Bacterial concentration detection in waterby microfabricated impedance biosensor

Dr. Marco GrossiDipartimento di Elettronica (D.E.I.S.)

Università di Bologna

Strumento portatile a basso costo per Strumento portatile a basso costo per analisi batteriologica delle acqueanalisi batteriologica delle acque

�� Sistema biosensore portatile per analisi Sistema biosensore portatile per analisi ““in situin situ”” delle acque (anche per acque salate).delle acque (anche per acque salate).�� Analisi piAnalisi piùù rapide di quelle tradizionali con rapide di quelle tradizionali con ““conta in piastraconta in piastra””..�� Strumento di semplice utilizzo: nessuna necessitStrumento di semplice utilizzo: nessuna necessitàà di invio dei dati a un laboratorio e di personale di invio dei dati a un laboratorio e di personale

specializzato.specializzato.�� PossibilitPossibilitàà di analisi selettive su particolari specie batteriche.di analisi selettive su particolari specie batteriche.�� Utilizzo di tecnologie ICT per invio dati in modo wireless. Utilizzo di tecnologie ICT per invio dati in modo wireless. �� Possibile applicazione a campioni diversi dallPossibile applicazione a campioni diversi dall’’acqua: prodotti lattiero caseari, succhi di frutta, suolo acqua: prodotti lattiero caseari, succhi di frutta, suolo

ecc.ecc.

• Normative relative alla presenza di specie microbiche

La valutazione della popolazione batterica riveste un ruolo fondamentale nel monitoraggio ambientale.

Valori elevati di concentrazione batterica e/o la presenza di particolari specie patogene possono rappresentare una possibile minaccia alla salute umana.

Lo stato di contaminazione microbiologica delle acque viene effettuato valutando la concentrazione di coliformi.

Acque potabili Acque balneabili Acque reflue immesse in corpi idrici

Coliformi totali Assenti in 100 ml 2000 cfu in 100 ml 20000 cfu in 100 ml

Coliformi fecali Assenti in 100 ml 100 cfu in 100 ml 12000 cfu in 100 ml

Streptococchi fecali Assenti in 100 ml 100 cfu in 100 ml 2000 cfu in 100 ml

Sulla base della concentrazione di coliformi fecali (Escherichia coli) viene definito l’indice IFEC che suddivide le acque in 4 classi fondamentali:

• classe I : IFEC ≤ 300 ambiente non inquinato• classe II : 301 ≤ IFEC ≤ 2000 ambiente leggermente inquinato• classe III : 2001 ≤ IFEC ≤ 20000 ambiente inquinato• classe IV : IFEC ≥ 20001 ambiente fortemente inquinato

• Riproduzione delle cellule batteriche

I batteri si riproducono per scissione binaria. Durante questo processo si ha:• la duplicazione del cromosoma batterico• l’allungamento della cellula• la formazione di un setto trasverso in posizione centrale• la suddivisione di una copia del cromosoma e del citoplasma nelle due cellule figlie

La crescita di una popolazione batterica si compone di quattro fasi.A) Fase di latenza: adattamento dei

microorganismi al mezzo di coltura. Non si ha crescita batterica.

B) Fase esponenziale: fase in cui i batteri si riproducono alla massima velocità. Il numero di batteri raddoppia a intervalli di tempo regolari (tempo di generazione medio TG).

C) Fase stazionaria: per effetto della mancanza di nutrienti e dell’accumulo di metaboliti tossici la crescita batterica rallenta fino ad arrestarsi.

D) Fase di morte: il numero di celle vitali decresce in modo esponenziale.

• La tecnica tradizionale di conta in piastra

Rappresenta lo standard di riferimento per la valutazione della concentrazione batterica. La concentrazione batterica viene valutata sulla base del numero di colonie (colony forming unit, cfu) che crescono su piastre (Petri plates) riempite con un substrato che favorisce la crescita batterica e inoculate con diluizioni seriali del campione da analizzare.

• Le piastre sono riempite con un substrato di crescita che favorisce lo sviluppo batterico.Lauria Bertani : conc. batterica totale.Mc Conkey agar : conc. coliformi.Mannitol salt agar: conc. staffilococchi• Diluizioni seriali (10-2, 10-4, 10-6) del campione vengono effettuate in soluzione salina sterile.• Le piastre sono inoculate con 100 µl del campione diluito e incubate a una temperatura che favorisce la proliferazione batterica per 24-72 ore.• Il numero di colonie cresciute sulla piastra sono contate e la carica batterica del campione stimata. Vantaggi Svantaggi

• Standard di riferimento per le misure di concentrazione batterica.• Risultati accurati e affidabili.

• Tempi di risposta elevati (24-72 ore).• E’ una tecnica di laboratorio che richiede personale specializzato e non è automatizzabile.

• La tecnica impedenziometrica: principio di funzionamento

Il campione da analizzare viene introdotto nel sensore a diretto contatto con gli elettrodi e incubato a una temperatura che favorisce la crescita batterica.

Se la concentrazione batterica è inferiore a una soglia critica (≈ 107 cfu/ml), I parametri elettrici misurati si mantengono costanti.

Quando la concentrazione batterica raggiunge 107

cfu/ml si ha variazione dei parametri elettrici. L’intervallo di tempo per raggiungere la soglia è detto Detect Time (DT).

I valori misurati di DT sono proporzionali al logaritmo della concentrazione batterica iniziale.

Campioni con forte concentrazione batterica sono caratterizzati da bassi valori di DT, mentre campioni poco contaminati da valori di DT elevati.

• Strumenti commerciali basati sulla tecnica impedenziometrica

Bactometer (Biomeriex, Grenoble, Francia)

BacTrac(Sy-Lab, Purkersdorf, Austria)

• Elettrodi in acciaio inox• Fino a 128 campioni analizzabili in parallelo• Cella di capacità 2 ml• Temperatura target: 10°C sotto TAMB –55°C• Altezza: 81 cm• Lunghezza: 188 cm• Profondità: 61 cm• Peso: 130.2 Kg

• Elettrodi in acciaio inox• Fino a 64 campioni analizzabili in parallelo• Cella usa e getta di capacità 20 ml• Cella dotata di 4 elettrodi• Temperatura target: 0°C – 56°C• Dimensioni: 400 x 440 x 535 mm• Peso: 20 Kg

Malthus(Malthus Instruments Ltd, Bury, Gran Bretagna)

RABIT(Don Whitley Scientific, West Yorkshire, Gran Bretagna)

• Elettrodi in platino• Effettua solo misure della componente resistiva• Fino a 256 campioni analizzabili in parallelo• Cella di capacità 2 − 10 − 100 ml• Temperatura target: 5°C − 45°C• Dispone di stampante e plotter digitale

• Elettrodi in acciaio inox• Fino a 32 campioni analizzabili in parallelo

(estendibili a 512 con moduli aggiuntivi)• Cella di capacità 2 – 10 ml• Temperatura target: 4°C sopra TAMB − 55°C• Dimensioni: 400 x 600 x 400 mm• Peso: 35 Kg

• Biosensore portatile basato sulla tecnica impedenziometrica

È stato sviluppato un sistema a biosensore portatile per poter realizzare misure in-situ di carica batterica. Il sistema è di facile utilizzo e non richiede la presenza di personale qualificato.

La camera di incubazione usa e getta è costituita da due parti separate:

• una camera permanente che integra al suo interno il sensore di temperatura, il sistema di riscaldamento e tutta la circuiteria necessaria per interfacciarsi con la scheda di misura dei parametri elettrici• un sensore usa e getta sterile, dotato di una coppia di elettrodi in acciaio inox di forma semisferica che si collegano alla camera permenente tramite contatti striscianti.

La procedura per effettuare la misura è la seguente:

• introduzione del campione nel sensore usa e getta• alloggiamento del sensore usa e getta nella camera permanente• inizio della misura• al termine della misura il sensore con il campione contenuto viene gettato via

Struttura della camera di incubazione: 1) sensore di temperatura LM135, 2) contatti striscianti per gli elettrodi della camera usa e getta, 3) camera usa e getta, 4) diffusore termico, 5) isolamento termico, 6) cella di Peltier, 7) ventola di raffreddamento.

• Utilizzo di un sensore microfabbricato per la rilevazione dellaconcentrazione batterica con metodo impedenziometrico

Si è studiata la possibilità di utilizzare un sensore microfabbricato per la misura della concentrazione batterica con metodo impedenziometrico.

Vantaggi : dimensioni ridotte del sensore, possibilità di utilizzare piccole quantità di campione (µl).

Il sensore è stato testato utilizzando un ceppo batterico appartenete ai coliformi isolato nelle acque di fiume.

I campioni da analizzare sono stati realizzati inoculando diverse concentrazioni del batterio in Lauria Bertani

modificato al fine di ridurre la concentrazione salina. La composizione del substrato di crescita (pH 7.0) per 1

litro di acqua distillata è: Triptone 10.0 g, Estratto di lievito 5.0 g.

Il sensore e il campione da analizzare sono stati incubati a una temperatura di 37 °C per un tempo di 24 ore.

La misura dei parametri elettrici è stata effettuata a intervalli regolari di 5 minuti.

Il campione da analizzare è stato posto a diretto contatto con il sensore dotato di elettrodi planari in oro di area

1 mm2 e separati da 100 µm.

Agli elettrodi è stata applicata una tensione di test sinusoidale di ampiezza 10 mVPP e frequenza compresa nel

range 20 Hz – 2 MHz.

Il modello elettrico equivalente del sistema costituito dal sensore e dal campione a diretto contatto è mostrato

in figura (a). I parametri elettrici del modello sono stati calcolati con il software MEISP v 3.0.

Ri : resistenza dell’interfaccia elettrodo-soluzione

Rm : resistenza della soluzione

Cpar : capacità dovuta al substrato di AlN del sensore e alle particelle polarizzabili presenti in soluzione

α : parametro empirico del Constant Phase Element (CPE). Nel caso di capacità ideale α = 1

Q : capacità dell’interfaccia elettrodo-soluzione

I parametri elettrici sensibili allo sviluppo batterico del campione sono la capacità di interfaccia Q e la

resistenza della soluzione Rm. I valori misurati di Q sono però caratterizzati da basso rapporto segnale-rumore

e scarsa ripetibilità. La resistenza della soluzione è il parametro più affidabile per la stima della

concentrazione batterica.

Campioni maggiormente contaminati sono caratterizzati da valori più bassi del Detect Time (tempo

necessario per avere variazione del parametro elettrico rispetto al valore di baseline).

• nel caso di un campione con contaminazione 102 cfu/ml si ha DT = 460 minuti (7 ore e mezzo).

• nel caso di un campione con contaminazione 106 cfu/ml si ha DT = 225 minuti (circa 3 ore e mezzo).

La misura della resistenza del mezzo Rm richiede un approccio multi-frequenza (misura dei parametri elettrici

|Z| e Arg(Z) su un ampio range di frequenze e fitting dei dati misurati utilizzando un algoritmo numerico).

Si è studiata la possibilità di stimare la concentrazione batterica con misure di |Z| a singola frequenza.

Il sensore opera correttamente con frequenze del segnale di test fino a 1 MHz (gli strumenti da laboratorio e il

sistema portatile sono caratterizzati da una massima frequenza di lavoro non superiore a 10 kHz).

L’utilizzo di un segnale di test a frequenza più elevata permette di ottenere curve più regolari con baseline più

piatte, un più elevato rapporto segnale-rumore e in generale permette una determinazione più accurata del

Detect Time.

• Conclusioni

• Prospettive future

Sviluppo di un sistema biosensore per la valutazione della concentrazione batterica usando il metodo impedenziometrico. Applicazioni all’analisi delle acque di fiume e

di mare, ai prodotti dell’undustria alimentare lattiero casearia etc.

Utilizzo di un sensore microfabbricato (riduzione delle dimensioni del sistema ed analisi su piccoli volumi di campione) per la misura della concentrazione batterica.

Il monitoraggio della resistenza della soluzione permette una affidabile determinazione della concentrazione batterica.

Misure dei parametri elettrici a singola frequenza sono possibili utilizzando frequenze elevate per il segnale di test (> 100 kHz).

Studio di geometrie alternative per il sensore e di substrati di crescita che massimizzino le prestazioni (elevata accuratezza della concentrazione batterica

stimata e riduzione dei tempi di misura).

• Bibliografia

1) Presentazione della versione portatile del sistema biosensore

Autori : Marco Grossi, Massimo Lanzoni, Anna Pompei, Roberto Lazzarini, Diego Matteuzzi, Bruno Riccò.Titolo : An embedded portable biosensor system for bacterial concentration detection.Rivista : Elsevier Biosensors and Bioelectronics. Agosto 2010.

2) Applicazione del metodo impedenziometrico alla determinazione della concentrazione batterica in miscela gelato

Autori : Marco Grossi, Massimo Lanzoni, Anna Pompei, Roberto Lazzarini, Diego Matteuzzi, Bruno Riccò.Titolo : Detection of microbial concentration in ice-cream using the impedance technique.Rivista : Elsevier Biosensors and Bioelectronics. Gennaio 2008.

Autori : Marco Grossi, Anna Pompei, Massimo Lanzoni, Roberto Lazzarini, Diego Matteuzzi, Bruno Riccò.Titolo : Total bacterial count in soft-frozen dairy products by impedance biosensor system.Rivista : IEEE Sensors Journal. Ottobre 2009.

3) Applicazione del metodo impedenziometrico alla determinazione della concentrazione batterica in latte crudo di vacca

Autori : Marco Grossi, Massimo Lanzoni, Anna Pompei, Roberto Lazzarini, Diego Matteuzzi, Bruno Riccò.Titolo : A portable biosensor system for bacterial concentration measurements in cow’s raw milk.Conferenza : IEEE International Workshop on Advances in Sensors and Interfaces (IWASI) 2011, Borgo Egnazia, Savelletri di Fasano (BR), 28-29 Giugno 2011.

4) Applicazione del metodo impedenziometrico per la valutazione del contenuto microbico delle acque

Autori : Marco Grossi, Anna Pompei, Massimo Lanzoni, Roberto Lazzarini, Diego Matteuzzi, Bruno Riccò.Titolo : Detection of coliforms concentration in water samples by portable impedance-based biosensor system.Conferenza : ECOMONDO 2010, Rimini Fiera (RN), Italy, 3-6 Novembre 2010.

5) Applicazione del metodo impedenziometrico per la determinazione della concentrazione di lattobacilli in campioni di birra

Autori : Anna Pompei, Marco Grossi, Massimo Lanzoni, Giuseppe Perretti, Roberto Lazzarini, Bruno Riccò, Diego Matteuzzi.Titolo : Feasibility of lactobacilli concentration detection in beer by automated impedance technique.Rivista : MBAA Technical Quarterly. Aprile 2012.