diminuire gli effetti delle inesattezze relative al pipettaggio.

• Inibitori della PCR - La presenza di inibitori della PCR nella reazione può ridurre l'efficienza di amplificazione.


Glossario

esperimento Si riferisce all'intero processo di esecuzione di una sessione utilizzando il sistema StepOne™, includendo impostazione, esecuzione e analisi. I tipi di esperimenti eseguibili utilizzando il sistema StepOne™ sono:

• Quantificazione – curva standard

• Quantificazione – curva standard relativa

• Quantificazione – CT comparativo (ΔΔCT)

• Curva di melting

• Genotipizzazione

• Presenza/Assenza

esperimento end-point Esperimento in cui i dati sulla fluorescenza acquisiti in una lettura post-PCR vengono utilizzati per calcolare i risultati per gli esperimenti di genotipizzazione o di presenza/assenza.

fase ciclica Fase nel profilo termico che viene ripetuta. Se per eseguire la PCR viene utilizzata la fase ciclica, questa viene denominata fase di amplificazione.

fase della curva di melting

Fase nel profilo termico con un incremento della temperatura per la generazione di una curva di melting.

fase di sosta Fase nel profilo termico che include uno o più passaggi. È possibile, ad esempio, aggiungere una fase di sosta al profilo termico per attivare enzimi, inattivare enzimi o incubare una reazione.

fase o stage Componente del profilo termico. Una fase consiste di uno o più passaggi.

fattore di diluizione Vedere fattore seriale.

fattore seriale Valore numerico che definisce la sequenza delle quantità nella curva standard. Il fattore seriale e la quantità di partenza vengono utilizzati per il calcolo della quantità standard per ogni punto nella curva standard. Ad esempio, se la curva standard viene definita con un fattore seriale di 1:10 o 10, la differenza tra 2 punti adiacenti nella curva viene decuplicata.

file con le informazioni del saggio (AIF, Assay Information File)

File dati su CD spedito insieme a ogni ordine di saggi. Il nome del file include il numero del codice a barre presente sulla piastra di reazione. Le informazioni presenti nell'AIF sono fornite in un formato delimitato da tabulazioni.

fluorocromi puri Reagente che contiene il fluorocromo del sistema. I fluorocromi vengono utilizzati per eseguire una calibrazione di fluorocromo sul sistema StepOne™. Vedere anche fluorocromo del sistema.


Glossario

fluorocromo di sistema fluorocromo prodotto da Applied Biosystems e precalibrato sul sistema StepOne™. fluorocromi di sistema:

• fluorocromo FAM™

• fluorocromo JOE™

• fluorocromo ROX™

• fluorocromo SYBR® Green

• fluorocromo VIC®

IMPORTANTE! Applied Biosystems non raccomanda l'uso del fluorocromo TAMRA™ come reporter o quencher con il sistema StepOne™ .

fluorocromo personalizzato

fluorocromo non prodotto da AppliedBiosystems. È possibile utilizzare fluorocromi personalizzati per eseguire gli esperimenti PCR in tempo reale sul sistema StepOne™. Prima di utilizzare fluorocromi personalizzati, eseguire una calibrazione specifica per il fluorocromo.


forward primer Oligonucleotide all'estremità 5′ del target. Reverse primer e forward primer vengono utilizzati insieme nelle reazioni PCR per l'amplificazione del target.

gene di riferimento Vedere controllo endogeno.

gruppo di replicati Set di reazioni identiche in un esperimento.

ID refSNP Numero che identifica l'ID del cluster di riferimento SNP (refSNP). Generato dal Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation (dbSNP). Può essere utilizzato per ricercare nello Store di Applied Biosystem un SNP Genotyping Assay di Applied Biosystems Noto anche come Numero rs.

ID saggio Valore assegnato da Applied Biosystems a TaqMan® Gene Expression Assays e TaqMan® SNP Genotyping Assays.

impostazione avanzata Funzione nel software StepOne™ che consente l'impostazione degli esperimenti in base al proprio disegno.

intercetta y Coefficiente di regressione calcolato dalla linea di regressione nella curva standard. L'intercetta y di questa linea costituisce il valore di y nel punto in cui la linea interseca l'asse y.

IPC Abbreviazione per controllo positivo interno (IPC, Internal Positive Control) Inoltre, in esperimenti di presenza/assenza, la task per il target IPC nei pozzetti che contengono un templato IPC.

IPC bloccato In esperimenti di presenza/assenza, la task e assegnata al target IPC in pozzetti che contengono un'agente bloccante IPC invece di un templato di campione. Vedere anche pozzetti IPC bloccati a controllo negativo.


Glossario

IPC+ Richiesta di presenza/assenza quando il controllo positivo interno (IPC) è riuscito.

layout piastra Illustrazione della griglia di pozzetti 6 × 8 del contenuto assegnato nella piastra di reazione. Nel software, è possibile utilizzare il layout piastra come strumento di selezione per assegnare il contenuto dei pozzetti, per visualizzare le assegnazione dei pozzetti e per visualizzare i risultati. Il layout piastra viene visualizzato nelle schermate del Design Wizard, in quelle di Advanced Setup (Impostazioni avanzate) e in quelle delle esecuzioni e delle analisi. Il layout piastra può essere stampato, incluso in un report, esportato e salvato come slide per una presentazione.

lettura end-point Vedere lettura post-PCR.

lettura post-PCR Utilizzata negli esperimenti di genotipizzazione e di presenza/assenza, la parte della sessione analitica dello strumento che si verifica dopo l'amplificazione. Negli esperimenti di genotipizzazione, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante la lettura post-PCR vengono visualizzati nel plot di discriminazione allelica e utilizzati per fare richieste di alleli. Negli esperimenti di presenza/assenza, i dati sulla fluorescenza acquisiti durante la lettura post-PCR vengono visualizzati nel plot di presenza/assenza e utilizzati per fare richieste di rilevamento. Chiamata anche lettura end-point.

lettura pre-PCR Utilizzata negli esperimenti di genotipizzazione e di presenza/assenza, la parte della sessione analitica dello strumento che si verifica prima dell'amplificazione. I dati sulla fluorescenza acquisiti durante la lettura pre-PCR vengono utilizzati per normalizzare i dati sulla fluorescenza post-lettura.

libreria campioni Acquisizione di campioni nel software StepOne™. La libreria campioni contiene il nome e il colore del campione.

libreria saggi SNP Acquisizione di saggi SNP nel software StepOne™.

libreria target Acquisizione di target nel software StepOne™.

linea di base Nel plot di amplificazione, linea adeguata ai livelli di fluorescenza per un range definito di cicli. In caso di utilizzo dell'impostazione di analisi con linea di base manuale, per la determinazione della linea di base Applied Biosystem raccomanda di selezionare cicli precoci della PCR.

linea di base automatica Impostazione di analisi in cui il software calcola i valori di inizio e di fine della linea di base per il plot di amplificazione. Il software utilizza la linea di base e la soglia per calcolare il ciclo soglia (CT).

linea di base manuale Impostazione di analisi in cui vengono immessi i valori di inizio e di fine della linea di base per il plot di amplificazione. Il software utilizza la linea di base e la soglia per calcolare il valori del CT.


Glossario

linea di regressione Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa, la migliore linea adeguata alla curva standard. Formula della linea di regressione:

CT = m [log (Qtà)] + b

dove m rappresenta la pendenza, b l'intercetta y e Qtà la quantità standard.

Vedere anche coefficienti di regressione.

metodo CT comparativo (ΔΔCT)

Metodo di quantificazione per esperimenti di quantificazione. Con il metodo CT comparativo (ΔΔCT), vengono utilizzati i risultati provenienti da un campione di riferimento e da un controllo endogeno per determinare le quantità relative di un target nei campioni.

metodo della curva standard

Metodo di quantificazione per esperimenti di quantificazione. Con il metodo della curva standard, vengono utilizzati i risultati provenienti dagli standard per determinare le quantità relative di un target nei campioni.

metodo della curva standard relativa

Metodo di quantificazione per esperimenti di quantificazione. Con il metodo della curva standard relativa, vengono utilizzati i risultati provenienti dagli standard, da un campione di riferimento e da un controllo endogeno per determinare le quantità relative di un target nei campioni.

metodo di esecuzione Definizione del volume della reazione e del profilo termico per la sessione analitica dello strumento.

metodo di quantificazione

Con gli esperimenti di quantificazione, il metodo utilizzato per determinare la quantità di target nei campioni. Per gli esperimenti di quantificazione, esistono tre tipi di metodi di quantificazione disponibili: curva standard, CT comparativo (ΔΔCT) e curva standard relativa.

miscela di primer Componente della reazione PCR contenente il forward primer e il reverse primer disegnati per amplificare il target.

miscela di reazione Soluzione contenente tutti i componenti necessari per eseguire la reazione PCR, ad eccezione del templato (campione, standard o controllo).

miscela primer/sonda Componente della reazione PCR che consiste nei primer disegnati per amplificare il target e una sonda TaqMan® disegnata per rilevare l'amplificazione del target.

miscela sonda Componente della reazione PCR contenente una sonda TaqMan® disegnata per rilevare l'amplificazione del target.

monitoraggio remoto Funzione software che consente la visualizzazione dello stato di uno strumento in rete, l'invio di esperimenti allo strumento e il download degli esperimenti eseguiti al proprio computer.

nome dell'esperimento Immesso durante l'impostazione dell'esperimento, il nome che viene utilizzato per identificare l'esperimento. I nomi degli esperimenti non possono superare i 100 caratteri e non possono includere alcuno dei seguenti caratteri: slash (/), backslash (\), maggiore di (>), minore di (<), asterisco (*), punto interrogativo (?), virgolette ("), linea verticale (|), due punti (:) o punto e virgola (;).


Glossario

numero rs Vedere ID refSNP.

ometti pozzetto Azione che viene eseguita dopo l'analisi per omettere uno o più pozzetti da tutte le analisi prima di analizzare nuovamente i dati.

outlier Per un gruppo di dati, dato significativamente più piccolo o più grande rispetto agli altri.

passaggio Componente del profilo termico. Un passaggio viene definito dalla temperatura, dal tempo, dalla rampa e dallo stato di acquisizione dei dati. Per le fasi cicliche, un passaggio viene anche definito dallo stato AutoΔ.

PCR in tempo reale Procedura di acquisizione di dati sulla fluorescenza durante l'amplificazione della PCR. I dati della PCR in tempo reale vengono utilizzati per calcolare i risultati per gli esperimenti di quantificazione o per risolvere i problemi dei risultati per gli esperimenti di genotipizzazione o di presenza/assenza.

pendenza Coefficiente di regressione calcolato dalla linea di regressione nella curva standard. La pendenza indica l'efficienza dell'amplificazione PCR per il saggio. Una pendenza di −3,3 indica un'efficienza di amplificazione del 100%. Vedere anche efficienza di amplificazione (EFF%).

plot dati non elaborati Visualizzazione dell'ampiezza della fluorescenza per i pozzetti selezionati per tutti i filtri. Visualizza l'ampiezza della fluorescenza proveniente da tutti i dati acquisiti nella sessione analitica.

plot della temperatura Visualizzazione delle temperature per il campione, il pannello di copertura dello strumento e il blocco dello strumento durante la sessione analitica dello strumento.

plot di amplificazione Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase ciclica dell'amplificazione della PCR. È visualizzabile come:

• Reporter normalizzato baseline-corretcted (ΔRn) rispetto al ciclo

• Reporter normalizzato (Rn) rispetto al ciclo

• Ciclo soglia (CT) rispetto al pozzetto

plot di discriminazione allelica

Visualizzazione dei dati acquisiti durante la lettura post-PCR. Il plot di discriminazione allelica è una manifestazione grafica del segnale del reporter normalizzato proveniente dalla sonda dell'allele 1, riportato rispetto al segnale del reporter normalizzato proveniente dalla sonda dell'allele 2.

plot multicomponente Visualizzazione dei dati acquisiti durante la fase ciclica della PCR in tempo reale. Il plot multicomponente mostra la fluorescenza per tutti i cicli nella sessione analitica.

pozzetti IPC a controllo negativo

In esperimenti di presenza/assenza, i pozzetti che contengono un templato IPC e buffer o acqua invece di un templato di campione nella reazione PCR. Solo il templato IPC dovrebbe amplificarsi nei pozzetti IPC a controllo negativo, in quanto la reazione non contiene templato di campione. Vedere anche IPC+.


Glossario

pozzetti IPC bloccati a controllo negativo

In esperimenti di presenza/assenza, i pozzetti che contengono agente bloccante IPC invece di un templato di campione nella reazione PCR. Nei pozzetti IPC bloccati a controllo negativo non deve verificarsi alcuna reazione di amplificazione in quanto la reazione non contiene alcun templato di campione e l'amplificazione dell'IPC è bloccata. Chiamati anche Controllo senza amplificazione (NAC, No Amplification Control)

profilo termico Parte del metodo di esecuzione che specifica temperatura, tempo, rampa e punti di acquisizione dati per tutti i passaggi e le fasi della sessione analitica dello strumento.

punto Uno standard in una curva standard. La quantità di standard per ogni punto nella curva standard viene calcolato in base alla quantità di partenza e al fattore seriale.

quantità Negli esperimenti di quantificazione, la quantità di target presente nei campioni. La quantità assoluta può riferirsi al numero di copie, alla massa, alla molarità o alla carica virale. La quantità relativa si riferisce a n volte la differenza tra la quantità normalizzata di target nel campione e la quantità normalizzata di target nel campione di riferimento.

quantità di partenza Quando viene definita una curva standard o una serie di diluizioni standard, corrisponde alla quantità maggiore o minore.

quantità normalizzata Quantità di target divisa per la quantità di controllo endogeno.

quantità standard Quantità nota nella reazione PCR.

• Negli esperimenti con curva standard, la quantità nota di target. Le unità per la quantità standard possono essere per la massa, il numero di copie, la carica virale o altre unità per la misurazione della quantità di target.

• Negli esperimenti con curva standard relativa, quantità nota nello standard. Ad esempio, la quantità nota può riferirsi alla quantità di cDNA o alla quantità di stock. Le unità non sono rilevanti per gli esperimenti di curva standard relativa in quanto si annullano nei calcoli.

quencher Molecola legata all'estremità 3′ delle sonde TaqMan® per impedire che il reporter emetta un segnale fluorescente quando la sonda è intatta. Con i reagenti TaqMan®, è possibile utilizzare come quencher il quencher non fluorescente-minor groove binder (NFQ-MGB). Con i reagenti SYBR® Green, non viene utilizzato alcun quencher.


quencher non fluorescente-minor groove binder (NFQ-MGB)

Molecole legate all'estremità 3′ delle sonde TaqMan®. Quando la sonda è intatta, il quencher non fluorescente (NFQ) impedisce l'emissione del segnale di fluorescenza al fluorocromo del reporter. L'NFQ non è fluorescente e quindi, producendo minori segnali di background, porta a una migliore precisione nella quantificazione. Il minor groove binder (MGB) aumenta la temperatura di melting (Tm) senza aumentare la lunghezza della sonda. Consente inoltre il disegno di sonde più corte.


Glossario

rampa La velocità con cui cambia la temperatura durante la sessione analitica dello strumento. Ad eccezione del passaggio della curva di melting, la rampa viene definita da valore percentuale. Per il passaggio della curva di melting, la rampa viene definita da un incremento di temperatura. Nella visualizzazione grafica del profilo termico, la rampa viene indicata da una linea diagonale.

reagenti I componenti della reazione PCR che vengono utilizzati per amplificare il target e per rilevare l'amplificazione. Tipi di reagenti utilizzati sul sistema StepOne™:


• Reagenti SYBR® Green

• Altri reagenti

Reagenti SYBR® Green Componenti della reazione PCR che consistono in due primer disegnati per amplificare il target e un fluorocromo SYBR® Green per il rilevamento del DNA a doppia elica.

Reagenti TaqMan® Componenti della reazione PCR che consistono nei primer disegnati per amplificare il target e una sonda TaqMan® disegnata per il rilevamento dell'amplificazione del target.

reazione campione/saggio SNP

Combinazione di campione e saggio SNP in una reazione PCR. Ogni reazione PCR può contenere un solo campione e un solo saggio SNP.

reazione campione/target

Combinazione di campione e saggio target in una reazione PCR. Nel Design Wizard, ogni reazione PCR può contenere un solo campione e un solo saggio target.

replicati Numero totale di reazioni identiche contenenti componenti identici e volumi identici.

reporter fluorocromo fluorescente utilizzato per rilevare l'amplificazione. Se si utilizzano reagenti TaqMan®, il fluorocromo reporter viene collegato all'estremità 5′. Se si utilizzano reagenti SYBR® Green, il fluorocromo reporter è il fluorocromo SYBR® Green.

reporter derivativo (−Rn′) Visualizzato nell'asse y della curva di melting. Il segnale di reporter derivativo è la derivata prima negativa della fluorescenza normalizzata proveniente dal reporter.

reporter normalizzato (Rn)

Segnale della fluorescenza proveniente dal fluorocromo del reporter, normalizzato al segnale della fluorescenza del riferimento passivo.

Reporter normalizzato corretto sulla linea di base (ΔRn)

La grandezza del segnale di fluorescenza normalizzato generato dal reporter durante l'amplificazione della PCR.

ΔRn = Rn (end-point) − Rn (linea di base), dove Rn = reporter normalizzato.

reverse primer Oligonucleotide all'estremità 3′ del target. Reverse primer e forward primer vengono utilizzati insieme nelle reazioni PCR per l'amplificazione del target.


Glossario

riferimento passivo fluorocromo che produce un segnale fluorescente. Dal momento che il segnale di riferimento passivo deve essere uniforme per tutti i pozzetti, viene utilizzato per normalizzare il segnale del fluorocromo del reporter per rispondere delle fluttuazioni di fluorescenza provocate dalle differenze minori in concentrazioni o volume esistenti da pozzetto a pozzetto. La normalizzazione al segnale di riferimento passivo consente una elevata precisione dei dati.

rifiuta pozzetto Azione eseguita dal software durante l'analisi per rimuovere uno o più pozzetti dall'esecuzione di ulteriori analisi se al pozzetto è applicato un indicatore specifico.

Rn Abbreviazione per reporter normalizzato.

saggi inventariati TaqMan® Genomic Assays prodotti precedentemente, che hanno passato le specifiche del controllo di qualità e sono conservati nell'inventario.

saggi prodotti su richiesta

TaqMan® Genomic Assays che vengono prodotti al momento dell'ordine. Solo i saggi che superano le specifiche del controllo di qualità della produzione vengono spediti.

saggio Nel sistema StepOne™, una reazione PCR che contiene i primer per l'amplificazione di un target e un reagente per il rilevamento del target amplificato.

saggio SNP Utilizzato negli esperimenti di genotipizzazione, reazione PCR che contiene i primer per l'amplificazione di un SNP e due sonde per il rilevamento di alleli diversi.

sconosciuti Negli esperimenti di quantificazione, l'operazione per il target nei pozzetti che contengono un templato di campione con quantità target sconosciute.

Negli esperimenti di genotipizzazione, l'operazione per il saggio SNP nei pozzetti che contengono un templato di campione con un genotipo sconosciuto.

Negli esperimenti di presenza/assenza, l'operazione per il target nei pozzetti che contengono un templato di campione in cui la presenza del target non è nota.

serie Vedere serie di diluizioni standard.

serie di diluizioni standard

Negli esperimenti con curva standard e curva standard relativa, un set di standard contenenti un range di quantità note. La serie di diluizioni standard viene preparata da standard diluiti serialmente. Ad esempio, lo soluzione standard stock viene utilizzata per preparare il primo punto di diluizione, il primo punto di diluizione viene utilizzato per preparare il secondo punto di diluizione e così via. I volumi necessari per la preparazione di una serie di diluizioni standard vengono calcolati dal numero di punti di diluizione, dal numero dei replicati standard, dalla quantità di partenza, dal fattore seriale e dalla concentrazione standard nello stock. Vedere anche curva standard.

SNP Abbreviazione per polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP, Single Nucleotide Polymorphism). L'SNP può consistere nella differenza di una base o in un indel (da insertion/deletion, cioè inserimento/soppressione).


Glossario

soglia Il livello di fluorescenza al di sopra della linea di base ed entro l'area di crescita esponenziale del plot di amplificazione. È possibile determinare la soglia automaticamente (vedere CT automatico) o impostarla manualmente (vedere CT manuale).

standard Campione che contiene quantità di standard note. Le reazioni standard vengono utilizzate negli esperimenti di quantificazione per la generazione di curve standard. Vedere anche curva standard e serie di diluizioni standard.

target La sequenza di acido nucleico che si desidera amplificare e rilevare.

task Tipo di reazione eseguita nel pozzetto per il target o il saggio SNP. Le operazioni disponibili negli esperimenti del sistema StepOne™ sono:

• Sconosciuta

• Controllo negativo

• Standard (esperimenti di curva standard e curva standard relativa)

• Controllo positivo (esperimenti di genotipizzazione)

• IPC (esperimenti di presenza/assenza)

• IPC bloccato (esperimenti di presenza/assenza)

temperatura di melting (Tm)

Punto nella curva di melting in cui i livelli della fluorescenza raggiungono il picco, ad indicare che il DNA a doppia elica amplificato si dissocia in DNA a singola elica.

templato Tipo di acido nucleico da aggiungere alla reazione PCR. Il templato raccomandato varia in base al tipo di esperimento.

tipo di esperimento I tipi di esperimenti eseguibili utilizzando il sistema StepOne™ sono:

• Curva standard

• CT comparativo (ΔΔCT)

• Curva standard relativa

• Curva di melting (non disponibile nel Design Wizard)

• Genotipizzazione

• Presenza/Assenza

Il tipo di esperimento selezionato influenza le schermate di impostazione, di esecuzione e di analisi.

Tm Abbreviazione per temperatura di melting (Tm).

touchscreen Display a sfioramento dello strumento per il controllo dello strumento stesso.

trascrittasi inversa Componente della reazione PCR che converte l'RNA in cDNA. La trascrittasi inversa viene aggiunta alla reazione PCR per eseguire il passaggio 1 della RT-PCR.


Glossario

Valore R2 Coefficiente di regressione calcolato dalla linea di regressione nella curva standard. Il valore R2 indica la vicinanza di accordo tra la linea di regressione della curva standard e i datapoint del CT individuale provenienti dalle reazioni standard. Un valore di 1,00 indica un perfetto accordo tra la linea di regressione e i datapoint.

velocità di rampa Velocità alla quale si verifica la rampa di temperatura durante la sessione analitica dello strumento. Le velocità di rampa disponibili includono la Rapida e la standard.

Indice-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Indice

Aacquisizione dati 1-2altri reagenti fluorescenti 1-6ampliconi, selezione piccoli 3-24aree dell'amplicone

contenuto G/C 3-24estremità del primer 3’ 3-24estremità della sonda 5’ 3-24individuazione 3-23selezione 3-23temperatura di melting 3-24

Bbinding-fluorocromo, metodi di 2-4

Ccampione 3-5, 3-6, 4-4, 5-4campione di riferimento 3-5, 3-6carryover, UNG per la riduzione al minimo 2-8condizioni ciclo termico

quantificazione DNA/cDNA 3-28quantificazione RNA 3-28RT-PCR in 1 fase 3-28RT-PCR in 2 fasi 3-29

contaminazione, DNA riduzione al minimo 2-8contenuto G/C e aree amplicone 3-24controlli negativi 3-5, 3-6, 4-4, 5-4controlli positivi 4-4controllo endogeno 3-6

Ddisegno degli esperimenti

genotipizzazione 4-14, 4-17presenza/assenza 5-15quantificazione 3-22

Eesperimenti con CT comparativo

componenti 3-6informazioni su 3-6Vedere anche esperimenti di quantificazione 3-6

esperimenti con curva standardcomponenti 3-5

informazioni su 3-5vedere anche esperimenti di quantificazione 3-5

esperimenti con curva standard relativacomponenti 3-5informazioni su 3-5vedere anche esperimenti di quantificazione 3-5

esperimenti di genotipizzazionecome si svolgono 4-4componenti 4-4conclusioni per le linee guida disegno saggi C-2descritti 4-4disegno 4-14, 4-17mancato abbinamento 4-5reagenti TaqMan 2-2selezione Master Mix 4-13, 4-16strumenti 4-4tipi di saggi 4-6

esperimenti di presenza/assenzacome si svolgono 5-5componenti 5-4definiti 5-4disegno 5-15esecuzione senza un IPC 5-4incorporamento di un IPC 5-5linee guida disegno saggi per il tipo di saggio

personalizzato 5-15reagenti TaqMan 2-2selezione Master Mix 5-14selezione reagenti per il tipo di saggio

personalizzato 3-25tipi di saggi 5-5

esperimenti di quantificazioneconclusioni per le linee guida disegno saggi C-1confronto 3-7CT comparativo 3-6curva standard 3-5curva standard relativa 3-5disegno 3-22linee guida disegno saggi per il tipo di saggio

personalizzato 3-22PCR in tempo reale 3-4reagenti SYBR Green 2-4, 3-32reagenti TaqMan 2-2selezione del tipo di reagente 3-13selezione di un metodo di quantificazione 3-5selezione Master Mix 3-21selezione reagenti per il tipo di saggio

personalizzato 3-25

Indice-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Indice

spiegati 3-4tipi di saggi 3-13

esperimenti end-pointgenotipizzazione 4-4presenza/assenza 5-4

Fflusso di lavoro del Design Wizard 1-6, 1-7, 1-8flusso di lavoro impostazione avanzata 1-6, 1-7, 1-8

Hhairpin loop e scelta del primer 3-9

IIPC 5-4, 5-5

Llimitazione primer, saggi multiplex 3-10linee guida disegno saggi

condizioni ciclo termico 3-27esperimenti di genotipizzazione C-2esperimenti di presenza/assenza 5-15esperimenti di quantificazione 3-22, C-1informazioni su C-1ottimizzazione concentrazione sonde 3-34ottimizzazione delle concentrazioni primer 3-30primer e sonda 3-23, 3-25selezione reagenti 3-25

Mmancato abbinamento, negli esperimenti di

genotipizzazione 4-5master mix

selezione per esperimenti di presenza/assenza 5-14selezione per esperimenti di quantificazione 3-21selezione per gli esperimenti di genotipizzazione 4-13,

4-16materiali di consumo, supportati 1-3matrice primer

definizione limiti B-2esempio di limitazione B-2modalità di utilizzo 3-31

Oottimizzazione 3-34

PPCR in tempo reale

esperimenti di quantificazione 3-4Processo di rilevamento TaqMan 2-2

PCR multiplexconfronto singleplex 3-10descritta 3-10limitazione per i primer 3-10primer rRNA B-1

PCR, prassi generali 2-9PDAR TaqMan per DA 4-12piccoli ampliconi, selezione 3-24primer

concentrazioni predefinite 3-30hairpin loop 3-9riepilogo delle linee guida disegno 3-25RT-PCR in 1 fase 3-9RT-PCR in 2 fasi 3-9

prodotto non specifico, contaminazione con fluorocromo SYBR Green 2-8

Qquantificazione DNA/cDNA, condizioni di ciclo

termico 3-28quantificazione RNA

condizioni ciclo termico 3-28, 3-29RT-PCR in 1 fase 3-26RT-PCR in 2 fasi 3-26

Rreagenti

altri fluorescenti 1-6considerazioni 2-7reagenti SYBR Green 1-6reagenti TaqMan 1-6, 2-2selezione 1-6, 2-6selezione tipo di saggio personalizzato 3-25

reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan 5-13

reagenti Master Mix Universalbenefici polimerasi 3-27

reagenti SYBR Greencome agiscono 2-5considerazioni per la selezione 2-7ottimizzazione esperimenti di quantificazione 3-32sviluppo 2-4

reagenti TaqMancome agiscono 2-2considerazioni per la selezione 2-7sviluppo 2-2tipi di esperimento 2-2

replicati 3-5, 3-6, 4-4, 5-4RT-PCR

confronto metodo 3-7, 3-10in 1 fase 3-8in 2 fasi 3-8

Indice-3Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Indice

RT-PCR in 1 faseinformazioni su 3-8primer utilizzati 3-9quantificazione RNA 3-26

RT-PCR in 2 fasiinformazioni su 3-8primer utilizzati 3-9quantificazione RNA 3-26

Ssaggi di controllo endogeno TaqMan 3-19saggi di espressione genica TaqMan 3-18, 5-10saggi di espressione genica TaqMan personalizzati 3-20,

5-12saggi di genotipizzazione SNP TaqMan

personalizzati 4-15saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci

TaqMan 4-11saggi genotipizzazione SNP TaqMan 4-10serie di diluizioni standard 3-5, 3-6sistema StepOne

acquisizione dati 1-2materiali di consumo 1-3tipi di esperimento 1-5tipi di reagente 1-6tipi di saggi 1-7

Software Primer Expressesperimenti di presenza/assenza 5-15esperimenti di quantificazione 3-22piccoli ampliconi 3-24saggi SNP 1-9

sondeottimizzazione concentrazione sonde 3-34riepilogo delle linee guida disegno 3-25sonde MGB TaqMan disponibili 2-4

sonde MGB TaqMan 2-3standard 3-5

Ttemperatura di melting e aree amplicone 3-24tipi di saggi

esperimenti di genotipizzazione 4-6esperimenti di presenza/assenza 5-5esperimenti di quantificazione 3-13saggi inventariati/prodotti su ordine 1-7saggi personalizzati 1-8, 1-9saggi pre-disegnati/convalidati 1-8selezione 1-7

tipo di saggio inventariato 1-7tipo di saggio personalizzato 1-8, 1-9

esperimenti di presenza/assenza 5-15esperimenti di quantificazione 3-22

tipo di saggio pre-disegnato/convalidato 1-8tipo di saggio prodotto su ordine 1-7trascrittasi inversa MultiScribe, definita 3-27

UUNG e riduzione al minimo carryover 2-8

Indice-4 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR SystemCONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Indice

www.appliedbiosystems.com

Worldwide Sales and Support

Applied Biosystems vast distribution and service network, composed of highly trained support and applications personnel, reaches 150 countries on six continents. For sales office locations and technical support, please call our local office or refer to our Web site at www.appliedbiosystems.com.

Applied Biosystems is committed to providing the world’s leading technology and information for life scientists.

Headquarters850 Lincoln Centre DriveFoster City, CA 94404 USA Phone: +1 650.638.5800 Toll Free (In North America): +1 800.345.5224 Fax: +1 650.638.5884

06/2010

Numero di catalogo 4377717 Rev. B

Date post:	03-Feb-2022
Category:	Documents
Upload:	others
View:	4 times
Download:	0 times

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System - Life Technologies

Documents