TEN YEARS OF EXPERIENCE IN MOLECULAR PRENATAL DIAGNOSIS AND CARRIER TESTING FOR SPINAL MUSCULAR ATROPHY AMONG FAMILIES FROM SERBIAMarijana Miskovic , Tanja Lalic , Danijela Radivojevic , Sanja Cirkovic,Slavica Ostojic , Marija Guc-Scekic.

María Alejandra Gómez OtálvaroDaniela Hincapié Tabares

1. INTRODUCTION

MUSCULAR ATROPHY

SPINAL MUSCULAR ATROPHY

Affects Anterior Horn Cells Of The

Spinal Cord

Autosomal Recessive Hereditary

Disease

Neuromuscular Disease

SPINAL MUSCULAR ATROPHY

Alteration in SMN1 gene

Homologous gene SMN2Locus: 5q13

SMA TYPES

I

In neonatal period or

early infancy

-Muscle weakness -Arreflexia

-Flared thorax

-Globular belly

They are unable to sit

SMA TYPES

II

6-18 Months

-Some walk -Most wheelchair

-Quake in hands -Scoliosis

Respiratory complications

SMA TYPES

Tremor Weakness

Inability to run Frequent falls

IIIFrom 18 months Usually reaches adulthood

SMA TYPES

IV

Recurrent falls

In the second or

third decade of life

Symptoms worsen

over time Tremor

Hypotonia

Set of techniques available to know the proper training and correct development of the fetus before its birth.

PRENATAL DIAGNOSIS

PRENATAL DIAGNOSIS

NON-INVASIVE TECHNIQUES

CLINIC

DNA TEST MATERNAL FETAL

BLOOD

ANALYTICAL

ULTRASOUND

INVASIVE TECHNIQUES

BIOPSY*

AMNIOCENTESIS*

FUNICULOCENTESIS

RELATIONSHIP

SMA

SMN1 genePRENATAL DIAGNOSIS

2. GENERAL OBJECTIVE

GENERAL OBJECTIVE To describe ten years of experience of prenatal analysis of

spinal muscular atrophy (SMA).

3. MATERIALES Y MÉTODOS

DATOS GENERALES

The Mother and Child

Health Care Institute of Serbia Dr.

Vukan Cupic

44 Familias Serbias con 1 individuo con

SMA

Enero 1 de 2003-

Diciembre 31 de 2013

Análisis prenatal en 66 embarazos de

alto riesgo

Los estudios familiares se dividieron en:

Grupo 1: 36 familias con al menos un niño afectado con deleción homocigótica de los exones 7 y 8 del gen SMN1.

Grupo 2: 5 familias con al menos un niño afectado sin confirmación molecular genética de la enfermedad.

Grupo 3: 3 familias en donde uno de los padres debía tener historia familiar de un individuo afectado con deleción homocigótica del gen SMN1.

EXTRACCIÓN DEL DNA

1. Lisis celular

2. Tratamiento con RNAsa

3. Precipitación de proteínas

4. Precipitación

de DNA

5. Almacenamiento en TE

PCR

• Es una técnica desarrollada por Kary Mullis.

• Amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA o indirecta de un RNA.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA-PCR

Desnaturalización: calentamiento 90-97°.

Alineamiento: hibridación de DNA con primer´s y DNTp´s (37-65°).

Síntesis: amplificación (72-75°). Replicación en dirección 5´-3´.

1. Conocer la secuencia que rodea al sitio de restricción.

2. La PCR amplifica la secuencia con el sitio de restricción.

3. Se corta con enzimas de restricción.

PCR-RFLP

Los productos se ven con electroforesis en gel de agarosa con LUV.

PCR-RFLP

BAYESIAN ANALYSIS

• Is a method of combining probabilities and which is used to calculate the probability of having or not having a disease causing mutation after a negative test is obtained.

MAPAS GENÉTICOS

Representación gráfica de la ordenación y ubicación de los genes en cada cromosoma.

MAPEO/RFLP

Se basa en la detección de aquellas variaciones de la secuencia del DNA que tienen como consecuencia un cambio en un sitio de restricción.

RFLP- polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción.

MLPA

• Detección de variación en el número de copias de múltiples secuencias de ADN en una única reacción (más de 50 secuencias génicas o genes)

Multiplex Ligation

Dependent Probe

Amplification

Técnica descrita por

Schouten JP et al en 2002.

Procedimiento de

cuantificación relativa basado

en la PCR.

Detección de variación en el

número de copias de

secuencias de DNA.

Detección de deleciones o inserciones

que afectan un exón o más.

4. RESULTADOS

66 MUESTRAS

FETALES

13 CON DELECIÓN HOMOCIGÓTICA EN GEN

SMN1

12 CASOS:

DELECIÓN EN AMBOS EXONES

1 CASO:

ELIMINACIÓN DE UN SÓLO EXÓN

RESULTADOS

7 8 7

1 caso Embarazo dicigótico->ambos hijos afectados

5 Control (-)6 Control (+)

Gen homocigoto*

RESULTADOS

RESULTADOS

ControlHermano PapáMamáTío

RESULTADOS

ControlMamáPapá

5. DISCUSSION

AUTOR QUOTE AGREE DISAGREE

Wirth B. [7] Because 94% of clinically typical SMA patients have the homozygous deletion in SMN1. .

Miskovic M et al [13] Among the second group of families with at least 1 affected child without molecular genetic confirmation of the disease, prenatal diagnosis was offered on the basis of data from a previous study showing that 81% of Serbian individuals affected with SMA had the homozygous SMN1 deletion that causes the disease.

.

DISCUSSION

AUTOR QUOTE AGREE DISAGREE

Somerville MJ et al [16] False negative results might be expected in cases of individuals who are compound heterozygous or (very rarely) homozygous for small mutations in the SMN1 gene.

.

Wirth B et al [17] Another concern in the prenatal prediction of SMA is that the SMN1 locus has a high rate of the novo deletions and rearrangements, which are found in 2% of affected individuals.

.

DISCUSSION

6. CONCLUSSIONS

• Genetic mapping was really useful for this study because it can locate the gene which is responsible of a hereditary disease, even without knowing the identity of the gene or the molecular basis of the disease. This technique can be used in a lot of inherited disorders such as SMA, with the purpose of decreasing the morbidity and mortality rate of the disease by doing prenatal diagnosis on the fetuses.

CONCLUSSIONS

Daniela Hincapié Tabares

• PCR, RFLP and genetic mapping like MLPA, are laboratory techniques with a huge utility in the field of medicine, especially in the discovery of genetic diseases because these methods give an amplification of the DNA which allows a more detailed observation.

CONCLUSSIONS

Daniela Hincapié Tabares

• By understanding the mechanisms affected by the absence of the SMN1 gene, we will be able to design effective therapeutic strategies to prevent neuronal degeneration and death in patients with SMA.

CONCLUSSIONS

Maria Alejandra Gómez Otálvaro

• Early diagnosis of any congenital defect in the fetus is of vital importance as it would help to avoid unnecessary risks to the mother and child and try to improve the quality of life of the newborn.

CONCLUSSIONS

Maria Alejandra Gómez Otálvaro

7. MAPAS CONCEPTUALES

Daniela Hincapié Tabares

Maria Alejandra Gómez Otálvaro

8. BIBLIOGRAFÍA

BIBLIOGRAFÍA• Martínez L.M., Vargas N., Toro A.E., Pamplona A.P., Quevedo

E. Biología molecular. 7°edición. Medellín, Colombia: UPB; 2012.

• Gómez J.E., González A., Castaño J.C., Patarroyo M.A. Biología molecular: principios y aplicaciones. Medellín, Colombia: CIB; 2011.