ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

ผลของชนดและวธการใหสาร cryoprotectant ทมผลตอความมชวตของเนอเยอ

กระชาย และ ขมนชน เมอเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว Effect of Cryoprotectants and Methods of Application on Survival of

Boesenbergia rotunda (L.) and Curcuma longa Linn. Tissue Stored in Liquid Nitrogen

โดย นางสาว หทยรตน ประภสสร

ควบคมและอนมตโดย

____________________________________ วนท.......เดอน.................... พ.ศ. .......... ( ผชวยศาสตราจารย ดร. สนธชย จนทรเปรม ) ____________________________________ วนท.......เดอน.................... พ.ศ. .......... ( ดร. เสรมศร จนทรเปรม )

ผลของสาร cryoprotectant บางชนดทมตอความมชวตของเนอเยอกระชาย และ ขมนชน เมอเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว

นางสาว หทยรตน ประภสสร

บทคดยอ

ไดศกษาชนดและวธการใชสาร cryoprotectant ทสามารถรกษาความมชวตของเนอเยอกระชายและขมนชน เมอเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว โดยการนาเนอเยอของกระชายและขมนชน ทตดใหมขนาด 3x3 มลลเมตรจากสวนของเหงา มาทดสอบความมชวตเมอเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว โดยใชสาร cryoprotectant คอ mineral oil, air dry, air dry+mineral oil และ dimethylsulfoxide (DMSO) ความเขมขน 5%, 10%, 15% และ 20% ทเวลาตาง ๆ กน คอ 0, 30, 60, 90, และ 120 นาท พบวา การแชเนอเยอใน mineral oil 0.5 มลลลตร กอนการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลวนน ทาใหเนอเยอมอตราการรอดชวตสงขนเพยงเลกนอย เมอเทยบกบ control ทไมไดแชในไนโตรเจนเหลว สวนการทา air dry ทระยะเวลา 0, 30, 60, 90 และ 120 นาทกอนการเกบในไนโตรเจนเหลวนน พบวา ระยะเวลาการทา air dry ของกระชาย คอ 120 นาท สวนขมนชน คอ 60 นาท ทาใหสามารถรกษาความมชวตของเนอเยอพชไดมากทสด แตถาทา air dry แลวแชใน mineral oil 0.5 มลลลตร กอนการเกบในไนโตรเจนเหลวนน พบวา ระยะเวลาทเหมาะสม คอ กระชายใชระยะเวลา 120 นาท สวนขมนชนใชระยะเวลา 90 นาท ทาใหสามารถรกษาความมชวตของเนอเยอพชไดมากทสด และการแชใน DMSO ทความเขมขน 5%, 10%, 15% และ 20% ทเวลา 30 และ 60 นาทนน พบวา กระชายเมอแช DMSO ทความเขมขน 15% เปนเวลา 30 นาท สวนขมนชนเมอแช DMSO ความเขมขน 5% เปนเวลา 30 นาท สามารถรกษาความมชวตของเนอเยอไดมากทสด คาสาคญ : cryoprotectant, ไนโตรเจนเหลว, กระชาย, ขมนชน สาขาวชา : เทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร ปญหาพเศษ : ปรญญาตร ภาควชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : ผชวยศาสตราจารย ดร. สนธชย จนทรเปรม ปทพมพ : 2546 จานวนหนา : 32 หนา

Effect of cryoprotectants and methods of application on survival of Boesenbergia rotunda (Linn) Mansf. and Curcuma longa Linn.

tissue stored in liquid nitrogen

Miss Hathairat Prapassorn

Abstract The effect of some cryoprotectants and methods of application on survial of galingale and curcuma tissue stored in liquid nitrogen was studied. The tissues of under ground stem, 3x3 mm., were treated with cryoprotectants. The treatments were mineral oil, air dry, air dry+mineral oil and dimethylsulfoxide (DMSO) at the concentration of 5, 10, 15 and 20%. It was found that soaking the plant tissue in mineral oil before storing in liquid nitrogen did not maintain the survial of the cell. When the tissues were air dried for 120 min, resulting in highest survival rate of the tissue after storing in liquid nitrogen. When galingale and curcuma tissue were air dried for 120 and 90 min, respectively and then were soaked in mineral oil slowed the best result in cell survival. DMSO at the concentrations of 15% and 5% with the application time of 30 min resulted in an appropriate treatment for cryopreservation of galingale and curcuma tissue, respectively. Key word : cryoprotectant, liquid nitrogen, Boesenbergia rotunda (Linn) Mansf. and Curcuma longa Linn. Field : Agricultural biotechnology Degree : B.S.(Ag-Biotech), Program in Agricultural biotechnology, Kasetsart University Advisor : Assistant Professor Sontichai Chanprame Year : 2003 Pages : 32

คานยม

ปญหาพเศษฉบบน สาเรจลลวงไปไดดวยดโดยไดรบความกรณาอยางสงจาก ผชวยศาสตราจารย ดร.สนธชย จนทรเปรม อาจารยทปรกษาการทาปญหาพเศษ ทใหคาแนะนา ชวยเหลอ และดแลเปนอยางดตลอดระยะเวลาในการทาปญหาพเศษ และขอขอบพระคณสาหรบการใหคาปรกษา และตรวจแกปญหาพเศษฉบบนใหสาเรจลลวง และมความสมบรณยงขน จงขอขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.สนธชย จนทรเปรม เปนอยางสง ขอขอบพระคณเจาหนาท พ ๆ และเพอน ๆ ทหองปฏบตการภาควชาพชไรนา คณะเกษตร กาแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน ทกคน ทคอยใหความชวยเหลอในดานตาง ๆ จนปญหาพเศษสาเรจไดดวยด หทยรตน ประภสสร พฤศจกายน 2546

สารบญ

เรอง หนา

คานา 1 วตถประสงค, สถานททาการทดลอง, ระยะเวลาทาการทดลอง 2 ตรวจเอกสาร 3 อปกรณและวธการ 12 ผลการทดลอง 14 วจารณ 17 สรปผลการทดลอง 18 เอกสารอางอง 19 ภาคผนวก 22

คานา

ปจจบนสมนไพรกาลงเปนพชเศรษฐกจทสาคญอยางหนงของประเทศ ซงตลาดตางประเทศมความตองการสงมาก โดยเฉพาะอยางยงประเทศญปน สหรฐอเมรกาและประเทศตาง ๆ ในทวปยโรป เนองจากสมนไพรสวนมากไมสามารถทาการผลตไดในประเทศเหลาน อกทงคนสวนใหญนยมใชสมนไพรกนมากในลกษณะการใชเปนอาหารเสรมสขภาพ ใชสมนไพรเปนวตถดบเบองตนในการสกดสารเคมตาง ๆ เพอใชในการผลตยาแผนปจจบนตอไป ฉะนน ปจจบนจงมการสนบสนนสงเสรมใหมการปลกพชสมนไพรกนมากขน สาหรบในประเทศไทยนนมสมนไพรทสาคญหลายชนดทตลาดตางประเทศตองการ สมนไพรไทยจงเปนสนคาออกทสาคญกลมหนง อยางไรกด การผลตสมนไพรของไทยสวนใหญใชวธเกบหามาจากปาธรรมชาตมากกวาจะทาการเพาะปลกเปนการคา แตกมบางชนดทเพาะปลกกนมากและเปนทรจกกนดในทางการคา หนงในนนกคอ ขมน และกระชาย ดงนน ปรมาณการผลตและการควบคมคณภาพจงกระทาไดยาก ซงเปนอปสรรคตอการสงออกและการขยายตลาดการคาตางประเทศ ตลอดจนตลาดภายในประเทศ (สมภพ, 2539) ปญหาทสาคญอกอยางหนงกคอ ลกษณะอากาศในประเทศไทยมอณหภมและความชนสมพทธในอากาศสง ทาใหพชมความชนอยภายในสงทจดสมดล ทงสองปจจยทาใหพนธพชเสอมการเจรญเตบโตอยางรวดเรว การลดความชนภายในและการบรรจในภาชนะปดผนกกสามารถชะลอความเสอมลงไดบาง (ภาณ และคณะ, 2541) อกวธหนงกคอ การเกบรกษาพนธพชในสภาพปลอดเชอซงม 3 วธคอ 1) การเกบรกษาพนธพชในระยะสน โดยเกบรกษาไวในสภาพการเจรญเตบโตปกต 2) การเกบรกษาพนธพชในระยะปานกลางเปนวธการชะลอการเจรญเตบโตของเนอเยอพชโดยการเกบรกษาไวทอณหภมตา หรอเปลยนแปลงสตรอาหาร และ 3) การเกบรกษาพนธพชในระยะยาวโดยการหยดการเจรญเตบโต ซงจะเกบไวในไนโตรเจนเหลว ซงมอณหภมตาถง -196 องศาเซลเซยส หรอเรยกวา cryopreservation (Wilkins and Dodds, 1983) ซงสามารถหยดปฏกรยาทางเคม การยอยสลาย และการแบงเซลลโดยสนเชง เมอละลายเกลดนาแขงออกเนอเยอพชทเกบกยงคงมชวตดงเดม (ภาณ และคณะ, 2541) ในปจจบนมการศกษาวธการเกบรกษาเนอเยอพชโดยวธ cryopreservation กบเนอเยอพชหลายชนด เชน การศกษา cryoprotectant เพอการเกบรกษาเชอพนธของกลวยไมสกลหวายซอนยาพนธ BOM 17 (ปยามาศ, 2539) วธการเกบรกษาละอองเรณระกาในไนโตรเจนเหลว (รมยรญ, 2542) วธการเหลานอาจนามาปรบใชกบพชในวงศขงได

วตถประสงค

เพอใหทราบถงชนดและวธการใชสาร cryoprotectant ทสามารถรกษาความมชวตของเซลลกระชายและขมนชนทเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว

สถานททาการทดลอง

หองปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอ ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร กาแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน

ระยะเวลาทาการทดลอง

ตงแต เมษายน 2546 ถง กรกฎาคม 2546

ตรวจเอกสาร

กระชาย

ชอวทยาศาสตร Boesenbergia pandurata (Roxb.)Schltr. อยในวงศ Zingiberaceae มชอทองถนแตกตางกนออกไปคอ กะแอน, ระแอน (ภาคเหนอ) ขงทราย (มหาสารคาม) วานพระอาทตย (กรงเทพ) จป, ซฟ (ฉาน-แมฮองสอน) เปาซอเราะ, เปาะส (กระเหรยง-แมฮองสอน) (สมสข, 2534)

ลกษณะทางพฤกษศาสตร ราก เปนรากฝอย ลาตน กระชายเปนพชลมลกขนาดเลกสงประมาณ 2 ฟตเศษ มลาตนใตดนเรยกวา เหงา (rhizome) แตละเหงามสนาตาลแกมเทาจนถงสนาตาลแกมสม เหงาใตดนนแตกออกเปนกระจกจานวนมากโดยมลกษณะอวบนา ตรงกลางเหงามลกษณะพองมากกวาหวทาย เนอในมสเหลองออน มกลนหอมเฉพาะตว ใบ เปนใบเดยว มขนาดใหญ มความยาวมากกวาความกวางประมาณ 2 เทา ใบมรปไข ปลายใบแหลม ใบออกสลบกนแตอยในระนาบเดยวกน ใบมสเขยวออน ทองใบมสแดง เนอใบละเอยด กาบใบมสแดงหรอสแดงปนสเขยวออน ดอก ออกเปนชอทสวนยอด ออกแทรกอยระหวางกาบใบ ชอดอกมใบประดบเรยงทะแยงกน ดอกบานทละดอกโดยดอกทอยทางปลายชอจะบานกอน ดอกมสขาวหรอสชมพออนหรอสมวงแดง ดอกมลกษณะเปนถง กลบเลยงและกลบดอกจะเชอมตดกน เกสรตวผม 5-6 อน แตจะมเพยงอนเดยวเทานนทไมเปนหมน ผล เปนแบบผลแหง เมอแกแลวไมแตก

พนธกระชาย มอย 3 ชนด คอ กระชายเหลอง กระชายดาและกระชายแดง (รงรตน, 2535) ขอมลทางวทยาศาสตร ในเหงากระชายมสารสาคญคอ นามนหอมระเหย (essential oil) แตพบวามเปนจานวนนอย มรายงานวาไดปรมาณนามนหอมระเหยประมาณ 0.08 เปอเซนต ในนามนหอมระเหยประกอบดวยสารเคมหลายชนด เชน 1,5-cineol, boesenbergin A, dl-pinostrobin, camphor (สมสข, 2534) flavonaid, และ chromene เปนตน (รงรตน, 2535) การทดลองพบวา สารจากเหงากระชายมประสทธภาพในการยบยงการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย ไดผลกบเชอแบคทเรยมากกวาเชอรา เชอแบคทเรยทถกยบยงคอ Bacillus subtitis, แบคทเรยในลาไส และแบคทเรยททาใหเกดหนอง นามนหอมระเหยมฤทธในการขบลม ชวยใหกระเพาะและลาไสเคลอนไหว ชวยใหเจรญอาหารดวย กรมวทยาศาสตรการแพทยศกษาและรายงานวาไมมพษเฉยบพลนในหนถบจกร (สมสข, 2534) คณสมบตและสรรพคณ 1. ใชเปนยาแกทองรวง ทองเดน ทองอด ทองเฟอ แกปวดทอง แกบด 2. เปนยาบารงหวใจ แกใจสน บารงกาลง (นจศร และ พยอม, 2534) 3. ยารกษารดสดวงทวาร ขบปสสาวะ 4. เปนยาแกไอ 5. เปนยาอายวฒนะ (สมภพ, 2539) ขมนชน ชอวทยาศาสตร Curcuma longa Linn. อยในวงศ Zingiberaceae มชอทองถนแตกตางกบออกไปคอ ขมน (ทวไป), ขมนแกง, ขมนหยวก, ขมนหว (เชยงใหม) ขมน, หมน (ภาคใต) ตายอ (กะเหรยง-กาแพงเพชร) สะยอ (กะเหรยง-แมฮองสอน)

ลกษณะทางพฤกษศาสตร ขมนเปนพชลมลกขามปและมหวใตดนเชนเดยวกบขงและขา ลาตน มลาตนใตดนทเรยกวา เหงา (rhizome) ซงประกอบดวยแงงทมลกษณะตาง ๆ กนคอ แงงแม (mother rhizome) หรอแงงหลกมลกษณะกลม จะเปนทแตกของแขนงทสองและทสามตอไป (secondary และ tertiary branches) แขนงทแตกออกมานถามลกษณะกลมจะเรยกวาหวหรอ corm และถามลกษณะยาวคลายนวมอเรยกวา นว (finger) เปนทเกดของรากฝอย บรเวณแงงของหวและนวจะมตาอยทวไป มสคอนขางออน ปลายแหลม ซงตอไปจะเจรญเปนลาตนและใบ สวนลาตนทปรากฏใหเหนเหนอพนดนเปนลาตนเทยมสงประมาณ 50-70 เซนตเมตร ประกอบดวยกาบใบซอนทบกนเปนชน ๆ จากโคนถงปลาย ใบ เปนใบเดยว แผนใบมลกษณะยาวร ปลายแหลม ยาวประมาณ 30-45 เซนตเมตร และกวางประมาณ 10-20 เซนตเมตร มเสนกลางใบเหนไดชดเจนทางดานลางของใบ ใบเรยงแบบสลบและอยกนเปนกลม เมอโตเตมทจะมใบประมาณ 6-10 ใบ ดอก เกดเปนชอ ชอดอกจะเกดบนลาตนทมใบหรอโผลขนมาจากใจกลางของกลมใบ ชอดอกมรปรางแบบทรงกระบอกหรอรป cone ยาวประมาณ 10-13 เซนตเมตร กวางประมาณ 5 เซนตเมตร แตปกตแลวดอกขมนจะเปนหมนเชนเดยวกบขง ดงนน จงมกไมตดผลและเมลด (สมสข, 2534) ปลายชอดอกสชมพ กลบดอกสขาวประเหลอง (นจศร และ พยอม, 2534)

ขอมลทางวทยาศาสตร

ขมนชน ประกอบดวย volatile oil 3-4% สารสเหลอง 0.3-5.4% เปนสารจาพวก diferuloyl methane มชอวา curcumin, monodesmethoxy curcumin, didesmethoxy curcumin (รงรตน, 2535) เหงาขมนจะมสารประกอบสาคญ เปนนามนหอมระเหย (essential oil) ประมาณ 2-6 เปอรเซนต เปนนามนสเหลอง มสารหลายชนดคอ turmerone, zingiberene, borneol เปนตน และในเหงายงมสารสเหลองสม ททาใหขมนมสชอวา Curcumin มประมาณ 1.8-5.4 เปอรเซนต จากการทดลองพบวา ขมนมฤทธในการฆาเชอแบคทเรย เชอรา ลดการอกเสบ และ

มฤทธในการขบนาด นามนหอมระเหยในขมนทาใหมสรรพคณรกษาอาการปวดทอง ทองอด แนนจกเสยดได การตรวจสอบพษเฉยบพลนของขมนในสตวทดลองพบวาไมมพษ (สมสข, 2534) และยงมฤทธในการปองกนการเกดแผลในกระเพาะอาหาร ทาใหเกดการกระตนการหลง mucin ออกมาเคลอบกระเพาะอาหารไดดวย (สานกงานคณะกรรมการสาธารณสขมลฐาน, 2533) คณสมบตและสรรพคณ 1. ใชเปนสวนผสมในยาลดกรด ขบลม แกปวดทอง แกทองอด แกทองเฟอ 2. แกอาการเกรงของกลามเนอ ทาใหการเคลอนตวของลาไสนอยลง 3. เปนยาเจรญอาหาร 4. เปนยาขบนาเหลอง 5. ใชรกษารอบเดอนไมปกต 6. นาทไดจากหวขมนใชรกษาโรคผวหนง ผนคนตาง ๆ ใชทาแผลสด ใชทาลายพยาธ 7. ใชพอกแกปวดขอ 8. นามนทกลนไดจากหวทแหงเอามาใชเปนยาฆาจลนทรยได และกาจดแมลงตาง ๆ ไดด 9. ทาสผสมอาหาร ใชเปนสยอมผาและเครองสาอาง 10. ใชเปนวตถดบในการผลตผลตภณฑอาหารและเครองเทศชนดอน เชน ซอส 11. เปนเครองเทศใชปรงแตงกลนและรสชาตของอาหาร (รงรตน, 2540) การเกบรกษาเนอเยอพชในหลอดทดลองแบบตางๆ การเกบรกษาพนธหรอสายพนธพชมความสาคญอยางยงตองานดานการปรบปรงพนธพช ซงโดยปกตแลวสวนใหญจะตองเกบไวในรปของเมลดพนธ และจาเปนจะตองมการปลกอยางตอเนองเพอใหไดเมลดใหมทยงคงมชวตเพอการเกบรกษาไวเปนระยะเวลานาน ๆ ทาใหประสบปญหาในพชบางชนดทตดเมลดไดนอยหรอไมตดเมลดเลย บางชนดเมลดมอายสนไมสามารถเกบไวไดนานถงแมจะเกบไวในทมอณหภมและความชนสมพทธตาแลวกตาม ขณะเดยวกนอาจเกดการสญหายของพนธกรรมพช เสยงตอการกลายพนธหรอการผสมขามพนธและภยธรรมชาต รวมทงยงเปนการสนเปลองทงเนอท คาใชจาย และแรงงานในการปลกและเกบรกษาอกดวย ดงนนจงไดมผคดคนและพฒนาวธการเกบรกษาพนธพชในสภาพการเพาะเลยงในหลอดทดลอง ซง

สามารถรกษาความมชวตไวไดนาน และเกบรกษาไดจากสวนตาง ๆ ของตนพชไมวาจะเปน เมลด ยอด ราก คพภะ แคลลส เซลล หรอโปรโตพลาส โดยเกบไวได 2 รปแบบ คอ 1. ลดการเจรญเตบโตใหชาลง (slow growth) เนอเยอพชบางชนดและในบางกรณ มอตราการเจรญเตบโตอยางชา ๆ แมจะไดรบสภาพหรอเงอนไขตาง ๆ ในการเพาะเลยงอยางเตมท อยางไรกตาม เนอเยอพชทเพาะเลยงสวนใหญตองการเงอนไขพเศษทงดานธาตอาหารและปจจยสภาพแวดลอมเพอใหมอตราการเจรญเตบโตทชาลง วธการทนยมใชกนมากคอ การลดอณหภมขณะเพาะเลยงรวมกบการใสสารบางชนดทไปจากดการเจรญเตบโต หรอไปยบยงกระบวนการออสโมซสของเนอเยอ และในบางกรณอาจใชวธลด หรอไมใสธาตอาหารทจาเปนตอการเจรญเตบโตบางชนด เชนเดยวกบการลดปรมาณกาซออกซเจน 2. การเกบไวในทมอณหภมตามาก ๆ (cryopreservation) เนองจากการเจรญเตบโตของเนอเยอพชตองใชพลงงาน และตองมการเปลยนถายอาหารอยางสมาเสมอ ดงนน จะลดการเจรญเตบโตของเนอเยอพชจนกระทงไมมเลย (มคาเปนศนย) หรอกลาวอกนยหนงใหมการพกตวในลกษณะคลายกบการพกตวของเมลดไมใหงอก เปนสงทเปนไปไมได ทางเดยวททาไดคอ หนวงเหนยวระยะเวลาในการเจรญเตบโตใหยาวนานมากทสด โดยการเกบไวในทมอณหภมตามาก ๆ เชนท -196 องศาเซลเซยส ในไนโตรเจนเหลว (liquid nitrogen) ขนตอนการเกบในไนโตรเจนเหลวมดงน 2.1 การทา pregrowth เนอเยอพชทจะนามาเกบรกษาจะตองผานกระบวนการเลยงในทมอณหภมตากวาปกต (<25 องศาเซลเซยส) และจดสภาพการเพาะเลยงทจาเพาะนานประมาณ 2-3 วน ขนกบระบบการเพาะเลยงและชนดของพช เพอกระตนใหมการปรบตวทนตอสภาพการแขงตวขณะเกบรกษาตอไป 2.2 การเตมสาร cryopropectant กอนการเกบรกษาในสภาพทมอณหภมตามาก ๆ อยางนอย 1 ชวโมงจะตองเตมสารพวก cryoprotectant (ตารางภาคผนวกท 1) ลงในอาหารทเพาะเลยงเพอใหเซลลหรอเนอเยอปรบสภาพ permeability และจดเยอกแขง (freezing point) ซงจะทาใหทนทานตอการแขงตว (freezing) และการละลายตว (thawing) หลงการเกบรกษาโดยไมมผลกระทบตอการพฒนาของเซลลหรอเนอเยอ ทนยมใชมากทสดคอ dimethylsulfoxide (DMSO)

และ glycerol โดยเฉพาะอยางยง DMSO นนสามารถใชเดยว ๆ ไดผลด สวน glecerol นนจาเปนตองใชรวมกบ DMSO หรอสารประกอบอน ๆ เชน sorbitol, sucrose, glucose, proline หรอ polyethylene glycol (PEG) จงจะไดผลด (รงสฤษด, 2540) และเพอปองกนเซลลตอ osmotic shooks ขอแนะนาคอ ควรเตมสารปองกนความเยน (cryoprotectant) เพมขนทละนอยเปนชวงเวลา 30-60 นาท การใช glycerol อาจใชชวงเวลานยาวนานกวา เพราะวาการแทรกซมเขาไปในเซลลพชไดชา (Wither and Street,1977 อางโดย คานญ, 2542) ในขณะทใส DMSO เนอเยอพชควรอยอณหภมประมาณ 0 องศาเซลเซยส เพอลดพษของสารปองกนความเยน (Nag and Street, 1975; Bajaj, 1978; Withers,1979 อางโดย คานญ, 2542) 2.3 การทาใหแขงตวอยางชา ๆ (slow freezing) เมออณหภมของการเกบรกษาลดตาลงกวา 0 องศาเซลเซยส จนถงประมาณ -100 องศาเซลเซยส จะมการเปลยนแปลงอยางมาก เกดเปนผลกนาแขงทงภายในและภายนอกเซลล โดยเฉพาะอยางยงไซโตพลาสซมภายในเซลลจะแขงตวและเพมปรมาตรขน ดงนน การลดอณหภมลงอยางชา ๆ เปนการชวยไมใหเซลลไดรบอนตรายจากการเกดผลกนาแขง ขณะเดยวกนกชวยดงนาออกจากเซลลไปในตว ในกรณทมการแขงตวอยางรวดเรวจะทาใหสญเสยนาออกมาไดนอย เมอเกดผลกนาแขงและมปรมาตรเพมขนจะทาใหเซลลไดรบความเสยหาย อยางไรกตามถาเซลลสญเสยนามากเกนไปอาจเกดความเสยหายไดเชนกน ดงนนอตราการอยรอดของเซลลจงขนกบสมดลระหวางอตราการลดลงของอณหภมอยางชา ๆ กบอตราการสญเสยนาออกไปจากเซลลดวย และอตราการอยรอดดงกลาวขนกบชนดของเนอเยอทเกบรกษา 2.4 การเกบไวในสภาพแขงตว (frozen culture หรอ freeze storage) หลงจากการทาใหเซลลแขงตวลงอยางชา ๆ แลว ตองยายไปเกบไวในทเยนจด (ตากวา -100 องศาเซลเซยส) เพอปองกนการเกดผลกนาแขงภายในเซลลอกครงหนง ซงจะทาใหเซลลเกดการเปลยนแปลงและไดรบอนตรายจนกระทงตายได ในทางปฏบตเพอความสะดวกจงนยมเกบไวในไนโตรเจนเหลวท -196 องศาเซลเซยส หรอในไอของไนโตรเจนเหลว (liquid nitrogen vapour) ท -150 องศาเซลเซยส (รงสฤษด, 2540) ซงการเกบในสภาพแขงตวนน อาจทาไดโดยวธการแชแขงแหง (dry-freezing method) ซงเนอเยอพชทถกเอานาออกโดยการทาใหแหงในตอบ หรอภายใตสภาพสญญากาศ มความตานทานตออนตรายทเกดจากความเยนได เปนททราบแลววาเมลดแหงสามารถมชวตรอดไดภายใตการแชแขงทอณหภมตามาก แตเมอเมลดไดดดนาเขาไปแลวมนจะ

ออนแอตอสภาพแชแขง เซลลทเสยนาภายใตสญญากาศทาใหอวยวะของพชทแชแขง ณ อณหภม -196 องศาเซลเซยส มชวตรอดไดด ความเหมาะสมสาหรบการดงนาออกซงอาจแตกตางกนในแตละสปชสและชนสวนของเนอเยอพช (คานญ, 2542) 2.5 การละลายเนอเยอทแขงตว (thawing) เมอตองการนาเนอเยอทเกบรกษาไวในไนโตรเจนเหลวมาใช ตองละลายผลกนาแขงทเกาะตวออกมาอยางรวดเรวเพอไมใหเซลลไดรบอนตราย โดยใสลงในนาอนหรออาหารเพาะเลยงทมอณหภมประมาณ 37-40 องศาเซลเซยส อยางไรกตามในกรณทเกดการตกผลกของนาแขงภายในเซลล จะทาใหการละลายเนอเยอทแขงตวนทาไดชา และเกดความเสยหายตอเซลลนนได (รงสฤษด, 2540) หลงจากการแชแขงทอณหภม -196 องศาเซลเซยส เมอศกษาโครงสรางแลวพบวา อวยวะทเจรญเปนตนพชไดรบอนตรายในระดบเซลลทแตกตางกนในระหวางการทาใหเยนและการละลาย อนตรายทเกดขนอาจทาอนตรายตอ embryonic tissue ทงหมดหรออาจทาอนตรายในตาแหนงของเนอเยอเจรญเพยงบางสวน ในกรณแรกอาจงอกไปเปนตนพชทเกดมาจากเซลลทไมไดมาจากเนอเยอเจรญปลายยอด จงชใหเหนวา เนอเยอเจรญทงหมดไมไดเปนสงจาเปนสาหรบการเจรญเปนตนพชทสมบรณได (ประศาสตร, 2536) เรวต และ ปยะ (2537) ไดทดลองนายอดออยพนธเกษตรศาสตร 50 มาเกบในไนโตรเจนเหลว โดยกอนทนาไปเกบในไนโตรเจนเหลว ไดนายอดออยมาแชในสาร cryoprotectant PVS II ทระยะเวลาตาง ๆ พบวา สารละลาย PVS II ทใชมผลในการชะงกการเจรญของยอดออย ถาแชในสารละลายนานเกน 2 ชวโมง แตไมทาใหยอดออยตาย และในการทดลองน สารละลาย PVS II ไมสามารถใชในการเกบรกษายอดออยในไนโตรเจนเหลว เนองจากยอดออยทผานการเกบในไนโตรเจนเหลวไมสามารถเจรญตอไปได เมอนากลบมาเลยงบนอาหารปกต ปยามาศ (2539) ทดสอบผลของ dimethylsulfoxide ( DMSO) ความเขมขน 0, 5, 10, และ15% ทมตอ protocom like bodys (plbs) ของหวายซอนยาพนธ BOM 17 พบวา การแช DMSO เปนเวลา 80 นาทนน plbs มอตราการรอดชวตมากทสดเมอใช DMSO เขมขน 5% สวนการใช DMSO เขมขน 10% รวมกบ glycerol เขมขน 0, 5, และ 10%, ethylene glycol เขมขน 0,

5, และ 10% หรอซโครสเขมขน 0.3 และ 0.4 โมลาร แช plbs นาน 80 นาท พบวาการเพมความเขมขนของสารละลายทาใหอตราการรอดชวตของ plbs ลดลง การแช plbs ในสารละลายซงประกอบดวย DMSO เขมขน 10%, glecerol เขมขน10%, ethylene glycol เขมขน 5% และซโครสเขมขน 0.3 โมลาร ทถกทาใหมความเขมขนเปน 70, 80, 90 และ 100% เปนเวลา 80 นาทนน พบวา สารละลายเขมขน 70%ทาให plbs รอดชวตมากทสด ภาณ และคณะ (2541) ไดศกษาเทคนคและวธการเกบรกษาเมลดพนธพชผกทสาคญทางเศรษฐกจ ในสภาพเยนยงยวดในไนโตรเจนเหลว (อณหภม-196 องศาเซลเซยส) โดยทาการปรบความชนในเมลดใหตากวาปกตเลกนอยขนอยกบชนดพช บรรจเมลดลงในหลอดททนตอสภาพใตจดเยอกแขง แลวจงเกบในไนโตรเจนเหลว และไมไดใชวธการพเศษในการละลายนาแขง เมลดตาง ๆ ทนามาทดสอบมเปอรเซนตการรอดชวตตากวาเมลดเปรยบเทยบ 5-17% ไดแก แมงลก พรก มะเขอเทศ ขาวโพดหวาน กระเจยบเขยว แตงกวา กวางตง ผกคะนา และถวฝกยาว โดยทถวฝกยาวไดทาการศกษาหาวธการเกบเฉพาะสวนคพภะ โดยใหเมลดดดซมนาทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง แลวจงแยกคพภะออกจากเมลดกอนบรรจลงในถงไนโตรเจนเหลว พบวา สวนของคพภะสามารถเกบรกษาไดเปนเวลานานเทาทมไนโตรเจนเหลวอย รมยรญ (2542) ทดลองศกษาวธการเกบรกษาละอองเรณระกา 4 วธ คอ 1) เกบทอณหภม 0 องศาเซลเซยส 2) การดดความชน 30 นาท กอนการเกบในไนโตรเจนเหลว 3) การผานความเยน -20 องศาเซลเซยส กอนเกบในไนโตรเจนเหลว และ 4) การเกบในไนโตรเจนเหลวโดยตรง พบวาละอองเรณทเกบรกษาไวยงคงความสามารถในการปฏสนธและตดผลหลงจากถายเรณกบสละเนนวง แตการเกบละอองเรณวธท 1 มการตดผลนอยทสด Seibert (1976) ไดทดลองนาปลายยอดของคารเนชน (Dianthus caryophyllus) มาทาการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลวทอณหภม -196 องศาเซลเซยส เปนเวลานาน 60 วน แลวนามาทาการละลาย พบวา ปลายยอดของ Carnation มอตราการรอดชวตสงถง 33% โดยสงเกตจากการพฒนาเปนแคลลส การเจรญเตบโตหรอการกลบมามสเขยวของเนอเยอ Katano และคณะ (1983) รายงานการเกบรกษาเนอเยอปลายยอดของแอปเปลในไนโตรเจนเหลว โดยการลดอณหภมลง 2.5 องศาเซลเซยส ในชวงเวลา 5 นาท พบวา การลด

อณหภมลงตากวา -10 องศาเซลเซยส โดยไมม cryoprotectant กอนใสลงในไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 4 นาท ทาใหปลายยอดแอปเปลยงคงมชวตและสามารถนามาเลยงเพมปรมาณยอดไดจานวนมากเชนเดยวกบปลายยอดทไมผานการเกบ Matsumoto และคณะ (1995) รายงานการเกบรกษาเนอเยอปลายยอดของวาซาบในไนโตรเจนเหลว โดยนาเนอเยอปลายยอดมาเลยงไวในอาหาร 1/2MS ทเตมนาตาล 0.3 โมลาร อณหภม 20 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 วน หลงจากนนนาเนอเยอปลายยอดมาหม (encapsulated) ดวย alginate นาไปแชในไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 1 ชวโมง แลวนามาทาการละลาย พบวา encapsulated-vitrified meristems จะกลบมาเจรญเตบโตไดภายใน 3 วน และมอตราเฉลยการเกดยอดใหมประมาณ 95 %

อปกรณและวธการ

วธการ

1. นาเหงากระชายและขมนชน มาตดใหเปนชนเลก ๆ ขนาด 3x3 มลลเมตร ประมาณ 150 ชน เพอใหเพยงพอกบการทดลองทง 4 การทดลอง โดยทาการทดลองละ 3 ซา และอก 1 control

2. นาแตละชนไปชงนาหนก พรอมกบบนทกผลไว และนาไปใสในหลอด โดยใส 1 ชนตอ

1 หลอด 3. ใสสารลงในหลอดทมชนพชอย หลอดละ 0.5 มลลลตร ตามการทดลองตาง ๆ ดงน

3.1 เตม mineral oil ปรมาตร 0.5 มลลลตร ลงในหลอดกระชายและขมนชน ตวอยางละ 4 หลอด โดยให 1 ใน 4 หลอดเปนหลอด control 3.2 นาชนพชทงกระชายและขมนชนมาทา air dry ในต larminar air flow นาน 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท ตามลาดบ โดยใชชวงเวลาละ 4 หลอดตอชนดของพช และจดใหแตละชวงเวลาม 1 ใน 4 หลอดเปนหลอด control 3.3 นาชนพชทงกระชายและขมนชนมาทา air dry ในต larminar air flow และเตม mineral oil ทระยะเวลา 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท ตามลาดบ โดยใชชวงเวลาละ 4 หลอดตอชนดของพช และจดใหแตละชวงเวลามหลอด 1 ใน 4 หลอดเปนหลอด control 3.4 เตม dimethylsulfoxide (DMSO) ทความเขมขน 5%, 10%, 15% และ 20% ตามลาดบ ลงในหลอดกระชายและขมนชน แชไวในระยะเวลา 30 และ 60 นาท ในทกความเขมขนของ DMSO และแตละชวงเวลาของแตละความเขมขนใหมตวอยางละ 4 หลอด และให 1 ใน 4 หลอดเปนหลอด control

4. นาทกหลอดทเตรยมไวทง 4 การทดลอง ลงไปแชในไนโตรเจนเหลว เปนเวลา 1 คน ยกเวนหลอดทเปน control ไมตองแชในไนโตรเจนเหลว แตเกบในทมดแทน

5. เมอครบเวลา 1 คนแลว นาทกหลอดในทกการทดลอง ออกมาจากไนโตรเจนเหลว แลวนาไปแชนาอนทอณหภม 35 องศาเซลเซยส ใน water bath จากนน ดดสารทมอยในหลอดทกหลอดออก รวมทงหลอด control ทเกบในทมดดวย ใหเหลอแตชนพชเทานนในหลอด

6. ทดสอบ TTC-test ซงเปนการตรวจวาเนอเยอพชสามารถอยรอดไดหรอไมมากนอย

เพยงใด โดยเซลลจะทาปฏกรยากบสารเคม ผลจากปฏกรยาจะเกดเปนสแดงของ formazen โดยวดจากสแดง ถาสแดงมาก แสดงวาเนอเยอมชวตรอดมาก ถาสแดงนอย แสดงวาเนอเยอมชวตรอดนอย แตถาเกดสขาว แสดงวาเซลลตาย โดยเตม TTC (2,3,5 tetrazoliumchloride) 0.6% ใน K.K2

phosphat buffer 0.05 M pH 7.4 ปรมาตร 1 มลลลตร ลงในหลอดทกหลอดรวมทงหลอด control ดวย แลวเกบในทมดขามคน

7. ดด TTC ออกแลวเตม ethanol 95% ปรมาตร 1 มลลลตร ลงไปแทน ethanol จะละลาย

สแดงออกมา 8. จากนนนาทกหลอดไป incubate ทใน hot air oven อณหภม 80 องศาเซลเซยส เปน

เวลา 1 ชวโมง 9. นาทกหลอดมาวดคาการดดกลนแสงท 530 นาโนเมตร โดยใช spectrophotomrter

เพอวดเปอรเซนตการรอดชวตของเนอเยอ แลวบนทกคา

สรปผลการทดลอง

ชนสวนของเนอเยอ กระชาย และ ขมนชน ทผานการแชใน mineral oil กอนการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว มเปอรเซนตการรอดชวตเพมขนเพยงเลกนอย เมอเทยบกบ control ซงไมไดแชในไนโตรเจนเหลว การทา air dry กบเนอเยอของกระชาย และ ขมนชน เปนเวลา 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท กอนการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลวนน ชวงเวลาทดทสดททาใหเนอเยอมเปอรเซนตการรอดชวตมากทสด คอ 120 นาท สวนขมนชน คอ 60 นาท สวนการทา air dry 0, 30, 60, 90 และ 120 นาทแลวแชใน mineral oil กอนการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว ระยะเวลาทดทสด คอ กระชายใชระยะเวลา air dry 120 นาท สวนขมนชนใชระยะเวลา air dry 90 นาท แลวจงแชใน mineral oil และการนาเนอเยอกระชาย และ ขมนชน แชใน DMSO ความเขมขน 5%, 10%, 15% และ 20% เปนระยะเวลา 30 และ 60 นาทนน กระชายใช DMSO ความเขมขน 15% แชนาน 30 นาท สวนขมนชนใช DMSO ความเขมขน 5% แชนาน 30 นาท ทาใหเนอเยอมเปอรเซนตการรอดชวตสงทสด

เอกสารอางอง

คานญ กาญจนภม. 2542. การเพาะเลยงเนอเยอพช. บรษท ดานสทธาการพมพ จากด, กรงเทพฯ.

นจศร เรองรงษ และ พยอม ตนตวฒน. 2534. พชสมนไพร. สานกพมพโอเดยนสโตร,

กรงเทพฯ. น. 49, 93-94 ประศาสตร เกอมณ. 2536. เทคนคการเพาะเลยงเนอเยอพช. O.S.พรนตง เฮาส, กรงเทพฯ ปยามาศ อศวะววฒน. 2539. การศกษา cryoprotectant เพอการเกบรกษาเชอพนธของ

หวายซอนยาพนธ BOM 17. ปญหาพเศษปรญญาตร. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 13 น.

ภาณ ทองพานก, มณฑา วงศมณโรจน, บวหลวง จอยปอย, และประเทอง ดอนสมไพร. 2541.

การเกบรกษาเมลดพนธพชผกและไมผลทสาคญทางเศรษฐกจ ภายใตสภาพเยนยงยวด. รายงานผลการวจยประจาป ฝายปฏบตการวจยและเรอนปลกพชทดลอง สถาบนวจยและพฒนาแหงมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน, นครปฐม. 10 น.

รมยรญ ปยารมย. 2542. วธการเกบรกษาละอองเรณระกา (Salacca wallichiana Mart.)

ในไนโตรเจนเหลว. ปญหาพเศษปรญญาตร. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 13 น.

รงสฤษด กาวตะ. 2540. การเพาะเลยงเนอเยอพช : หลกการและเทคนค. ภาควชาพชไร

นา คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. รงรตน เหลองนทเทพ. 2535. พชเครองเทศและสมนไพร. ตารา-เอกสารวชาการ ฉบบท 59.

ภาคพฒนาตาราและเอกสารวชาการ หนวยศกษานเทศก กรมการฝกหดคร. โรงพมพการศาสนา กรมศาสนา, กรงเทพฯ. น. 49-53

รงรตน เหลองนทเทพ. 2540. พชเครองเทศและสมนไพร. O.S.พรนตง เฮาส, กรงเทพฯ. เรวต เลศฤทยโยธน และ ปยะ กตตภาดากล. 2537. การศกษาระยะเวลาในการใชสาร

cryoprotectant เพอเกบรกษายอดออยในไนโตรเจนเหลว. รายงานผลการวจยประจาป.ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 12น.

สมภพ ประธานธรารกษ. 2539. อนกรมวธานพชสมนไพร. ภาควชาเภสชพฤกษศาสตร คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล. สานกพมพโอเดยนสโตร, กรงเทพฯ. สมสข มจฉาชพ. 2534. พชสมนไพร. ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลย

บรพา. สานกพมพแพรพทยา, กรงเทพฯ. น. 4, 35. สานกงานคณะกรรมการสาธารณสขมลฐาน. 2533. สมนไพรในงานสาธารณสขมลฐาน

สาหรบบคลากรสาธารณสข. โรงพมพองคการสงเคราะหทหารผานศก, กรงเทพฯ. น. 50-52, 66-68

Katano, M., A. Ishihara and A. Sakai. 1983. Survival of dormant apple shoot tips after

immersion in liquid nitrogen. Hort. Sci. 18 : 707-708.

Matsumoto, T., A.Sakai, and K. Yamada. 1994. Cryopreservation of in vitro-grown apical meristem of wasabi ( Wasabi japonica) by vitrification and subsequent high plant regeneration. Plant Cell Rep. 13 : 442-446. Matsumato, T., A. Sakai, C. Takahashi and K. yamada. 1995. Cryopreservation of in

vitro grown apical meristem of wasabi (Wasabi japonica) by encapsulation- vitrification method. Cryo-Letters. 16 : 189-196.

Rall, WF. 1987. Factor affecting the survival of mouse embryo cryopreserved by vitrification. Cryobiology. 24 : 367-402.

Seibert, M. 1976, Shoot initiation from canation shoot apices frozen to -196 C. Science

191 : 1178-1179. Towill L.E. 1991. Cryopreservation, pp. 41-70. In H. John Dodds ed. In Vitro Methods for

Conservation of Plant Genetic Resources. International Potato Center Lima,Peru Wilkins, C.P. and J.H. Dodds. 1983. Tissue culture conservation of woody species,

p.113-136. In : J.H. Dodds, ed. Tissue Culture of Trees. The AVI Publishing Company, Westport, Connecticus.

ภาคผนวก

ตารางภาคผนวกท 1 สารเคมทนามาใชเปน cryoprotectant และปรมาณทใช

ปรมาณทใช สารเคม

( % )

( M ) Dimethylsulfoxide (DMSO) 2.5-10.0 0.5

Glycerol 1.0-10.0 0.5 Proline 10.0 1.0

Sucrose - 1.0 Glucose 4.0-8.0 -

Ethylene glycol 2.5 - Polyethylene glycol (PEG) m.w. 6000 10.0 -

ตารางภาคผนวกท 2 ขอมลคาการดดกลนแสงของเยอเยอกระชาย เมอแชใน mineral oil treatment นาหนกเนอเยอ

(g) คาการดดกลนแสง (absorbance :

abs) abs/นาหนก

เฉลย

1 - - - 2 - - - 3 0.074 1.6510 22.31

22.31

control 0.030 0.7964 26.54 26.54 ตารางภาคผนวกท 3 ขอมลคาการดดกลนแสงของเนอเยอกระชาย เมอทา air dry

treatment นาหนกเนอเยอ

(g) คาการดดกลนแสง (absorbance :

abs) abs/นาหนก

เฉลย

0 นาท 1

0.077

0.5074

6.59

2 0.053 0.2926 5.52 3 0.045 0.2605 5.78

5.96

control 0.060 1.8268 30.44 30.44 30 นาท

1

0.064

0.3846

6.00 2 0.063 0.6400 10.15 3 0.048 0.3812 7.94

8.03

control 0.049 0.6713 13.70 13.70 60 นาท

1

0.052

0.3501

6.73 2 0.056 0.3459 6.17 3 0.044 0.3761 8.54

7.14

control 0.053 0.6421 12.11 12.11 90 นาท

1

0.053

0.4153

7.83 2 0.050 0.3269 6.53 3 0.060 0.3362 5.60

6.65

control 0.049 0.4424 9.02 9.02 120 นาท

1 -

-

-

2 - - - 3 0.057 0.3811 6.68

6.68

control 0.051 0.2965 5.51 5.81 ตารางภาคผนวกท 4 ขอมลคาการดดกลนแสงของเนอเยอกระชาย เมอทา air dry + mineral oil

treatment นาหนกเนอเยอ

(g) คาการดดกลนแสง (absorbance :

abs) abs/นาหนก

เฉลย

0 นาท 1

0.043

0.9327

21.69

2 0.044 0.7018 15.95 3 0.058 1.8450 31.81

23.15

control 0.025 1.3669 54.67 54.67 30 นาท

1

0.053

1.4636

27.61 2 0.034 0.9414 27.68 3 0.067 0.8263 12.33

22.54

control 0.018 0.3019 16.77 16.77 60 นาท

1

0.023

1.9545

84.97 2 0.042 1.7866 42.53 3 0.041 0.3539 8.63

45.37

control 0.036 1.3500 37.50 37.50 90 นาท

1

0.036

0.6990

19.41 2 0.036 0.7177 19.93 3 0.035 0.7896 22.56

20.63

control 0.024 0.5085 21.18 21.18 120 นาท

1 -

-

-

2 0.048 1.5258 31.78 3 - - -

31.78

control 0.063 0.3297 5.23 5.23 ตารางภาคผนวกท 5 ขอมลคาการดดกลนแสงของเนอเยอกระชาย เมอแชใน DMSO

treatment นาหนกเนอเยอ

(g) คาการดดกลนแสง (absorbance :

abs) abs/นาหนก

เฉลย

DMSO 5% 30 นาท

1

-

-

-

2 - - - 3 0.051 0.3909 7.66

7.66

control 0.033 0.8358 25.32 25.32 DMSO 5%

60 นาท 1

0.041

0.2664

6.49 2 0.036 0.2128 5.91 3 0.039 0.3286 8.42

6.94

control 0.037 1.0929 29.53 29.53 DMSO10%

30 นาท 1

-

-

-

2 - - - 3 - - -

-

control 0.033 0.7433 22.52 22.52 DMSO10%

60 นาท 1

0.057

0.2731

4.79 2 0.040 0.2732 6.83 3 - - -

5.81

control 0.037 1.0988 29.69 29.69

Treatment

นาหนกเนอเยอ (g)

คาการดดกลนแสง (absorbance : abs)

abs/ นาหนก

เฉลย

DMSO15% 30 นาท

1

0.030

0.2925

9.75

2 0.034 1.4808 43.55 3 0.018 0.3099 17.21

23.50

control 0.056 0.5769 10.30 10.30 DMSO15%

60 นาท 1

0.024

0.2443

10.17 2 0.051 0.3501 6.68 3 0.040 0.2454 6.13

7.72

control 0.023 0.2330 10.13 10.13 DMSO20%

30 นาท 1

0.040

0.3121

7.80 2 0.034 0.3387 9.96 3 0.036 0.2950 8.19

8.65

control 0.043 0.9755 22.68 22.68 DMSO20%

60 นาท 1

0.037

0.3015

8.14 2 0.043 0.2421 5.63 3 0.024 0.1964 8.18

7.31

control 0.024 0.2488 10.36 10.36 ตารางภาคผนวกท 6 ขอมลคาการดดกลนแสงของเนอเยอขมนชน เมอแชใน mineral oil

ตารางภาคผนวกท 7 ขอมลคาการดดกลนแสงของเนอเยอขมนชน เมอทา air dry

treatment นาหนกเนอเยอ (g)

คาการดดกลนแสง ( absorbance : abs)

abs/นาหนก

เฉลย

1 0.042 3.3113 78.84 2 0.057 2.6128 45.83 3 - - -

62.33

control 0.053 2.6351 49.71 49.71

treatment นาหนกเนอเยอ

(g) คาการดดกลนแสง (absorbance :

abs) abs/นาหนก

เฉลย

0 นาท 1

0.040

2.3341

58.35

2 - - - 3 0.061 2.7092 44.41

51.38

control 0.047 2.6351 56.06 56.06 30 นาท

1

0.070

2.8341

40.48 2 0.033 2.6587 80.56 3 0.046 2.2141 48.13

56.39

control 0.071 3.0103 42.39 42.39 60 นาท

1

0.034

2.7668

81.37 2 0.039 3.0103 77.18 3 0.032 2.9597 92.49

83.68

control 0.071 2.8721 40.45 40.45 90 นาท

1

0.033

3.0103

91.22 2 0.038 2.7668 72.81 3 0.036 2.5710 71.41

78.48

control 0.040 2.1807 54.51 54.51 120 นาท

1

0.040

3.0103

75.25 2 - - - 3 0.043 2.1727 50.52

62.88

control 0.040 2.0505 51.26 51.26 ตารางภาคผนวกท 8 ขอมลคาการดดกลนแสงของเนอเยอขมนชน เมอทา air dry + mineral oil

treatment นาหนกเนอเยอ

(g) คาการดดกลนแสง (absorbance :

abs) abs/นาหนก

เฉลย

0 นาท 1

0.088

2.8721

32.63

2 0.068 2.8721 42.23 3 0.084 2.0107 23.93

32.63

control 0.039 2.5518 65.43 65.43 30 นาท

1

0.055

2.5914

47.11 2 0.034 3.0679 90.23 3 0.054 0.0103 55.74

64.36

control 0.063 3.1351 49.76 49.76 60 นาท

1

0.067

3.1351

46.79 2 0.039 2.9138 74.71 3 0.044 1.6300 37.04

52.84

control 0.042 2.2507 53.58 53.58 90 นาท

1 -

-

-

2 - - - 3 0.046 2.8341 61.61

61.61

control 0.087 2.1423 24.62 24.62 120 นาท

1

0.055

2.5331

46.05 2 0.090 2.5518 28.35 3 0.052 1.2041 23.15

32.51

control 0.073 2.4507 33.57 33.57 ตารางภาคผนวกท 9 ขอมลคาการดดกลนแสงของเนอเยอขมนชน เมอแชใน DMSO

treatment นาหนกเนอเยอ

(g) คาการดดกลนแสง (absorbance :

abs) abs/นาหนก

เฉลย

DMSO 5% 30 นาท

1

0.072

2.1072

29.26 2 0.061 2.7092 44.41 3 0.075 2.0217 26.95

33.54

control 0.057 2.2054 38.69 38.69 DMSO 5%

60 นาท 1

0.052

2.8341

54.50 2 0.061 1.1844 19.41 3 0.084 2.8341 33.73

35.88

control 0.062 2.6587 42.88 42.88 DMSO10%

30 นาท 1

-

-

-

2 - - - 3 - - -

-

control 0.073 2.8721 39.34 39.34 DMSO10%

60 นาท 1

-

-

-

2 - - - 3 - - -

-

control 0.054 1.9641 36.37 36.37

treatment นาหนกเนอเยอ (g)

คาการดดกลนแสง (absorbance : abs)

abs/นาหนก

เฉลย

DMSO15% 30 นาท

1

0.076

1.0234

13.46 2 - - - 3 - - -

13.46

control 0.067 1.0741 16.03 16.03 DMSO15%

60 นาท 1

0.067

3.3113

49.42 2 0.091 1.0929 12.00 3 0.077 2.6531 34.22

31.88

control 0.050 2.2507 45.01 45.01 DMSO20%

30 นาท 1

0.050

2.7092

54.18 2 0.061 1.0166 16.66 3 - - -

35.42

control 0.078 3.3113 42.45 42.45 DMSO20%

60 นาท 1

0.102

3.0679

30.07 2 - - - 3 - - -

30.07

control 0.065 2.2054 33.92 33.92 การเตรยมสาร cryoprotectant

การเตรยมสาร DMSO 5%, 10%, 15% และ 20% อยางละ 100 มลลลตร เตรยมดงน โดยการเตม DMSO 5, 10, 15 และ 20 มลลลตร ลงใน flask อยางละ flask แลวเตมนาลงไปใหมปรมาตร 100 มลลลตร การเตรยมสารในการทา TTC-test การเตรยม TTC 0.6% ใน K.K2 phosphate buffer 0.05 M pH 7.34 ปรมาตร 500 มลลลตร โดยใช K2HPO4 ซงมมวลโมเลกล 174.18 g/mole และ KH2PO4 ซงมมวลโมเลกล 136.09 g/mole เตรยมอยางละ 300 มลลลตร จะได KH2PO4 : 1 M มนาหนก 136.09 กรม 0.05 M มนาหนก 6.8045 กรม 1000 มลลลตร ตองชงสาร 6.8045 กรม 300 มลลลตร ตองชงสาร 2.04138 กรม K2HPO4 : 1 M มนาหนก 174.18 กรม 0.05 M มนาหนก 8.709 กรม 1000 มลลลตร ตองชงสาร 8.709 กรม 300 มลลลตร ตองชงสาร 2.6127 กรม ดงนน จงตองชงสารทง 2 ชนด ตามทคานวณได มาเตมนาอยางละ 300 มลลลตร เทสวนหนงลงในอกสวนหนง โดยปรบ pH ใหได 7.34 แลวนาสารทไดมา 500 มลลลตร เตม TTC 0.6% โดยใช TTC : 100 มลลลตร เตม 0.6 กรม 500 มลลลตร เตม 3 กรม แลวละลายใหเขากนกจะไดสารทจะนามาทดสอบ TTC-test ได