Bakterielle Kontamination von Thrombozytenkonzentraten und ... · Sterilisation der Haut vor der...

Aus dem

Institut für Hygiene und Mikrobiologie

der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. Sören G. Gatermann

Bakterielle Kontamination von

Thrombozytenkonzentraten und Screeningmethoden

zur Reduktion des Risikos bakteriell bedingter

Transfusionsreaktionen

Inaugural Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

Vorgelegt von

Jens Asmus

aus Bochum

2011

Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla

Referent: Prof. Dr. med. Sören G. Gatermann

Korreferent: Prof. Dr. med. Jürgen Bux

Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2012

Abstract

Jens Asmus

Bakterielle Kontamination von Thrombozytenkonzentraten und Screeningmethoden zur Reduktion

des Risikos bakteriell bedingter Transfusionsreaktionen

Problem:

Thrombozytenkonzentrate (TK) bergen von allen Blutkomponenten das höchste Risiko einer

transfusionsassoziierten Sepsis. Das Screening von TK auf bakterielle Kontamination mit

Kultivierungsmethoden ist in einigen Ländern etabliert, um die Transfusion kontaminierter TK zu

verhindern. In Deutschland liegen Daten zur Prävalenz von Bakterien in TK aus verschiedenen

Herstellungsmethoden und Erfahrungen mit dem Bakterienscreening von TK nicht vor.

Methode:

In einer prospektiven Multicenterstudie wurden 52.243 TK (15.198 Apherese-TK, 37.045 Pool-TK) in

aerober und anaerober Kultur (BacT/ALERT, bio Mérieux) untersucht und bei positivem Testergebnis

von der Transfusion ausgeschlossen. An einer Teilmenge der TK wurden mehrere

Detektionsmethoden für Bakterien eingesetzt und verglichen. Über ein Monitoring der klinischen

Verträglichkeit der TK sollten Zeichen transfusionsassoziierter Nebenwirkungen erfasst und zur

Ursachenabklärung sollten Nachuntersuchungen erfolgen.

Ergebnisse:

In 135 TK (0,26%) konnten Bakterien in der 1. Kultur nachgewiesen werden, bei 37 TK (0,07%) wurde

die Kontamination in einer 2. Kultur bestätigt. Apherese- und Pool-TK zeigten keinen Unterschied.

Keime der Hautflora waren die häufigsten Kontaminanten. Aufgrund eines späten Kultursignals

konnten 66% der kontaminierten TK nicht von der Transfusion ausgeschlossen werden. Das klinische

Follow up deckte 6 Fälle mit febrilen Transfusionsreaktionen (TR) auf, die nicht weiter untersucht

wurden. 2 Einheiten eines als negativ getesteten Apherese-TK verursachten

schwerwiegende/tödliche septische TR. Der Methodenvergleich mehrerer Detektionsverfahren

bestätigte BacT/ALERT als sensitivste Methode

Diskussion:

Das Screening von TK auf bakterielle Kontamination ist nur bedingt geeignet, die Transfusion

kontaminierter TK zu verhindern. Es ist begleitet von dem Risiko falsch-negativer Testergebnisse. Die

Bevorzugung von Apherese-TK gegenüber Pool-TK aus 4 Vollblutspenden senkt das Risiko septischer

TR nicht. Transfundierende Ärzte müssen auch milde TR melden und einer Aufklärung der Ursache

zuführen. Mit dem Screening kann das Risiko der Bakterienübertragung zwar gesenkt, aber nicht

beseitigt werden.

Für meine Eltern, meine Frau und meinen Sohn.

- 5 -

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung - 10 -

1.1. Historischer Überblick - 10 -

1.2. Inzidenz transfusionsassoziierter septischer Reaktionen - 18 -

1.3. Ursachen der bakteriellen Kontamination von Blutkomponenten - 23 -

1.4. Strategien zur Reduktion des Kontaminationsrisikos - 26 -

1.5. Vorgaben zur Risikobeschränkung in Deutschland - 31 -

1.6. Screening von Thrombozytenkonzentraten auf bakterielle

Kontamination vor der Abgabe zur Anwendung - 32 -

2. Fragestellung - 35 -

3. Material und Methoden - 36 -

3.1. Material - 38 -

3.1.1. Leukozytendepletiertes Pool-Thrombozytenkonzentrat mit

Plasma (Plasma-PTK) - 38 -


Thrombozytenlagerlösung T-Sol (T-Sol-PTK) - 39 -

3.1.3. Apherese-Thrombozytenkonzentrat (ATK) - 39 -

3.1.4. Art und Anzahl der getesteten Thrombozytenkonzentrate - 40 -

3.2. Methoden - 40 -

3.2.1. Blutspenderauswahl und Vollblutspende - 40 -

3.2.2. Präparation von Pool-Thrombozytenkonzentraten - 44 -

3.2.3. Herstellung von Apherese-Thrombozytenkonzentraten - 46 -

3.3. Teste auf bakterielle Kontamination, Keimbestimmung,

Keimdifferenzierung - 47 -

3.3.1. Probenziehung und Verimpfung - 47 -

3.3.2. BacT/ALERT-Testung - 48 -

3.3.3. Testung mittels Scansystem™ - 51 -

3.3.4. Testung mittels PALL eBDS - 56 -

3.4. Vorgehen bei positiven Testergebnissen - 59 -

3.4.1. Positive Ergebnisse im BacT/ALERT-System - 59 -

3.4.2. Positive Ergebnisse im Scansystem™ - 60 -

3.4.3. Positive Ergebnisse im PALL eBDS - 60 -

3.4.4. Testung der verbundenen Erythrozytenkonzentrate bei

positiven Ergebnissen - 61 -

3.5. Fragebogen zur klinischen Verträglichkeit der Thrombozytenkonzentrate - 61 -

- 6 -

3.6. Mikrobiologische Untersuchungen - 62 -

3.7. Datenerfassung und Auswertung - 62 -

4. Ergebnisse - 64 -

4.1. Bakterielle Kontaminationsraten in der BacT/ALERT-Testung - 64 -

4.1.1. Bakterienspezies - 68 -

4.1.2. Testergebnisse verbundener Erythrozytenkonzentrate - 69 -

4.1.3. Bakterienspezies in potentiell positiven Thrombozytenkonzentraten,

transfundierte Einheiten und klinischer Follow up - 70 -

4.1.4. Bakterienspezies in bestätigt positiven Thrombozytenkonzentraten,

transfundierte Einheiten und klinischer Follow up - 72 -

4.2. Septische Transfusionsreaktionen bei falsch negativ getesteten

Thrombozytenkonzentraten - 73 -

4.3. Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben - 74 -

4.4. Ergebnisse der Testung mit dem ScansystemTM und dem PALL eBDS - 76 -

4.4.1. Sensitivität und Spezifität - 78 -

5. Diskussion - 80 -

5.1. Kontaminationsraten von Thrombozytenkonzentraten - 80 -

5.2. Bakterienspezies und ihre klinische Bedeutung - 87 -

5.3. Wirksamkeit des Bakterienscreenings zur Vermeidung der Transfusion

kontaminierter Thrombozytenkonzentrate - 89 -

5.4. Klinischer Follow up kontaminierter Thrombozytenkonzentrate - 91 -

5.5. Zum Risiko septischer Transfusionsreaktionen bei falsch

negativen Testergebnissen - 93 -

5.6. Zum Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben - 94 -

5.7. Bewertung des Vergleiches von BacT/ALERT, ScansystemTM und PALL eBDS - 95 -

5.8. Aussichten und Empfehlungen - 97 -

6. Zusammenfassung - 101 -

7. Literaturverzeichnis - 103 -

- 7 -

Verzeichnis der Abkürzungen

TK Thrombozytenkonzentrat

PTK Pool-Thrombozytenkonzentrat

Plasma-TK Pool-TK mit Plasma

T-Sol-TK Pool-TK mit Thrombozytenlagerlösung T-Sol

ATK Apherese-Thrombozytenkonzentrat

EK Erythrozytenkonzentrat

BC Buffy-Coat

TR Transfusionsreaktion

DRK Deutsches Rotes Kreuz

BRK Bayrisches Rotes Kreuz

ARC Amerikanisches Rotes Kreuz

AABB American Association of Blood Banks

FDA Food and Drug Administration (USA)

BPAC Blood Products Advisory Committee der FDA

CDC Centers for Disease Control (USA)

DoD Department of Defense (USA)

SHOT Serious Hazards of Transfusion (UK)

CFU/ml Colony Forming Units per Milliliter

- 8 -

Verzeichnis Tabellen

Tabelle 1: Übersicht der Gesamtzahl an TK, Seite 37

Herstellungsort, Herstellungsart und mit

welchem Verfahren getestet

Tabelle 2: Anzahl der TK in der Paralleltestung mit den Seite 37

verschiedenen Testverfahren

Tabelle 3: Zeitabstände zwischen den Arbeitsschritten Seite 48

Präparation und Probenziehung bzw. Inkubation

Tabelle 4: Resultate der Sterilitätstestung der TK Seite 65

Tabelle 5: Positive Testresultate in aerober/anaerober Seite 66

Kultur

Tabelle 6: Zeitabstand zwischen Abschluss der Testung Seite 67

und erstem positiven Signal

Tabelle 7: Bakterienspezies in potentiell und bestätigt Seite 68

positiven TK

Tabelle 8: Potentiell positive TK: Bakterienspezies, Inku- Seite 71

bationszeit bis zum ersten positiven Signal,

transfundierte TK und klinisches Follow-up

Tabelle 9: Bestätigt positive TK: Bakterienspezies, Inku- Seite 72

bationszeit bis zum ersten positiven Signal,

transfundierte TK und klinisches Follow-up

Tabelle 10: RAPD-PCR Ergebnisse: Propionibakterien Seite 75

Isolate aus bestätigt positiven Pool-TK

und assoziierten EK

Tabelle 11: Pulsfeld-Gelelektrophorese: Typisierung von Seite 76

Staphylokokken Subspezies

- 9 -

Tabelle 12: Vergleich von BacT/ALERT, ScansystemTM Seite 78

und PALL eBDS

Tabelle 13: Überblick über Methoden und Ergebnisse Seite 82

von Studien zum BacT/ALERT-Screening von

Thrombozytenkonzentraten

Verzeichnis Abbildungen

Abbildung 1: Ablauf des Spendevorgangs Seite 43

Abbildung 2: 4 Buffy-Coats und 1 zugehöriges Plasma Seite 45

Abbildung 3: Poolen der 4 BC und des Plasmas Seite 45

Abbildung 4: Herstellung von Pool-TK (Schema) Seite 46

Abbildung 5: Verimpfungsnadel wird an den Seite 49

TK-Probenbeutelangeschweißt

Abbildung 6: Zeitschema BacT/ALERT Seite 51

Abbildung 7: ScansystemTM Thrombozyten-Kit Seite 52

Abbildung 8: Membranvalidierung des ScansystemTM Seite 54

Abbildung 9: Zeitschema ScansystemTM Seite 55

Abbildung 10: PALL eBDS-Probenbeutel Seite 56

Abbildung 11: PALL eBDS Analyzer Seite 57

Abbildung 12: Zeitschema PALL eBDS Seite 58

Abbildung 13: Definition der Testresultate des Seite 64

BacT/ALERT-Screenings

- 10 -

1. Einleitung

1.1. Historischer Überblick

Die Übertragung von Bakterien durch Bluttransfusionen ist ein lange

bestehendes Problem und stellt das älteste transfusionsassoziierte

Infektionsrisiko dar. Während bemerkenswerte Fortschritte bei der

Spenderauswahl und den Laboruntersuchungen an Blutspenden zu

einer massiven Reduzierung der Übertragung hauptsächlich viraler

Infektionserregern führten, ist die bakterielle Kontamination von

Blutkomponenten und damit die Übertragung von Bakterien auf den

Empfänger als potentiell schwerwiegendes Transfusionsrisiko in den

Vordergrund getreten.

Bereits aus den Anfangszeiten der Therapie mit Blutpräparaten zu

Beginn des 20. Jahrhunderts liegen Berichte der Übertragung von

bakteriellen Infektionskrankheiten vor. Damals wurde das Blut dem

Empfänger mittels vaskulärer Anastomosen direkt vom Spender

transfundiert (Schmidt, 2001). 1915 wurde zum ersten Mal von einer

direkten Übertragung der Syphilis durch Bluttransfusion berichtet

(Orton, 2001). Die Infektionskrankheit war damals weit verbreitet und

aufgrund des Fehlens verlässlicher Nachweisverfahren war das Risiko

der Übertragung sehr hoch. Als die Technik Fortschritte machte, Blut

außerhalb des menschlichen Körpers für bestimmte Zeit gekühlt

gelagert werden konnte, die antibiotische Therapie die Prävalenz der

Syphilis radikal senkte und 1940 das Spenderblut mit neuen

Nachweismethoden untersucht werden konnte, wurde das Problem der

transfusionsassoziierten Übertragung der Syphilis-Erreger weitgehend

beseitigt (Dood RY, 2001). In der ersten Auflage der Standards der

- 11 -

American Association of Blood Banks wurde bereits ein akzeptabler

serologischer Test auf Syphilis für die Spenderblute gefordert

(Standards for a blood transfusion service, 1958). Das Blut sollte nicht

zur Transfusion verwendet werden, bevor dieser Test nicht negativ

ausgefallen war.

Mit steigender Bedeutung der Blutpräparate als therapeutisches Mittel

wurde das Problem der Übertragung von anderen Bakterien registriert.

1939 veröffentlichte Novak im Journal of the American Medical

Association einen Artikel über das Problem der bakteriellen

Kontamination (Novak, 1939). Er machte darauf aufmerksam, dass Blut

ein Nährmedium für Bakterien sei und schätzte, dass 5% der

Blutprodukte, welche für 10 Tage in Glasflaschen gelagert wurden,

massiv kontaminiert seien. Er vermutete, dass der Vorgang der

Blutspende die hauptsächliche Quelle für das Eindringen von Bakterien

in das gesammelte Blut ist. Novak war sich bewusst, dass die komplette

Sterilisation der Haut vor der Phlebotomie unmöglich ist und immer

einige Bakterien der antiseptischen Behandlung entkommen. Bei der

Punktion der Haut kann somit die Nadel Bakterien aufnehmen und

diese gelangen mit hoher Wahrscheinlichkeit mit dem Blut in die

Flasche. Außerdem merkte er an, dass der Nachweis der Bakterien

speziell nach kurzer Lagerungszeit, wenn die Anzahl der Bakterien

gering ist, eine unsichere Prozedur sei.

Der erste Bericht über eine Transfusionsreaktion im Zusammenhang mit

bakterieller Kontamination wurde 1941 von Strumia und McGraw

erstellt (Strumia und McGraw, 1941). Sie berichteten über 4 Patienten,

die nach der Transfusionen von gepooltem flüssigem Plasma, in dem

später eine große Anzahl gram-positiver Bakterien nachgewiesen

- 12 -

wurde, schweres Fieber entwickelten. Die Autoren befürworteten im

Wissen um das Risiko der bakteriellen Kontamination für die Lagerung,

das Plasma einzufrieren oder zu lyophilisieren. Im folgenden Jahr

erschien der erste Bericht über eine Transfusionsreaktion im

Zusammenhang mit der bakteriellen Kontamination von Vollblut, bei

der der Empfänger starb und verschiedene Mikroorganismen aus dem

verwendeten Blut isoliert wurden (Officer, 1942).

1945 beschäftigte sich das Biologics Control Laboratory des US Public

Health Service mit dem Problem der bakteriellen Kontamination (Proby

und Pittman, 1945). In einer Studie wurden 28 verschiedene

Mikroorganismen, die aus kontaminiertem Spenderblut und Plasma

isoliert wurden, in Kaninchen verimpft, um ihre Pyogenität zu

untersuchen. Wurden gram-negative Organismen in einer Anzahl von

2x10³ bis 5x10³ verimpft, löste dies einen leichten Temperaturanstieg

bei den Tieren aus. Verimpfte man aber höhere Anzahl an Bakterien, so

fiel der Temperaturanstieg wesentlich deutlicher aus. Gram-positive

Organismen, speziell Kokken, führten zum geringsten

Temperaturanstieg, der häufig erst mit 2-3 Stunden Verzögerung

auftrat. In einigen Fällen war der Gipfel des Temperaturanstiegs nach 6

Stunden noch nicht erreicht. Dies war die erste Studie zur

Epidemiologie der bakteriellen Kontamination von Blutprodukten, die

die Differenzierung des Typus der kontaminierenden Organismen nach

gram-positiv vs. gram-negativ und Stäbchen vs. Kokken zur Grundlage

hatte und auch eine Korrelation zwischen der Anzahl der

kontaminierenden Organismen und den pathophysiologischen Effekten

untersuchte.

- 13 -

Im folgenden Jahr untersuchten Braude und Mitarbeiter die Häufigkeit

und das potentielle klinische Risiko der bakteriellen Kontamination von

Vollblut (Braude et al., 1951). Sie kultivierten 1697 fortlaufende

Blutflaschen nach einer Lagerungszeit von 24 Stunden bei 4°C und

fanden eine Kontaminationsrate von 2,2%. Sie bemerkten die

Limitierung der bakteriellen Kontamination durch Kühlung ebenso wie

durch natürlich vorkommende schützende Eigenschaften des Blutes. In

36 Fällen wurde je ein Produkt angewendet, welches sich retrospektiv

als bakteriell kontaminiert herausstellte und zu einer verzögerten

septischen Reaktion beim Empfänger führte.

Die Untersuchungen von Gibson und Norris an Phlebotomienadeln

zeigte, dass ein kleines Stück Haut beladen mit einer kleinen Anzahl an

Bakterien in das gespendete Blut gelangen kann. Somit wurde ihre

Annahme, die ubiquitäre natürliche Hautflora könne die häufigste

Quelle für bakterielle Kontaminationen sein, gestützt (Gibson und

Norris, 1958).

Ein im Jahr 1953 veröffentlichter Bericht des Laboratory of Biologics

Control von Pittman erfasste 18 Fälle von schweren und tödlichen

Transfusionsreaktionen (Pittman, 1953). Diese Reaktionen ereigneten

sich in der Zeitspanne zwischen den Jahren 1944 bis 1952; eine nach

der Gabe von Serum, 15 Reaktionen nach der Gabe von Vollblut und

zwei Reaktionen nach der Gabe von roten Blutzellen. In all diesen Fällen

wurden gram-negative Organismen nachgewiesen. Pittman vermutete,

dass diese 18 Berichte nur ein Teil der tatsächlichen Ereignisse waren.

Er glaubte, die Kontamination mit gram-positiven Organismen sei

häufiger als die Kontamination mit gram-negativen, die klinischen

- 14 -

Reaktionen würden jedoch bei gram-positiven Bakterien deutlich milder

ausfallen und somit nicht beachtet oder nicht in einen Zusammenhang

mit der Transfusion gesetzt werden.

Im Bemühen um ein besseres Verständnis für die klinische Relevanz der

bakteriellen Kontamination, haben Geller und Jawetz als erste das

Wachstumsverhalten von Bakterien untersucht (Geller und Jawetz,

1954). Gefolgt von einer initialen Reduktion der Bakterienzahl stellten

sich vier verschiedene Formen des Wachstums heraus – eine mit direkt

folgendem exponentiellem Wachstum (log-Phase); eine, welche mit

verlangsamten log-Phasen Wachstum einhergeht; eine mit langer

Latenz-Phase (lag-Phase) gefolgt vom log-Phasen-Wachstum und eine

mit kurzer lag-Phase, der ein log-Phasen-Wachstum folgt. Weiterhin

konnten die Autoren zeigen, dass je kleiner die initiale Kontamination

ist, desto größer die Wahrscheinlichkeit für eine verlängerte lag-Phase

ist.

Im Jahr 1954 beschrieb Gardner eine Methode zur Verwendung von

Plastikmaterialien, die sterilisierbar sind und eine bestimmte Zeit steril

gehalten werden können (Gardner et al., 1954). Dies führte in den

nächsten zwei Dekaden zu einer Verbesserung von Methoden,

Thrombozytenkonzentrate (TK) als eigenständiges Therapeutikum zu

entwickeln. Auch löste die Verwendung von Plastikbeuteln das Problem

der Sterilisation von Glasflaschen, die, wenn sie insuffizient oder

unvollständig war, ein hohes Potential für die Verunreinigung von

gelagertem Spenderblut enthielt. Nach dem Wechsel von Glasflaschen

auf Plastikbeutel verlagerte sich das Interesse der bakteriellen

- 15 -

Kontaminationen vornehmlich auf Thrombozytenkonzentrate

(Blajchman, 1994).

Anfangs erfolgte die Transfusion von TK möglichst zeitnah zur Spende.

Auch die gekühlte Lagerung wurde getestet, es stellte sich jedoch

schnell heraus, dass die Thrombozytenfunktion unter

Lagerungsbedingungen bei 4°C rapide abnimmt. Murphy und Gardner

revolutionierten die Verwendung von TK in dem sie zeigten, dass die

Thrombozytenfunktion unter Lagerung bei Raumtemperatur über

mehrere Tage erhalten bleibt (Murphy und Gardner, 1969). Sie

beachteten auch die Möglichkeit der bakteriellen Kontamination,

glaubten jedoch, dass dies durch Verwendung kleiner Einheiten nicht zu

einem klinischen Problem werden würde.

Das Potential für ein ernstes Problem durch die bakterielle

Kontamination von TK wurde 1971 durch die Arbeit von Buchholz et al.

hervorgehoben (Buchholz et al., 1971). Sie berichteten über 2 Patienten

die im Juli und August 1970 nach der Transfusion von TK an einer Sepsis

durch Enterobacter cloacae erkrankten. In einer Pilotstudie zur

Abschätzung der Häufigkeit der bakteriellen Kontamination von TK

kultivierten sie Proben von 258 Pools aus TK, wobei insgesamt 2188

Einzelspenden erfasst wurden. Sie erhielten eine Kontaminationsrate

von 2,5%. Da die Patienten, die bei Raumtemperatur gelagerte TK

erhielten, überwiegend solche mit Immundefiziten waren und somit

eine Risikogruppe für Infektionen darstellen, warnten die Autoren, TK

mit Vorsicht anzuwenden.

Eine weitere Studie von Buchholz et al. zum quantitativen Ausmaß der

bakteriellen Kontamination von TK zeigte, dass 45 Proben (1,4%) von

- 16 -

3251 Einheiten auf mindestens einem Medium bakterielles Wachstum

zeigten (Buchholz et al., 1973). Interessant an dieser Untersuchung war

die Beobachtung, dass die Prozentzahl an positiv identifizierten

Einheiten mit der Länge der Lagerungszeit vor der Untersuchung

korrelierte. Dies deutete erstmals darauf hin, dass Bakterien zum

Zeitpunkt der Phlebotomie in kleiner Zahl in die Bluteinheit gelangen

und während der Lagerung proliferieren. Obwohl in den frühen 70er

Jahren das fortbestehende Problem der bakteriellen Kontamination und

die Korrelation mit der Lagerungsdauer erkannt waren, veranlassten

logistische Überlegungen die Hersteller zur Entwicklung neuer

Beutelfolien, die die Lagerungszeit von TK verlängern sollten. So wurde

1982 die Lagerungsdauer für TK bei Raumtemperatur von 3 auf 5 Tage,

1984 auf 7 Tage verlängert. Dazu merkte Dr. Fratantoni bei einem

Treffen des Blood Products Advisory Committee (BPAC) der Food and

Drug Administration (FDA) am 13. Februar 1986 an, dass sich die

Möglichkeit der Verlängerung der Lagerungszeit auf 7 Tage auf die

funktionelle Qualität der Thrombozyten bezog, über das Problem der

Sterilität zu diesem Zeitpunkt jedoch noch nicht ausreichend diskutiert

wäre (Fratantoni, 1986). Aufgrund der steigenden Anzahl von Berichten

über bakterielle Kontaminationen von TK und damit verbundenen

Transfusionszwischenfällen, mit Prädilektion auf die am längsten

gelagerten Einheiten, votierte das FDA BPAC für die Reduzierung der

Lagerungszeit bei Raumtemperatur für alle TK auf 5 Tage. Es wurde

angemerkt, dass mehr Daten benötigt würden, um das Ausmaß des

Problems abschätzen zu können.

- 17 -

1992 empfahl das Center of Disease Control (CDC) wegen anhaltender

Berichte über die bakterielle Kontaminationen, alle TK, die bei

Transfusionszwischenfällen eine Rolle spielten, auf die Verunreinigung

durch Bakterien zu untersuchen, um über die Inzidenz genauere

Auskunft zu erhalten (US Centers of Disease Control, 1992; Zaza et al.,

1994).

Diese Strategie des CDC führte zur BaCon-Studie, deren Ergebnisse

später dargestellt werden (Kuehnert et al., 2001; Roth et al., 2001).

Bei drei weiteren Workshops des FDA, am 27. September 1995, am 24.

September 1999 und am 7. August 2002, ging es weiterhin

hauptsächlich um das Problem der bakteriellen Kontamination von TK

(Klein et al., 1997; US Food and Drug Administration, 1999; US Food and

Drug Administration, 2002). Hier wurden viele Informationen von

nationalen und internationalen Forschungsgruppen vorgestellt, welche

das Ausmaß des Problems der bakteriellen Kontamination

betrachteten. Zusätzlich präsentierten Vertreter der Industrie und der

Hersteller verschiedene Strategien zur Reduktion, zum Nachweis und zu

Möglichkeiten der Eradikation von Bakterien. Tatsächlich gab die FDA

im Februar und Oktober 2002 den BacT/ALERT Kulturflaschen

(bioMérieux Inc., Durham, NC) und dem PALL Bacterial Detection

System (BDS, PALL Corporation, East Hill, NY), zwei Systemen zum

Bakteriennachweis in TK, die Zulassung für Qualitätskontrollen und für

Sterilitätstestungen von TK.

Die Entwicklung von Vorgaben zur Erkennung einer bakteriellen

Kontamination von TK vor der Transfusion erweist sich als schwierig

angesichts der kurzen Haltbarkeitsfrist von TK und der Unsicherheit

über die Sensitivität der Nachweismethoden. Der schwierigste Teil war

- 18 -

die bakterielle Kontamination rechtzeitig und zuverlässig nachzuweisen

und gleichzeitig den Anforderungen der Klinik gerecht zu werden und

den Bedarf zu decken. Die 22te Ausgabe des AABB Standards of Blood

Banks and Transfusion Services beinhaltet einen Standard, der sich mit

dem Thema auseinandersetzt (Fridey, 2003). Dieser Standard, der am 1.

März 2004 in den USA verbindlich wurde, fordert Methoden zur

Begrenzung der bakteriellen Kontamination und zur Prüfung auf

Bakterien bei allen zur Transfusion vorgesehenen TK.

1.2. Inzidenz transfusionsassoziierter septischer Reaktionen

Die Angaben in der Literatur zur Inzidenz bakteriell bedingter

Transfusionsreaktionen variieren stark. Verschiedene Studien kamen zu

sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Dies liegt zum einen an

unterschiedlichen Studiendesigns, ob z.B. eine Reihe produzierter TK

getestet wurde oder ob TK nach einem Transfusionszwischenfall

hinsichtlich vorhandener Bakterien untersucht wurden.

Transfusionszwischenfälle, die im Zusammenhang mit Bakterien stehen,

können übersehen werden oder werden nicht als solche bewertet,

wenn das Krankheitsbild der Patienten andere Ursachen vermuten

lässt.

In einigen Ländern wurden Institutionen etabliert, die Daten zu

Transfusionszwischenfällen systematisch sammeln und die Ursachen

von Transfusionsreaktionen untersuchen. In Frankreich hat das

Hemovigilance Network von April 1994 bis Dezember 1998 730 Fälle

erfasst, die unter dem Verdacht der bakteriellen Kontamination

gemeldet wurden (Andreu et al., 2002). Nach genauer Analyse wurden

195 Zwischenfälle auf Bakterien zurückgeführt, 18 mit tödlichem

- 19 -

Ausgang. Von den insgesamt 82 gemeldeten letalen TR waren 22% auf

eine bakterielle Kontamination der beteiligten Blutpräparate

zurückzuführen. Betrachtet man nun die verschiedenen beteiligten

Produkte so ergibt sich, dass für 37,3% aller Transfusionszwischenfälle

im Zusammenhang mit bakterieller Kontamination TK verantwortlich

waren. Erythrozytenkonzentrate (EK) waren in 62,7% der Fälle

verwickelt und bei der Verwendung von gefrorenen Frischplasma (FFP)

ist nicht ein einziger Fall registriert worden. Durch die Anzahl der

angewendeten Einheiten lässt sich auf die Inzidenz der septischen

Komplikationen bei den einzelnen Blutprodukten schließen. Sie lag bei

36 auf 10 Millionen transfundierte EK, bei 56 auf 1 Millionen TK aus

Vollblut und bei 38 auf 1 Millionen Apherese-TK.

Das Serious Hazards of Transfusion-Programm im Vereinigten

Königreich (SHOT) erfasst und untersucht Transfusionszwischenfälle

ähnlich wie das Hemovigilance Network in Frankreich. Die Berichte von

SHOT werden jedes Jahr veröffentlicht (Stainsby et al., 2003). Zwischen

dem 01.10.2001 und dem 31.12.2002 wurden von den Blutbanken 34

Fälle (England, Wales und Nordirland 28, Schottland 6) von bakteriell

bedingten TR gemeldet, trotz einer längeren Periode 20,9% weniger als

in der vorherigen Periode (1.10.2000 bis 30.9.2001). 5 der 34 Fälle

(15%) wurden als gesichert durch Bakterien ausgelöst bewertet. 4 Fälle

wurden im Jahr 2001 registriert, ein Fall im ganzen Jahr 2002. Die

anderen Fälle konnten nicht gesichert als durch die Transfusion

ausgelöst eingeordnet werden. Alle Reaktionen waren durch TK

ausgelöst worden, in 4 Fällen durch 5 Tage alte und in einem Fall durch

ein 3 Tage altes TK. In 3 der 5 Fälle wurden Staphylococcus epidermidis

als der kontaminierende Keim identifiziert, als dessen Herkunft in 2

- 20 -

Fällen die Spenderhaut identifiziert werden konnte. Im dritten Fall war

eine Herkunft nicht zu bestimmen. Einmal war Morganella morganii der

im Empfängerblut und im Rest der Konserve identifizierte Keim und im

letzten Fall Streptokokken der Gruppe B. In beiden Fällen konnte die

Quelle nicht identifiziert werden. Alle betroffenen Patienten hatten ein

schweres Grundleiden, aber keiner der Patienten starb durch die

transfusionsassoziierte Infektion.

Da es in den USA nur Schätzungen zur Rate der bakteriellen

Kontamination von Blutpräparaten gab, entwickelten die American

Association of Blood Banks (AABB), das American Red Cross (ARC), das

Center for Disease Control (CDC) und das Department of Defense (DoD)

1997 ein Programm, um genauere Informationen über die Problematik

zu erhalten, und führten vom 1. Januar 1999 bis zum 31. Dezember

2000 die BaCon-Studie durch (Kuehnert et al., 2001). Die „Assessment

of the Frequency of Blood Component Bacterial Contamination

Associated with Transfusion Reaction Study“ (BaCon) sollte folgende

Informationen liefern: a) die nationale Rate der

transfusionsübertragenen Bakteriämien, b) die Identifizierung der

Krankheitserreger und assoziierter Risikofaktoren, und c) die

Identifizierung vorhersehbarer Faktoren der Sterblichkeit der

Empfänger. Mitarbeiter von AABB, ARC, CDC und DoD entwickelten im

August 1997 Fallkriterien, Definitionen und standardisierte

Berichtsformulare für bakterielle Infektionen, die im Verdacht standen,

transfusionsübertragen zu sein. Als klinisches Kriterium für den

Verdacht auf einen transfusionsübertragenen Infektionsfall wurde das

Vorhandensein eines der folgenden Zeichen oder Symptoms innerhalb

von 4 Stunden nach der Transfusion verwendet: Fieber ≥39°C oder eine

- 21 -

Veränderung ≥2°C gegenüber dem Wert vor der Transfusion, Rigor,

Tachykardie ≥120 Schläge pro Minute oder eine Veränderung ≥40

Schläge pro Minute gegenüber dem Wert vor der Transfusion, oder ein

Anstieg oder Absinken des systolischen Blutdrucks um ≥30 mmHg. Bei

Patienten, die diese Kriterien erfüllten, sollte das Klinikpersonal eine

Bericht über die aufgetretene Transfusionsreaktion schreiben, die

involvierten Blutkomponenten sichern und Blut vom Patienten zur

Kultivierung abnehmen. Wenn in den Kulturen des Blutbeutels und in

dem Patientenblut dieselben Organismen angezüchtet werden konnten,

sollten Proben und die involvierten Blutbeutel zum CDC gebracht

werden. Wenn die Organismen aus Blutbeutel und Empfängerblut in

der Pulsfeld-Gelelektrophorese identisch waren, so wurde das Ereignis

als bestätigter Fall gewertet.

In den 94 beteiligten Blutbanken wurden in dem Zeitraum der Studie

23.711.169 EK, 1.804.725 Einzelspender-TK und 1.033.671 Pool-TK (PPC)

hergestellt, was ungefähr 60-70% der Produktion in den USA entsprach.

Es wurden 56 Berichte über Patienten angefertigt, bei denen eins oder

mehrere der genannten Kriterien auftraten. Nach den Untersuchungen

wurden 34 Fälle als bestätigte Fälle gewertet. Die beobachteten Zeichen

und Symptome variierten bei den Patienten, aber Rigor (30 Fälle/88%),

Fieber (27 Fälle/79%) und Tachykardien (24 Fälle/75%) waren die

dominierenden Symptome. Die in die 34 Fälle involvierten

Blutkomponenten setzten sich aus 18 Einzelspender-TK, 11 Pool-TK und

5 EK zusammen. Im Zusammenhang mit Thrombozytenkonzentraten

war das Risiko einer transfusionsübertragenen Bakteriämie und einer

Reaktion mit letalem Ausgang gegenüber EK signifikant erhöht.

- 22 -

Von den 34 Krankheitserregern waren 20 (59%) gram-positiv und 14

(41%) gram-negativ. Die verwendeten Produkte waren im Mittel 4 Tage

bei TK und 22 Tage bei EK gelagert.

Neun (27%) der 34 Zwischenfälle hatten einen tödlichen Ausgang, bei 3

wurden EK, bei 6 TK verwendet. Tödliche Ausgänge waren mit gram-

negativen Organismen, einem höheren Empfängeralter, einem

kleineren Transfusionsvolumen, einer kürzeren Zeitspanne zwischen

Transfusionsbeginn und auftretenden Symptomen und bei TK mit einer

längeren Lagerungszeit vor der Transfusion assoziiert. Der gemessene

Endotoxingehalt in den Präparaten unterschied sich zwischen tödlichen

und nicht tödlichen Fällen nicht signifikant.

Kuehnert et al. schätzten die Rate einer transfusionsübertragenen

Bakteriämie auf 1 auf 100.000 TK und 1 auf 5 Millionen EK (30). Die

Letalität wurde auf 1 auf 500.000 TK und 1 auf 8 Millionen für EK

geschätzt. Der Vergleich mit dem Risiko der Virusübertragung, das 1996

für das Hepatitis-B-Virus auf < 1 auf 100.000 Blutpräparate und für das

HIV auf < 1 auf 2 Millionen Präparate geschätzt wurde, zeigte, dass die

Übertragung von Bakterien speziell durch TK ein beachtliches Risiko

darstellte (Schreiber et al., 1996).

Die meisten TK, die zu letalen Reaktionen durch Infektionen führten,

waren mit gram-negativen Organismen kontaminiert und wurden

innerhalb der ersten 3 Tage der Haltbarkeitsfrist transfundiert,

wohingegen nichtletale Reaktionen größtenteils durch gram-positive

Keime ausgelöst wurden und die Lagerungszeit der TK vor der

Anwendung bei 5 Tagen lag, also der maximalen Verwendbarkeitsfrist.

Die Präsenz von Endotoxinen, welche innerhalb von Stunden bis zum

ersten Tag nach der Spende in gram-negativ kontaminierten TK rapide

- 23 -

ansteigt, ist eine Erklärung für den Zusammenhang zwischen gram-

negativen Organismen und tödlichen Verläufen (Arduino et al., 1989).

Für Deutschland liegen für die in den Zeiträumen in Frankreich, den USA

und dem Vereinigten Königreich erhobenen Daten keine publizierten

Vergleichsdaten vor, sodass die Einschätzung der Inzidenz von bakteriell

bedingten TR nicht möglich ist.

1.3. Ursachen der bakteriellen Kontamination von Blutkomponenten

Die bakterielle Kontamination kann während der Blutspende durch die

Phlebotomie, durch eine asymptomatische Bakteriämie beim Spender

zum Zeitpunkt der Spende oder durch verunreinigtes Spendeequipment

entstehen. Ebenso können Bakterien während der nachfolgenden

Präparationsschritte oder durch Mikroläsionen der Beutelfolie Zugang

zu den Präparaten erhalten.

Eine asymptomatische Bakteriämie zum Zeitpunkt der Blutspende ist

praktisch nicht detektierbar, sodass Spender auf diesem Weg mit ihrem

Blut Bakterien in den Sammelbeutel übertragen können. In der Literatur

sind rund 30 Fälle von Yersinia enterocolitica-Septitiden im

Zusammenhang mit der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten

beschrieben (US Department of Health and Human Services, 1997;

Theakstone et al., 1997; Beresford, 1995). Symptome einer Infektion

mit Y. enterocolitica sind eine Enterocolitis mit Diarrhoen, Fieber und

abdominellen Schmerzen. Die Symptome sind meist sehr mild und auch

komplett asymptomatische Fälle sind beschrieben. Nach einer

Inkubationszeit von 1 bis 11 Tagen entwickelt sich die Erkrankung mit

einer Dauer 5 bis 14 Tagen, sie kann aber auch über Monate

persistieren. Bei den Fällen, die durch eine Transfusion übertragen

- 24 -

wurden, konnte das CDC in ca. 75% der Fälle retrospektiv bei den

Spendern in den Tagen vor oder nach der Spende eine Diarrhoe

erfragen (US Department of Health and Human Services, 1997).

Ebenso konnten Posttransfusionsinfektionen durch andere

enteropathogene Bakterien wie z.B. Campylobacter jejuni und

Salmonella Heidelberg auf eine Bakteriämie der Spender zurückgeführt

werden (Goldman und Blajchman, 1991; Sazama, 1990; Wagner et al.,

1994). Auch während der Inkubationszeit anderer Infektionen, z.B. der

oberen Atemwege können nicht erkannte Bakteriämien auftreten.

Spender mit chronischen Infektionen wie Osteomyelitis oder Ulzera an

der unteren Extremität müssen ebenfalls als potentielle Quelle der

bakteriellen Kontamination beachtet werden (Goldman und Blajchman,

1991; Duncan et al., 1994). Bakteriämien von kurzer Dauer sind nach

zahnärztlicher Manipulation wie einer Zahnextraktion, aber auch nach

dem Zähneputzen zu erwarten. Eine Übertragung von Staphylococcus

aureus durch ein TK wurde auf eine zahnärztliche Behandlung des

Spenders zurückgeführt, die 3 Stunden vor der Spende stattfand

(Goldman und Blajchman, 1991).

Die Kontamination zum Zeitpunkt der Blutspende stellt die

bedeutendste Quelle der bakteriellen Kontamination von TK dar. Die

Mehrzahl der in Kultivierungsstudien und in Fallberichten über

transfusionsübertragene septische Reaktionen gefundenen Organismen

sind Bestandteil der normalen Hautflora. Da es unmöglich ist, die Haut

des Spenders vollkommen bakterienfrei zu bekommen, ist hier eine

wichtige Quelle für bakterielle Kontaminationen. Neuere Studien, bei

denen Proben aus Spenderblut kultiviert wurden, zeigen, dass bei

- 25 -

Spendern, bei denen eine Bakteriämie ausgeschlossen worden war, die

Inzidenz von Bakterien im gespendeten Blut zwischen 2 und 6% liegt

(Schifman und Pindur 1993). Auch das Eindringen eines kleinen Stückes

Haut, welches bei der Punktion durch die Phlebotomienadel

herausgestanzt wird, wurde postuliert. Somit würden auch tiefere

Hautschichten, die sich einer adäquaten Desinfektion entziehen, in den

Beutel gelangen und die sie besiedelnden Bakterien mitbringen (Gibson

und Norris, 1958). Auch Organismen, die nicht zu normalen Hautflora

gehören, können diese besiedeln und für septische

Transfusionsreaktionen verantwortlich sein (McDonald et al., 1998).

Einer tödlichen Reaktion, ausgelöst durch Clostridium perfringens,

wurde als Quelle ein Spender zugeordnet, der regelmäßig die Windeln

seiner Kinder wechselte. Diese Bakterien, ebenso wie andere

Organismen der normalen Darmflora, konnten durch einen Abstrich

vom Arm des betroffenen Spenders kultiviert werden.

Auch Materialien, die zur Desinfektion der Spenderhaut verwendet

werden, wie in Alkohol und Jod getränkte Tupfer, können eine Quelle

darstellen. So wurde ein Desinfektionskit eines großen amerikanischen

Herstellers zurückgerufen, nachdem eine bakterielle Kontamination der

Desinfektionsmittel mit Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas

maltophilia und koagulasenegativen Staphylokokken bekannt wurde

(US Food and Drug Administration, 2000).

1991 entwickelten 6 Patienten in Dänemark und Schweden eine Sepsis

mit Serratia marcescens, nachdem sie EK oder TK transfundiert

bekommen hatten (Heltberg et al., 1993; Högman et al., 1993). Der

Ausbruch konnte zurückgeführt werden auf eine massive

- 26 -

Kontamination der Außenhülle der Sammelbeutel, die in einer

Herstellungsanlage in Belgien produziert worden waren. Der gleiche

Ribotyp von S.marcescens wurde aus Proben der Empfänger, dem

transfundierten Produkt, 0,73% der Sammelbeutel der gleichen Charge

und aus dem Herstellungsbereich der Beutel isoliert. Da man keine

Notwendigkeit für die Sterilisierung der äußeren Hülle der Beutel sah,

wurde postuliert, dass auf der Außenseite der Beutel während der

Lagerung vor der Blutspende ein Wachstum der Bakterien möglich war.

Die Bakterien könnten dann zum Zeitpunkt der Blutspende durch die

Nadel angesaugt oder durch die Hände des Phlebotomisten in den

Beutel gelangt sein. Auch Mikroläsionen der Beutelfolie als

Bakterieneintrittspforte wurden diskutiert.

Undichten Verschlüssen, beschädigten Schläuchen oder Mikrolöchern in

den Sammelbeuteln wurden einige Fälle von bakterieller Kontamination

mit S.marcescens zugeschrieben (Högman und Engstrand, 1998). Im

Jahr 1995 wurden von der National Blood Authority in England 7000

Blutbeutel wegen fehlerhafter Verschlüsse bei einigen der Beutel

zurückgerufen (Dyer, 1995).

1.4. Strategien zur Reduktion des Kontaminationsrisikos

Die Richtlinie zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur

Anwendung von Blutprodukten des Wissenschaftlichen Beirats der

Bundesärztekammer und des Paul-Ehrlich Instituts führt aus: „Jeder

Spender muss sich nach ärztlicher Beurteilung in einem

gesundheitlichen Zustand befinden, der eine Blutspende ohne

Bedenken zulässt. Dies gilt sowohl im Hinblick auf den

Gesundheitsschutz des Spenders, als auch für die Herstellung von

- 27 -

möglichst risikoarmen Blutkomponenten und Plasmaderivaten“

(Wissenschftlicher Beirat der Bundesärtzekammer und vom Paul-

Ehrlich-Institut, 2005). Daraus ergibt sich, dass bei der Spenderauswahl

ein hohes Maß an Verantwortung für den Arzt und den Spender selbst

besteht. Durch die konsequente Durchführung der Anamnese, den

Ausschluss von Spendern, die die hohen Ansprüche nicht erfüllen und

das Labor-Screening der Spenden ist es gelungen, die Übertragung

viraler Infektionen nahezu auszuschließen. Bei der Kontamination von

Blutkomponenten durch Bakterien ist die Problematik jedoch deutlich

komplexer. Vor allem die asymptomatische Bakteriämie beim Spender

und das ubiquitäre Vorkommen von Bakterien auf der Spenderhaut und

in deren tieferen Schichten stellen ein kaum lösbares Problem dar. Eine

multivariante Analyse der Faktoren der bakteriellen Kontamination von

Vollblutspenden führten Perez et al. von März bis Dezember 1997 in

vier französischen Blutbanken durch (Perez et al., 2002). Die Spender

wurden nach den in Frankreich geltenden Regeln zur Spenderauswahl

selektioniert. Neben den von den Spendeteams bestimmten Faktoren

(Spende in der Blutbank, im Spendebus oder in öffentlichen

Spenderäumen; der Art und Weise der Hautdesinfektion) wurden auch

spenderbedingte Faktoren ermittelt. Diese waren das Geschlecht, das

Alter und der Zeitraum seit der letzten Mahlzeit. Das Spendeteam sollte

die Haut um die Phlebotomiestelle inspizieren und das Vorhandensein

von Haaren, Läsionen und Narben vermerken. Nachdem die Spenden

am Morgen gesammelt wurden, wurden direkt am Nachmittag aus den

Sammelbeuteln Proben in BacT/ALERT Flaschen überführt. Diese

wurden für 7 Tage bei 37°C inkubiert. Bei positiven Proben wurde eine

Subkultur zur Keimdifferenzierung angelegt. Interessant ist, dass das

- 28 -

Alter des Spenders anscheinend einen Einfluss auf die Inzidenz der

bakteriellen Kontamination des gespendeten Blutes hat. Perez et al.

teilten die Spender in 2 Gruppen ein. Die Gruppe >35 Jahre hatte eine

doppelt so hohe Inzidenz wie die Gruppe <35 Jahre. Dies wird von den

Autoren durch die altersbedingten Hautveränderungen und

Narbengewebe durch vorherige Spenden erklärt. Das Vorhandensein

von Haaren, Läsionen und Narben lässt die Inzidenz ansteigen. Bei den

Haaren sind es vor allem die Follikel, die sich, von Bakterien besiedelt,

der oberflächlichen Hautdesinfektion entziehen. Narbengewebe und

Läsionen scheinen für das Auftreten von Bakterien prädisponiert zu

sein, da sie sich der Desinfektion entziehen und körpereigene

Mechanismen zur Eradizierung hier nicht zu funktionieren scheinen.

Da in allen Studien Bakterien der transienten und residenten Hautflora

den Großteil der Kontaminanten von Blutkomponenten ausmachten,

kommt der antiseptischen Hautdesinfektion vor der Spende eine hohe

Bedeutung zu. McDonald et al. untersuchten die Reduktion der

Bakterienanzahl auf der Haut von Spendern durch verschiedene

Desinfektionslösungen und verschiedene Methoden von deren

Anwendung (MCDonald und Lowe et al., 2001). Im ersten

Probendurchgang wurden drei verschiedene Desinfektionsmethoden

untersucht. Keine der drei untersuchten Methoden erreichte das

gewünschte Resultat einer Reduktion der Bakterienzahl von >90%. In

einer zweiten Testreihe wurden 9 verschiedene Desinfektionstechniken

getestet. Insgesamt wurde das beste Ergebnis durch die Medi-Flex

Adapted Methode (Insight Biotechnology, Wembley Middlesex,

UK/Medi-Flex) erzielt. Die Desinfektionslösungen werden in zwei

Schritten aufgetragen. Die Bewegung schient einen deutlichen Einfluss

- 29 -

auf die Reduktion zu haben, da die ebenfalls getestete Medi-Flex

Standard Methode den gleichen Ablauf hat, nur die Jodtinktur statt in

einer vertikalen in einer Spiralbewegung aufgetragen wurde. Hierbei

wurden jedoch schlechtere Ergebnisse erzielt. Bei der Medi-Flex

Adapted Methode wurde bereits bei einmaliger Anwendung eine

durchschnittliche Reduktion der Bakterienzahl um 99,75% erzielt. Alle

Testpersonen hatten nach der Desinfektion <100 CFU/Platte, bei mehr

als 90% wurde die Anzahl der Bakterien auf unter 10 CFU/Platte

reduziert und bei 79% wurden überhaupt keine Bakterien in der Fossa

antecubitalis der Spender nachgewiesen.

Da die kontaminierenden Bakterien überwiegend von der Haut der

Spender stammen, gilt es alle Möglichkeiten auszuschöpfen diese

Kontamination zu reduzieren. Es wurde schon früh postuliert, dass mit

den ersten Millilitern einer Blutspende ein Stück Haut, welches durch

die Nadel aus der Haut gestanzt wird, in den Sammelbeutel gelangt und

die Spende somit kontaminiert (Gibson und Norris, 1958;

Blajchman,1998). Olthuis et al. waren die ersten die zeigten, dass die

ersten 10ml einer Apheresespende eine höhere Rate an bakterieller

Kontamination aufweisen, als die folgenden zweiten 10ml (Olthuis et

al., 1995). In einem In-vitro-Modell bestätigten Wagner et al. die

Effektivität der Reduzierung von Bakterien durch die Entfernung der

ersten Milliliter einer Blutspende (Wagner et al., 2000). Bruneau et al.

untersuchten in einer groß angelegten Studie in vier französischen

Blutbanken den Einfluss des als Predonation Samplings bezeichneten

Verfahrens auf die Häufigkeit der bakteriellen Kontamination in

Vollblutspenden (Bruneau et al., 2001). Durch ein speziell für diese

Studie entwickeltes Beutelsystem war es möglich, unter aseptischen

- 30 -

Bedingungen die ersten 30ml einer Blutspende in zwei Probenbeutel zu

überführen. Im Probenbeutel S1 wurden die ersten 15ml, in dem

Probenbeutel S2 die nächsten 15ml einer Blutspende separat

gesammelt. Von diesen Proben wurden dann aerobe und anaerobe

Kulturen im BacT/ALERT-System angelegt. Von einer als positive

detektierten Kultur wurden Subkulturen angelegt. Wurde bei den

Subkulturen ein bakterielles Wachstum beobachtet, so wurden die

Bakterien mit mikrobiologischen Standardmethoden identifiziert.

Wurde kein Wachstum erreicht, so wurde die Probe als falsch-positiv

bewertet. Die EK und das Plasma der zugehörigen Spende wurden bei

positiven Proben nach Möglichkeit ebenfalls kultiviert und auf das

Vorhandensein von Bakterien hin untersucht. Insgesamt wurden 3385

Spenden im Zeitraum von März bis September 1997 untersucht. In 76

Fällen (2,2%) wurden in den Proben S1 oder S2 Bakterien gefunden. In

21 Fällen war S2, unabhängig des Ergebnisses in S1, als bakteriell

kontaminiert identifiziert. Somit wurde das Risiko der bakteriellen

Kontamination durch die Entfernung der ersten 15ml um 72.4%

reduziert. Durch die neue Spendentechnik konnte die bakterielle

Kontamination der Vollblutspende signifikant reduziert werden. Die

Ergebnisse der Studie führten dazu, dass das Verfahren des Predonation

Sampling in Frankreich und anderen Ländern eingeführt wurde, wobei

das Volumen des initial abgetrennten Blutes auf 30ml erhöht wurde

und für die Laboruntersuchungen des Spenderblutes genutzt wird.

Als eine weitere Option zur Reduktion der bakteriellen Kontamination

wurde die Leukozytendepletion von Spenderblut untersucht. Högman

et al. und auch Sanz et al. konnten zeigen, dass Bakterien von

Leukozyten während der Vollblutlagerungsphase phagozytiert werden

- 31 -

und anschließend durch die Leukozytenentfernung mittels Filtration

eliminiert werden (Högman et al., 1991; Sanz et al., 1997). Allerdings ist

dieser Effekt beschränkt und konnte insbesondere für TK nicht bestätigt

werden (McDonald und Roy et al., 2001; Wagner und Robinette, 1998;

Wenz et al., 1993; Brecher et al., 1993; Sherburne ei al., 1991).

1.5. Vorgaben zur Risikobeschränkung in Deutschland

In allen transfusionsmedizinischen Einrichtungen gilt seit 1997 eine

Vorgabe zur Sterilitätstestung einer definierten Stichprobe von

hergestellten Blutkomponenten mittels Kulturmethode am Ende der

Haltbarkeitsfrist als Teil der Routinequalitätskontrolle (Arbeitskreis Blut,

1997). Sterile Schlauchschweißverbindungen, die bei der

Komponentenpräparation benötigt werden, müssen jeweils mit einem

Drucktest auf ihre Dichtigkeit überprüft werden (Arbeitskreis Blut,

1999).

Die Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur

Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie) wurden im Jahr 2000

mit einer detaillierten Vorgabe zu den Blutspenderauswahlkriterien

ergänzt, die das Risiko der Bakteriämie als Ausschlussgrund von der

Blutspende erfassen sollen. Ferner wurde das Verfahren der

Hautdesinfektion mit einem lizensierten Desinfektionsmittel in einer 2-

Phasentechnik unter strikter Beachtung der Einwirkzeit präzisiert

(Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärtzekammer und vom Paul-

Ehrlich-Institut, 2000, 2005, Ergänzungen 2007). Die generelle

Leukozytendepletion von zellulären Blutkomponenten wurde von

Oktober 2001 an vorgeschrieben (Arbeitskreis Blut, 2001). Mit einer

einjährigen Übergangsperiode wurde 2002 die Abtrennung des initialen

- 32 -

Blutvolumens bei der Blutspende als so genanntes Predonation

Sampling als weiter Maßnahme vorgeschrieben (Arbeitskreis Blut,

2002).

1.6. Screening von Thrombozytenkonzentraten auf bakterielle

Kontamination vor der Abgabe zur Anwendung

Eine Reihe von Studien berichtet über die Ergebnisse des Screenings

von TK mit dem BacT/ALERT-System (Munksgaard et al., 2004; Larsen et

al., 2005; Fang et al., 2005; Te Boekhorst et al., 2005). Dabei handelt es

sich um ein automatisiertes Blutkultursystem, welches das von

Bakterien produzierte CO2 detektiert. Die Detektionsgrenze liegt bei 1

koloniebildender Einheit pro Milliliter (CFU/ml).

Das Prinzip des Screenings bestand darin, kurz nach der Herstellung

eine Probe aus dem TK zu entnehmen und zu kultivieren. Bei der

Ausgabe an der Blutbank wurde der Kulturstatus überprüft und nur bei

negativem Kulturstatus erfolgte die Ausgabe im Sinne eines negative-to-

date-Konzeptes. Nach der Ausgabe positiv gemeldete Kulturen führten

zum Rückruf der betroffenen TK. War das Präparat bereits

transfundiert, wurde der behandelnde Arzt informiert und aufgefordert

zu prüfen, ob der Patient Zeichen einer bakteriell bedingten TR zeigte.

Die detektierten Bakterien gehörten überwiegend der physiologischen

Hautflora an: Staphylococcus epidermidis, Bacillus spp.,

Propionibakterien und Corynebakterien. Gram-negative Keime wie

Klebsiellen, Serratien und Colibakterien wurden besonders in Apherese-

TK gefunden (Fang et al., 2005). Die Zeitspanne bis zu einem positiven

Kultursignal lag zwischen 7 bis 166 Stunden. Es zeigte sich, dass die

- 33 -

Wachstumskinetik der Bakterien die Chance des Ausschlusses des

kontaminierten TK von der Transfusion entscheidend beeinflusst. Da bei

Patienten, die TK mit einem positiven Kultursignal und nachgewiesener

Kontamination transfundiert bekamen, keine septischen Reaktionen

auftraten, wurde der Schluss gezogen, dass langsam sich vermehrende

Bakterien mit einem späten positiven Kultursignal von geringer

Pathogenität sind.

Die Grenzen des Screenings mit BacT/ALERT wurden dadurch deutlich,

dass eine Reihe von TR bei TK mit falsch negativem Kulturergebnis

beobachtet wurden (Fang et al., 2005; Te Boekhorst et al., 2005). Bei

der frühen Probenziehung kurz nach der Herstellung wurden aufgrund

ihrer geringen Anzahl im TK Bakterien mit der Untersuchungsprobe

nicht erfasst.

Weitere Methoden für das Screening von TK auf Bakterien sind in der

Entwicklung. Das PALL eBDS (eBDS, PALL Corp.) misst den

Sauerstoffgehalt in der Luft einer Probe aus TK und wertet den

Sauerstoffverbrauch als Zeichen der metabolischen Aktivität und des

Wachstums von Bakterien. Holme et al. testeten 118.067 TK und fanden

23 bestätigt kontaminierte Präparate (Holme ez al., 2005). Auch in einer

Kontaminationsstudie konnte die Fähigkeit des PALL eBDS zum

Bakteriennachweis belegt werden (McDonald und Pearce et al., 2005).

In Frankreich wurde das Scansystem™ (Hemosystem, Marseille,

Frankreich) entwickelt, mit dem Bakterien mit einer Fluoreszenz-

Zytometrie-Technik nachgewiesen werden. Spiking-Studien zeigten eine

Nachweisgrenze in TK von 103 CFU/ml (Schmidt et al., 2005; McDonald

et al., 2005).

- 34 -

Die Sensitivität einer PCR-Technik, basierend auf dem Nachweis von

bakterieller 16S rDNA, wurde ebenfalls in Spiking-Studien untersucht

(Mohammadi et al., Transfusion 2005 und Vox Sanguinis 2005). Auch

geringgradige Kontaminationen konnten innerhalb von 24 Stunden nach

der TK-Herstellung nachgewiesen werden. Bisher liegen nur

experimentelle Daten vor.

- 35 -

2. Fragestellung

In einer prospektiven multizentrischen Studie integriert in die

Arbeitsroutine der beteiligten Zentren wurde eine systematische

Prüfung von Thrombozytenkonzentraten auf eine bakterielle

Kontamination mit verschiedenen Testverfahren durchgeführt.

Primäres Ziel der Studie war es, die Kontaminationsraten von TK aus

verschiedenen Herstellungsverfahren festzustellen. Durch die Testung

einer großen Anzahl von TK sollte die Kontaminationsrate zuverlässig

bestimmt werden. Als positiv getestete TK sollten möglichst von der

Abgabe zur Transfusion ausgeschlossen werden.

Bei als positiv getesteten Pool-TK, welche aus insgesamt 4 Blutspenden

hergestellt werden, sollten die verbundenen Erythrozytenkonzentrate

getestet werden, um das kontaminierende Ausgangsvollblut zu

ermitteln. Auch Kontaminationsraten unter aeroben und anaeroben

Kulturbedingungen sollten verglichen werden.

An einer Teilmenge von TK sollten mehrere Detektionsmethoden

(BacT/Alert, ScansystemTM, PALL eBDS) für Bakterien eingesetzt

werden, um die Spezifität und Sensitivität der Methoden zu

vergleichen.

Des Weiteren sollte ein Monitoring über die klinische Verträglichkeit

der auf Sterilität geprüften TK mit einem Begleitschein für die

Anwender zur Protokollierung der Transfusion durchgeführt werden.

TK, bei denen Zeichen einer transfusionsbedingten Nebenwirkung

registriert wurden, sollten einer Nachuntersuchung zugeführt werden.

- 36 -

3. Material und Methoden

Die Studie wurde in der Produktionsroutine von 9

transfusionsmedizinischen Instituten des Deutsche Roten Kreuzes (DRK)

integriert. Es nahmen folgende Einrichtungen teil: DRK-

Blutspendedienst (BSD) West mit den Zentren Breitscheid und Münster,

DRK-BSD Baden-Württemberg-Hessen und Ost mit den Zentren

Dresden, Frankfurt und Ulm, DRK-BSD NSTOB mir den Zentren Springe

und Oldenburg und Bayrisches Rotes Kreuz-BSD mit den Zentren

München und Nürnberg.

Die Testung und Analysen erfolgten im Zeitraum von Januar 2004 bis

Februar 2006.

Die Steuerung der Studiengruppe und deren Koordination erfolgte

durch die Studienleitung bestehend aus Frau Dr. Gabriele Walther-

Wenke (DRK-BSD West, Münster), Herrn PD Dr. Thomas Müller (DRK-

BSD NSTOB, Springe) Herrn Dr. Franz Weinauer (BRK-BSD, München)

und Frau Dr. Adelheid Younis (DRK-BSD West, Breitscheid). Als

Doktorand war ich im Zentrum für Transfusionsmedizin Münster und im

Institut für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum an

der Präparateherstellung, Testung, Ergebniserstellung, Dateneingabe,

Auswertung der Ergebnisse und den bakteriologischen Untersuchungen

beteiligt. Ferner war ich in die Studiengruppe integriert, die sich im

Studienzeitraum regelmäßig zur Besprechung der Ergebnisse traf.

In den Tabellen 1 und 2 ist dargestellt, welche Thrombozytenpräparate

mit welchen Untersuchungsmethoden in den 9 beteiligten Zentren

untersucht wurden.

- 37 -

Tabelle 1: Übersicht der Gesamtzahl an TK, Herstellungsort und Herstellungsart Herstellungs-ort

Plasma-Pool-TK

T-Sol-Pool-TK

Apherese-TK Gesamt

Springe 8109

8109

Breitscheid 5104

685 5789

Münster 8831

8831

Ulm

9000 1105 10105 Frankfurt a.M.

6001

6001

Oldenburg

2860 2860

München

3977 3977

Nürnberg

2696 2696

Chemnitz

1195 1195

Dresden

2024 2024

Plauen

656 656

Gesamt 22044 15001 15198 52243

Tabelle 2: Anzahl der TK in der Paralleltestung mit den verschiedenen Testverfahren Produkt Gesamt BacT/ALERT PALL eBDS ScansystemTM

Apherese-TK

4730

Breitscheid 2000 2000

München 2730 2730

Pool-TK 6307

Münster 4732 4732 4732

Breitscheid 1575 1575 1575

Die Studiengruppe beschloss im Rahmen der Studienvorbereitung

Maßnahmen zur Qualitätssicherung. Die Herstellungsvorgänge von der

Spenderauswahl über die Hautdesinfektion, die Präparation bis zur

Lagerung wurden auf für die Fragestellung der Studie relevante

Unterschiede überprüft und ggf. vereinheitlicht. Um eine einheitliche

Vorgehensweis bei den Untersuchungen auf Sterilität sicher zu stellen,

wurden verbindliche Arbeitsanweisungen erarbeitet.

- 38 -

3.1. Material

Es wurden Sterilitätskontrollen an den in der Routine produzierten TK

der beteiligten Zentren vorgenommen. Diese Produkte waren zur

Therapie vorgesehene Blutkomponenten aus humanem Vollblut bzw.

durch Apherese gewonnen TK in entsprechenden Blutbeuteln. Alle

getesteten Produkte waren Arzneimittel im Sinne des §2

Arzneimittelgesetzes und vom Paul-Ehrlich-Institut zugelassen

(Arbeitskreis Blut, 1997).

TK werden bei angeborenen oder erworbenen Thrombozyten-

bildungsstörungen oder akutem Thrombozytenverlust, z.B. durch eine

starke Blutung, eingesetzt. Der arzneilich wirksame Bestandteil sind

Thrombozyten, die im Zusammenspiel mit Gerinnungsfaktoren und den

Gefäßwänden die Blutstillung gewährleisten.


Plasma (Plasma-PTK)

Durch die Zentrifugation von Vollblut und anschließender Abtrennung

von Plasma und Erythrozyten erhält man als Rest den Buffy-Coat, der

den größten Teil der Thrombozyten aus dem Vollblut enthält. Zum

Erreichen einer therapeutischen Standarddosis für Erwachsene von

200-500 x 109 werden im funktionell geschlossenen Systeme 4 Buffy-

Coats mit einem zugehörigen Plasma zu einem Pool zusammengeführt

und erneut zentrifugiert. Im anschließenden Abpressvorgang wird der

Überstand als TK durch einen Filter leukozytendepletiert

(Restleukozyten <1x106 in der gepoolten Einheit). PTK sind bei einer

Lagerungstemperatur von 22°C± 2°C unter ständiger Agitation maximal

- 39 -

5 Tage nach der Spende verwendbar (Wissenschftlicher Beirat der

Bundesärtzekammer und vom Paul-Ehrlich-Institut, 2005).


Thrombozytenlagerlösung T-Sol (T-Sol-PTK)

Die Herstellung T-Sol-gepoolter TK entspricht weitestgehend der

Herstellung von mit Plasma gepoolten TK. Zum Zusammenbringen der

Buffy-Coats wird bei dieser Methode jedoch nicht ein zugehöriges

Plasma verwendet, sondern eine additive Lösung, das T-Sol. Diese

Lösung soll hinsichtlich der Funktionserhaltung der Thrombozyten dem

Plasma überlegen sein. Auch T-Sol-gepoolte TK werden

leukozytendepletiert und sind bei einer Lagerungstemperatur von 22°C±

2°C unter ständiger Agitation maximal 5 Tage nach der Spende

verwendbar.

3.1.3. Apherese-Thrombozytenkonzentrat (ATK)

Die Herstellung erfolgt durch eine Apherese, mittels einer

Apheresemaschine. Die Leukozytendepletion ist in das

Aphereseverfahren integriert. ATK sind bei einer Lagerungstemperatur

von 22°C± 2°C unter ständiger Agitation maximal 5 Tage nach der

Spende verwendbar (Wissenschftlicher Beirat der Bundesärtzekammer

und vom Paul-Ehrlich-Institut, 2005). Es wurden Einfach-Apheresen mit

1 TK als Ergebnis und Zweifach-Apheresen mit der anschließenden

Aufteilung in 2 therapeutische Einheiten durchgeführt.

- 40 -

3.1.4. Art und Anzahl der getesteten Thrombozytenkonzentrate

Es wurden an 3 Standorten insgesamt 22.044 Plasma-PTK getestet. An 2

Standorten erfolgte die Testung von insgesamt 15.001 T-Sol-PTK. An 6

Standorten wurden ATK hergestellt. Aus 3.376 Apheresen wurde jeweils

1 TK hergestellt, aus 11.822 Apheresen entstanden durch Teilung

jeweils 2 therapeutische Einheiten. Somit wurden 15.198 Apheresen

mit 27.020 ATK durchgeführt.

3.2. Methoden

Vollblutspenden und Apheresen wurden nach schriftlichen

Verfahrensanweisungen hergestellt. Der Herstellungsbeginn jedes

Blutproduktes ist mit dem Zeitpunkt der Punktion gleichzusetzen. Die

Blutspenden wurden von gesunden Blutspendern auf Außenterminen

oder in den institutseigenen Entnahmeräumen entnommen.

3.2.1. Blutspenderauswahl und Vollblutspende

Die Spenderauswahl orientiert sich an den Richtlinien des

Wissenschaftlichen Beirats der Bundesärztekammer des Paul-Ehrlich-

Instituts (Wissenschftlicher Beirat der Bundesärtzekammer und vom

Paul-Ehrlich-Institut, 2005). Hiernach muss sich jeder Blutspender in

einem gesundheitlichen Zustand befinden, der eine Blutspende ohne

Bedenken zulässt. Dies gilt sowohl im Hinblick auf den

Gesundheitszustand des Spenders als auch auf die Herstellung von

möglichst risikoarmen Blutkomponenten. Durch eine schriftliche

Anamneseerhebung und anschließende ärztliche Zulassung zur Spende

ist eine sorgfältige Spenderauswahl gewährleistet, die Spenderwillige

mit akuten Erkrankungen von der Entnahme ausschließt. Insbesondere

- 41 -

wird jeder Spender nach Fieber, Zahnbehandlungen, invasiven

diagnostischen und therapeutischen Eingriffen sowie Durchfällen

gefragt, die auf eine unerkannte Bakteriämie hinweisen könnten. Durch

eine Temperaturmessung wird sichergestellt, dass der Spenderwillige

nur mit einer Temperatur von <37,5°C zugelassen wird.

Die Hautdesinfektion der Punktionsstelle dient der möglichst

vollständigen Entfernung der Bakterien von der Hautoberfläche und der

Reduzierung der in tieferen Hautschichten befindlichen Bakterien. Die

Desinfektion erfolgt mit einem DGHM-gelisteten

Hautdesinfektionsmitteln nach genauer Vorschrift und ist eine der

wichtigsten Tätigkeiten zur Vermeidung bakterieller Kontamination bei

der Blutgewinnung. Es wird eine gebrauchsfertige alkoholische Lösung

in Sprühflaschen verwendet. Der Punktierende muss sicherstellen, dass

die Punktionsstelle in der Ellenbeuge des Spenders vollständig benetzt

ist und die Einwirkzeit mindestens eine Minute beträgt. Nach Inspektion

und Palpation erfolgt eine erneute Desinfektion, anschließend die

Punktion.

Die Vollblutentnahme erfolgt mit einem funktionell geschlossenen

Beutelsystem, welches aus einem Entnahmeschlauch, einem PDS-Beutel

zur Abtrennung der ersten Milliliter der Vollblutspende, einem

Entnahmebeutel und einer Nadel besteht. Ferner sind weitere Beutel

für die Herstellungsschritte in das System integriert.

Vor der Entfernung der Schutzkappe der Punktionsnadel, die eine

Belüftung des Beutelsystems verhindert, ist es notwendig das

Beutelsystem durch Abklemmen des Entnahmeschlauchs zu

verschließen. Dies wird durch eine aufgesetzte Klemme oder die

- 42 -

Abklemmeinrichtung einer automatischen Mischwaage gewährleistet.

Zudem wird eine lockere Schlaufe in den Entnahmeschlauch gelegt.

Nach erfolgter Punktion und Fixierung der Nadel mit Heftpflaster wird

das Brechventil zum Predonation-Sampling-Beutel (PDS-Beutel)

geöffnet und ein für die Befüllung der Probenröhrchen ausreichendes

Volumen (von 30-40 ml) in den PDS-Beutel überführt. Dann wird die

irreversible Klemme am PDS-Schlauch geschlossen, die reversible

Klemme am Entnahmeschlauch geöffnet und die Mischwaage gestartet.

Im Anschluss können die Proberöhrchen aus dem PDS-Beutel gefüllt

werden. Nach Erreichen des Sollgewichts (500-555g 475-525ml

Vollblut) wird der Entnahmeschlauch durch eine Klemme möglichst

nahe an der Punktionsstelle temporär verschlossen. Die vorgelegte

Schlaufe des Entnahmeschlauches wird zugezogen, bis eine

Weißfärbung des Knotens eintritt. Zwischen Klemme und Knoten wird

der Entnahmeschlauch durchtrennt (Abb.1).

- 43 -

Verschluss des Predonation-Sampling-Beutels

Ausfüllen des Spenderfragebogens

Arztgespräch

Temperaturmessung < 37,5°C

Hämoglobingehalt >12,5 g/dl Frauen; >13,5 g/dl Männer

Keine Rückstellungsgründe

Spenderidentifizierung

Hautdesinfektion

Punktion

Füllen des Predonation-Sampling-Beutels

Spenderauswahl

Transport zur Weiterverarbeitung in den BSD

Steriler Verschluss des Beutelsystems

Lagerung zwischen Butardiolplatten

Füllen des Spendebeutelsystems

Abbildung 1: Ablauf des Spendevorgangs

- 44 -

3.2.2. Präparation von Pool-Thrombozytenkonzentraten

Die Vollblutkonserven, die zur Fraktionierung in

Erythrozytenkonzentrat, Plasma und Thrombozytenkonzentrat

vorgesehen sind, werden nach Übergabe durch die Entnahmeteams an

das verarbeitende Institut bei 22°C±2°C über Nacht gelagert.

Ein Teil der bei Spendeterminen gewonnenen Vollblutspenden werden

für die Herstellung von Pool-TK ausgewählt. Nach einer ersten

Zentrifugation werden Plasma und Erythrozyten getrennt, während der

Buffy-Coat (BC) im Entnahmebeutel verbleibt. Aus vier BC und 220-

250ml Plasma wird ein gefiltertes TK hergestellt (Abb. 2). Jeder BC-

Vierergruppe wird ein Plasma zugeordnet, wobei es sich um das Plasma

eines Spenders handeln muss, dessen BC bereits der Vierergruppe

angehört. Die vier BC der Gruppe und das zugeordnete Plasma werden

mittels steriler Schlauchverbindungen kettengliederartig verbunden

und gepoolt (Abb.3). Anschließend erfolgt eine zweite Zentrifugation.

An das zentrifugierte Zwischenprodukt wird mittels Konnektion der

Leukozytenfilter mit dem Thrombozytenlagerungsbeutel angeschlossen.

Anschließend wird das thrombozytenreiche Überstandsplasma durch

den Leukozytenfilter in den Lagerungsbeutel überführt (Abb.4).

Die Herstellung von T-Sol-Pool-TK und dessen zeitlicher Ablauf

entsprechen dem der Herstellung von Plasma-PTK. Lediglich das Plasma

wird bei diesem Produkt zu 70% durch eine additive Lösung, das T-Sol,

ersetzt. Das eingesparte Plasma kann anderen Verwendungszwecken

zugeführt werden.

- 45 -

Abbildung 2: Vier Buffy-Coats und ein zugehöriges Plasma

Abbildung 3: Poolen der 4 BC und des Plasmas, der Pool wird dann erneut zentrifugiert und das thrombozytenreiche Überstandsplasma abgepresst

- 46 -

3.2.3. Herstellung von Apherese-Thrombozytenkonzentraten

Thrombozytapherese ist definiert als die Herstellung eines

standardisierten Präparates mit mindestens 200 x 109 Thrombozyten in

ca. 200 – 300 ml Plasma mittels einer Apheresemaschine direkt aus dem

Blutkreislauf eines Spenders. Während der Blutentnahme erfolgt eine

gleichmäßige Durchmischung des Blutes mit einer Stabilisatorlösung

unmittelbar hinter der Entnahmenadel. Das entnommene Blut enthält

alle Blutbestandteile. Mittels extrakorporaler Zirkulation und

Lagerung des TK bei +22°C unter Agitation

einwandfrei

Zuordnung zur Produktlinie Pool-TK

Erste Zentrifugation (4000g, 13 min.)

Abpressen von Erythrozyten und Plasma

Buff-Coat (BC) verbleibt im Beutel

Poolen von 4 BC und einem zugehörigem Plasma/T-Sol

Zweite Zentrifugation (540g, 10 min.)

Abpressen durch Leukozytenfilter

in den TK-Beutel

Eingangskontrolle

Abbildung 4: Herstellung von Pool-TK (Schema)

- 47 -

Zentrifugation im Apheresegerät werden die Thrombozyten von den

anderen Bestandteilen getrennt und das TK hergestellt. Es können

mittels Thrombozytapherese simultan 2 standardisierte Präparate

hergestellt werden, indem der Inhalt eines Sammelbeutels auf 2 Beutel

aufgeteilt wird.

3.3. Teste auf bakterielle Kontamination, Keimbestimmung,

Keimdifferenzierung

3.3.1. Probenziehung und Verimpfung

Die zu testenden Proben mit einem Volumen von 50 ml wurden aus den

Entlüftungsbeuteln der TK, der nach Abschluss der Herstellung der TK

vom Endprodukt getrennt wurde, entnommen. Am Tag der

Probenziehung wurden je 7,5ml der Probe in aerobe und anaerobe

BacT-Alert-Flaschen überführt, die dann für maximal 7 Tage nach der

Herstellung im automatischen BacT/Alert-System inkubiert wurden

(Tab.3). Die Probenbeutel wurden dann unter den

Lagerungsbedingungen der TK bei 22°C bis zum Abschluss der Testung

gelagert.

- 48 -

Tabelle 3: Zeitabstände zwischen den verschiedenen Arbeitschritten

Präparat Median Mittelwert Minimum Maximum

Zeit zwischen Ende der Präparation und Probenziehung (min)

ATK 436 672 40 1999

Plasma-PTK 180 123 5 330

T-Sol-PTK 60 72 60 90

Zeit zwischen Ende der Präparation und Inkubation (min)

ATK 1256 1140 60 2983

Plasma-PTK 220 174 15 360

T-Sol-PTK 80 156 80 270

3.3.2. BacT/ALERT-Testung

Das BacT/ALERT-System (bioMerieux) ist das derzeitig am häufigsten

genutzte System für den Nachweis von Bakterien. Zwei Flaschen, eine

aerobe und eine anaerobe, werden mit Proben einer zu

untersuchenden Flüssigkeit beimpft. Diese Flaschen kommen zur

Inkubation bei 35° in den dafür vorgesehenen BacT/ALERT-Inkubator,

wo sie für 7 Tage inkubiert werden. Am Flaschenboden befindet sich ein

grauer Indikator für CO2, der mit steigendem CO2-Gehalt seine Farbe ins

Gelbe ändert. Im Inkubator wird jeder Flaschenboden mit einer LED

beleuchtet und über eine Photodiode das reflektierte Licht

aufgenommen und ausgewertet. Über die Änderung der Farbe durch

den CO2-Anstieg kann mittels der Kontrolleinheit eine Wachstumskurve

aufgezeichnet werden. Die automatische Analyse der Wachstumskurve

gibt an die Kontrolleinheit ein positives Signal, d.h. Bakterien sind in der

Probe nachweisbar, wenn eine logarithmische Wachstumskurve

entsteht. Durch eine integrierte, automatische Qualitätskontrolle ist das

- 49 -

BacT/ALERT-System derzeit die Methode mit der niedrigsten Rate an

falsch positiven Ergebnissen.

Zur Testung wurden die Probenbeutel mit den Etiketten der aeroben

und anaeroben Flasche markiert. Die Flaschen wurden mit den

Präparatenummern der Proben versehen. Danach wurde ein

Entnahmeschlauch mit Verimpfungsnadel (Donafix-System, B. Braun

Melsungen AG, Melsung, Deutschland) an den Probenbeutel

angeschweißt (Abb. 5).

An einem Arbeitsplatz mit Lamina-Air-Flow wurden dann jeweils 7,5ml

der Probe in eine anaerobe und eine aerobe BacT-ALERT-Flasche

überführt. Der beimpfende Mitarbeiter trug dabei eine Kopfhaube,

einen Mundschutz und sterile Handschuhe, um eine sekundäre

Kontamination der Proben zu vermeiden. Zum Verimpfen wurden die

Abbildung 5: Verimpfungsnadel wir an den TK-Probenbeutel

angeschweißt

- 50 -

Deckel der Flaschen entfernt und der Einfüllstopfen mit

Desinfektionslösung eingesprüht. Dann wurde die Schweißverbindung

zwischen Probenbeutel und Entnahmeschlauch geöffnet, und der

Entnahmeschlauch durch Füllen mit der Probe entlüftet. Anschließend

wurde, nach minimal 30 Sekunden, die Desinfektionslösung mittels

eines sterilen Tupfers vom Einfüllstopfen gewischt. Dann wurde zuerst

die anaerobe Flasche mit 7,5ml der Probe beimpft, danach die aerobe

Flasche. Nach dem Beimpfen wurde der Entnahmeschlauch samt Nadel

von dem Probenbeutel abgeschweißt, und verworfen. Anschließend

wurden die Flaschen ins BacT/ALERT-System überführt. Hierzu wurden

der Code der Flasche und der Code der zu testenden Probe als

Identifizierungsnummer eingescannt. Die Proben wurden bis zum

Zeitpunkt eines positiven Ergebnisses inkubiert oder nach einer

maximalen Inkubationszeit von 7 Tagen als negativ gewertet (Abb.6).

Das Detektionslimit der BacT/ALERT-Testung liegt bei 1 CFU/ml.

- 51 -

3.3.3. Testung mittels Scansystem™

Das Scansystem™ (Hemosystem SA, Marseille, Frankreich) benutzt zum

Bakteriennachweis den fluoreszierenden Farbstoff Picogreen, der

speziell die Doppelstrang-DNA von lebenden und abgetöteten Bakterien

sowie Bakteriensporen markiert.

Die Testung mit Scansystem startete 30 Stunden nach der Blutspende.

Steriles Überführen der Proben

in die BacT/ALERT-Flaschen

Herstellung des PC

Überführung der Probe in den Entlüftugsbeutels

Zuordnung der Spendennummer

Anschweißen des Donafix-Verbindungssystems

Bekleben der BacT/ALERT-Flaschen und

der Satellitenbeutel mit entsprechenden Etiketten

Desinfektion und Abwischen des Anstechstopfens

Entlüftung des Donafix-Systems

Vollblutentnahme am Spendetag

Inkubation bei 35° bis zu einem positiven Signal,

max. 7 Tage

Überführen der Flaschen

in den BacT/ALERT-Inkubator

1.Tag

2.Tag

7 Tage

Abbildung 6: Zeitschema BacT/ALERT

- 52 -

Für die Testung wurden je 3ml Probenvolumen von drei Pool-TK

gepoolt. Dafür wurden mittels des Thrombozyten-Kits je 3 ml Probe in

eine Spritze überführt (Abb.7). Diese enthält ein Thrombozyten-

Aggregationsmittel und den DNA-bindenden, fluoreszierenden

Markierungsfarbstoff. Während einer 40 minütigen Inkubationszeit

unter konstanter Agitation bindet dieser an die DNA, während die

Thrombozyten agglutinieren. Durch die anschließende Pressung durch

einen Filter (5 µm) wird die Probe von den Thrombozytenagglutinaten

befreit, während die Bakterien diesen passieren können.

Im angeschlossenen Beutel mit thrombozytolytischer Lösung verbleibt

die Probe für weitere 10 Minuten, um die restlichen Thrombozyten

aufzulösen. Außerdem dringt die Lösung auch in die

Bakterienmembran, um die Aufnahme des fluoreszierenden Farbstoffes

Abbildung 7: Scansystem Thrombozyten-Kit mit Spritze

(rechts),Thrombozyten- Filter (grün), thrombolytischer

Lösung im Beutel und 0,4µm-Membran (in der Kappe links)

- 53 -

zu fördern, bevor die Probe über eine Vakuumpumpe durch eine 0,4

µm-Membran abgesaugt wird. Diese Membran dient der Rückhaltung

der markierten Bakterien und zum darauf folgenden Transfer zur

Analyse im Scansystem-Analysator.

Zur Analyse wird die Membran auf einen Metallträger gelegt, dieser

wird dann in die Schublade des Analyse-Scannermoduls gelegt. Im

Scanner wird der Fluorophor-Farbstoff durch einen Argon-Laser (488

nm) angeregt und gibt Signale der Wellenlänge 515 nm ab. Diese

Signale werden während des Scan-Vorgangs erkannt. Da die Signalform

bei Partikelrückständen und Bakterien völlig unterschiedlich ist, kann

der Computer die Signale analysieren und zwischen Bakterien und

Partikelrückständen unterscheiden.

Nach dem Scannen muss innerhalb von fünf Minuten die

Membranvalidierung mit dem Mikroskop durch einen Laboranten

erfolgen. Dazu wird der Membran-Metallträger auf den

Mikroskopschlitten gelegt und mithilfe der Software die Validierung

gestartet. Das Mikroskop bewegt sich automatisch zum ersten

gescannten Fleck und der Laborant begutachtet diesen visuell durch das

Mikroskop und validiert das Signal mittels der Validierungstastatur

(Abb.8). Über diese gibt der Laborant ein, ob es sich um einen

Mikroorganismus oder einen Partikelrückstand handelt.

Nachdem 50 Signale validiert wurden, errechnet die Software

automatisch die Verhältniszahl R (Anzahl der bestätigten Bakterien

geteilt durch die Anzahl der validierten fluoreszierenden Signale). Ist

R<0,2 ist der Test negativ, d.h. die Probe ist nicht bakteriell

kontaminiert, ist R≥0,2 so ist der Test positiv und die Software erfasst

die Probe als bakteriell kontaminiert.

- 54 -

Die Daten der Proben werden durch die Software auf der Festplatte

gespeichert und einmal wöchentlich auf einer CD-ROM gesichert.

Im Fall eines positiven Testergebnisses bei einer Probe aus drei

gepoolten Proben, muss der Test einzeln für jedes der drei beteiligten

PCs wiederholt werden (Abb. 9).

Der Testhersteller gibt als Detektionslimit 1000 CFU/ml an.

Abbildung 8: Membranvalidierung des Scansystem, die Laborantin

validiert über eine Tastatur ob die von der Software ausgewählten

Punkte Mikroorganismen oder Partikelrückstände sind

- 55 -

Thrombolyse und Erhöhung der Permeabilität der Bakterienmembran für Farbstoff

Herstellung des Pool-TK

Überführung des Entlüftugsbeutels in die zuständige Abteilung

Probenentnahme BacT/ALERT (sieh Abb.3)

Lagerung des Entlüftungsbeutels bis zum nächsten Morgen

Poolen von 3ml von je 3 Proben im Thrombozyten-Kit

Aggregation der Thrombozyten und Markierung der Bakterien DNA

Abpressen durch 5µm-Membran

Vollblutentnahme am Spendetag

Scannen der Membran im Scannermodul

Absaugen der Probe durch 0,4µm-Membran

1.Tag

2.Tag

Mikroskopische Validierung durch Laboranten

Berechnung von R; Auswertung durch Computer

3.Tag

40 min

10 min

Abbildung 9: Zeitschema Scansystem

- 56 -

3.3.4. Testung mittels PALL eBDS

Das PALL enhanced Bacterial Detection System verwendet die Abnahme

der Sauerstoffkonzentration in der Untersuchungsprobe als Marker für

bakterielles Wachstum. Potenzielle Hintergrundstörungen werden

vermieden, indem die Thrombozyten, die ebenfalls Sauerstoff

verbrauchen, herausgefiltert werden. Das PALL eBDS ermöglicht eine

Probenentnahme im geschlossenen System und es werden keine

zusätzlichen Reagenzien benötigt.

Am Tag der TK-Herstellung werden 2 ml der TK-Probe mittels steriler

Konnektion über einen Filter in den PALL eBDS-Probenbeutel gepresst

(Abb.10). Nach der Abtrennung wird der Probenbeutel für minimal 24

Stunden, maximal 30 Stunden auf einem horizontalen Schüttelblech bei

35°C inkubiert.

Abbildung 10: PALL eBDS-Probenbeutel

- 57 -

Nach der Inkubation erfolgt die Messung der O2-Utilisation mit dem

PALL eBDS Oxygen Analyzer (Abb. 11). Zur Probenmessung wird die

PALL eBDS-ID (Lot Nr.) auf der Etikettenlasche des Probenbeutels und

die TK-Pool-Identitätsnummer gescannt. Der Messfühler wird durch die

Membran in der Mitte des Detektionsports am PALL eBDS-Probenbeutel

bis zum Kanülenende eingeführt. Durch Drücken der Taste „Enter“ wird

der Messvorgang gestartet. Nach dem Beenden der Messung wird der

Messfühler in die Halterung am Analyzer gesteckt, um einen

Referenzwert (O2 % in atmosphärischer Luft, 21%) zu messen. Im

Anschluss erscheint im Display bei einer O2-Konzentration in der Probe

von >19,5% das Ergebnis „Bestanden“ oder bei einer Konzentration

≤19,5% „Nicht-Bestanden“. Die Probenmesswerte werden im Computer

gespeichert und am Ende des Tages wird eine aktuelle Liste der

Ergebnisse ausgedruckt (Abb. 12).

Abbildung 11: Der PALL eBDS Analyzer misst die O2-Konzen-

tration in der Luft des Probenbeutels

- 58 -

Die Nachweisgrenze für Bakterien wird vom Hersteller mit 1 bis 100

CFU/ml, in Abhängigkeit der Wachstumskinetik der Bakterien,

angegeben.

Analyser gibt Ergebnis Bestanden (>19,5%) oder Nicht Bestanden (<19,5%)

Herstellung des Pool-TK

Überführung des Entlüftugsbeutels in die zuständige Abteilung

Probenentnahme BacT/ALERT (sieh Abb.3)

Überführen von 2ml in PALL eBDS-Probenbeutel und gleichzeitige Thrombozytenentfernung mittels Filter

Inkubation bei 35°C unter Aggitation für mindestens 24h, max. 30h

Messung des O2-Gehaltes im Beutel

Messung des O2-Referenzwertes (Raumluft 21%)

Vollblutentnahme am Spendetag 1.Tag

2.Tag

3.Tag

Abbildung 12: Zeitschema PALL eBDS

- 59 -

3.4. Vorgehen bei positiven Testergebnissen

Es erfolgte eine kontinuierliche Überwachung der BacT/ALERT-

Inkubatoren, um bei positivem Testsignal sofort reagieren zu können.

3.4.1. Positive Ergebnisse im BacT/ALERT-System

Im Falle eines positiven Signals wurden die Flaschen frühestens 6

Stunden nach Auftreten des Signals aus dem Inkubator genommen und

diese zur Keimdifferenzierung an die Institute für Medizinische

Mikrobiologie Bochum oder Frankfurt gesandt. Proben die ein eindeutig

exponentielles Bild in der Wachstumskurve zeigten, wurden direkt

entnommen.

War nur eine der beiden Flaschen positiv, so wurde die Flasche ohne

positives Signal bis zu einem positiven Signal oder bis zum Ablauf der

maximalen Inkubationszeit weiter im BacT/ALERT-Inkubator belassen.

Das zugehörige TK einer positiven Probe wurde über das hausinterne

EDV-Programm umgehend gesperrt. Erfolgte bereits die Auslieferung,

wurde ein Protokoll zur Rückrufaktion an den Vertrieb weitergeleitet,

der sofort den Rückruf startete.

Aus dem zurückgestellten Entlüftungsbeutel des entsprechenden TK

und falls noch vorhanden aus dem TK selbst, erfolgte eine zeitnahe

zweite Probenverimpfung und Überprüfung auf Keimwachstum mit

dem BacT/ALERT-System.

Bei einem positiven Ausfall des Zweitansatzes, beimpft aus dem

Restmaterial des Entlüftungsbeutels bzw. des Hauptpräparates, erfolgte

eine Einsendung der entsprechenden Kulturflasche zur

Keimdifferenzierung an die Institute für Medizinische Mikrobiologie

Bochum oder Frankfurt.

- 60 -

Die Inkubation wurde bei negativem Testergebnis nach 7 Tagen

beendet.

3.4.2. Positive Ergebnisse im Scansystem™

Mittels des Scansystems wurden Proben aus 3 PTK gleichzeitig getestet.

Sollte das Ergebnis in der Probe positiv sein, so musste jedes beteiligte

Produkt einzeln einer zweiten Testung unterzogen werden, um zu

bestimmen, welches der beteiligten Produkte kontaminiert war. Die als

kontaminiert identifizierte Probe wurde an das Institut für medizinische

Mikrobiologie Bochum zur Keimdifferenzierung eingesandt. Falls

vorhanden wurde aus dem gelagerten Entlüftungsbeutel eine Probe in

der BacT/ALERT-Methode untersucht. Eine Quarantänelagerung bzw.

Rückholung und Nachtestung assoziierter Präparate erfolgte nach

Einzelfallentscheidung der Studienleitung.

Bei positivem Ausfall einer BacT/ALERT-Nachtestung erfolgte eine

Einsendung an das Institut für Medizinische Mikrobiologie Bochum.

3.4.3. Positive Ergebnisse im PALL eBDS

Im Falle einer positiven Reaktion im PALL eBDS-Test wurde der positiv

getestete PALL eBDS-Probenbeutel zur Keimdifferenzierung an das

Institut für medizinische Mikrobiologie Bochum eingesandt. Aus der

gelagerten Entlüftungsbeutelprobe der entsprechenden TK wurde eine

Wiederholungstestung mit der BacT/ALERT-Methode eingeleitet. Falls

noch asservierbar, wurde eine Nachtestung aus dem Original-TK in der

BacT/ALERT-Methode durchgeführt.

- 61 -

Eine Quarantänelagerung bzw. Rückholung und Nachtestung

assoziierter Präparate erfolgte nach Einzelfallentscheidung der

Studienleitung.

Bei positivem Ausfall einer BacT/ALERT-Nachtestung erfolgte eine

Einsendung der Kulturflaschen an das Institut für medizinische

Mikrobiologie.

3.4.4. Testung der verbundenen Erythrozytenkonzentrate bei

positiven Ergebnissen

Im Falle eines positiven Signals in einem der Pool-TK sollten auch die

assoziierten EK einer Sterilitätstestung unterzogen werden. Einem PTK

sind 4 EK zugeordnet. Aus diesen sollte, falls noch nicht ausgeliefert

bzw. transfundiert, eine aerobe und anaerobe Kultur im BacT/Alert-

System angelegt werden. Nach diesem Prinzip wurde mit allen EK

verfahren, die noch nicht ausgeliefert waren. Ausgelieferte EK wurden

zurückgeholt und ebenfalls getestet, soweit sie noch nicht transfundiert

waren.

3.5. Fragebogen zur klinischen Verträglichkeit der

Thrombozytenkonzentrate

Mit jedem TK wurde an den Anwender ein Fragebogen ausgegeben, mit

dem Daten bezüglich der Verträglichkeit der getesteten TK erfasst

werden sollten. Auf dem Fragebogen der TK wurden

Herstellungsdatum, Konservennummer und der Zeitpunkt der Abgabe

der TK ausgewiesen. Vom Anwender sollten mögliche relevante Daten

des TK-Empfängers (Diagnose, Größe, Gewicht, Alter, Geschlecht,

Transfusionszeitpunkt, Thrombozytenzahl vor und nach Transfusion),

- 62 -

Angaben bezüglich der Verträglichkeit (ohne/mit Nebenwirkungen,

Beginn der Symptomatik, welche Symptome) und weitere klinische

Angaben (Fieber, Blutungen, Antibiotikatherapie, Zytostatika,

Hypersplenismus, DIC, HIT, HLA/HPA-Antikörper) gemacht werden.

3.6. Mikrobiologische Untersuchungen

Die mikrobiologischen Untersuchungen zur Identifizierung der

kontaminierenden Bakterien wurden vom Institut für Medizinische

Mikrobiologie Bochum und vom Institut für Mikrobiologie der

Universität Frankfurt/Main durchgeführt. Dabei kamen

Standardmethoden wie Gramfärbung und Subkultivierung auf festen

Medien zum Einsatz. Es wurde Schokoladen-Agar, McConkey-Agar,

Sabouraud-Dextrose-Agar und bei anaerober Inkubation Columbia-Agar

verwendet. Die Bakteriendifferenzierung wurde mit biochemischen

Standardmethoden und molekularen Verfahren wie 16S-rDNA-

Sequenzierung oder sodA-Sequenzierung durchgeführt.

Weiter Untersuchungen wurden ausschließlich im Institut für

Medizinische Mikrobiologie Bochum vorgenommen. Die Typisierung

von Staphylokokken erfolgte mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese. Die

Vergleiche von Propionibakterienstämmen erfolgte mittels Random-

Amplifikation polymorpher DNA (RAPD-PCR) mit dem Primer OLP-05

(Rossi et al., 1998; Goering et al.,1992).

3.7. Datenerfassung und Auswertung

Die Daten und Ergebnisse zu den untersuchten TK wurden in den

beteiligten Zentren in vorgegebener tabellarischer Form im Programm

Excel 2003 (Microsoft Corporation, USA) erfasst.

- 63 -

Folgende Daten wurden eingegeben:

Konservennummer, Art des TK, Entnahmedatum, Herstellungsdatum,

Zeitpunkt der Probenziehung, Zeitpunkt des Inkubationsbeginns,

Ergebnisse der aerobe und anaeroben Kulturen, ggf. Ergebnis der

Keimdifferenzierung, ggf. Datum der Ausgabe, Testergebnisse

verbundener EK.

Die statistische Auswertung erfolgte in Zusammenarbeit mit dem

Zentrum für Biomedizinische Methoden der Abteilung für Medizinische

Informatik, Biometrie und Epidemiologie der Ruhr-Universität Bochum.

Primäre Endpunkte waren Unterschiede zwischen den

Kontaminationsraten der verschiedenen Thrombozytenpräparationen.

Unterschiede wurden mittels Chi-Quadrattest auf ihre Signifikanz

überprüft und p-Werte <0,05 als signifikant gewertet. Die statistischen

Analysen wurden mit der Software SAS, Version 8.02 (SAS Inc.,

Chicago, Il.) und NCSS, Version 2001 (NCSS, Kaysville, UT) durchgeführt.

- 64 -

4. Ergebnisse

4.1. Bakterielle Kontaminationsraten in der BacT/ALERT-Testung

Nach Abschluss der Untersuchungen erfolgte für alle getesteten TK die

Zuordnung zu einem Testergebnis. Abbildung 6 gibt einen Überblick

hierzu.

1. Kultur

kein positives Signal

1. Kultur

positives Signal, kein Bakteriennachweis in der Kulturflasche

1. Kultur

positives Signal, Bakteriennachweis und Identifikation der Spezies

1. Kultur

positives Signal, Bakteriennachweis und Identifikation der Spezies

Negativ

2. Kultur

durchgeführt, negatives Ergebnis

Falsch positiv

2. Kultur

durchgeführt, negatives Ergebnis, oder positiv, aber keine Bestätigung der 1. pos. Kultur

Potentiell positiv

2. Kultur

positives Signal, Bakteriennachweis und Identifikation identischer Spezies

Bestätigt positiv

Abbildung 13: Definition der Testresultate des BacT/ALERT-

Screenings

- 65 -

Insgesamt wurden an 52.243 TK 282 positive Testergebnisse beobachtet

(Tab.4). Von diesen waren 98 TK potentiell positiv. Dabei zeigten die

Apherese-TK mit 0,32% eine signifikant höhere Rate als Plasma-PTK mit

0,12% und T-Sol-PTK mit 0,16% (p<0,001). Die Rate bestätigt positiver

TK aus den verschiedenen Herstellungsmethoden unterschieden sich

nicht signifikant.

Tabelle 4 : Resultate der Sterilitätstestung der TK

Endergebnisse

Produktart Anzahl der getesteten

TK

Anzahl der TK mit pos Signal

aerob und/oder anaerob

Falsch positiv

Potentiell positiv

Bestätigt positiv

n % n % n % n %

Apherese-TK1

15.198 115 0,76 54 0,36 48 0,32c 13 0,09

Plasma-PTK 22.044 96 0,44 54 0,24 26 0,12a,c 16 0,07

T-Sol PTK 15.001 71 0,47 39 0,26 24 0,16b,c 8 0,05

Total 52.243 282 0,54 147 0,28 98 0,19 37 0,07

1 Anzahl der Apherese-Prozeduren: Aus 11.822 Apheresen wurden zwei Einheiten hergestellt, aus 3.376 eine Einheit.

Die Gesamtzahl der Apherese-TK ist 27.020.

a: p=0,001 Plasms-PTK vs Apherese-TK

b: p=0,02 T-Sol-PTK vs Apherese-TK

C: p<0,001 Plasma-PTK und T-Sol-PTK vs Apherese-TK

Falsch positive Resultate fanden sich bei insgesamt 147 untersuchten

Produkten. Die Raten der einzelnen Produkte, ATK mit 0,35% (n=54),

- 66 -

Plasma-PTK mit 0,25% (n=54) und T-Sol-PTK mit 0,26% (n=39) falsch

positiven Ergebnissen, unterschieden sich nicht signifikant voneinander.

Zu Beginn der BacT/ALERT-Testung zeigte sich, dass die Ursache von

falsch positiven Testresultaten in der Fehlfunktion von

Inkubationszellen zu suchen war (GERMS Group, 2005). Bei der

Herstellung der Inkubationsflaschen verwendete der Hersteller jetzt

Kunststoffe statt Glas, zusätzlich kam ein veränderter colometrischer

Sensor zum Einsatz. Ein Teil der zu Beginn gefundenen falsch positiven

Testresultate konnte auf eine fehlerhafte Kalibrierung der Messzellen

im BacT/Alert-Automaten zurückgeführt werden. Der Ersatz

entsprechender Module beseitigte das Problem. Die falsch positiven

Testergebnisse werden hier nicht weiter betrachtet.

Der größte Anteil positiver Kulturergebnisse entfiel auf die anaeroben

Kulturflaschen. Tabelle 5 zeigt, dass 66% der potentiell positiven

Ergebnisse und mehr als 80% der bestätigt positiven Ergebnisse in

anaerober Kultur erzielt wurden.

Tabelle 5: Positive Testresultate in aerober/anaerober Kultur

Potentiell

positiv anaerob positiv

aerob positiv

anaerob und aerob positiv

98 65 66,3% 31 31,6% 2 2,0%

Bestätigt positiv anaerob positiv

aerob positiv

anaerob und aerob positiv

37 30 81,1% 3 8,1% 4 10,8%

Der Zeitabstand zwischen Abschluss der Präparateherstellung und dem

ersten positiven Kultursignal entschied darüber, ob die entsprechenden

TK zur Transfusion gelangten oder nicht. Tabelle 6 zeigt, dass bis 48

- 67 -

Stunden nach der Herstellung bereits 66% der insgesamt hergestellten

TK zur Transfusion abgegeben waren. Bei einem späten positiven

Kultursignal bestand somit kaum eine Chance, die Abgabe eines

möglicherweise bakteriell kontaminierten TK zu verhindern.

Tabelle 6: Zeitabstand zwischen Abschluss der Herstellung und erstem pos. Signal

Positive Signale

Gesamt 0 - 24 h 24 - 48 h 48 - 72 h 72 - 96 h > 96 h

282 28 81 30 42 101

Anteil der zu diesem Zeitpunkt abgegebenen TK aus der Gesamtproduktion

~ 40% ~ 66% ~ 87% ~ 99%

Von den 282 TK mit falsch positivem, potentiell positivem oder bestätigt

positivem Testergebnis waren 155 (55%) vor dem ersten positiven

Signal ausgegeben. Der Rückruf war nur bei einem potentiell positiven

ATK (Bacillus circulans) und einem bestätigt positiven PTK

(Staphylococcus saccharolyticus) erfolgreich.

- 68 -

4.1.1. Bakterienspezies

Das Bakterienspektrum, das in potentiell und bestätigt positiven TK

identifiziert wurde, ist in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7: Bakterienspezies in potentiell und bestätigt positiven TK

Präparateart

Spezies ATK Plasma-PTK T-Sol-PTK Gesamt

A: Bakterienspezies in 98 potentiell positiven TK

P. acnes 21 14 10 45

S. epidermidis 5 1 2 8

andere koagulase-negative 6* 6 2 14

Staphylokokken/Mikrokokken †

Bacillus-Familie ‡ 7 3 4 14

anaerobe Staphylokokken § 2

3 5

Coryneforme Bakterien ‽ 4

1 5

S. aureus

1

1

Bacteroides capillosus

1

1

Clostridium bifermentans

1 1

Peptostreptococcus prevotii

1 1

S. lugdunensis 1

1

Andere ∏ 2

2

Total 48 26 24 98

B: Bakterien in 37 bestätigt positiven TK

P. acnes 10 6 4 20

S. epidermidis 1 5 2 8

S. capitis 1 2

3

S. saccharolyticus

2 2 4

S. aureus 1

1

S. marcescens

1

1

Total 13 16 8 37

* Bei einem ATK mit S.capitis in der aeroben Kultur, wurde P. acnes aus der anaeroben Kultur isoliert.

† Staphylpcoccus capitis, S. cohnii, S. warneri, Micrococcus luteus.

‡ Bacillus circulans, B. endophyticus, B. firmus, B. licheniformis, B. pumilus, B. simplex, B. stearothermophilus, B. subtilis, Bacillus spp., Brevibacillus thermoruber, Paenibacillus turicensis.

§ Staphylococcus (Peptococcus) saccharolyticus.

‽ Brevibacterium casei, Corynebacterium afermentans, C. coyleae, C. imitans, Rothia dentocariosa.

∏ Nicht kultiviertes β-Proteobakterium, Nicht kultiviertes Soil Bakterium.

- 69 -

In den potentiell positiven TK fanden sich zu 46% Propionibakterien und

zu 30% Staphylokokken. Der Anteil der Propionibakterien in den

bestätigt positiven TK liegt mit 54% noch höher. Als Keime mit der

höchsten Pathogenität müssen Serratia marcescens und S.aureus

gelten, die in einem potentiell positiven und zwei bestätigt positiven TK

gefunden wurden. Bei diesen TK führten frühe positive Kultursignale

nach 9 bzw. 13 Stunden zu deren Ausschluss von der Transfusion.

Der hohe Anteil von Propionibakterien als Kontaminante erklären den

hohen Anteil an positiven anaeroben Kulturen, denn Propionibakterien

sind obligate Anaerobier. Aufgrund ihrer langsamen Vermehrung

erklären sie auch den hohen Anteil spät positiver Signale.

Die kontaminierenden Bakterienspezies unterschieden sich bei den

verschiedenen Präparatearten nicht voneinander.

4.1.2. Testergebnisse verbundener Erythrozytenkonzentrate

Für 50 potentiell positive TK wurden 200 verbunden EK identifiziert, von

welchen 147 (73,5%) als steril getestet wurden. 25 EK waren

transfundiert worden, ohne dass eine Transfusionsreaktion beobachtet

wurde, wie durch eine gezielte telefonische Befragung der zuständigen

Ärzte festgestellt wurde. 21 EK wurden vernichtet. In 7 EK konnte

Propionibacterium acnes in anaeroben Kulturen identifiziert werden.

Derselbe Keim war in den korrespondierenden TK entdeckt worden.

96 EK waren mit bestätigt positiven TK verbunden. Davon wurden 79 EK

(82,3%) negativ getestet, 6 (6,2%) wurden ohne eine TR verabreicht und

1 EK wurde vernichtet. Bei 10 der 24 bestätigt positiven TK konnte 1

kontaminiertes EK mit identischen Bakterien identifiziert werden.

- 70 -

Propionibakterien wurden in 9 Fällen entdeckt und Staphylococcus

captitis in einem Fall.

Bei den TK-Kontaminationen mit S. marcescens und S. aureus zeigten

die verbundenen EK kein Wachstum.

4.1.3. Bakterienspezies in potentiell positiven Thrombozyten-

konzentraten, transfundierte Einheiten und klinischer Follow up

Da der Rücklauf der Präparate-Begleitscheine aus den

transfundierenden Einrichtungen gering war, wurde nach Abschluss der

Testung beschlossen, zu allen Präparaten mit potentiell und bestätigt

positiven Testergebnissen eine telefonische Befragung der

verantwortlichen Ärzte durchzuführen.

Tabelle 8 zeigt zu den potentiell positiven TK die Bakterienspezies, die

Inkubationsdauer bis zum ersten positiven Kultursignal, die

transfundierten TK und das Ergebnis der klinischen Einschätzung.

Insgesamt wurden 74 ATK, welche aus 48 Apheresen gewonnen worden

waren, als potentiell positiv eingestuft. Von diesen wurden 55 ATK aus

35 Apheresen transfundiert. Bei den PTK wurden 29 Einheiten von 50

potentiell positiven PTK transfundiert.

Bei der Befragung wurden 4 Fälle berichtet, bei denen die Patienten in

zeitlichem Zusammenhang mit der TK-Transfusion einen

Temperaturanstieg zeigten, bzw. eine Sepsis entwickelten. Ein

Kausalzusammenhang mit der Transfusion wurde in allen Fällen

verneint. Weitergehende Untersuchungen unterblieben und als

Erklärung wurden andere Gründe vermutet.

- 71 -

Tabelle 8: Potentiell positive TK: Bakterienspezies, Inkubationszeit bis zum ersten positiven Signal, transfundierte TK und klinisches Follow-up

Spezies Anzahl und Art der TK

Inkuba-tionszeit bis zum ersten pos. Signal

Anzahl und Art d. transfun-dierten TK

Klinisches Follow-up/ Transfusionsreaktionen (TR)

Propionibacterium acnes 21 ATK, 4,9 Tage 37 ATK aus 1x Temperaturanstieg, vom Arzt nicht als TR eingestuft

38 Einh.

(3,7-6,3) 21 Apheresen

24 PTK 5,4 Tage 14 PTK 1x vorübergehender Temperaturanstieg, rückläufig unter Antibiotikagabe, vom Arzt nicht als TR eingestuft

(3,7-5,7)

1x multimorbider Pat. mit Sepsis und Neutropenie nach Knochenmarkstransplantation, Pat. verstarb, vom Arzt nicht als TR eingestuft

Staphylococcus 2 ATK, 2x2,7 Tage 1 ATK aus Keine TR

saccharolyticus

3 Einh.

1 Apherese

3 PTK 3,3 Tage 3 PTK Keine TR

(2,3-4,2)

Staphylococcus 5 ATK, 1,1 Tage 2 ATK aus Keine TR

epidermidis

7 Einh.


3 PTK 20,3 Stunden

- -

(20,0-20,9)

Bacillus circulans, B. endophyticus, 7 ATK, 1,9 Tage 4 ATK aus Keine TR

B. firmus, B. licheniformis, B. pumilus, B.simplex, B. stearothermophilus, B. subtilis, Bacilus spp., Brevibacillus thermoruber, Paenibacillus turicensis

9 Einh.


7 PTK 1,8 Tage 3 PTK 1x Temperaturanstieg bis 39°C, Pat. mit Neutropenie, vom Arzt nicht als TR eingestuft (Bacillus firmus)

(0,8-6,8)

Staphylococcus capits‡, S. cohnii, 5 ATK, 1,5 Tage 3 ATK aus Keine TR

S. hominis, S. warneri, S. lugdunensis

6 Einh.


1 PTK 19 Stunden - -

Corynebacterium afermentans, 4 ATK, 2,1 Tage 5 ATK aus Keine TR

C. coyleae, C. imitans, Rothia dentocariosa, Brevibacterium casei

5 Einh.



Mikrococcus luteus 1 ATK 3,3 Tage 1 ATK Keine TR


(1,5-5,6)

Staphylococcus lugdunensis 1 ATK 1,2 Tage -

Staphylococcus aureus 1 PTK 22,1 Stunden

-

Bacteroides capillosus 1 PTK 1,6 Tage 1 PTK

Clostridium bifermentans 1 PTK 4,5 Tage 1 PTK

Peptostretococcus prevotii 1 PTK 4,5 Tage 1 PTK

Nichtkultiviertes β-Proteobakterium 1 ATK, 1,4 Tage 1 ATK aus

2 Einh.

1 Apheresen

Nichtkultiviertes Soil Bakterium 1 ATK, 1,2 Tage 1 ATK aus

2 Einh.

1 Apheresen

Gesamt 48 ATK,

35 ATK aus

74 Einh.

Apheresen mit 55 Einh.

50 PTK 29 PTK

ATK Apherese-Thrombozytenkonzentrate, PTK gepoolte Thrombozytenkonznetrate, TR Transfusionsreaktion

‡ In einem ATK S.capitis und P. acnes

- 72 -

4.1.4. Bakterienspezies in bestätigt positiven Thrombozyten-

konzentraten, transfundierte Einheiten und klinischer Follow up

Von 29 transfundierten TK waren 25 mit Propionibakterien

kontaminiert. Tabelle 9 zeigt, dass die Transfusion aufgrund der langen

Zeitphase zwischen Inkubationsbeginn und positiven Signal Ursache

dafür ist, dass die Anwendung nicht verhindert werden konnte.

Tabelle 9: Bestätigt positive TK: Bakterienspezies, Inkubationszeit bis zum ersten positiven Signal, transfundierte TK und klinisches Follow-up

Spezies Anzahl und Art der TK

Inkuba-tionszeit bis zum ersten pos. Signal

Anzahl und Art d. transfun-dierten TK

Klinisches Follow-up/ Transfusionsreaktionen (TR)

Propionibacterium acnes 10 ATK, 4,5 Tage 17 ATK aus 1x Pat. dem beide Einheiten einer Apherese transfundiert wurden, febrile Reaktion, klinisch keine schwere TR, vom Arzt nicht als TR eingestuft

17 Einh.


10 PTK 4,3 Tage 8 PTK 1x Temperaturanstieg bei Pat. mit

akuter myeloischer Leukämie, unter Antibiotikagabe schnell rückläufig, vom Arzt nicht als TR eingestuft

(3,4-5,8)

Staphylococcus 1 ATK, 15,7 Stunden 1 ATK aus Keine TR, Pat. unter antibiotischer Therapie

epidermidis

2 Einh.

1 Apherese

7 PTK 20,2 Stunden - -

(17,6-24,5)

Staphylococcus 4 PTK 2,7 Tage 2 PTK Keine TR

saccharolyticus

(2,3-3,1)

Staphylococcus 1 ATK 15,1 Stunden 1 ATK Keine TR

capitis 2 PTK 18,9 und -

-

26 Stunden

Staphylococcus 1 ATK 9,1 Stunden -

-

aureus

Serratia 1 PTK 12,8 Stunden -

-

marcescens

Gesamt 13 ATK,

12 ATK aus

24 Einh.

Apheresen mit 19 Einh.

50 PTK 10 PTK

ATK Apherese-Thrombozytenkonzentrate, PTK gepoolte Thrombozytenkonznetrate, TR Transfusionsreaktion

- 73 -

Spontanberichte zu TR bei den bestätigt positiven TK gingen nicht ein.

Die nachträgliche Befragung der transfundierenden Ärzte deckte 2 Fälle

mit Propionibakterien auf, bei denen die Patienten Fieberepisoden

hatten. Diese wurden von den Ärzten jedoch als nicht

transfusionsassoziiert und als nicht bakteriell bedingt eingeordnet.

Daher erfolgten keine weiteren Untersuchungen.

4.2. Septische Transfusionsreaktionen bei falsch negativ getesteten

Thrombozytenkonzentraten

Zu einem Apherese-TK, welches in zwei therapeutische Einheiten

aufgeteilt und in der Sterilitätstestung als negativ befundet wurde,

kamen Meldungen über schwerwiegende Transfusionsreaktionen. In

einem Fall war eine Patientin mit der Diagnose Non-Hodgkin-Lymphom

betroffen, welche nach myeloablativer Radiochemotherapie zur

Vorbereitung auf eine Knochenmarktransplantation eine Einheit 4,1

Tage nach Herstellung transfundiert bekam. Nach der Transfusion

entwickelte die Patientin eine respiratorische Insuffizienz und

Kreislaufinstabilität. Trotz sofortiger antibiotischer Therapie entwickelte

die Patientin ein septisches Krankheitsbild mit Multiorganversagen,

woran sie 10 Tage später verstarb. In der angelegten Blutkultur der

Patientin konnte ebenso wie im Restmaterial aus dem TK-Beutels

Klebsiella pneumoniae nachgewiesen werden.

Eine zweite Patientin mit der Diagnose einer akuten myeloischen

Leukämie erhielt die zweite Einheit aus derselben Apherese 4,2 Tage

nach Herstellung. Sie reagierte mit Fieber und Kreislaufinstabilität. Nach

notwendiger Katecholamingabe und einer Antibiotikatherapie

stabilisierte sich der Zustand. In der Blutkultur und dem Restmaterial

- 74 -

aus dem TK-Beutel konnte ebenfalls Klebsiella pneumoniae

nachgewiesen werden.

Die Probe für die BacT/ALERT-Testung wurde 20 Stunden nach der

Herstellung, vor der Teilung in 2 Einheiten, gezogen. Aus der Probe

wurde ebenfalls Material für die Testung im PALL eBDS gezogen. In

beiden Testsystemen lautete das Ergebnis negativ. Die

Nachuntersuchung des Spenders, der primär gezogenen

Untersuchungsprobe und der weiteren Materialien ergab keinen Anhalt

für eine Kontaminationsquelle mit K. pneumoniae.

4.3. Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben

Bei sieben der neun bestätigt positiven Pool-TK, bei denen ein

assoziiertes EK ebenfalls mit Propionibakterien kontaminiert war,

wurde ein Vergleich der Keimisolate mittels RAPD-PCR durchgeführt. In

allen Fällen konnte eine klonale Beziehung zwischen den Isolaten aus

den Pool-TK und den EK nachgewiesen werden. Hierdurch konnte als

Quelle für die Kontamination die Vollblutspende in allen Fällen

identifiziert werden. Tabelle 10 gibt einen Überblick über die Herkunft

der untersuchten Proben und die Ergebnisse der RAPD-PCR.

- 75 -

Tabelle 10: RAPD-PCR Ergebnisse: Propionibakterien Isolate aus bestätigt positiven Pool-TK und assoziierter EK ID Nummer

Kulturergebnis der EK Herkunft der Probe Testergebnis: klonale Beziehung

479 3 EK negativ PTKa Sammelbeutel, EK bestätigt

1 EK: Propionibacterium acnes

671 3 EK negativ PTKb Sammelbeutel, PTK, EK bestätigt






5716 3 EK negativ PTKb Sammelbeutel, PTK, EK bestätigt






a PTK transfundiert, keine Transfusionsreaktion

b PTK nicht ausgegebnen

Staphylokokkus-Arten, welche in 2 Apherese-TK und 5 Pool-TK

detektiert wurden, wurden in der Pulsfeld-Gel-Elektrophorese

verglichen. Tabelle 11 zeigt die Herkunft der untersuchten Proben und

die Testergebnisse. In 6 Fällen handelte es sich um identische Isolate, in

einem Fall um verwandte Isolate.

- 76 -

Tabelle 11: Pulsfeld-Gelelektrophorese: Typisierung von Staphylokokken ID Nummer

Art des PC

Spezies Kulturergebnis EK

Herkunft der Probe Testergebnis

656 ATKa Staphylococcus

aureus ATK Sammelbeutel,

zweite Kulturflasche, ATK

Identische Isolate

2576 ATKb Staphylococcus

capitis ATK Sammelbeutel,

erste Kulturflasche, Rest aus ATK nach Transfusion

Identische Isolate

1198 PTKa Staphylococcus 1 EK: S. capitis Erste Kulturflasche,

PTK, EK Identische Isolate capitis 3 EK: negativ

802 PTKa Staphylococcus

epidermidis 4 EK: negativ PTK Sammelbeutel,

PTK Verwandte Isolate


capitis 4 EK: negativ Erste Kulturflasche,

PTK Identische Isolate


epidermidis 4 EK: negativ Erste Kulturflasche,

PTK Sammelbeutel, PTK

Identische Isolate


epidermidis 4 EK: negativ PTK Sammelbeutel,

PTK Identische Isolate

a TK nicht ausgegeben

b TK transfundiert, keine Transfusionsreaktion

4.4. Ergebnisse der Testung mit dem Scansystem und dem PALL

eBDS

Parallel wurden 6307 Plasma-PTK im BacT/ALERT, Scansystem und PALL

eBDS getestet. Von den Apherese-TK wurden 4730 Präparate im

BacT/ALERT und im PALL eBDS untersucht. Alle Proben ohne eine

positive Reaktion in allen drei Testmethoden wurden als negativ

bezeichnet. Proben mit einem positiven Signal in einem der Tests

wurden als initial reaktiv bewertet. Wurde in der Probe, die ein

positives Signal zeigte, ein Bakterienstamm nachgewiesen, so wurde

diese Probe als potentiell positiv bezeichnet. Konnte bei einer potentiell

positiven Probe dasselbe Bakterium in einem zweiten Test aus dem

- 77 -

Satellitenbeutel, dem TK oder im Falle von PTK aus einem zugehörigen

EK nachgewiesen werden, so wurde diese Probe als bestätigt positiv

bewertet.

Wie in Tabelle 12 dargestellt, zeigten 25 PTK im BacT/ALERT ein initial

reaktives Ergebnis. In 13 dieser Proben wurden Bakterien identifiziert.

Nur 1 PTK zeigte ein bestätigt positives Ergebnis mit S. saccharolyticus.

Keine dieser Proben war im Scansystem oder PALL eBDS positiv. Nur 3

PTK waren initial reaktiv im PALL eBDS, die 2. Untersuchung fiel negativ

aus, ebenso die BacT/ALERT-Testung diese Präparate.

Bei den Apherese-TK waren im BacT/ALERT 39 Proben initial reaktiv, in

23 davon waren Bakterien nachweisbar. Bestätigt positiv waren 3 ATK,

die im PALL eBDS negative Ergebnisse zeigten. In einem ATK, das im

PALL eBDS potentiell positiv war, konnten in der Probe S. hominis und S.

epidermidis nachgewiesen werden. Die Wiederholungsuntersuchungen

fielen negativ aus. Wie zuvor unter 4.2 bereits beschrieben fiel die

Testung einer mit K. pneumoniae kontaminierten ATK im BacT/ALERT

und im PALL eBDS negativ aus.

- 78 -

Tabelle 12: Vergleich von BacT/ALERT, Scansystem und PALL eBDS

BacT/ALERT Scansystem PALL eBDS

Initial reaktiv Potentiell positiv

Bestätigt positiv

Initial reaktiv

Potentiell positiv

Bestätigt positiv

Initial reaktiv

Potentiell positiv

Bestätigt positiv

Produkt Gesamt

Aer

ob

e

Flas

che

An

aero

be

Flas

che

Aer

ob

e

Flas

che

An

aero

be

Flas

che

Aer

ob

e

Flas

che

An

aero

be

Flas

che

PTK 6307 7 19 6 8 1a 1a 0 0 0 3 0 0

PTK 6307 Gesamt: 25

Gesamt: 13

Gesamt: 1

ATK 4730 10 29 6 17 0 3

c NT NT NT 1 1

b 0

ATK 4730 Gesamt: 39

Gesamt: 23

Gesamt: 3

Total 11037 64 36 4 0 0 0 4 1 0

Pool-TK (PTK) wurden parallel mit BacT/ALERT, Scansytsem und PALL eBDS getestet. Apherese-TK wurden mit BacT/ALERT und PALL eBDS getestet.

Alle Proben mit einem positiven Signal wurden mikrobiologisch untersucht. Initial reaktive Proben waren nur im Screening positiv. Bakterien wurden bei initial positiven und bestätigt positiven Proben gefunden. Bei bestätigt positiven Proben wurde in der zweiten Probe dasselbe Bakterium nachgewiesen. a Staphylococcus saccharolyticus

b Staphylococcus hominis und Staphylococcus epidermidis

c Propionibacterium acnes

Ein ATK, welches mit Klebsiella pneumoniae kontaminiert war, wurde im BacT/ALERT und PALL eBDS negativ getestet.

NT = nicht getestet

4.4.1. Sensitivität und Spezifität

Die Rate falsch positiver Testergebnisse bei PTK lag für das BacT/ALERT

bei 0,25% (28 von 11037). Für das PALL eBDS lag die Rate mit 0,03% (3

von 11037) deutlich niedriger. Das Scansystem zeigte in 6307 Testen

kein reaktives oder positives Resultat. Damit zeigten das PALL eBDS und

das Scansystem gegenüber BacT/ALERT eine höhere Spezifität.

Da die tatsächliche Anzahl der positiven Proben als unbekannt gelten

musste, wurde die Sensitivität der drei Methoden kalkuliert. Hierzu

wurde die Anzahl der mit dem jeweiligen Verfahren entdeckten

potentiell positiven Proben durch die Anzahl der potentiell positiven

Proben in den drei Messverfahren geteilt.

- 79 -

Bei den PTK wurden mit dem BacT/ALERT 13 potentiell positive Proben

entdeckt (13/13). Die Sensitivität beträgt 100%. Keine dieser Proben

wurde im Scansystem (0/13, Sensitivität 0%) und im PALL eBDS (0/13,

Sensitivität 0%) erkannt.

Bei den ATK wurden mit dem BacT/ALERT 23 potentiell positive Proben

gefunden. Eine Probe wurde nicht als positiv erkannt, die im PALL eBDS

Bakterien nachwies.

Für die Untersuchungen aller Prodkte (PTK und ATK) war die Sensitivität

des BacT/ALERT (36/37 Proben, Sensitivität 93,7%) am höchsten,

gefolgt vom PALL eBDS (1/37 Proben, Sensitivität 2,7%) und dem

Scansystem (0/13 Proben, Sensitivität 0%)

- 80 -

5. Diskussion

5.1. Kontaminationsraten von Thrombozytenkonzentraten

Die Kontaminationsraten von TK, über die in der Literatur berichtet

werden, variieren erheblich. Ursache ist die Heterogenität der Studien.

Eine Reihe von Studien berichtet über BacT/ALERT-Screening.

Methodische Unterschiede liegen vor allem im Zeitpunkt der

Probenziehung aus den TK, dem Inokulumvolumen und der

Kulturmethode (nur aerob oder aerob und anaerob). Das Predonation

Sampling wurde nur teilweise eingesetzt. Die Herstellungsmethoden

der TK variieren von der Gewinnung mittels Apherese über Konzentrate

aus einem Vollblut, Poolherstellung aus 4 bis 6 Einzelkonzentraten im

funktionell geschlossenen System bis hin zu TK aus zuvor gepoolten

Buffy-Coats mit Plasma oder Thrombozytenlagerlösung.

In unserer Studie wurden 52.243 TK aus der Herstellung der neun

teilnehmenden Zentren der DRK-Blutspendedienste an einer

Präparateprobe auf Sterilität getestet. In die Testung wurden drei

verschiedene Produktionslinien einbezogen: 15.198 Apherese-TK mit

insgesamt 27.020 therapeutischen Einheiten, 15.001 Pool-TK mit der

Thrombozytenlagerlösung T-Sol und 22.044 Pool-TK mit Plasma, jeweils

hergestellt aus 4 Buffy coats.

Bei den 52.243 getesteten TK wurden insgesamt 282 (0,54%) positive

Kulturergebnisse in der ersten Kultivierung erzielt. 147 (0,28%) falsch

positive Resultate, ohne Keimnacheis in der ersten und zweiten

Kultivierung, zeigten sich insbesondere in der Anfangsphase der Studie

als technisches Problem mit Fehlfunktionen der BacT/Alert-

- 81 -

Inkubationszellen (GERMS, 2005). Bei 98 (0,19%) der TK konnte die

zweite Kultivierung das positive Ergebnis der ersten nicht bestätigen, sie

wurden als potentiell positiv bewertet. Die Rate der potentiell positiven

Apherese-TK (0,32%) war im Vergleich zu Pool-TK (0,13%) signifikant

höher (p<0,001). Durch einen Bakteriennachweis und die Identifikation

identischer Spezies in der ersten und zweiten Kultivierung konnten 37

(0,07%) der TK als bestätigt positiv bewertet werden. Der Vergleich der

bestätigt positiver Testergebnisse zeigte keinen signifikanten

Unterschied zwischen den Apherese-TK und Pool-TK.

Eine Studie des amerikanischen Roten Kreuzes (ARC) berichtet über die

BacT/ALERT-Testung von 350.658 Apherese-TK (Fang et al., 2005). Mit

einem Probenvolumen von 4 ml, gezogen spätestens 4 Stunden nach

Abschluss der Herstellung, inkubiert in aerober Kultur zeigte die Studie

eine Rate von 0,019% bestätigt positiven Ergebnissen. In unserer Studie

wurde ein Probenvolumen von mindestens je 7,5 ml in aerober und

anaerober Kulturflasche untersucht. Würde man nur die bestätigt

positiven TK aus der aeroben Kultur zum Vergleich heranziehen, läge

die Kontaminationsrate von Pool-TK bei 0,011% (1 auf 9.261) und von

Apherese-TK bei 0,019% (1 auf 5.066) und wäre mit der Rate der Studie

des ARC vergleichbar. Einen Überblick über Methoden und Ergebnisse

von Studien zum BacT/ALERT-Screening von TK zeigt Tabelle 13.

Brecher et al. berichten über eine Kontaminationsrate von 0,29% bei

2.397 Apherese-TK, die aerober und anaerober Kultur nach

Probenziehung an Tag 2 und am Ende der Haltbarkeitsfrist (Tag 5)

untersucht wurden (Brecher et al., 2003).

- 82 -

Tabelle 13: Überblick über Methoden und Ergebnisse von Studien zum BacT/ALERT-Screening von Thrombozytenkonzentraten Referenz/Land Methode Anzahl und Art

der getesteten TK Testergebnisse Klinische

Angaben

Brecher et al., 2003 USA

• 4ml aerob und 4 ml anaerob

• 2.397 Apherese-TK • 7 (0,29%) bestätigt positiv

• 4 TK mit Propionibakterien transfundiert

• Probenziehung an Tag 2 der Haltberkeitsfrist und bei Abgabe bzw. am Verfallsdatum

• 5 Tage Haltbarkeitsfrist

• keine TR

• kein Predonation Sampling

Macauley et al., 2003 Nordirland

• 5-7 ml aerob • 3.285 Pool-TK aus 4 Buffy coats • 1.600 Apherese-TK

• 12 (0,36%) bestätigt positiv • 1 (0,06%) bestätigt positiv

• 1 TK mit Propionibakterien transfundiert

• Probenziehung an Tag 2 der Haltberkeitsfrist



• keine TR

Munksgaard et al., 2004 Dänemark

• 10 ml aerob • 20.761 Pool-TK aus 4 Buffy coats • 1.296 Apherese-TK

• 70 (0,32%) bestätigt positiv • 0 bestätigt positiv

• 26 TK mit Propionibakterien und Corynebakterien transfundiert • keine TR

• Probenziehung 3-30 Stunden nach Venenpunktion



Larsen et al., 2005 Norwegen

• 5-10 ml aerob • 30.993 Pool-TK aus 4 Buffy coats • 5.903 Apherese-TK

• 12 (0,03%) bestätigt positiv • 29 TK (0,08%) mit positiver 1. Kultur nicht nachgetestet

• keine TR

• Probenziehung 24 Stunden nach Entnahme


• 6,5 Tage Haltbarkeitsfrist

Fang et al., 2005 USA

• 4 ml aerob • 350.658 Apherese-TK

• 68 (0,019%) bestätigt positiv

• kein TK mit bestätigt positiver Kultur transfundiert

• Probenziehung bis spätestens 4 Stunden nach Herstellung


• 12 Stunden TK-Quarantäne nach Inkubations-beginn

• 3 septische TR durch negativ getestete TK mit S. lugdunensis, S.epidermidis, koagulase negative Staphylokokken


Te Boekhorst et al., 2005 Niederlande

• 5-10 ml in aerober und anaerober Kultur

• 28.104 Pool-TK aus 5 Vollbluten mit Additivlösung

• 185 (0,65%) Kulturen mit Keimnachweis, keine Untersuchung in 2. Kultur

• 113 TK mit positivem Kulturergebnis transfundiert, ohne TR

• Probenziehung 2 Stunden nach Herstellung


• 2 septische TR durch negativ getestete TK mit Bacillus cereus


- 83 -

Referenz/Land Methode Anzahl und Art der getesteten TK

Testergebnisse Klinische Angaben

Kleinman et al., 2006 USA

• 4 ml in arober Kultur • 122.971 Apherese-TK • 13.579 Pool-TK, Proben aus Vollblut vor Pooling gezogen


• Abgabe von nur 1 TK mit bestätigt positiver Kultur

• Probenziehung 24 Stunden nach Herstellung

• keine TR

• Predonation Sampling bei einer Teilmenge der Apherese



de Korte et al., 2006 Niederlande

• 5-10 ml in aerober und anaerober Kultur

• 113.093 Pool-TK aus 5 Buffy coats • 8000 Apherese-TK


• 40% der TK mit positivem Kultursignal transfundiert • 2 Fälle mit Fieber nach Transfusion • 2 septische TR durch negativ getestete TK mit Bacillus cereus (bereits von Te Boekhorst berichtet)

• Probenziehung 2-12 Stunden nach Herstellung


• bei Teilmenge mit Predonation Sampling 0,32% bestätigt positiv, ohne Predonation Sampling 0,78% bestätigt positiv

• Predonation Sampling bei Teilmenge

Ramirez-Arcos et al., 2007 Kanada

• 3,5-10 ml in aerober Kultur

• 82.004 Apherese-TK

• 6 (0,0073%) bestätigt positiv

• bestätigt positive TK nicht transfundiert

• Probenziehung 14-30 Stunden nach Herstellung


• 2 schwerwiegende septische TR durch negativ getestete TK mit Serratia marcescens/Salmonella sp.


methodische Unterschiede zwischen den Testeinrichtungen

Eder et al., 2007 USA

• 4-5 ml in aerober Kultur

• 1.496.134 Apherese-TK

186 (0,018%) bestätigt positiv

• 1 bestätigt positives TK transfundiert ohne TR • Im Testzeitraum 20 Fälle mit transfusionsassoziierter Sepsis, davon 3 tödliche Verläufe mit negativ getesteten TK durch S.lugdunensis, S.aureus (2) alle an Tag 5 der Haltbarkeitsfrist

• Probenziehung spätestens 24 Stunden nach Herstellung



• Predonation Sampling

TK=Thrombozytenkonzentrat, TR=Transfusionsreaktion

- 84 -

Macauley et al. untersuchten 3.285 Pool-TK mit 5-7 ml Probenvolumen

in aerober und anaerober Kultur und fanden 0,36% bestätigt positiv

(Macauley et al., 2003). Bei 1.600 Apherese-TK fanden sie eine deutlich

niedrigere Rate von 0,06%, die der in unserer Studie festgestellten Rate

entspricht.

Munksgaard et al. fanden eine Rate von 0,32% bestätigt positiver Pool-

TK bei einem Probenvolumen von 10 ml in aerober Kultur (Munksgaard

et al., 2004). Die Blutspenden erfolgten ohne Predonation Sampling.

Dagegen stellten Larsen et al. unter aeroben Kulturbedingungen an

36.896 TK (84% Pool-TK, 16% Apherese-TK) eine Rate von 0,03%

bestätigt positiven TK fest (Larsen et al., 2005). Allerdings wurden in

dieser Studie 0,08% der Präparate mit positiver erster Kultur nicht

nachgetestet.

Aus den Niederlanden berichten te Boekhorst et al. über die Testung

von 28.104 Pool-TK in aerober und anaerober Kultur (Te Boekhorst et

al., 2005). Die Kontaminationsrate von 0,65% umfasst alle Kulturen mit

Keimnachweis, eine Bestätigungsuntersuchung in zweiter Kultur

erfolgte nicht.

Kleinman et al. berichten über die BacT/ALERT-Testung von 122.971

Apherese-TK in aerober Kultur mit einer Kontaminationsrate von

0,017% (Kleinmann et al., 2006).

Ebenfalls aus den Niederlanden stammen die Daten von de Korte et al.

über das Screening von 8.000 Apherese-TK und 113.093 Pool-TK in

aerober und anaerober Kultur. Bei den Pool-TK wurde eine Teilmenge

mit Predonation Sampling gewonnen und zeigte eine

- 85 -

Kontaminationsrate von 0,32% im zu TK ohne PDS mit einer Rate von

0,78% (de Korte et al., 2006).

Eine kanadische Studie von Ramirez-Arcos et al. fand bei Apherese-TK

eine bestätigte Kontaminationsrate von 0,0073%, allerdings nur in

aerober Kultur untersucht (Ramirez-Arcos et al., 2007). Eder et al.

berichten über eine große Anzahl von Apherese-TK, die einem

Bakterien-Screening im BacT/ALERT mit aerober Kultur untersucht

wurden, davon waren 0,018% bestätigt positiv (Eder et al., 2007).

Nicht nur die Kulturverfahren (aerob/anaerob) werden das Ergebnis der

BacT/ALERT-Testung beeinflussen, sondern auch der Zeitpunkt der

Probenziehung aus dem Präparat. Die zuvor zitierten Studien

unterschieden sich darin beträchtlich. So wurden bei den Pool-TK die

Proben zwischen 3 und 30 Stunden nach der Venenpunktion oder 0 bis

24 Stunden nach Abschluss der Präparation gezogen. Aus den

Apherese-TK wurden die Proben zwischen 2 und 24 Stunden nach der

Herstellung gezogen. Ein optimaler Zeitpunkt für die Probenziehung ist

somit nicht definiert und sollte Gegenstand weiterer Studien sein.

Ein weiterer wesentlicher Faktor scheint das Predonation Sampling zu

sein, dessen Wirksamkeit bezüglich der Reduktion des

Bakterieneintrags in das gespendete Blut durch Wagner et al. gezeigt

werden konnte (Wagner et al., 2000). In der Studie wurde an einem in

vitro Modell gezeigt, dass die Entfernung der ersten 21 bis 42 ml einer

Blutspende den Eintrag an Bakterien um eine 10er Potenz reduzieren

kann. In einer Studie an Blutspenden teilten Bruneau et al. das

Blutvolumen des Predonation Samplings in zwei Teile, S1 und S2 mit je

15ml, auf und untersuchten beide Proben im BacT/ALERT-System.

- 86 -

(Bruneau et al., 2001). Von den untersuchten 3385 Spenden waren 76

in S1 und/oder S2 positiv. Um die Effektivität des Predonation

Samplings darzustellen, verglichen sie das Verhältnis von in S2

negativen Proben, welche in S1 positiv waren. Hier konnte gezeigt

werden, dass in 75% der Fälle nur die ersten 15 ml (S1) ein positives

Ergebnis zeigten, während in den zweite 15 ml (S2) kein bakterielles

Wachstum nachgewiesen werden konnte. Die Abtrennung der ersten

30 bis 40 ml Blut bei der Spende wurde in den an dieser Studie

beteiligten Zentren in 2003 eingeführt, sodass die TK hiervon profitieren

konnten.

Im Gegensatz zu anderen Studien konnten wir beim Screening einer

großen Anzahl an Pool-TK und Apherese-TK keinen Unterschied in den

Kontaminationsraten der Präparate feststellen. Ness et al. postulierten,

dass die ausschließliche Transfusion von Einzel-TK aus Apherese das

Risiko der transfusionsassoziierten Sepsis reduziere, da ihre

Kontaminationsrate niedriger sei, als die von Pool-TK (Ness et al., 2001).

Pool- und Apherese-TK sind bei der Anwendung der für Deutschland

festgelegten Standards bei der Herstellung nach unseren Ergebnissen

nicht mit unterschiedlichen Risiken bezüglich der Belastung mit

Bakterien behaftet.

Für den Vergleich der Kontaminationsraten von TK können nur

Testresultate herangezogen werden, die mit denselben Methoden

geprüft und zuvor unter vergleichbaren Bedingungen hergestellt

wurden.

- 87 -

Insgesamt erwies sich die zeitnah zur Herstellung begonnene Testung

von Proben aus TK mit BacT/ALERT als durchführbar in der

Blutbankroutine.

5.2. Bakterienspezies und ihre klinische Bedeutung

Das Spektrum der detektierten Bakterien stammt überwiegend aus der

transienten und residenten Hautflora und zeigt die Grenzen der

Hautdesinfektion auf (de Korte et al., 2006). Das mikrobielle Spektrum

ist vergleichbar mit anderen Studien, die ebenfalls mit aeroben und

anaeroben Kulturen durchgeführt wurden. (Te Boekhorst et al., 2005;

Brecher et al., 2003; Macauley et al., 2003; de Korte et al., 2006).

Auffällig ist der hohe Anteil an TK, die mit Propionibakterien belastet

sind. Propionibakterien residieren in Haarfollikeln und Schweißdrüsen-

ausführungsgängen und können sich somit der Hautdesinfektion an der

Oberfläche entziehen. Propionibakterien gelten als geringgradig

pathogen. Störmer et al. berichten über 6 Fälle von Transfusionen mit

TK, die mit Propionibakterien kontaminiert waren (Störmer et al., 2008).

Sie stellten keine Transfusionsreaktion fest. Die Autoren untersuchten

das Wachstumsverhalten von Propionibakterien in TK und folgerten,

dass aufgrund der langsamen Vermehrung relevante Bakterienzahlen

nicht erreicht werden. Andererseits sind Berichte über febrile Episoden

bei immunsupprimierten Patienten publiziert, die TK erhielten, die mit

Propionibakterien kontaminiert waren (Schneider et al., 2000).

Kunishima et al. berichten über transiente febrile Episoden auch bei

immunkompetenten Transfusionsempfängern (Kunishima et al., 2001).

Koopman et al. untersuchten retrospektiv 158 Patienten, die TK

transfundiert bekamen, welche nachträglich im bakteriellen Monitoring

- 88 -

ein positives Signal zeigten (Koopman et al., 2009). Zwei dieser

Patienten entwickelten Reaktionen im Zusammenhang mit der

Transfusion. In beiden transfundierten TK konnten Propionibakterien

nachgewiesen werden. Eine der Reaktionen mit Entwicklung einer

Urtikaria wurde als allergische Reaktion gewertet. Der andere Patient

wurde mit einer septischen Reaktion und auf die Intensivstation verlegt.

Die anderen 156 Patienten zeigten im Zusammenhang mit der

Transfusion keine Auffälligkeiten.

Propionibakterien sind als Verursacher von Endokarditis, Arthritis,

Lungeninfektionen und Abszessen in der Milz und im Gehirn

beschrieben (Clayton et al., 2006; Perry und Lambert, 2006). Darüber

hinaus können sie klinisch stumme Infektionen von Endoprothesen

verursachen (Zeller et al, 2007). Daher sind Propionibakterien

keineswegs als klinisch unbedeutend einzuordnen. Ob zwischen den

febrilen Reaktionen von 5 Patienten in unserer Studie, die potentiell

oder bestätigt mit Propionibakterien kontaminierte TK erhielten, ein

kausaler Zusammenhang mit der Transfusion besteht, muss offen

bleiben.

Staphylokokken repräsentieren eine weitere wichtige Gruppe von

Keimen, die als Kontaminanten von Blutkomponenten und als

Verursacher von TR bekannt sind (Hillyer et al., 2003). Insbesondere bei

hämato-onkologischen Patienten spielen Staphylokokken eine wichtige

Rolle als Auslöser von Katheterinfektionen und nachfolgenden

septischen Komplikationen (Wolff et al., 2008). Gerade diese

Patientengruppe benötigt im Rahmen von Chemotherapie

Thrombozytentransfusionen. Eine Reihe von potentiell und bestätigt

- 89 -

mit Staphylokokken kontaminierten TK in unserer Studie wurden nach

Angaben der zuständigen Kliniker von den Patienten reaktionslos

vertragen. Die Mehrheit der S. epidermidis, S. capitis und S.

saccharolyticus kontaminierten TK wurden nicht transfundiert. Auch 2

bestätigte Kontaminationen mit S. aureus und Serratia marcescens

fielen frühzeitig auf, sodass eine Transfusion dieser mit hochgradig

pathogenen Keimen kontaminierten TK nicht erfolgte.

Ob neben dem Eintrag von Bakterien von der Spenderhaut passagere

Bakteriämien bei ansonsten gesunden Spendern als

Kontaminationsquelle infrage kommt, kann werder bestätigt noch

ausgeschlossen werden.

5.3. Wirksamkeit des Bakterienscreenings zur Vermeidung der

Transfusion kontaminierter Thrombozytenkonzentrate

Mit der Überprüfung des Kulturstatus zum Zeitpunkt der Abgabe der TK

sollte möglichst die Transfusion bakteriell kontaminierter TK verhindert

werden. Dieses als negative to date-Konzept bezeichnete Vorgehen

erwies sich nur sehr beschränkt als geeignet, da 67% der potentiell oder

bestätigt positiven TK ausgeliefert und transfundiert waren, als das

positive Kultursignal auftrat. Eine Ursache ist die frühzeitige

Auslieferung an den Tagen 2 und 3 der Haltbarkeitsfrist und die dazu

zeitnahe Transfusion. Rückrufe waren nur bei 2 TK erfolgreich.

Hauptursache jedoch ist ein zu spätes positives Kultursignal, das im

Mittel nach 3,7 Tagen auftrat. Propionibakterien in anaeroben Kulturen

mit einem positiven Kultursignal nach mehr als 4 Tagen Inkubation

machen den größten Anteil aus. Es gab aber auch mit Staphylokokken

- 90 -

kontaminierte TK, die bereits nach 15 Stunden Inkubationsfrist

transfundiert waren.

In den zuvor bereits zitierten Studien zeigten sich dieselben

Einschränkungen des negative to date-Konzeptes. Te Boekhorst et al.

berichten, dass 68% der positiven Kulturen der Pool-TK erst nach 48

Stunden ein positives Signal zeigten und dass 56% der positiven TK ohne

Reaktion transfundiert wurden (Te Boekhorst et al., 2005). De Korte et

al. berichten, dass 40% der TK mit positivem Kultursignal bereits

transfundiert waren, als das Signal auftrat (de Korte et al., 2006).

Einige Untersucher legten eine 12 bis 24 Stunden dauernde

Quarantänefrist zwischen den Inkubationsstart und die Auslieferung der

TK (Fang et al., 2005; Kleinmann et al., 2006; Eder et al., 2007). Diese

Vorgehensweise reduzierte den Anteil bereits transfundierter TK. Folge

ist allerdings ein höheres Alter der TK bei Anwendung und eine kürzere

Zeit für die Präparatelogistik. Auch wurden in den genannten Studien

nur aerobe Kulturen verwendet, die Propionibakterien in der Regel

nicht erfassen.

Fuller et al. verglichen retrospektiv die Anzahl der septischen

Transfusionreaktionen vor und nach der Einführung eines bakteriellen

Screenings der produzierten TK in ihrem Krankenhaus (Fuller et al.,

2009). Sie konnten zeigen, dass die Rate an septischen

Transfusionsreaktionen nach Einführung des Screenings um 69,7%

abnahm (p=0,41). Obwohl die Raten sich nicht signifikant

unterschieden, deuten sie doch an, dass eine Reduktion der septischen

Transfusionsreaktion mittels des Screenings möglich ist.

- 91 -

Zwischen 2003 und 2010 untersuchten Pearce el al. 54828 TK mittels

aerober und anaerober Kultur im BacT/ALERT-System. Hier wurden 35

(0,06%) als bestätigt positive gewertet (Pearce et al., 2010). 6438 nicht

transfundierte TK wurden nach Ablauf der Haltbarkeitsfrist erneut auf

bakterielle Kontamination untersucht. Dabei fanden sich 6 (0,09%)

bestätigt positive Kontaminationen, welche im ersten Screening nicht

gefunden wurden. Aus der Analyse der Daten schätzten sie die

Sensitivität auf 40%.

Sowohl Fuller als auch Pearce zeigten in ihren Studien, dass eine

Erhöhung des Probenvolumen von 4ml auf 8ml, bzw. von 8ml auf 10ml

pro Kulturflasche Raten der bestätigt positiven Proben erhöht (Fuller et

al., 2009; Pearce et al., 2010). Die führen beide auf die kleine Anzahl

Bakterien zum Zeitpunkt der Probenziehung am Beginn der

Haltbarkeitsfrist zurück.

Zweifelsfrei konnten während unserer Studie mit der rechtzeitigen

Sperrung von 2 TK mit bestätigt positivem Ergebnis potentiell

schwerwiegende Transfusionsreaktionen verhindert werden. In einem

Fall fiel die Kultur nach 9,1 Stunden positiv aus (S. aureus), im anderen

Fall nach 12,8 Stunden (Serratia marcescens).

5.4. Klinischer Follow up kontaminierter Thrombozytenkonzentrate

Die Nachforschung zur Verträglichkeit der potentiell und bestätigt

positiven TK und der mit Pool-TK verbundenen EK deckte insgesamt 6

Fälle auf, bei denen Patienten febrile Reaktionen zeigten. Zu keinem

dieser Fälle wurde von den behandelnden Ärzten spontan Bericht

erstattet. 80 Patienten erhielten potentiell positive TK transfundiert und

- 92 -

26 Patienten erhielten bestätigt positive TK. In keinem dieser Fälle

wurden Transfusionsreaktionen registriert. In der Mehrzahl der

Screening-Studien wurde bei Patienten, die TK mit positiven Kulturen

erhielten, keine Transfusionsreaktion beobachtet (Brecher et al., 2003;

Macauley et al., 2003; Munksgaard et al., 2004; Kleinmann et al., 2006;

Ramirez-Arcos et al., 2007; Eder et al., 2007). Lediglich deKorte

berichtet 2 Fälle mit Fieber nach der Transfusion (de Korte et al., 2006).

Bemerkenswert ist, dass die zuvor genannten 6 Fälle mit

Transfusionsreaktionen nicht aktiv gemeldet wurden, sondern erst auf

gezielte Nachfrage von den behandelnden Ärzten angegeben wurden.

Dies deutet darauf, dass die Meldeverpflichtung von transfundierenden

Ärzten nicht im gewünschten Maße wahrgenommen wurde. Daher

erscheint es wichtig, transfundierende Ärzte auf ihre Verantwortung bei

der Beobachtung und Meldung von Transfusionsreaktionen

hinzuweisen. Thrombozytopenische Patienten, insbesondere solche mit

begleitender Neutropenie, haben häufiger febrile Episoden.

Die Transfusion verkeimter TK kann als mögliche Ursache in Betracht

gezogen werden und bedarf der Aufklärung über entsprechende

Untersuchungen der Restpräparate und der Patienten. Auch können

weitere Blutkomponenten wie z.B. verbundene EK oder ein zweites

Apherese-TK mit betroffen sein. Bei einem Verdachtsfall mit Meldung

an die Blutbank können entsprechende Komponenten gesperrt werden,

um weiteren Schaden an anderen Patienten zu vermeiden.

- 93 -

5.5. Zum Risiko septischer Transfusionsreaktionen bei falsch

negativen Testergebnissen

Im Studienzeitraum ereigneten sich 2 schwerwiegende septische

Transfusionsreaktionen mit einem in 2 Einheiten geteilten Apherese-TK.

Diese war im BacT/ALERT und PALL eBDS negativ getestet worden,

erwies sich aber in der Nachuntersuchung als mit Klebsiella pneumoniae

kontaminiert.

In einem Fall war eine Patientin nach myeloablativer

Radiochemotherapie zu Verbereitung auf eine

Knochenmarktransplantation bei Non-Hodgkin-Lymphom betroffen.

Nach Transfusion eines 4,1 Tage alten ATK entwickelte die Patientin

eine septische Transfusionsreaktion mit respiratorischer Insuffizienz

und Kreislaufinstabilität. Trotz sofortiger antibiotischer Therapie und

intensivmedizinischer Versorgung verstarb die Patientin 10 Tage später

im Multiorganversagen. In der angelegten Blutkultur der Patientin

konnte ebenso wie im Restmaterial aus dem TK-Beutel Klebsiella

pneumoniae nachgewiesen werden.

Im zweiten Fall wurde einer Patientin mit akuter myeloischer Leukamie

ein TK aus derselben Apherese 4,2 Tage nach Herstellung transfundiert.

Sie reagierte mit Fieber und Kreislaufinstabilität. Nach notwendiger

Katecholamingabe und einer Antibiotikatherapie stabilisierte sich ihr

Zustand. In der Blutkultur der Patientin und dem Restmaterial aus dem

TK-Beutel konnte ebenfalls Klebsiella pneumoniae nachgewiesen

werden.

Septische Transfusionsreaktionen mit falsch-negativ getesteten TK

wurden in einer Reihe von Studien beobachtet, die sich mit dem

- 94 -

BacT/ALERT-Screening von TK befassten. Fang et al. berichten über 3

Fälle mit negativ getesteten TK, die sich im Nachhinein als mit S.

lugdunensis, S. epidermidis und koagulase-negativen Staphylokokken

kontaminiert erwiesen (Fang et al., 2005). Te Boekhorst et al. sahen 2

septische Ereignisse mit Bacillus cereus (Te Boekhorst et al., 2005).

Ramirez-Arcos et al. beschrieben 2 schwerwiegende

Transfusionsreaktionen durch TK mit Serratia marcescens und

Salmonella Spezies (Ramirez-Arcos et al., 2007). In der mit 1 Millionen

getesteten TK sehr umfangreichen Studie von Eder et al. wurden im

Testzeitraum 20 Fälle mit transfusionsassoziierten Septitiden

beobachtet, 3 dieser Patienten verstarben (Eder et al., 2007). In einem

Fall war die Kontaminante S. lugdunensis, in 2 Fällen S. aureus.

Somit liegt eine wesentliche Beschränkung des BacT/ALERT-Screenings

zeitnah zur Präparateherstellung darin, dass bei der Probenziehung aus

dem Präparat kontaminierende Bakterien verpasst werden, mit dem

Ergebnis eines falsch-negativen Testresultats. Eine frühe Probenziehung

und ein relativ kleines Probenvolumen erhöhen dieses Risiko. Benjamin

kalkulierte das Risiko der septischen Transfusionsreaktion aufgrund

falsch-negativer Testresultate im BacT/ALERT-Screening auf 1 zu 45.000

Thrombozytentransfusionen (Benjamin, 2008).

5.6. Zum Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben

Der Vergleich von Keimisolaten aus verschiedenen Proben der gleichen

Spende mittels RAPD-PCR zeigte die klonale Verwandtschaft der Keime.

Da bei der Gewinnung und Verimpfung von Untersuchungsproben eine

akzidentelle Kontamination durch die Untersucher nicht auszuschließen

ist und da für kontaminierte Pool-TK die Ausgangsvollblutspende

- 95 -

eindeutig identifiziert werden sollte, untersuchten wir

Propionibakterien Isolate aus 9 TK, Probenbeuteln und verbundenen

EK. In allen Fällen wurde die klonale Verwandtschaft bestätigt. Damit

konnten die Ausgangsvollblutspenden eindeutig als

Kontaminationsquelle identifiziert werden.

Auch mit der Untersuchung von Staphylokokken-Isolaten aus 2

Apherese-TK und 5 Pool-TK sowie Kulturflaschen und Probenbeuteln

konnte mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese die Übereinstimmung der

Isolate belegt werden. Es gab keinen Anhalt für

Sekundärkontaminationen.

5.7. Bewertung des Vergleiches von BacT/ALERT, Scansystem und

PALL eBDS

Die verglichene Methoden beruhen auf der Kultivierung von Bakterien

(BacT/ALERT und PALL eBDS) und auf den schnellen Direktnachweis von

Bakterien (Scansystem). In Studien mit der artifiziellen Kontamination

von TK ist die Eignung der Methoden beschrieben (Jakobs et la., 2005;

Schmidt et al., 2005; Ortolano GA et al., 2003; McDonald und Pearce et

al., 2005; Brecher et al., 2002).

Die Sensitivität war für das BacT/ALERT am höchsten. Das PALL eBDS

verpasste 4 von 4 im BacT/ALERT positive Proben, wobei zumindest

teilweise die Ursache darin lag, dass es sich um anaerobe Bakterien

handelte. Das PALL eBDS fokussiert auf aerobe Keime. Im Scansystem

wurde eine im BacT/ALERT positive Probe verpasst. Ursache kann die

vom Hersteller mit 1000 CFU/ml angegebene Sensitivität sein.

Verglichen damit liegt diese für das BacT/ALERT bei 1 CFU/ml. Bei

- 96 -

langsamer Keimvermehrung und geringem initialem Keimeintrag kann

das Detektionslimit des Scansystems unterschritten werden. Eine

möglichst späte Probenziehung erlaubt die Vermehrung von Bakterien

in kontaminierten Präparaten, erhöht die Chance bei der

Probenziehung Bakterien mitzunehmen und reduziert das Risiko des

falsch-negativen Testergebnisses. Somit würden alle eingesetzten

Testmethoden von der späten Probenziehung mit einer erhöhten

Sensitivität profitieren. Allerdings kollidiert diese Überlegung mit der

Notwendigkeit der möglichst frühen Abgabe von TK zur Transfusion.

Bei ansonsten gleichen Testbedingungen variierten Eder et al. nur das

das zur Verimpfung in BacT/Alert-Flaschen vorgesehene

Probenvolumen (Eder et al., 2009). Ein Vergleich der

Kontaminationsraten zeigte, dass ein größeres Probenvolumen mit

einer höheren Kontaminationsrate einhergeht. Hier wird postuliert,

dass bei einer niedrigen bakteriellen Kontamination die

Wahrscheinlichkeit, Bakterien in einer Probe nachzuweisen, mit dem

Volumen der gezogenen Probe steigt. Ähnliche Ergebnisse zeigen auch

die Studien von Fuller und Pearce, die bei einer Vergrößerung des

gezogenen Probenvolumen höhere Raten an positiven

Kulturergebnissen fanden (Fuller et al., 2009; Pearce et al., 2010).

Beim Vergleich der Testergebnisse unter Beachtung des

Untersuchungsziels erscheint die höhere Sensitivität des BacT/ALERT-

Systems als wichtiger Vorteil, wenn auch damit das Risiko der falsch-

positiven Resultate einhergeht. Eine geringere Spezifität des

BacT/ALERT gegenüber den anderen beiden Testmethoden löst in der

Folge mehr Fehlalarme aus, die zur Sperrung oder zum Rückruf von

- 97 -

Präparaten führen. Dieser Nachteil gefährdet allerdings keine Patienten,

wie dies falsch-negative Testresultate einer zwar spezifischeren, aber

weniger sensitiven Methode würden.

Insgesamt ist keines der verglichenen Testsysteme zufriedenstellend.

Das BacT/ALERT ist ein sensitiver Screeningtest, benötigt aber 7 Tage bis

zum Testende bei einer Haltbarkeitsfrist von 5 Tagen bei TK. PALL eBDS

detektiert nur aerobe Bakterien, während der größte Teil der in TK

nachgewiesenen Keime anaerob ist. Das Scansystem hat eine geringere

Sensitivität als die Kultivierungsmethoden.

5.8. Aussichten und Empfehlungen

Insgesamt kann das Screening der produzierten TK, mit den zurzeit zu

Verfügung stehenden Methoden, das Risiko der transfusions-

assoziierten Sepsis zwar reduzieren, die Sterilität der zur Transfusion

abgegebenen TK jedoch nicht garantieren. Dies zeigte sich in dieser

Studie auch im Fall einer mit Klebsiella pneumoniae kontaminierten

Apherese, aus welcher zwei ATK hergestellt wurden. Beide wurden

negativ getestet, führten jedoch retrospektiv betrachtet zu septischen

Transfusionsreaktionen, von welchen eine tödlich verlief. Zu

vergleichbaren Ergebnissen kommt auch ein Bericht von Wood über das

Screening von Blutprodukten des Australian Red Cross Blood Service

(Wood, 2010). In Australien werden seit April 2008 alle TK einem

Routinescreening auf bakterielle Kontamination unterzogen, wobei

aerobe und anaerobe Kulturen im BacT/ALERT-System angelegt

werden. Die TK werden nach dem negative-to-date Prinzip abgegeben,

im Falle eines späteren positiven Signals, wurden die

Transfusionsverläufe nachträglich auf eine mögliche

- 98 -

Transfusionsreaktion hin untersucht. Auch wenn in Australien bei den

bestätigt positiven, transfundierten TK kein septischer Verlauf

beobachtet werden konnte, warnte auch Wood, dass das Risiko der

transfusionsassoziierten Sepsis zwar reduziert, aber nicht gänzlich

ausgeschlossen werden kann.

Für die Zukunft ist eine Weiterentwicklung der Screening-Methoden zur

Kontaminationstestung zu erwarten, um dem Risiko der bakteriellen

Transfusionsreaktion im Sinne des Vorsorgeprinzips zu begegnen. Es

konnte gezeigt werden, dass Methoden die eine Kultivierung der

Proben verlangen, die höchste Sensitivität für bakterielle Kontamination

aufweisen und TK, die mit schnell wachsenden Keimspezies

kontaminiert waren, von der Transfusion ausschließen konnten.

Langsame Vermehrung der kontaminierenden Bakterien führten jedoch

zu einem späten Signal in den Nachweismethoden, so dass ein Teil der

TK zu diesem Zeitpunkt nach dem negative-to-date Prinzip schon

abgegeben und transfundiert waren. Optimal wären Schnellmethoden

zur Bakteriendetektion, die zeitnah zur Transfusion einsetzbar sind. Bis

zu deren Verfügbarkeit muss über eine Verkürzung der Haltbarkeitsfrist

von TK nachgedacht werden, die die berichteten Sepsisfälle zumindest

teilweise verhindert hätte. Allerdings sind mit einer kürzeren

Haltbarkeitsfrist erhebliche logostische Anstrengungen verbunden, um

die Patientenversorgung nicht zu gefährden. Eine diskutierte

Verlängerung der Haltbarkeitsfrist von TK über die 5 Tage hinaus ist

unter den genannten Testbedingungen nicht vertretbar. Dies wird auch

durch eine Studie von Dumont et al. gestützt, bei der

nichttransfundierte ATK am Ende der Haltbarkeit von 7 Tagen erneut

hinsichtlich der bakteriellen Kontamination untersucht wurden

- 99 -

(Dumont et al., 2010). Bei den an Tag eins gezogenen Proben fanden 76

von 388.903 (195/106) Proben bestätigt positiv, bei den achten Tag von

4 von 6039 (662/106) bestätigt positiven Proben. Aufgrund der hohen

Rate an positiven Proben am Ende der Haltbarkeit wurde die Studie

abgebrochen, und eine Beschränkung der Haltbarkeitsfrist auf wieder 5

Tage empfohlen.

Auch bei der Transfusionsvorbereitung, Durchführung sowie der

Registrierung und Aufklärung von Transfusionsreaktionen ist eine Reihe

von qualitätssichernden Maßnahmen zu beachten, die das Risiko der

bakteriell bedingten Transfusionsreaktion reduzieren können. Hier kann

einer besseren Koordination von Beschaffung und Bedarf an TK, mit

dem Ziel der Begrenzung der Lagerungsdauer bis zur Anwendung, eine

hohe Bedeutung zukommen. Maßnahmen, die das Ziel haben TK,

welche möglicherweise kontaminiert sind, von der Transfusion

auszuschließen, sollten an den Anwender weitergegeben bzw. stärker

zu Bewusstsein geführt werden. Hier gilt eine visuelle Kontrolle direkt

vor der Transfusion durch den Anwender auf Leckage, Verfärbung,

Gerinnsel oder Trübung. Diese sollte den Anwender von der Transfusion

eines TK abhalten. Cawley et al. berichten über eine Fall mit Bakterien

kontaminierter ATK, welche bei der visuellen Kontrolle durch

Verfärbung einer Einheit auffielen (Cawley et al., 2010). Die Apherese

wurde in eine Einheit für Erwachsene und vier pädiatrische Einheiten

aufgeteilt. Die Einheit für Erwachsene und drei der pädiatrischen

Einheiten wurden transfundiert, bevor die Verfärbung der vierten

pädiatrischen Einheit auffiel. In dieser konnte eine massive

Kontamination mit S. pneumoniae nachgewiesen werden. Bei dem

erwachsenen Patienten und dem Kind, welches die drei pädiatrischen

- 100 -

Einheiten erhielt, konnten in einer Nachuntersuchung febrile

Reaktionen um die Transfusion registriert werden. Nur in der Blutkultur

des erwachsenen Patienten konnte S. pneumoniae nachgewiesen

werden. Durch molekulare Analyse der beiden gefunden Streptokokken

konnten diese als identisch identifiiert werden. Hier zeigt sich, dass

neben neuerer Screeningmethoden auch länger bestehende

Kontrollmechanismen, wie die visuelle Kontrolle der TK vor Ausgabe

und direkt vor der Transfusion Hinweise auf bakterielle Kontamination

liefern können, auch wenn in diesem Fall eine Transfusion der

assoziierten Einheiten nicht verhindert werden konnte.

Aber auch das aseptische Arbeiten, das Einführen des

Transfusionsbesteckes erst kurz vor der Transfusion und die

Beschränkung des Gebrauchs von Transfusionsbestecken auf maximal 6

Stunden, sollten beachtet werde.

Leitlinien zur Erkennung, Untersuchung und Kausalitätsbewältigung

bakteriell bedingter Transfusionsreaktion sollten weiterentwickelt

werden und konsequent zu Anwendung kommen. U.a. gilt es, den

Patienten engmaschig zu überwachen, die Transfusion frühzeitig bei

Zeichen der Unverträglichkeit abzubrechen und eine aufklärende

Diagnostik einzuleiten. Bei Verdacht auf eine bakteriell bedingte

Transfusionsreaktion sollten Blutkulturen des Patienten und Proben aus

den beteiligten Blutbeuteln angelegt und untersucht werden.

Verdachtsfälle sollten umgehend gemäß den einschlägigen Vorgaben

gemeldet werden, da insbesondere die umfassende Analyse von

septischen Transfusionsreaktionen dazu beitragen kann, präventive

Strategien weiterzuentwickeln und deren Wirksamkeit einzuschätzen.

- 101 -

6. Zusammenfassung

Das Screening von Thrombozytenkonzentraten (TK) auf bakterielle

Kontamination an einer zeitnah zur Präparateherstellung gezogenen

Probe mit der BacT/ALERT-Methode zeigte, dass Apherese-TK und Pool-

TK mit Plasma oder Lagerlösung keine Unterschiede der

Kontaminationsrate aufweisen. Bei einem frühen positiven Kultursignal

mit einer Kultivierungszeit < 24 Stunden gelang der Ausschluss von

kontaminierten TK zumindest teilweise. Aufgrund eines späten

positiven Kultursignals kombiniert mit im Regelfall früher Abgabe der TK

zur Transfusion an Tag 2 oder 3 der Haltbarkeitsfrist konnten 67% der

Präparate mit potentiell oder bestätigt positivem Testergebnis nicht von

der Anwendung ausgeschlossen werden.

Die detektierten Keime entstammen überwiegend der Hautflora, die

häufigsten waren Propionibakterien. Zu den transfundierten TK, die

potentiell oder bestätigt positiv waren, erfolgte keine Spontanmeldung

von bakteriell bedingten Transfusionsreaktionen. Die klinische

Nachverfolgung der TK deckte 6 Fälle mit febrilen

Transfusionsreaktionen auf, die weder gemeldet noch nachuntersucht

wurden. Ob ein Kausalzusammenhang mit der bakteriellen

Kontamination bestand, muss offen bleiben.

Die Wirksamkeit des Bakterienscreenings wird erheblich dadurch

beeinträchtigt, dass falsch-negativ getestete TK zu schwerwiegenden

und tödlichen Transfusionsreaktionen führen können. Die frühe

Probenziehung aus dem Präparat bei niedriger Keimzahl zu diesem

Zeitpunkt ist hierfür die Ursache.

- 102 -

Der Vergleich der eingesetzten Screeningverfahren an einer Teilmenge

der Präparate belegt die hohe Sensitivität der BacT/ALERT-Methode.

Insgesamt erweist sich das Screening von TK auf Bakterien als

durchführbar. Allerdings wird damit das Problem der

transfusionsassoziierten Sepsis zwar reduziert, die Sterilität der zur

Transfusion bereitgestellten TK kann aber nicht garantiert werden.

- 103 -

7. Literaturverzeichnis

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Danksagung

An die Studiengruppe, auch für die Überlassung der Daten aus den acht

anderen Zentren.

An Fr. Dr. Walther-Wenke, die mich in all den Jahren nicht vergessen

hat.

An die Mitarbeiter im ZTM Münster.

An Fr. Dr. Geis.

An meine Frau, für all Ihre Geduld.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Geburtsdatum 01.11.1976

Geburtsort Bochum

Familienstand Verheiratet

Staatangehörigkeit deutsch

Religion evangelisch

Ausbildung

1983-1987 Hüllberg-Grundschule, Witten

1987-1996 Albert-Martmöller-Gymnasium, Witten

1997-1998 Zivildienst im EVK-Witten

1998-2006 Studium der Humanmedizin an der

Ruhruniversität Bochum

Praktisches Jahr

Augusta-Kranken-Anstalt Bochum Mitte (Chirurgie, Innere Medizin, Anästhesie)

Mai 2006 3.Staatsexamen

Seit 2006 Assistenzarzt Augusta-Kranken-Anstalt Bochum

Abteilung für Anästhesie und Intensivmedizin

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