Date post: | 10-Oct-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | dantegomez |
View: | 12 times |
Download: | 0 times |
5/20/2018 bioenologia bacteriana
1/127
1
Biotecnologa microbiana
Es la disciplina que utiliza los microorganismos vivos o susproductos en procesos industriales.
La biotecnologa microbiana se puede dividir en dos fases distintas:
1. Tecnologa microbiana tradicional, que se refiere a la fabricacina gran escala de productos que los microorganismos son capaces
de fabricar.2. Tecnologa microbiana con organismos alterados genticamente
mediante procesos de ingeniera gentica.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
2/127
2
Microorganismos Industriales y Productos Industriales
Su fuente es la naturaleza
No todos los microorganismos (MOs) tienen uso industrial
Los hongos (levaduras y mohos) y algunos procariotas (Streptomyces) son los mas
usados.
Se seleccionan los que producen uno o mas productos de inters
Se modifican gneticamente por mutacin o recombinacin para aumentar el o los
metabolitos de inters.
Las vas metablicas menores se reprimen o eliminan.
Pueden presentar propiedades de desarrollo pobres, prdida en la capacidad de
esporulacin, propiedades bioqumicas y celulares alteradas.
Las cepas modificadas son conservadas en los laboratorios de microbiologa de lasindustrias y en distintas colecciones nacionales de microorganismos tipo.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
3/127
3
Colecciones Nacionales de microorganismos tipo
Estn disponibles para fines docentes, de investigacin o industriales.
Las cepas que producen los mejores rendimientos (con derechos de propiedad opatentadas) no estn en estas colecciones.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
4/127
4
Mejoramiento de la cepa de Penicillum chrysogenum,productora de la penicilina.
A travs de los aos y de numerosos procesos laproduccin de penicilina por el hongo Penicillumchrysogenum pas de 1-10 ug/ml a 50.000 ug/ml.
Este incremento de 50.000 veces se obtuvo por elmejoramiento de la cepa a travs de mutacin yseleccin sin incluir manipulacin gentica y porcambios en el medio y en las condiciones decrecimiento. La introduccin de nuevas tcnicasgenticas condujo posteriormente a incrementos
mucho mas modestos en el rendimiento.
Conjunto de mutaciones realizadas por cuatro grupos deinvestigadores para obtener una cepa de Penicillumchrysogenum capaz de sintetizar penicilina para unaexportacin comercial. S, mutacin espontnea; X, rayos
X; UV, radiacin ultra violeta; NM, gas mostaza.Los mtodos fermentativos habituales rinden ms de 20 g/litr
5/20/2018 bioenologia bacteriana
5/127
5
Requisitos de un microorganismo industrial
El microorganismo debe:
1- Producir la sustancia de inters
2- Obtenerse en cultivo puro
3- Ser genticamente estable.
4- Poder desarrollarse en cultivos a gran escala.
5- Poder mantener el cultivo del MO durante perodos largos en ellaboratorio y en la planta industrial.
6- Tener un tiempo de duplicacin bajo y fabricar el producto deseadoen un perodo corto.
Crecimiento rpido ocupar menos tiempo los equipos industriales
disminuir los riesgos de contaminacin.
mejor control de los factores ambientales
7- Ser susceptible de manipulacin gentica.
8-Crecer en medio de cultivo lquido relativamente barato y que seobtenga en grandes cantidades.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
6/127
6
Medios de cultivo industriales
Se usan muchas veces como medios de cultivo a gran escaladesechos carbonados provenientes de otras industrias.
-licor de maceracin del maz (rico en nitrgeno y factores decrecimiento).
- suero de leche (contiene lactosa y minerales)
-otros materiales residuales de la industria con elevado contenidoen carbono orgnico.
9- En la industria se prefieren los MOs grandes como los hongos,levaduras y bacterias filamentosas para poder separar las clulasmicrobianas del medio de cultivo con facilidad ya que este proceso esmuy costoso a gran escala. Es mas econmico efectuar la separacinpor filtracin que por centrifugacin.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
7/127
7
Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial
Los microorganismos industriales no deben:
1- ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de interseconmico.
2- liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas
fcilmente.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
8/127
8
Los productos industriales de inters pueden ser de varios tipos:
1- Las clulas propiamente dichas, por ej. las levaduras cultivadaspara alimentos, panadera o cerveza.
2- Las sustancias producidas por las clulas. Ejemplos de estasltimas son:
- las enzimas como la glucosa isomerasa
- agentes farmacolgicos activos como los antibiticos,esteroides y alcaloides
- productos qumicos y aditivos alimentarios como el aspartame,edulcorante de alimentos y bebidas de bajas caloras (fabricadoa partir de L-fenilalanina mas L-cido asprtico); el L-glutamato,utilizado para reforzar el sabor y para ablandar las carnes; el L-aspartato y alanina para enriquecer el sabor de jugos de fruta;la glicina para mejorar el sabor de alimentos edulcorados; la L-
lisina y la DL-metionina como aditivos nutritivos en alimentospara animales.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
9/127
9
Productos Industriales
Varias enzimas importantes de uso comercial son producidas por MOs, incluyendo enzimas quedigieren el almidn (amilasas), protenas (proteasas, renina) y las grasas (lipasas). Penicilina
acilasa es usada para producir penicilinas sintticas. Los metabolitos microbianos son otro grupoimportante de productos industriales. Estos metabolitos pueden ser productos de la fermentacincomo el etanol, ac. actico o ac. lctico; factores de crecimiento claves como los aminocidos, lasvitaminas, antibiticos, esteroides, alcaloides, etc.
Los agentes farmacolgicamente activos estn por lo general en la categora demetabolitos secundarios.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
10/127
10
Crecimiento y formacin de productos en procesos industriales
El crecimiento microbiano comprende distintas etapas: fase delatencia, fase exponencial y fase estacionaria.
Procesos donde lo que interesa es el metabolito microbiano.
Hay dos tipos bsicos de metabolito microbiano:
1- metabolito primario es el que se fabrica durante la faseexponencial del crecimiento del microorganismo.
2- metabolito secundario es el que se fabrica cerca del final de lafase logartmica de crecimiento, con frecuencia , cerca de la faseestacionaria de crecimiento.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
11/127
11
Comparacin entre metabolitos primarios y secundarios
Metabolitos microbianos primarios
Un proceso tpico microbiano en el cual el producto deinters se forma durante la fase primaria de
crecimiento es la fermentacin alcohlica (etanlica).El etanol es un producto del metabolismo anaerbicode la levadura y de ciertas bacterias, y se forma comoparte del metabolismo energtico. Dado que elcrecimiento slo se puede dar si se efecta laproduccin de energa, la produccin de etanol corre
paralelamente con el crecimiento.
Metabolismo microbiano secundario
Los metabolitos producidos durante la faseestacionaria suelen llamarse metabolitos secundarios y
son algunos de los ms comunes e importantes deinters industrial. Este es el caso de la mayora de loscompuestos de inters farmacolgico como es el casode los antibiticos por ejemplo.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
12/127
12
Comparacin entre metabolitos primarios y secundarios
a) Metabolismo primario: formacin dealcohol por la levadura. b) Metabolismosecundario: formacin de penicilina por
el hongo Penicillium chrysogenum,presentando la separacin de la fase decrecimiento (trofofase), y la fase deproduccin (idiofase). Ntese en b) quela penicilina no se produce hasta que elcrecimiento ha entrado en la fase media
y mayor parte del producto se formadespus de que el crecimiento haentrado a la fase estacionaria. Enambos grficos a) y b) los ejes sonaritmticos y no logartmicos.
a
b
5/20/2018 bioenologia bacteriana
13/127
13
Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todaslas clulas, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entreun organismo y otro.
Las caractersticas reconocidas del metabolismo secundario son:
1- Cada metabolito secundario slo lo forman relativamente pocos
organismos.2- Los metabolitos secundarios aparentemente no son esenciales parael crecimiento y la reproduccin.
3- La formacin de metabolitos secundarios depende fundamentalmentede las condiciones de cultivo, sobre todo de la composicin del medio.
Con frecuencia, se produce la represin de la formacin del metabolitosecundario.
4- Los metabolitos secundarios se producen como un grupo deestructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se ha encontrado que unasola cepa de Streptomyces produce alrededor de 30 antibiticosdistintos, pero relacionados, del tipo antraciclina.
5- Se puede incrementar enormemente la sobreproduccin de losmetabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primariosasociados al metabolismo primario, habitualmente no puedensobreproducirse en la misma medida.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
14/127
14
Las va metablicas del metabolismo secundario surgendel metabolismo primario.
El metabolito secundario, generalmente se produce a partir de varios
productos intermediarios acumulados ya sea en el medio de cultivo o en lasclulas, durante el metabolismo primario.
Las enzimas que intervienen en la produccin de metabolito secundario seregulan por separado de las del metabolismo primario.
En algunos casos se han identificado inductores de metabolitossecundarios por ejemplo, se ha identificado un inductor especfico para laproduccin de estreptomicina, compuesto que se llama factor-A.
La mayor parte de los metabolitos secundarios son molculas orgnicascomplejas que requieren una gran cantidad de reacciones enzimticasespecficas para su sntesis, (72 etapas para tetraciclina; 25 etapas paraeritromicina).
5/20/2018 bioenologia bacteriana
15/127
15
Caractersticas de la fermentacin en gran escala
En microbiologa industrial, el trmino f e r m e n t a c i n se refiere a cualquierproceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza aerbica comoanaerbicamente, es decir tanto si es o no bioqumicamente una fermentacin.De hecho la mayor parte de las fermentaciones industriales sonaerbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentacin industrial sellama f e r m e n t a d o r y el microorganismo que se utiliza se llama f e r m e n t o .
El fermentador puede variar de tamao de la escala pequea de laboratorio (5-10 litros) a la enorme escala industrial (400.000 litros). Las dimensionesdependen del tipo de proceso y de cmo opera. Los procesos manejados enlote o batch requieren fermentadores ms grandes que los que operan en
forma contnua o semicontnua.Los fermentadores industriales se pueden dividir en dos claseprincipales, para procesos anaerbicos y para procesos aerbicos. Losfermentadores anaerbicos requieren poco equipo especial, excepto para laremocin del calor generado durante la fermentacin, en tanto que losfermentadores aerbicos requieren equipo mucho ms elaborado para
asegurar la correcta mezcla y aireacin.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
16/127
16
5/20/2018 bioenologia bacteriana
17/127
17
Construccin de un fermentador aerbico
Los fermentadores a gran escala son casi siempre de acero inoxidable. Esprcticamente un cilindro grande cerrado por arriba y por abajo, dentrodel cual se han ajustado varios tubos y vlvulas. Tiene una cubiertaexterna de enfriamiento, a travs de la cual se hace pasar vapor o aguade enfriamiento. En el caso de fermentadores muy grandes el intercambiode calor a travs de la cubierta es insuficiente de modo que hay queadaptar serpentines internos a travs de los cuales se pasa vapor o aguade enfriamiento.
En equipos a gran escala se necesita optimizar el sistema de aireacin yaque la transferencia de oxgeno del gas al lquido es un proceso muy difcil
porque el oxgeno es poco soluble en agua y un fermentador con una granpoblacin microbiana tiene una tremenda demanda de oxgeno para elcultivo. Se necesitan dos dispositivos diferentes para asegurar laadecuada aireacin: un dispositivo de aireacin llamado difusor, y undispositivo de agitacin llamado impulsor. Para lograr una mezcla mseficiente se utilizan deflectores.
El microbilogo industrial debe conocer muy bien la extremadamentecompleja dinmica de los fluidos en los fermentadores para disear yoperar de un modo eficiente los mismos
5/20/2018 bioenologia bacteriana
18/127
18
Fermentadores: a) de laboratorio; b) esquema de fermentadorindustrial; c) interior de un fermentador industrial.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
19/127
19
a) Conjunto de fermentadores pequeos para investigacin usado en eldesarrollo del proceso. b) Gran batera de fermentadores al aire libre (240m3) que se utiliza para la fabricacin de alcohol en Japn. Dada la grandiferencia de sus tamaos, la misma fermentacin microbiana tendra quedirigirse en forma muy distinta en los dos tipos de fermentadores.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
20/127
20
Control y monitoreo del procesoDebido a los altos costos de produccin, los fermentadores industrialesestn cuidadosamente controlados. No solo se controla el crecimiento y laproduccin del producto , sino que se deben controlar otros factoresambientales a medida que el proceso se efecta.
Los factores ambientales controlados ms frecuentes son: laconcentracin de oxgeno, pH, masa celular, temperatura yconcentracin del producto. Tambin hay que controlar la formacin deespuma. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar losprocesos de fermentacin ya sea en la obtencin de datos o en elcontrol de varios factores ambientales.
La obtencin de datos a medida que el proceso de fermentacin tiene lugarse llama adquisicin inmediata. Las computadoras tambin puedengraficar los datos obtenidos permitiendo al operador tener unarepresentacin visual del progreso de la fermentacin. Las computadoraspermiten tambin almacenar los datos para poder analizarlos. Lascomputadoras permiten un control inmediato del proceso a travs de lamodificacin de los parmetros ambientales a medida que la fermentacin
progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto delcrecimiento evitando que el mismo sea metabolizado a productosindeseables.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
21/127
21
a) Una gran planta de fermentacin.Slo se ve la parte superior de losfermentadores, que pueden teneruna altura de varios pisos.
b) Habitacin de control por ordenadorpara una gran planta defermentacin
Los procesos microbianos deben sercontrolados en forma continua,usualmente esto se hace por medio decomputadoras, a fin de asegurarrendimientos satisfactorios de losproductos que se desean.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
22/127
22
Escalado de la fermentacin
Escalado o cambio de escala es la adaptacin de un procesoindustrial desde las condiciones de un pequeo laboratorio a las de unafermentacin comercial a gran escala.
La mezcla y la aireacin son mucho mas eficientes en el matraz delaboratorio pequeo que en el fermentador industrial grande. A medidaque cambia el tamao del equipo, cambia la relacinsuperficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayorpara un rea superficial determinada.
El escalado de la fermentacin en el fermentador industrial es la tarea
del ingeniero bioqumico, quien esta familiarizado con la transferenciade gases, la dinmica de fluidos y la termodinmica. El papel delmicrobilogo industrial en el proceso de escalado es trabajarestrechamente con el ingeniero bioqumico para asegurar que se hanabarcado los parmetros necesarios para una fermentacin exitosa yque se dispone de las cepas microbianas apropiadas para unafermentacin en gran escala.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
23/127
23
Las distintas etapas de escalado que deben realizarse para llegarde un proceso de laboratorio a un proceso industrial son lassiguientes:
1- Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente laprimera indicacin que es posible un proceso de inters industrial.
2- El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequea,generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En elfermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el mediode crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajostanto en el equipo como en los medios de cultivo.
3- La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de300 a 3000 litros. Aqu las condiciones se acercan mas a la escalaindustrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En elfermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosainstrumentacin y un control con computadora, de modo que lascondiciones que se obtengan sean lo ms similares a las delfermentador industrial.
4- El fermentador industrial mismo, generalmente de 10.000 a 400.000litros
5/20/2018 bioenologia bacteriana
24/127
24
En los estudios de escalado para los procesos aerbicos, elparmetro de mayor importancia que se debe controlar durante elaumento de escala es la velocidad de transferencia de oxigeno; sedebe mantener la tasa de oxigeno constante al incrementar lasdimensiones del fermentador.
La tasa de oxigeno expresa el consumo de oxigeno enmMoles de O2/l/hora que se requiere para obtener eloptimo rendimiento.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
25/127
25
Esquema general de un proceso de
fermentacin a gran escala.El producto comercial estausualmente en las clulas o en lafraccin libre de clulas, pero no enambas fracciones. De acuerdo a estouna de ambas fracciones debe serposteriormente procesada (sealada
con el smbolo +) o descartada(sealada con el smbolo -).
5/20/2018 bioenologia bacteriana
26/127
26
ANTIBIOTICOS
5/20/2018 bioenologia bacteriana
27/127
27
Antibiticos: aislamiento y caracterizacin
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por los MOs quematan o inhiben el crecimiento de otros MOs.
Los antibiticos son metabolitos secundarios tpicos.
Los que se usan comercialmente son producidos por hongos filamentososy por bacterias del grupo de los actinomicetos.
La mayora se usa para el tratamiento de enfermedades bacteriana yalgunos pocos son contra enfermedades fngicas.
Los gneros mas comunes son Streptomyces, Penicillum y Bacillus.
Fabricar o producir comercialmente un antibitico requiere adems de unalto rendimiento, desarrollar un mtodo eficiente de purificacin. Porejemplo si el antibitico es soluble en un compuesto orgnico inmiscibleen agua esto implica una purificacin sencilla y de bajo costo por lafacilidad de poder concentrarlo. Si el antibitico no es soluble en algndisolvente, hay que separarlo por: a) adsorcin; b) intercambio inico; c)precipitacin qumica. La meta es obtener un producto cristalino deelevada pureza.
Para obtener cepas con altos rendimientos el qumico debe obtener cepasque no produzcan impurezas indeseables o desarrollar mtodos paraeliminarlas.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
28/127
28
Aislamiento de antibiticos y mtodo para probar elespectro de actividad antibitico de un microorganismo
La forma tradicional por la que se descubren nuevos antibiticosconsiste en el rastreo (screening). Con este tipo de aproximaciones se
asla de la naturaleza, un gran nmero de posibles MOs productoresde antibiticos (a). En estos aislamientos se ensaya la produccin deantibiticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhibael crecimiento de ciertas bacterias representativas de patgenosbacterianos usadas como control en el test (b). Aquellos aislamientosque sean candidatos de la produccin de antibiticos se estudian
posteriormente, a fin de saber si los antibiticos que produce sonnuevos o no. Cuando se descubre un MO que produce un nuevoantibitico, ste se produce en cantidades suficientes para poderanalizar su estructura y determinar luego su toxicidad y actividadteraputica en animales infectados. La mayora de los antibiticosnuevos fallan en el test en animales de experimentacin. No obstante
la bsqueda contina ya que se estima que las especies del gneroStreptomyces producen unos 100.000 antibiticos diferente.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
29/127
29
Aislamiento de antibioticos
Placa de agar
Halo de inhibicinPenicilina
Cultivo bacteriano
5/20/2018 bioenologia bacteriana
30/127
30
Produccin mundial anual y consumo de antibiticos.
- Cada ao se manufacturan ms de 500 toneladas de agentesquimioteraputicos.
- Agente quimioteraputico es todo compuesto qumico que puede usarsepor va interna para controlar las enfermedades infecciosas. Son de granutilidad en medicina clnica y veterinaria, as como en agricultura.
- El elemento clave de todo agente quimioteraputico es la toxicidadselectiva, es decir , la capacidad de inhibir a las bacterias u otros agentespatgenos sin afectar al hospedador. Se los puede agrupar en doscategoras generales, los agentes sintticos y los antibiticos.
Cefalosporinas inhiben la sntesis de la
pared celular.Macrlidos ej. Eritromicina inhibesubunidad 50S (sntesis de protenas).
Quinolonas ej. cido nalidxicointeraccionan la DNA girasa.
Penicilinas. Inhiben sntesis de pared
Aminoglicsidos ej Estreptomicinainhibe subunidad 30S (sntesis deprotenas).
5/20/2018 bioenologia bacteriana
31/127
31
Produccin industrial de la penicilinaEl anillo -lactmico caracterstico de las penicilinas se muestra en colormarrn oscuro. Son producidas por varios hongos de los gnerosPenicillum yAspergillis y por algunos procariotas. La fermentacin normalconduce a la produccin de p e n i c i l i n a s n a t u r a l e s . Si durante lafermentacin de aaden precursores especficos, se forman algunaspe n i c i l i n a s b i o s i n tt i c a s. Las pe n i c i l i n a s sem i s i n tt i c a sse producenaadiendo por mtodos qumicos una cadena lateral especfica al ncleodel cido 6-aminopenicilnico en la posicin R. Las penicilinassemisintticas son las que tienen la mayor utilidad clnica, puesto que porlo general son activas frente a bacterias Gram negativas y puedenadministrarse por va oral.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
32/127
32
Estructuras de algunas penicilinas importantes
5/20/2018 bioenologia bacteriana
33/127
33
Cintica de fermentacin de la penicilina con Penicillum chrysogenum.
La produccin de penicilina es un procesoaerbico, se requiere una aireacin muy eficiente.La penicilina es un metabolito secundario. Durantela fase de crecimiento se produce muy pocapenicilina, pero una vez que se ha consumido la
fuente de carbono casi completamente, empieza lafase de produccin de la penicilina. Alimentando elfermentador con diversos componentes del mediode cultivo, se puede alargar por varios das la fasede produccin. El licor de maz es uno de losprincipales ingredientes de la mayora de losmedios de produccin de penicilina. Esta sustanciacontiene la fuente de nitrgeno y otros factores de
crecimiento. La fuente de carbono esgeneralmente la lactosa. La penicilina se secreta almedio y una vez que las clulas se separan porfiltracin, se baja el pH del medio y se extrae elantibitico con un disolvente orgnico. Despus deconcentrarse en el solvente, el antibitico sevuelve a extraer en medio acuoso a pH alcalino,posteriormente se concentra y cristaliza. Por este
mtodo se puede obtener rpidamente penicilinacon un alto nivel de pureza.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
34/127
34
Purificacin de antibiticos
5/20/2018 bioenologia bacteriana
35/127
35
Purificacin de un antibitico.
Instalacin para extraer un antibitico del caldo de fermentacin
5/20/2018 bioenologia bacteriana
36/127
36
AMINOACIDOS
Los aminocidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, en
medicina y como precursores de la industria qumica. El msimportante comercialmente es el cido glutmico, que se utilizapara aumentar el sabor. La L-Lisina y la DL-metionina como aditivoalimentario para piensos para animales. La L- triptofano y L-histidinacomo nutritivo alimentario en leches en polvo. Otros aminocidosimportantes son el L- cido asprtico y la L-fenilalanina, que son los
ingredientes del edulcorante artificial aspartame, un ingrediente enlas bebidas bajas en caloras y en otros productos sin azcar.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
37/127
37
Si bien la mayor parte de los aminocidos se puede producirpor sntesis qumica, esta ltima da como resultado las formasL y D. Si se necesita la forma L, bioqumicamente importante,entonces es necesario aplicar un mtodo de fabricacinenzimtico o microbiolgico.
La produccin microbiolgica de los aminocidos puede hacersepor fermentacin directa, en la cual un microorganismoproduce el aminocido en un proceso estndar defermentacin, o mediante sntesis enzimtica, donde elmicroorganismo es la fuente de una enzima y entonces se
utiliza sta en el proceso de produccin.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
38/127
38
Regulacin de la biosntesis de aminocidos
- La sntesis de los aminocidos se lleva a cabo a travs de una serie
de etapas en las que intervienen distintas enzimas a partir deprecursores de la va glucoltica o del ciclo del cido tricarboxlico.-La regulacin de la sntesis de los aminocidos se efecta porretroalimentacin, es decir que la primera etapa enzimtica sueleestar sometida a inhibicin por retroalimentacin por el productofinal de esa va.- As al aumentar la concentracin de un determinado aminocido,
se inhibe la actividad de la enzima que conduce a la biosntesis deese aminocido, dando como resultado una reduccin en lasntesis.
- Una forma de lograr la sobreproduccin de un determinadoaminocido es obtener una mutante en la primera y nica enzimade esa va de sntesis del aminocido, de forma tal que ya no estsometida a la inhibicin por retroalimentacin.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
39/127
39
Inhibicin de la actividad enzimtica por retroalimentacin
La inhibicin por retroalimentacin se observa principalmente enla regulacin de las rutas biosintticas complejas, tales como lasrutas implicadas en la sntesis de un aminocido o de una purina.Tales rutas requieren muchas etapas enzimticas y el productofinal, aminocido o nucletido, est separado del sustrato inicialpor muchas etapas. An as el producto final es capaz deretroalimentar la primera etapa de la ruta y regular su propiabiosntesis. En la inhibicin por retroalimentacin, el aminocido uotro producto final de la ruta biosinttica inhibe la actividad de laprimera enzima de esta ruta. Esto se debe a una propiedad de laenzima inhibida conocida como alosterismo. Una enzimaalostrica tiene dos sitios de unin importantes, el sitio activo,donde se une el sustrato , y el sitio alostrico, donde se unereversiblemente el inhibidor, llamado a veces efector. Cuando uninhibidor se une, por lo general no covalentemente, al sitioalostrico, la conformacin de la molcula de enzima cambia, de
manera que el sustrato deja de unirse eficientemente al sitioactivo.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
40/127
40
5/20/2018 bioenologia bacteriana
41/127
41
Mecanismo de inhibicinenzimtica por un efector alostrico
5/20/2018 bioenologia bacteriana
42/127
42
Produccin de la lisina utilizando Brevibacterium flavum.
La lisina es un aminocido esencial para el hombre yes utilizada como aditivo alimentario. Se producecomercialmente utilizando la bacteria Brevibacteriumflavum. La sntesis de lisina, como la de otrosaminocidos se encuentra estrictamente regulada.
Para poder obtener los aminocidos en formaeconmica es necesario obtener cepassobreproductoras, es decir que no sufran el fenmenogeneral de inhibicin por retroalimentacin. En la vabioqumica que conduce desde el aspartato a la lisina,esta ltima puede inhibir por retroalimentacin laactividad de la enzima aspartatoquinasa. Lasobreproduccin de lisina puede obtenerse aislandomutantes en las cuales la aspartatoquinasa no estsujeta a retroinhibicin. Esto se logra aislandomutantes resistentes a un anlogo de la lisina, la S-aminoetilcistena (AEC), que se une al sitio alostricode la enzima e inhibe su actividad. Las mutantesresistentes a la AEC que se obtienen fcilmente porseleccin positiva, producen una modificacin de laaspartatoquinasa con un sitio alostrico alterado queya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que laretroinhibicin por lisina est muy reducida. Dichasmutantes pueden producir hasta 60 g de lisina porlitro en fermentadores industriales.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
43/127
43
Produccin de cido glutmicoUn factor muy importante para lograr un proceso de produccin comercialde un aminocido es conseguir la excrecin del mismo al medio decultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitosindispensables como los aminocidos. Aumentando la excrecin seevitaran concentraciones relativamente altas dentro de la clula, quepodran ocasionar inhibicin por retroalimentacin, an en mutantesresistentes. Una forma de obtener un nivel elevado de excrecin de unaminocido es el que se utiliza en la obtencin del cido glutmico. Laproduccin y excrecin del cido glutmico depende de la permeabilidadcelular. El organismo productor del cido glutmico, Corynebacteriumglutamicum, requiere la vitamina biotina, factor indispensable en labiosntesis de los cidos grasos. La deficiencia en biotina daa lamembrana celular como resultado de una produccin deficiente defosfolpidos y bajo estas condiciones se excreta el cido glutmicointracelular. El medio empleado para la produccin del cido glutmicocontiene en una primera etapa suficiente biotina para obtener un buendesarrollo del microoganismo y en una segunda etapa la deficiencia debiotina asegura la excrecin de cido glutmico al medio. Eldescubrimiento del papel de la deficiencia en biotina en la produccin delcido glutmico ha permitido el desarrollo de mtodos racionales para laformulacin de un medio para producir este aminocido.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
44/127
44
Produccin de cortisona utilizando Rhizopus nigricans
Los microorganismos pueden usarse para biocatalizar reaccionesqumicas especficas. Este proceso se denomina bioconversin obiotransformacin, e implica el cultivo del MO en fermentadoresgrandes, seguido de la adicin del compuesto qumico que ha de serconvertido, en el momento adecuado. Despus de un perodo de
incubacin, durante el cual el MO acta sobre el compuesto qumico, seextrae el caldo de fermentacin y se purifica el producto que se desee.Si bien la bioconversin puede usarse para varios procesos, su principalutilizacin industrial ha sido la produccin de algunas hormonasesteroideas.
Bioconversin microbiana
Solo la primera reaccin es una bioconversin microbiana tpica. Esta oxidacinaltamente especfica es realizada por el hongo Rhizopus nigricans y omite unadifcil reaccin qumica. Todos los otros pasos se realizan qumicamente.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
45/127
45
EnzimasLas enzimas extracelulares (exoenzimas) se secretan al mediode cultivo y son capaces de digerir polmeros insolubles como la
celulosa, las protenas y el almidn; posteriormente, losproductos de digestin son transportados al interior de lasclulas donde se utilizan como nutrientes para el crecimiento.Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industriasalimentaria, lctica, farmacutica y textil, y se producen engrandes cantidades por sntesis microbiana.
Las enzimas son biocatalizadores especialmente tiles porque amenudo actan en grupos funcionales qumicos que son nicos,distinguen fcilmente entre grupos funcionales similares de unamisma molcula y, en muchos casos, catalizan reacciones deuna forma estereoespecfica, produciendo slo uno de los dosposibles enantimeros (por ejemplo, el enantimero-D de un
azcar , o un L-aminocido.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
46/127
46
Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa
Las enzimas que ms se producen comercialmente son lasproteasas, que se usan como aditivos en los detergentes para lavarla ropa. La mayora de los detergentes que se utilizan actualmentecontienen proteasas, amilasas, lipasas, reductasas y otras enzimas.Muchas de estas enzimas se aslan de bacterias alcalfilas delgnero Bacillus. Otras enzimas importantes fabricadascomercialmente son las amilasas y glucoamilasas, que se emplean
en la produccin de glucosa a partir de almidn. La glucosa seconvierte luego en fructosa (que es ms dulce que la glucosa y lasacarosa) por accin de la enzima glucosa isomerasa. Este procesolleva a la obtencin de un edulcorante rico en fructosa a partir dealmidn de maz, trigo o papa.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
47/127
47
En la conversin del almidn de maz en el producto llamadojarabede maz rico en fructosa funcionan tres reacciones en secuencia,cada una de ellas catalizada por una enzima microbiana diferente.
1- La enzima alfa-amilasa lleva a cabo el ataque inicial sobre elpolisacrido almidn, acortando la cadena y reduciendo laviscosidad del polmero. Esta se llama reaccin de adelgazamiento.
2-La enzima glucoamilasa produce monmeros de glucosa a partir delos polisacridos acortados, proceso llamado sacarificacin.
3- La enzima glucosa isomerasa lleva a cabo la conversin final de la
glucosa en fructosa, proceso que recibe el nombre de isomerizacin.Las tres enzimas se producen por fermentacin microbiana. El producto
final de esta serie de reacciones es un jarabe que contienecantidades aproximadamente iguales de glucosa y fructosa, el cualse puede adicionar directamente a bebidas refrescantes y a otrosproductos alimenticios. Esto permiti a Estados Unidos usar el
almidn de maz en lugar de importar la sacarosa y ahorrar millonesde dlares por aos.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
48/127
48
Extremoenzimas: enzimas de procariotas que viven enambientes extremos.
Algunos procariotas llamados hipertermfilos, tienen un crecimientoptimo a temperaturas muy altas y producen protenas termoestablesque funcionan a altas temperaturas. El trmino extremoenzimas serefiere a enzimas que funcionan en condiciones muy altas o muy bajasde temperatura, pH, salinidad, etc. Los organismos que las producen sedenominan extremfilos.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
49/127
49
Enzimas inmovilizadasEn algunos procesos biocatalticos se desea convertir enzimas solubles en
enzimas inmovilizadas. La inmovilizacin no solo facilita la reaccinenzimtica en condiciones de produccin continua a gran escala, sinoque tambin contribuye a la estabilizacin de las enzimas evitando sudesnaturalizacin. Existen tres aproximaciones bsicas para la
inmovilizacin de enzimas.1- Polimerizacin (entrecruzamiento, cross-linkage) de lasmolculas de enzima. El enlace de unas molculas de enzima con otrasse hace a travs de una reaccin qumica con un agente bifuncional deentrecruzamiento como el glutaraldehido.
2- Unin de la enzima a un soporte. La unin puede hacerse poradsorcin, enlace inico, o enlace covalente. Los soportes usados son
celulosas modificadas, carbn activado, arcillas minerales, xido dealuminio y bolitas de vidrio.3- Inclusin enzimtica, que comprende la inclusin de la enzima en
una membrana semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse enmicrocpsulas, geles, membranas semipermeables de polmeros, opolmeros fibrosos como el acetato de celulosa.Cada uno de estos mtodos tiene ventajas y desventajas y el
procedimiento utilizado depende de la enzima y de la aplicacinindustrial particular.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
50/127
50
5/20/2018 bioenologia bacteriana
51/127
51
Clulas inmovilizadas
En algunos casos no es necesario utilizar la enzima purificada.
Se pueden utilizar clulas inmovilizadas para utilizarlas en procesosindustriales.
En general se utilizan para procesos de flujo continuo.
Se utilizan instalaciones mucho mas econmicas.
Un ejemplo es la utilizacin de clulas de Bacillus cuagulansinmovilizadas para la conversin continua dejarabe de glucosa enjarabe de fructosa. Este microorganismo es productor de glucosaisomerasa, la enzima que convierte la glucosa en fructosa.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
52/127
52
5/20/2018 bioenologia bacteriana
53/127
53
Produccin de productos de mamferos por microorganismosmodificados por ingeniera gentica.
El mayor inters esta en la produccin de protenas y de pptidos demamferos por medios microbianos, ya que muchos de estos compuestostienen un alto valor farmacutico, son costosos y difciles de obtener porotros mtodos. A pesar de la excitante promesa de la ingeniera genticaen la biotecnologa, lograr la comercializacin de un producto es unaempresa gigantesca. Adems de la correcta clonacin y expresin del gende inters en una bacteria o levadura, y de la purificacin del productodeseado, se deben tomar en consideracin otros aspectos como las pruebasclnicas y permisos gubernamentales. Cualquier producto sintetizado
microbiolgicamente, que se intente utilizar en el hombre, debe pasarpruebas clnicas exhaustivas. Por ej., la insulina producidamicrobiolgicamente mediante la tecnologa del DNA recombinante hatenido que pasar pruebas clnicas estrictas con voluntarios humanos, apesar de que se ha demostrado que la insulina producidamicrobiolgicamente es idntica a la protena fabricada por humanos.
Si todo va bien en las pruebas clnicas, se puede pedir el permiso oficial,
pero esto puede ser un proceso que consume mucho tiempo.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
54/127
54
Produccin de insulina
La insulina es un hormona. Es una protena pancretica que regula elmetabolismo de los carbohidratos en mamferos. La diabetes es unaenfermedad caracterizada por una insuficiencia de insulina y afecta amillones de personas. El tratamiento estndar consiste en laadministracin de sta hormona peridicamente en forma oral oinyectable. La hormona proveniente de pncreas de terneros o decerdos no resulta tan eficaz como la insulina humana y , adems, elproceso de aislamiento es caro y complejo. Por esta razn se hallevado a cabo la clonacin del gen de la insulina humana enbacterias.
La insulina humana consta de dos polipptidos (A y B) conectados por
puentes disulfuro. Estos dos pptidos estn codificados por partesseparadas del mismo gen de la insulina. El gen de la insulina codificala preproinsulina, un pptido ms largo que contiene una secuenciaseal (implicada en la secrecin de la protena), los polipptidos A y Bde la molcula de insulina activa, y un polipptido de unin que estausente en la insulina madura. La proinsulina se forma a partir de lapreproinsulina, y la conversin de proinsulina en insulina implica la
ruptura enzimtica del polipptido de unin entre las cadenas A y B.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
55/127
55
Procesamiento de la preproinsulina
La metionina inicial es eliminada de la cadena antes de que sesintetice la molcula completa de preproinsulina. Tras laeliminacin del pptido lder, la molcula de insulina se pliega yel pptido C se elimina originando las cadenas A y B de lainsulina. Estas cadenas quedan unidas por puentes disulfuro.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
56/127
56
Hasta el momento se han utilizado dos mtodos para la produccin deinsulina humana en bacterias: (1) produccin de proinsulina yconversin en insulina mediante mtodos qumicos, y (2) produccin delas cadenas A y B en dos cultivos bacterianos separados, as como uninde las dos cadenas mediante procedimientos qumicos para producir lainsulina. Para sintetizar insulina, la secuencia de DNA adecuada se
realiz en forma qumica. La cadena A consta de 63 bases y la cadena Bde 90 bases. En la proinsulina existen otras 105 bases adicionales quecodifican el pptido C que conecta las cadenas A y B. Se aadieron basesen los extremos para el corte con enzimas de restriccin adecuadas quepermitieran clonar los fragmentos dentro de un plsmido vector. Paraobtener una expresin eficaz, los genes se insertaron debajo de unpromotor adecuado de Escherichia coli, pero de manera que el
fragmento de insulina se sintetizara como parte de una protena defusin para que fuera ms estable. Se coloc tambin un triplete quecodifica para metionina en el punto que una el gen de la insulina con laparte superior del gen de fusin para poder cortar luego el productoformado con bromuro de ciangeno aprovechando la propiedad de quela insulina no tiene residuos metionina en su molcula y el bromuro deciangeno corta especficamente por los residuos metionina.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
57/127
57
Cuando se utiliza el mtodo de la proinsulina, la proinsulina aislada delas bacterias por el tratamiento con bromuro de ciangeno, seconvierte en insulina cuando se forma el enlace disulfuro y se producela eliminacin enzimtica del pptido de unin el cual se hace por
tratamiento con las proteasas tripsina y carboxipeptidasa B, que notienen efecto sobre la molcula de insulina.
Cuando la insulina se produce mediante los pptidos separados A y B,cada uno de los pptidos se aslan de un cultivo independiente y lascadenas se separan mediante el corte con bromuro de ciangeno. Lascadenas cortas se conectan luego mediante un tratamiento qumicoque permite la formacin de los puentes disulfuro.
En los dos casos el producto final es idntico a la protena purificadadel pncreas humano y los costos son menores que los requeridospara la purificacin de la insulina de cerdos o de terneros.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
58/127
58
Ingeniera gentica para la produccin de insulina humana en bacterias
5/20/2018 bioenologia bacteriana
59/127
59
Ingeniera gentica aplicada a la produccin de xantanoXantomonas campestris es una bacteria Gram negativa del suelo aerbicaobligada que produce el biopolmero xantano de importante valorcomercial. Es un exopolisacrido que se produce como un subproducto delmetabolismo secundario. El xantano tiene un alto PM y esta compuestopor un esqueleto de celulosa (glucosa-1,4-glucosa) que tiene el
trisacrido manosa-cido glucurnico-manosa como rama lateral en formaalternada sobre dicho esqueleto. Posee adems los sustituyentes acetatoy piruvato sobre la primera y tercera manosa lateral.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
60/127
60
El xantano tiene una viscosidad alta, es estable en ambientes fsicos yqumicos extremos y tiene propiedades similares a las de un plstico. Enparticular las propiedades fsicas lo hacen til como estabilizante,emulsionante, adelgazante o agente para suspender otros compuestos.Para la obtencin exitosa del xantano en forma comercial se debenbajar los costos para lo cual se debe disponer de una fuente de carbonode costo bajo o nulo. Xanthomonas campestris puede utilizar en forma
eficiente glucosa, sacarosa y almidn, pero no puede usar lactosa comofuente de carbono. El suero es un subproducto de la manufactura de losquesos. Este consta de 94% a 95% de agua, 3,4 a 4% de lactosa,pequeas cantidades de protenas, minerales y compuestos orgnicosde pajo PM. Diariamente se producen enormes cantidades de suero porla industria y son un problema importante. La liberacin de este suero aros o lagos puede disminuir la cantidad de O2 disponible y por endematar a muchos organismos acuticos. El transporte de estos sueros adistintos sitios para su degradacin puede ser extremadamente costosoy puede ser una fuente potencial de contaminacin subterrnea. Porotra parte los costos para remover los componentes slidos del sueroson prohibitivos. En consecuencia, se han desarrollado muchosesquemas para deshacerse de los sueros en forma creativa.Tericamente el suero puede ser usado como fuente de carbono para elcrecimiento industrial de microorganismos importantes.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
61/127
61
Con esto en mente X. campestris fue modificado genticamentepara crecer sobre suero. Los genes lacZY de Escherichia coli, loscuales codifican para la -galactosidasa y la lactosa permeasafueron clonados en un plsmido de amplio rango de husped bajoel control transcripcional de un promotor de un bacterifago deX.campestris. Esta construccin fue introducida en E. coli y luegotransferida de E. colia X. campestris por conjugacin triparental.Los transformantes que mantuvieron el plsmido y que expresaronniveles altos de -galactosidasa y de lactosa permeasa, utilizan lalactosa como fuente de carbono y produjeron altos niveles dexantano usando como fuente de carbono glucosa, lactosa o suero.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
62/127
62
FIN
5/20/2018 bioenologia bacteriana
63/127
63
Bibliografa:
Brock Biologa de los Microorganismos (10 Edicin) Molecular Biotechnology Principles and Applications of
Recombinant DNA (Second Edition). Bernard R. Glick and Jack J.
Pasternak.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
64/127
64
Criterios mas importantes para el diseo de un fermentador
1.- El tanque debe disearse para que funcione aspticamente durante numerososdas, as como para las operaciones de ms larga duracin.
2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireacin y agitacin para cubrirlas necesidades metablicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible.
4.- Debe tener un sistema para el control del pH.
5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
7.- Las prdidas por evaporacin no deben ser excesivas.
8.- El diseo del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante elfuncionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean mnimas.
9.- El tanque debe ser verstil para la aplicacin de diversas modalidades de
procesos.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
65/127
65
10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde seaposible, soldaduras.
11.- La geometra del fermentador debe ser similar a otros tanques ms pequeos omayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos adiferentes escalas.
12.- deben emplearse los materiales ms baratos que proporcionen resultadossatisfactorios.
13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
De los 13 puntos mencionados anteriormente, los dos puntos de mayor relevancia
que hay que considerar son probablemente: 1- El mantenimiento de un ambiente asptico. 2- Las condiciones aerbicas adecuadas.
Los fermentadores ms ampliamente utilizados a nivel industrial estn provistos demecanismos de agitacin, dispersin y aireacin as como de sistemas para elcontrol de la temperatura, pH y formacin de espuma.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
66/127
66
Tipos de fermentaciones
1.- Fermentacin discontinua
2.- Fermentacin alimentada (fed-batch)
3.- Fermentacin continua
4.- Reactores de enzimas o clulasinmovilizadas
5/20/2018 bioenologia bacteriana
67/127
67
1.- Fermentacin discontinua
Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistemacerrado". Al inicio de la operacin se aade la solucin esterilizada de nutrientes y seinocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubacin encondiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aadenada, excepto oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante y cidos obases para controlar el pH.
La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y laconcentracin de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismode las clulas observndose las cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia,fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte.
En los procesos comerciales la fermentacin frecuentemente se interrumpe al finalde la fase logartmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase demuerte (metabolitos secundarios).
5/20/2018 bioenologia bacteriana
68/127
68
2.- Fermentacin alimentada (fed-batch)
En los procesos convencionales discontinuos que acabamos dedescribir, todos los sustratos se aaden al principio de la
fermentacin. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es lafermentacin alimentada que se utiliza en la produccin desustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, lossustratos se aaden escalonadamente a medida que progresa lafermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundariosest sometida a represin catablica (efecto glucosa). Por estarazn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin
de nutrientes se aaden en pequeas concentraciones al principiode la fermentacin y continan aadindose a pequeas dosisdurante la fase de produccin.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
69/127
69
3.- Fermentacin continua
En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. Lasolucin nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor yuna cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con
los microorganismos, se saca simultneamente del sistema.
4.- Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas
Consiste en pasar el medio fresco a travs de un biorreactor en elque por diversas tcnicas hemos inmovilizado clulas (o enzimas).En el biorreactor se producen las transformaciones bioqumicas quedeseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso porla columna. Con este sistema se eliminan los problemas dedesequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clsico y adems elproducto resultante est libre de clulas. Presenta el inconvenientede que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
70/127
70
Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas
Existen tres mtodos de inmovilizar las clulas:
a.- Asociacin fsica mediante resinas de intercambio inico. La
unin se puede romper fcilmente.
b.- Unin covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato,iodo acetil celulosa. Unin fuerte aunque inactivacin.
c.- Atrapamiento mediante colgeno, gelatina, agar, alginatos,poliacrilamida, poliestireno. Es el mtodo ms utilizado eninmovilizacin de clulas; para ello se mezclan las clulas con elpolisacrido lquido y posteriormente se deja enfriar para quesolidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta enuna columna.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
71/127
71
Objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones:
1- minimizar costos
2- incrementar los rendimientos.
Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo defermentacin ms adecuado para cada paso en particular.El coste de produccin de biomasa mediante cultivo continuo espotencialmente inferior al de cultivo discontinuo, sin embargo, no seutilizan de forma general en la industria debido fundamentalmenteal mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento declulas en fermentacin discontinua.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
72/127
72
Aunque muchas fermentaciones para la produccin de metabolitosfuncionan bien como procesos continuos, slo unos pocos procesos
han resultado tiles para la aplicacin prctica por varias razones:
a.- Muchos mtodos de laboratorio operan continuamente durantesolamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial elsistema debe ser estable durante al menos 500 a 1.000 horas.
b.- Mantener las condiciones estriles a escala industrial a lo largo
de un largo perodo de tiempo es difcil.
Limitaciones prcticas de los procesos continuospara la fabricacin de metabolitos
5/20/2018 bioenologia bacteriana
73/127
73
c.- La composicin de los sustratos debe ser constante a fin deobtener una produccin mxima. La composicin de las soluciones
de nutrientes industriales son variables (lquido de maceracin delmaz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiologade la clula y disminuir la productividad.
d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producenmutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivocontinuo ms deprisa que las cepas de produccin por lo que el
rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menosclulas las que sintetizan el producto de inters.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
74/127
74
FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO
DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES
1.- Oxgeno
2.- Temperatura 3.- pH
1. Oxgeno: El suministro de O2 es uno de los factores ms crticos enla operacin de fermentacin a gran escala.
- El oxgeno es el sustrato gaseoso ms importante para elmetabolismo microbiano y el anhdrido carbnico es el productometablico ms importante.
- El oxgeno no es un gas muy soluble ya que, cuando se utiliza aire,una solucin saturada de oxgeno en agua contiene aproximadamente
9 mg / L y 43 mg/L cuando se utiliza oxigeno puro. A medida queaumenta la temperatura disminuye la solubilidad del O2
-El suministro de O2 se logra pulverizando aire en el fermentadordurante el proceso.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
75/127
75
2.- Temperatura. Es otro parmetro importante.- Si la temperatura es inferior a la ptima, hay un crecimiento
retardado y menor productividad.- Si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir
una respuesta de estrs al choque trmico con la consiguienteproduccin de proteasas celulares que ocasionan una disminucinen el rendimiento de los productos proteicos.
- A fin de obtener rendimientos ptimos, las fermentaciones deben
ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y en loposible constante.- La velocidad de produccin de calor debida a la agitacin y a la
actividad metablica de los microorganismos no se ve compensadapor las prdidas de calor que resultan de la evaporacin, por lo quese debe recurrir a sistemas de refrigeracin. Los mas usados sonlas camisas de agua.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
76/127
76
3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecenptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante elcrecimiento en un fermentador, los metabolitos celularesson liberados al medio, lo que puede originar un cambiodel pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe
controlar el pH del medio de cultivo y aadir un cido ouna base cuando se necesite para mantener constanteel pH. Por supuesto que esta adicin del cido o basedebe ser mezclada rpidamente de tal manera que el pHdel medio de cultivo sea el mismo en todo elfermentador.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
77/127
77
AGITACION Y MEZCLADO
La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contactoentre dos o varias fases. Una fermentacin microbiana puede ser
considerada como un sistema de tres fases, que implica reaccioneslquido-slido, gas-slido y gas-lquido.
1.- La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos.Puede existir, en algunos casos, una segunda fase lquida si existeun sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de
micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo queprecipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro deoxgeno, para la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH conamonio gaseoso.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
78/127
78
Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano esesencial para la fermentacin ya que produce lossiguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersin del aire en la solucin de nutrientes.
2.- Homogeneizacin, para igualar la temperatura, pH yconcentracin de nutrientes, en el fermentador.
3.- Suspensin de los microorganismos y de losnutrientes slidos.
4.- Dispersin de los lquidos inmiscibles.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
79/127
79
Bajo estas premisas se podra concluir que
cuanto mayor sea la agitacin, mejor ser elcrecimiento. Sin embargo, la agitacin excesivapuede romper las clulas grandes e incrementarla temperatura lo que ocasiona un descenso enla viabilidad celular. Por lo tanto, se debeconseguir un balance entre la necesidad delmezclado y la necesidad de evitar el daocelular.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
80/127
80
Los diferentes tipos de agitacin que se utilizan en las fermentaciones seincluyen dentro de las siguientes clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecnico deagitacin.
2.- Columnas de burbujas, la agitacin se realiza mediante la introduccinde aire a sobrepresin.
3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno oexterno. La mezcla y circulacin de los fluidos son el resultado de las
corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidaddentro de las diferentes partes del fermentador.
De estos tres tipos el ms utilizado es el primero ya que es ms flexible enlas condiciones de operacin, es ms fcil de conseguir comercialmente,provee una eficiente transferencia de gases a las clulas y es el tipo con elque se tiene ms experiencia.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
81/127
81
Esterilizacin industrial
Es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres
de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentadorde produccin.
Hay que esterilizar:
1- El fermentador
2- Todo el equipamiento (uniones, vlvulas, electrodos)
3- Medio de cultivo4- Aditivos (antiespumantes)
- No es necesario esterilizar los cidos y bases concentrados
- No deben existir roturas mecnicas en el fermentador que podran permitir la
entrada de microorganismos.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
82/127
82
Bioreactor
Se puede esterilizar con:
1- Calor2- Radiacin
3- Producto qumico
4- Separando los organismos viables mediante unprocedimiento fsico como la filtracin.
Durante la fermentacin se deben observar dos puntospara asegurar la esterilidad:
- Esterilidad en el medio de cultivo- Esterilidad del aire que entra y sale
5/20/2018 bioenologia bacteriana
83/127
83
ESTERILIZACION DEL MEDIO DE CULTIVO
Por calor.
Por filtracin.
Esterilizacin por calor
El exito de la esterilizacin por calor depende de:
1- el nmero y tipo de microorganismos presentes
2- la composicin del medio de cultivo
3- el valor del pH
4- el tamao de las partculas en suspensin.Las clulas vegetativas son eliminadas rpidamente a temperaturas relativamentebajas, pero para la destruccin de las esporas se necesitan temperaturas de 121C.
Esterilizacin por filtracin
Se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solucin de nutrientesque son sensibles al calor (vitaminas, antibiticos, componentes de la sangre, etc).
5/20/2018 bioenologia bacteriana
84/127
84
A- Esterilizacin discontnua de los medios
- Esterilizacin Indirecta: consiste en inyectar vapor en la camisa del
fermentador o en los serpentines interiores.- Procedimiento directo: consiste en inyectar vapor en la propia solucin de
nutrientes. Pre-requisito, tener vapor puro (libre de aditivos qumicos).
Inconvenientes del proceso de esterilizacin discontinua
- Se requieren tiempos largos para alcanzar y mantener la temperatura de121oC.
- Es un procedimiento muy costoso, si el agua caliente que se producedurante el enfriamiento posterior del reactor no se aplica a algn uso.
- Las fases de calentamiento, esterilizacin y enfriamiento no solamentematan a los microorganismos, sino que tambin alteran severamente lasolucin de nutrientes (caramelizacin, deterioro de la calidad del medio,destruccin de vitaminas, cambio de pH).
5/20/2018 bioenologia bacteriana
85/127
85
B.- Esterilizacin continua- La esterilizacin continua es la etapa preliminar lgica en una fermentacin
continua a escala industrial- Para obtener posibles mayores rendimientos en el tiempo y el espacio
asignados se puede utilizar en la fermentacin discontinua- Mientras la esterilizacin discontinua se lleva a cabo en 30-60 minutos a
121C, la esterilizacin continua se lleva a cabo normalmente en 30-120segundos a 140C.
- El calentamiento del medio de cultivo para la esterilizacin continua puedeser llevado a cabo mediante inyeccin de vapor o medianteintercambiadores de calor.
Inconveniente en el proceso de esterilizacin contnua
- Cuando se usa el mtodo de intercambiadores de calor se pueden formarsales insolubles (p. ej. fosfato clcico u oxalato clcico) con algunassoluciones de nutrientes.
- Las soluciones que contienen almidn, que se hacen viscosas cuando secalientan, son difciles de utilizar en procesos de esterilizacin continua.
- El tiempo de esterilizacin puede ser insuficiente si hay partculas insolublesen el medio.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
86/127
86
ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACION
El aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado.
El nmero de partculas y microorganismos en el aire vara en gran medidadependiendo de la localizacin de la planta, el movimiento del aire y eltratamiento previo del aire.
Mtodos existentes para la esterilizacin de los gases:
1-filtracin
2- inyeccin de gas (ozono),
3- depuracin de gas
4- radiacin (UV)
5- calorSolamente el calor y la filtracin fueron utilizados industrialmente.
A partir de la crisis del petrleo de los aos 70, el proceso de esterilizacin porcalentamiento elctrico ha sido reemplazado por la filtracin.
E ili i d l i fil i
5/20/2018 bioenologia bacteriana
87/127
87
Esterilizacin del aire por filtracin
- En los sistemas industriales actuales el aire se esteriliza porfiltracin a travs de filtros de cartuchos que poseen una estructura
membranosa plegada (steres de celulosa, polisulfona o nylon).- En la actualidad no existen filtros industriales absolutos para
bacterifagos.
- Los bacterifagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como porejemplo en la produccin de cido glutmico porCorynebacteriumglutamicumo al trabajar con Escherichia coli.
- El aire que sale del fermentador tambin debe ser esterilizado, sobre todo sise trabaja con organismos recombinantes. No slo como medida deseguridad, sino tambin para prevenir que las cepas industriales seliberen al medio ambiente y por lo tanto estn disponibles de unaforma gratuita para los competidores.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
88/127
88
I. PREPARACION Y PROPAGACION DE INOCULOS
- El tamao del inculo generalmente es del orden del 1-10% delvolumen total del medio. Si es inferior a esta proporcin puede
existir un perodo de latencia excesivamente prolongado, lo queprolongar el perodo de fermentacin.
El proceso de fermentacin se lleva a cabo en cuatro etapas:
I. Preservacin del inculoII. Multiplicacin del inculo
III. Cultivo de prefermentacinIV. Fermentacin de produccin
Et I P i d l i l
5/20/2018 bioenologia bacteriana
89/127
89
Etapa I: Preservacin del inculo Debe preservarse no solo la supervivencia de las cepas sin la capacidad
de formar el producto de inters a lo largo de un perodo de tiempo largo.
Durante el proceso de seleccin de cepas, las cepas superproductorasestn frecuentemente daadas en su metabolismo primario y
frecuentemente degeneran durante las sucesivas transferencias,probablemente como resultado de mutaciones espontneas (revertantes).
El objetivo de la preservacin es mantener las cepas durante tanto tiempocomo sea posible sin divisin celular.
Las cepas maestras no deberan ser cultivadas ms que una vez cada dosaos controlando los niveles de actividad con cada uso
Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo peridicamenteprogramas de seleccin.
Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras.
Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en relacin a su pureza ysu capacidad de formar producto para posteriormente ser almacenadas
hasta su uso.
Et II C i i t d l i l
5/20/2018 bioenologia bacteriana
90/127
90
Etapa II: Crecimiento del inculo
El cultivo preservado se reaviva inicialmente
mediante crecimiento en un cultivo lquido enagitacin o en medio slido si se requiere laformacin de esporas.
Las condiciones utilizadas en el cultivo inicial
(composicin del medio, temperatura deincubacin, etc.) dependern del procesoespecfico.
Etapa III: Precultivo en fermentador
5/20/2018 bioenologia bacteriana
91/127
91
Etapa III: Precultivo en fermentador A fin de obtener suficiente inculo para el fermentador de produccin,
deben realizarse precultivos en fermentadores ms pequeos. Si unfermentador de produccin se inicia con demasiado poco inculo, elcrecimiento se retrasa y la velocidad de formacin del producto puede serinsatisfactoria.
La concentracin ptima del inculo para el fermentador de produccindetermina el nmero de etapas del precultivo de fermentacin que sonnecesarias.
En general se requieren las siguientes concentraciones de inculo:
Actinomicetos...........5 - 10 %Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %Hongos..................5 - 10 %
A veces el medio de cultivo de produccin se utiliza en la ltima etapa deformacin del inculo a fin de inducir la formacin del producto.
EtapaEtapa IV:IV: FermentaciFermentacinn dede producciproduccinnDependiendoDependiendo de lade la fermentacifermentacinn sese utilizanutilizan biorreactoresbiorreactores dededistintodistinto tamatamaoo y noy no puedepuede darsedarse unun esquemaesquema generalgeneral parapara lalainoculaciinoculacinn de unde un fermentadorfermentador dede producciproduccinn..
II RECUPERACION DE PRODUCTOS
5/20/2018 bioenologia bacteriana
92/127
92
II. RECUPERACION DE PRODUCTOS
En una etapa de recuperacin se optimiza la pureza y/o la concentracinde un metabolito.
En un proceso ideal de recuperacin se optimizan ambos parmetros. Las tcnicas utilizadas en la recuperacin de productos qumicos
industriales (extraccin, destilacin, dilisis, cristalizacin, precipitacin,desecacin) fueron perfeccionadas para adaptarlas a materiales biolgicos.
No existe una operacin nica, ideal o universal, ni siquiera una secuenciade operaciones que puedan ser recomendadas.
las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la formams adecuada para cada problema particular.
En muchos casos la primera etapa de recuperacin, al final de unafermentacin, es la separacin de los slidos del lquido que casi siemprees acuoso.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
93/127
93
Principios del crecimiento bacteriano
5/20/2018 bioenologia bacteriana
94/127
94
Principios del crecimiento bacterianoLos microorganismos pueden crecer en cultivos en lote (batch),lote alimentado (fed-batch) o cultivo continuo.
1-En la fermentacin en lote, el medio de crecimiento estril esinoculado con el microorganismo apropiado y la fermentacin
procede sin la adicin de medio de crecimiento fresco.2- En la fermentacin en lote alimentado, los nutrientes sonaadidos en forma incremental a varios tiempos durante el procesode fermentacin; no se remueve el medio de crecimiento hasta quetermine el proceso.
3- En el proceso de fermentacin continua, el medio fresco esaadido en forma continua durante la fermentacin, pero al mismotiempo un volumen igual de medio utilizado con el microorganismosuspendido es removido.
Para cada tipo de fermentacin se aade dentro del reactor, cuandoes necesario, el oxigeno (el cual es usualmente provisto en forma de
aire estril), un agente antiespumante, y, si es requerido, cido obase.
Fermentacin en loteDurante la fermentacin en lote la composicin del medio de
5/20/2018 bioenologia bacteriana
95/127
95
Fermentacin en loteDurante la fermentacin en lote, la composicin del medio decultivo, la concentracin de microorganismos (concentracin de labiomasa), la composicin qumica interna de los microorganismos, yla cantidad de la protena target o del metabolito, todas cambiancomo una consecuencia del estado de crecimiento celular, elmetabolismo celular, y la disponibilidad de nutrientes. Bajo estas
condiciones, se observan usualmente seis fases de crecimiento: faselag, fase de aceleracin, fase logartmica o exponencial, fase dedesaceleracin, fase estacionaria y fase de muerte.
Durante la fase logartmica de crecimiento, la masa celular
5/20/2018 bioenologia bacteriana
96/127
96
Durante la fase logartmica de crecimiento, la masa celularsufre varias duplicaciones y la velocidad de crecimientoespecfica del cultivo () permanece constante.Cuando hay exceso de sustrato (suplemento de nutrientes) y no hayinhibicin del crecimiento por un compuesto que est presente en el mediode crecimiento, la velocidad de crecimiento especfica es independiente dela concentracin de sustrato. En este caso, la velocidad de incremento dela biomasa celular con el tiempo, dX/dt, es el producto de la velocidad decrecimiento especfico, , y de la concentracin de la biomasa,X:
dX/dt = XLa velocidad de crecimiento especfico, , es una funcin de laconcentracin del substrato limitante (por ej., la fuente de carbono o denitrgeno) S, de la velocidad de crecimiento especfica mxima, m ax, y de
una constante especfica de substrato K s. Ambas S y Ks son expresadasen trminos de concentracin, por ej. en gramos o moles por litro. = maxS/ (Ks + S)
Algunas veces los cientficos se refieren al tiempo de duplicacin otiempo de generacin (t) de un cultivo ms bien que a una velocidad decrecimiento especfica , donde t = ln2/. El tiempo de generacin de uncultivo, es el tiempo que ste toma, bajo condiciones definidas, para queel nmero de clulas de la biomasa celular se duplique. Cuando hay unexceso de substrato (por ej., cuando S>> Ks), luego = maxy se obtienela velocidad mxima de crecimiento en fase logartmica del cultivo.
Fermentacin en lote alimentado (Fed-Batch)
5/20/2018 bioenologia bacteriana
97/127
97
Fermentacin en lote alimentado (Fed Batch)
En las fermentaciones en lote alimentado, el substrato es aadido en incrementos avarios tiempos a travs del curso de la reaccin. Estas adiciones prolongan tanto lafase log como la fase estacionaria, de esta forma se incrementa la biomasa y lacantidad de sntesis de metabolitos de fase estacionaria, tales como losantibiticos. Sin embargo, los microorganismos en fase estacionaria a menudoproducen enzimas proteolticas o proteasas, y estas enzimas pueden atacar algnproducto sintetizado por un microorganismo modificado genticamente. Luego,para las protenas producidas por microorganismos recombinantes, es importanteprevenir que la reaccin de fermentacin alcance esta parte del ciclo decrecimiento. Generalmente, las fermentaciones en lote con alimentacin requierems monitoreo y mayor control que las fermentaciones en lote y son luegoutilizadas en menor medida. La adicin peridica de substrato al cultivo microbianoen crecimiento prolonga la fase log de crecimiento y demora el onset de la faseestacionaria, la cual inicia las respuestas de stress celular, la produccin deproteasas y otros cambios metablicos que afectan el rendimiento de la protenarecombinante. Una estrategia de fermentacin en fed-batch puede incrementar elrendimiento de 25% a mas de 1.000%, comparado con la fermentacin en batch,dependiendo del microorganismo en particular, su background gentico y lanaturaleza de la protena recombinante.Los procesos de fed-batch no se limitan solamente a clulas microbianas sino quepueden ser utilizados con cultivos de clulas de mamferos y de insectos.
Fermentacin continua
5/20/2018 bioenologia bacteriana
98/127
98
Fermentacin continua.
En una fermentacin continua, una condicin de estado de equilibrio osteady-state, donde la variacin de la concentracin de la biomasa enfuncin del tiempo es igual a cero (dX/dt = 0) se alcanza cuando elnmero total de clulas y el volumen total en el biorector permanecen
constantes. En otras palabras, bajo esas condiciones, la prdida declulas debido al outflow o remocin del producto est balanceadoexactamente por la ganancia de nuevas clulas por el crecimiento(divisin celular). Para obtener un cultivo estable termodinmicamente,la velocidad de crecimiento especfica, , del cultivo debe ser menor quela velocidad de crecimiento mxima alcanzable, max. En la prctica, estacondicin se alcanza ajustando la bomba que controla la velocidad deflujo volumtrico, mientras se mantiene el volumen del cultivo en elbirreactor constante.El objetivo fundamental de la fermentacin industrial es minimizar loscostos y maximizar los rendimientos. Este logro se puede lograr a travsde desarrollos tecnolgicos que permitan una fermentacin ms eficientepara cada proceso en particular.
Si bien los procesos de fermentacin continua no son usados frecuentemente enprocesos industriales, principalmente debido a la mayor experiencia que loscientficos tienen con clulas creciendo en el modelo de lote o batch el costo de
5/20/2018 bioenologia bacteriana
99/127
99
cientficos tienen con clulas creciendo en el modelo de lote o batch, el costo deproduccin de una biomasa celular por cultivo continuo es potencialmente muchomenor que el de producir la misma biomasa por fermentacin en batch. Los factoresque se indican a continuacin dan cuenta para el ahorro de costos.
1- Fermentaciones continuas utilizan birreactores menores que los fermentadores en
batch para producir la misma cantidad de producto.2- Luego que una fermentacin en batch en gran escala es completada, se necesitaun equipo en gran escala para cosechar, romper las clulas, y el subsiguienteproceso de purificacin de la protena o del metabolito. En los procesos continuos amedida que se va produciendo el producto, ste se va procesando y de esta manerase requieren equipos ms pequeos.3- En las fermentaciones continuas se elimina el tiempo muerto entre corrida ycorrida que hay en los cultivos en batch, durante el cual el birreactor es preparado
para ser usado nuevamente (reparacin, lavado, esterilizacin, etc). Fermentacionescontinuas tienen menores tiempos perdidos porque una reaccin simple puede sermantenida por tiempos mas prolongados.4- El estado fisiolgico de las clulas durante la fermentacin continua es msuniforme, debido a ello los rendimientos del producto tienden a ser msconsistentes. En fermentaciones en batch, pequeas diferencias en el tiempo de lacosecha de clulas (timing), la cual coincide con el crecimiento en fase media ologartmica de crecimiento, pueden llevar a diferencias fisiolgicas significativas.
Las fermentaciones continuas pueden ser usadas para la produccin comercial deprotena celular simple, antibiticos, y solventes orgnicos.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
100/127
100
5/20/2018 bioenologia bacteriana
101/127
101
FIN
a) Batera de pequeos fermentadores de investigacin. b) fermentadoresindustriales
5/20/2018 bioenologia bacteriana
102/127
102
Produccin de vinagre
El vinagre es el producto resultante de la conversin del alcohol etlico en
5/20/2018 bioenologia bacteriana
103/127
103
El vinagre es el producto resultante de la conversin del alcohol etlico encido actico por la accin de las bacterias del cido actico que sonmiembros de los gneros Acetobacter y Gluconobacter. El vinagre puedeproducirse a partir de cualquier sustancia que contenga etanol. La materiaprima habitual es el vino, la cerveza o el zumo alcohlico de manzana. Lasbacterias del cido actico son aerbicas pero no oxidan completamente sus
dadores de electrones orgnicos hasta CO2 y agua, sino que lo hacen hastacido actico, son muy tolerantes a los cidos. El problema principal en laproduccin del vinagre consiste en garantizar una aireacin suficiente delmedio. Existen tres mtodos diferentes para la produccin del vinagre:mtodo de Orleans o de tinaja abierta, mtodo de goteo (vinagre rpido) ymtodo del burbujeo. La tinaja se denomina generador de vinagre
Diagrama de un generador de vinagre. Ellquido alcohlico se hace goteas a travs devirutas de madera y se deja que el aire pasedesde el fondo hacia arriba y a travs de lasvirutas. Las bacterias del cido actico sedesarrollan sobre las virutas de madera yconvierten el alcohol en cido actico. La
solucin de cido actico se acumula en unacmara colectora y se recicla a travs delgenerador hasta que se alcanza un contenidoen cido actico de al menos 4%, cantidadmnima para ser considerado vinagre.
Fermentacin del cido ctricoSe produce microbiolgicamente por fermentacin utilizando el hongo Aspergillus
5/20/2018 bioenologia bacteriana
104/127
104
p g p g p gniger. Este hongo excreta grandes cantidades de cido ctrico cuando el medio enel fermentador es deficiente en hierro, ya que el hongo superproduce el cidoctrico como agente quelante para apoderarse del hierro. El medio de partida parala obtencin del cido ctrico puede ser muy variado (almidn de papa, hidrolizadosde almidn, jarabe de glucosa procedente de almidn sacarizado, sacarosa, jarabede caa de azcar, melazas de caa de azcar y melazas de remolacha azucarera).Si se utiliza almidn, las amilasas formadas por el hongo la hidrolizan a azcares.Los azcares se catabolizan a travs de la va glicoltica y entran en el ciclo delcido ctrico, en el que tiene lugar la produccin de citrato.
El proceso es aerbico y se realiza en grandesfermentadores bien aireados. El cido ctrico se
produce de esta forma como un metabolito tpicosecundario. Durante la fase de crecimiento, lasacarosa se descompone en glucosa mas fructosay, en el momento que se alcanza la faseestacionaria, quedan grandes cantidades de estashexosas, que se convierten en cido ctrico paracontrarrestar la falta del hierro. El desarrollo deeste tipo de fermentacin aerbica industrial tubouna gran importancia histrica y esta tecnologa seaplic luego a otras fermentaciones de antibiticosimportantes como la penicilina.
Usos industriales de las levaduras
Las levaduras son los microorganismos ms importantes y ms ampliamente utilizados
5/20/2018 bioenologia bacteriana
105/127
105
en la industria. Se cultivan por sus propias clulas, por sus componentes celulares y porlos productos finales que producen durante la fermentacin alcohlica.
La produccin de clulas de levadura y la produccin de alcohol mediante levadura sondos procesos diferentes desde el punto de vista industrial en el hecho en que el primerorequiere la presencia de oxgeno para la mxima produccin de material celular,
mientras que la fermentacin alcohlica es anaerobia. Sin embargo en casi todos losprocesos industriales se utiliza una misma especie de levadura, o especies similares de lamisma, a saber , Saccharomyces cerevisiae.
Produccin industrial de clulas de levadura.
Se utilizan como agente estimulante del leudado de la masa antes de la coccin. La
5/20/2018 bioenologia bacteriana
106/127
106
glevadura que se utiliza en panadera o para fines alimentarios se cultiva en grandesfermentadores aireados, en un medio que contiene melazas como agente principal. Lamelazas contienen grandes cantidades de azcar que sirve como fuente de carbono yde energa y, adems contienen minerales, vitaminas y aminocidos que son utilizadospor la levadura, se aade adems fosfatos y sulfato de amonio como fuentes de
fsforo, azufre y nitrgeno. No es conveniente aadir todas las melazas al mismotiempo, ya que se producir un exceso de azcar y la levadura fermentar parte deste azcar en alcohol y CO2, en lugar de convertirlo en clulas de levadura. Lasmelazas se aaden a medida que el cultivo de levadura crece y consume este azcar.
Finalizado el perodo de crecimiento, lasclulas de levadura se recuperan delcaldo por centrifugacin y se lavan
mediante suspensin en agua y nuevacentrifugacin. La levadura de panaderase comercializa en forma de pastillascomo levadura prensada (mezcladacon otros aditivos como agentesemulsionantes, almidn, etc) o comopolvo seco (levadura seca activa) luegode mezclarla con aditivos y secarla lavaco.
Alcohol y bebidas alcohlicas
El uso de levadura seca en la produccin de bebidas alcohlicas es un proceso ancestral. Lamayor parte de los zumos de fruta sufren una fermentacin natural ocasionada por las
5/20/2018 bioenologia bacteriana
107/127
107
mayor parte de los zumos de fruta sufren una fermentacin natural ocasionada por laslevaduras silvestres que estn presentes en la fruta. A partir de estas fermentacionesnaturales se han seleccionado algunas levaduras para conseguir una produccin mscontrolada. Las bebidas alcohlicas ms importantes son el vino, producido por lafermentacin del zumo de fruta, la cerveza, producido por la fermentacin de cerealesmalteados, y las bebidas destiladas, producidas por concentracin, mediante destilacin,
del alcohol procedente de una fermentacin.Vinos: en general proceden de la uva. En los vinossecos se ha fermentado casi todos los azcares delzumo o mosto; en los vinos dulces, se deja partedel azcar, o bien se aade azcar despus de lafermentacin. En un vino fortificado se le agregaalgn licor despus de la fermentacin. En un vinoespumoso se encuentra presente el CO
2que surge
de una fermentacin final que realiza la levaduradirectamente dentro de la botella.
Bebidas alcohlicas destiladas
Whisky, destilado de bebidascon malta; brandy es eldestilado del vino; ron,
destilado de melazasfermentadas; vodka destiladode cereales de papafermentados.
Fabricacin comercial de vino
a) Equipo para transportar las uvashasta la bodega
5/20/2018 bioenologia bacteriana
108/127
108
hasta la bodega.
b) Tanques grandes donde tiene lugar lafermentacin principal del vino.
c) Barricas en las que tiene lugar el
proceso de envejecimiento.
Fabricacin de cerveza en una planta industrial.
a b) C ld d b d d l
5/20/2018 bioenologia bacteriana
109/127
109
a, b) Calderas de cobre donde elmosto se mezcla con el lpulo yluego se lo lleva a ebullicin.Desde la caldera, el lquido sepasa a grandes tanques defermentacin, en los que lalevadura fermenta la glucosa y dalugar a etanol ms CO2.
c) En cervezas tipo lager, lacerveza se almacena bariassemanas a baja temperatura entanques, donde se produce lasedimentacin de partculas,incluidas las clulas de levadura.d) La cerveza se filtra y sedeposita en tanques dealmacenamiento a partir de losque se envasa en barrilespequeos, en botellas o en latas.
5/20/2018 bioenologia bacteriana
110/127
110
Bibliografa:
Brock Biologa de los Microorganismos (10 Edicin)
Molecular Biotechnology Principles and Applications ofRecombinant DNA (Second Edition). Bernard R. Glickand Jack J. Pasternak.
Biotecnologa (Pedro F. Mateos Gonzlez)
http://nostoc.usual.es/sefin/MI/tema12MI.html
ANTIBIOTICOS
5/20/2018 bioenologia bacteriana
111/127
111
ANTIBIOTICOS
Descubrimiento de la PENICILINA
5/20/2018 bioenologia bacteriana
112/127
112
Penicillum notatum
Penicilina
De f i n i d a i n i c i a lm e n t e c om o a n t i sp t i co n a t u r a l d e e f e c t o s l e n t o s
Alexander Fleming
EL PREMIO NOBEL
5/20/2018 bioenologia bacteriana
113/127
113
FLEMING FLOREY CHAIN
PREMIO NOBEL DE MEDICINA Y FISIOLOGA EN 1945
5/20/2018 bioenologia bacteriana
114/127
114
Todos sabemos que la casualidad, la fortuna o el destino, como cadacual desee llamarlo, ha jugado un papel destacado en muchos de losgrandes descubrimientos cientficos. Esto es especialmente acertado enel caso de la Biologa, puesto que trata de los mecanismos de la vida,sobre la que existen multitud de lagunas en nuestro conocimiento.
A. Fleming
5/20/2018 bioenologia bacteriana
115/127
115
BIOTECNOLOGIA EN ARGENTINA
Cultivos biotecnolgicos en la Argentina
Reporte Anual 2008
Argentina es el segundo productor mas grande de cultivos
5/20/2018 bioenologia bacteriana
116/127
116
- Argentina es el segundo productor mas grande de cultivosbiotecnolgicos (despues de Estados Unidos), con un rea estimada de19,8 millones de hectareas para la cosecha 2007/08 (soja, algodn,maz).
Soja: 100%, variedad obtenida por biotecnologa (17millones de hect.)
Maz: 74%, variedad obtenida por biotecnologa
Algodn: 90%, variedad obtenida por biotecnologa
- Introduccin de la soja biotecnolgica en la Argentina en 1990.
- En Mayo del 2008 la Secretara Argentina de Agricultura , Ganadera,Pesca y Alimentos (SAGPyA) aprob la utilizacin de una variedad demaz con la suma de tres desarrollos biotecnolgicos en un mismoproducto, variedad HX+LL+RR (resitencia a Lepidoptera y tolerancia alos herbicidas Glufosinate y Glyphosate).
HX (Herculex I technology) proteccin contra insectosLL (Liberty Link technology) resistencia al glufosinato de amonio y RR(Rounup Ready technology) resistencia al glifosato; ambos herbicidas.
En la Argentina hay doce variedades biotecnolgicas aprobadas parasu produccin y comercializacin:
- 1 para soja (empresa Monsanto)
5/20/2018 bioenologia bacteriana
117/127
117
1 para soja (empresa Monsanto)
- 2 para algodn (Monsanto)
- 9 para maz ( Ciba-Geigi. AgrEvo, Monsanto, Novartis, Syngenta,
Dow/Pioneer y Pioneer.Soja
-En 1996 fue liberado el cultivo de soja tolerante a glifosato(Roundup Ready soybean). Este cultivo fue el primero introducido enla agricultura Argentina y permiti la incorporacin del cultivo doble
de soja (siguiendo al de trigo) en muchas reas donde solo seplantaba un cultivar.
- En Argentina la economa de la soja esta orientada casi totalmentea la exportacin: 2%, uso domestico, 30% exportado como grano yel 68% es procesado por la industria de los aceites de semilla.
-93% del aceite de semilla y 99% de los productos laterales(alimentos) son exportados.
En 2007 el gobierno simplific el proceso de aprobacin para eventosapilados, permitiendo aplicaciones para un cultivo transgnicocombinando dos eventos ya