Date post: | 30-Jun-2015 |
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RNA-Seq-based analysis of the physiologic cold shock-induced changes in Moraxella catarrhalis gene expression.
Autores: Spaniol V., Wyder S., Aebi C.
Apresentação: Vitor Lima Coelho
Laboratório Nacional de Computação CientíficaMinistério de Ciência, Tecnologia e InovaçãoPetrópolis, Rio de Janeiro - Brazil
Tópicos• Introdução• Metodologia• Resultados e Discussão• Considerações finais
INTRODUÇÃO
Moraxella catarrhalis• Encontrada no trato respiratório superior
• Causadora de infecções:• Sinusite, conjuntivite, bronquite crônica, etc.
• Estudos clínicos revelam a sazonalidade das infecções e sua intensificação em períodos de inverno
Moraxella catarrhalis• A flora da nasofaringe humana é exposta
repetidamente à alterações súbitas de temperatura
• Choque frio pode ser clinicamente relevante durante períodos de clima frio pelo aumento temporário da virulência do organismo
Fonte: http://www.bacteriainphotos.com/Moraxella%20catarrhalis%20light%20microscopy.html
METODOLOGIA
Cepas da bactéria e condições de culturaRNA: preparaçãoAnálise de dados de RNA-SeqAnálise estatística
Cepas da bactéria e condições de cultura
• M. catarrhalis O35E• M. catarrhalis isolada clinicamente 415• Cultura:• 37º C• 200 rpm em BHI (DifcoTM) ou placas de ágar em uma atmosfera
contendo 5% CO2
• Alteração de temperatura da cultura:• Culturas expostas a 26oC e 37oC• Duração: 3 horas
RNA: preparação• Isolamento:• Rneasy Kit (Quiagen)
• Remoção de DNA:• Dnase I
• Análise de integridade:• Agilent bioanalyzer (Agilent technologies)
• Remoção de rRNA:• Ribo-zero rRNA removal kit
• Construção da biblioteca e sequenciamento:• TruSeq RNA sample preparation v2 (illumina)
Análise dos dados de RNA-Seq• Qualidade: • FASTQC
• Anotação: • RefSeq e PATRIC
• Alinhamento: • algoritmo BWA
• Quantificação de transcritos: • BEDTools
• Normalização e expressão diferencial: • DESeq
Análise dos dados de RNA-Seq• Quantidade de reads para cada gene:• Combinação dos dados de três réplicas biológicas
• Cálculo e ajuste dos P-values:• FDR (False Discovery Rate)
• Classificação funcional dos genes projetada a partir do genoma da M. catarrhalis RH4:• Identificação das proteínas ortólogas entre diferentes cepas
usando o melhor blast hit recíproco
Análise estatística• Desvio padrão médio: ± 1• Diferenças entre grupos:• Análise de variância one-way com correção de Bonferroni
(software Prism 5.01)• P < 0,05 foi considerado como significante estatisticamente
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Genes diferencialmente expressos envolvidos em:• Transcrição e replicação• Metabolismo de lipídio• Biossíntese do envelope proteico• Metabolismo de nitrogênio• Aquisição de ferro• Metabolismo de fosfato• Metabolismo de enxofre• Stress oxidativo• Metabolismo de nucleotídeos
Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC • RNA-Seq foi executado para 3 réplicas biológicas
• Crescimento em diferentes temperaturas utilizando Illumina HiSeq 2000 system.
Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC • Total de reads• = 183 milhões
• Total de reads de mapeamento único• = 47.900.062
• Reads alinhados com regiões de non-rRNA para cada amostra • = 3,2-14,5 milhões (25% do total de reads)
Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC
Amostra Reads alinhados Reads ≠ rRNAReads de mRNA (% de
todos os reads mapeados)
26°C_1 13.807.058 3.214.746 23%
26°C_2 27.880.294 9.966.862 36%
26°C_3 17.127.887 5.791.186 34%
37°C_1 19.038.969 5.038.161 26%
37°C_2 66.832.479 14.576.839 22%
37°C_3 38.898.117 12.527.014 32%
Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC • Alta similaridade dos níveis de expressão de RNA entre as duas
condições• R² > 0,97 e R² > 0,99, respectivamente
• 831 genes foram diferencialmente expressos de forma significativa, maior que 1.5-fold a 26oC• 429 genes regulados positivamente (RP)• 402 genes regulados negativamente (RN)
Genes diferencialmente expressos por função biológica
Validação por qRT-PCR
Transcrição e replicação• Indução da expressão por choque frio:• Vários genes (infB, rho, nusAB) envolvidos na modulação da
tradução foram induzidos por choque frio.• Fatores de transcrição (dksA, rho, nusA/B, nadR)• DNA-depent RNA polymerases (rpoA, rpoC)• Genes envolvidos na replicação de DNA, Recombinação e
reparo (dnaA/E, recN/G, topA)
Metabolismo de energia e carbono• Maior expressão a 37oC:• Enzimas glicolíticas (fbp, gapA, gpmI, eno, ppsA, aceE)• D-lactase dehydrogenase (dld)• L-lactase dehydrogenase (lldD)• Acetate kinase, necessário para conversão de acetato em acetyl-
CoA• Malic enzyme, que converte malato em piruvirato
• Regulados positivamente a 26oC:• Triose-phosphate isomerase (tpiA), catalisadora da conversão
reversível de glyceraldehyde-3-phosphate e dihydroxyacetone• Glucose-6-phosphate isomerase (pgi)
Metabolismo de energia e carbono• Regulados positivamente a 26oC:• Enzimas do ciclo de Krebs• Genes codificantes de succinate dehydrogenase (sdhA), aconitate
hydratase (acnB) e enzima do glyoxylate bypass (aceB)• Necessários para glucogênese
Metabolismo de Lipídeos• Indução a 26oC:• Genes codificantes de enzimas envolvidas na degradação de
ácidos graxos (fadJ, fadD/fadK, pgpA)• Expressão reduzida a 26oC:• Genes envolvidos na codificação de enzimas ou reguladores da
biossíntese de ácidos graxos (fabB, fabH, accABCD)• Indução após a exposição a 37oC:• ompE, putative Fadl homolog e long-chain-fatty-acid transporter
Biossíntese do envoltório celular• Os níveis de expressão de vários genes envolvidos na
biossíntese de LOS (lpxB, lpxX, kdtA e lgt6) foi elevado por choque frio.
• A expressão de genes codificadores de LpxB e LpxL acytransferases foram elevados a 37oC (incorporação de cadeias secundárias de acyl em lipídeo A)
• No entanto, verificou-se que 26oC pode não ser suficientemente baixo para induzir mudanças notáveis na estrutura LOS ou a ação recíproca da LpxB e LpxL acytransferases podem compensar esse efeito
Metabolismo de nitrogênio• Genes induzidos por choque frio:• Genes da via de desnitrificação (transformação de nitratos e
outras substâncias em gás nitrogênio): • Nitrite reductase (aniA), Nitric oxide reductase (norB), Nitrate ABC
transporter complex (nrtABCD)
• Gene repressor nsrR, indicando uma forma de prevenir a super-expressão descontrolada dos genes da via de desnitrificação
• Glutamine synthetase (glnA), envolvida na assimilação de nitrogênio
Aquisição de ferro• Regulação positiva em 26oC:• Genes codificadores de proteínas de ligação de transferrina
(tbpA/B) e lactoferrina (lbpA/B)• afeBCD gene cluster, envolvido na aquisição de ferro quelado
• Regulação negativa em 26oC:• Bacterioferritins A/B (bfrA/B) envolvida no armazenamento
intracelular de ferro (5.5 e 6.2-fold)
Metabolismo de fosfato• Os níveis de expressão de genes envolvidos no transporte de
fosfato e utilização tiveram um aumento significativo a 26oC em comparação com 37oC. Exemplo:• PstS -> Phosphate ABC transporter periplasmic phosphate-
binding protein (110-fold)• PstC -> Phosphate transport system permease protein (63-fold)
Metabolismo de enxofre• A transcrição dos genes envolvidos na via de assimilação de
enxofre (cys DHNI) foi regulada positivamente depois da exposição ao choque frio.• Via essencial para sobrevivência e expressão da virulência em
muitas bactérias patógenas.
Stress oxidativo
• Expressão gênica elevada a 37oC:• Genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo:
superoxide dismutase A (sodA), catalase (katA), alkyl hydroperoxide reductase (ahpC/F), etc.• Indica tolerância ao stress oxidativo a 37oC
Metabolismo de nucleotídeos
• Nucleotídeos são importantes substratos para síntese e reparo de DNA
• A exposição a 37oC induz a expressão de genes associados ao metabolismo de nucleotídeos• Maioria dos genes envolvidos na biossíntese de purina
(purCHMN, guaB, prsA) e pirimidina (pyrBDE, carA)
Considerações Finais• É concebível que o choque frio promova a virulência da M.
catarrhalis
• Por exemplo:• Ativa a expressão do gene uspA1, que aumenta a aderência da
bactéria nas células epiteliais da faringe
• Diversas vias metabólicas associadas à resposta ao stress são ativadas
• Indução de um complexo de mecanismos adaptativos
OBRIGADO!