Caractérisation de chitinases chez les nématodes

Parole de JuniorDr Muriel Nirina MAEDER

Suisse

Introduction

Second composant naturel le plus abondant après la cellulose (1x1013kg/an)

Polysaccharide composé de résidus N-acétylglucosamine (GlcNAc) formant une chaîne

Constituant principal de la carapace des insectes, des crustacés et de la paroi des champignons

Chitine

GlcNAc

Introduction

Enzymes spécifiques qui coupent la chitine

Impliquées dans les mécanismes de défense, de nutrition ou de morphogenèse (en particulier les mues) ainsi que dans la transmission de certains parasites

Tous les organismes possèdent des chitinases

Chitinases

Introduction

2 familles principales: Famille * et Famille *

Famille * retrouvée chez tous les organismes

Famille * jusqu’à présent spécifique aux plantes et retrouvées dernièrement également chez certaines bactéries

Chitinases

Les chitinases et les animaux

Chitinases trouvées chez tous les organismes et donc chez tous les animaux

Etudes ciblées sur les chitinases présentes chez les nématodes

Nématodes

Appelés aussi vers ronds

Cosmopolites

Vers libres et vers parasites

4 mues obligatoires: œuf → L1 → L2 → L3 → L4 → adulte

Nématodes

Nématodes parasites

Qu’est-ce qu’un parasite? un parasite est un organisme vivant qui se nourrit, s'abrite et se reproduit en établissant une interaction durable avec un hôte

Qu’est-ce qu’un vecteur?un vecteur est un organisme qui ne provoque pas lui-même une maladie mais qui disperse l’infection en transportant les agents pathogènes d'un hôte à l'autre

Les nématodes peuvent être des parasites de plantes, d’insectes, d’animaux y compris l’Homme

Nématodes parasites

Pertes économiques importantes imputables aux nématodes parasites

Dégâts aux récoltes estimés chaque année à plus de 10%

Nématodes parasites et l’Homme

Baisse de rendement notamment au niveau de la viande et du lait pour les animaux de rente

Responsables des maladies les plus invalidantes pour l’Homme

Caenorhabditis elegans

Nématode libre: Caenorhabditis elegans

Ver utilisé comme modèle biologique: cycle de vie court, multiplication rapide, simplicité anatomique

Ver utilisé comme modèle génétique: organisme totalement séquencé

Ascaris suum

Nématode parasite: Ascaris suum

Hôte définitif: cochon

Différents organes touchés: intestin, foie, système respiratoire

1 million d’œufs pondus par jour

Heterorhabditis megidis

Ver entomopathogène avec pour hôte définitif le charançon

Utilisation dans la lutte biologique

Commercialement exploité

Nématode parasite: Heterorhabditis megidis

Brugia malayi et Brugia pahangi

Hôte définitif: HommeHôte intermédiaire: moustique

Responsable de l’éléphantiasis (filariose lymphatique)

120 millions de personnes infectées chaque année dans 80 pays

Nématodes parasites: Brugia malayiBrugia pahangi (modèle de laboratoire)

Présence des chitinases chez les nématodes?

La présence des chitinases a déjà été démontrée chez différents nématodes (C. elegans et certaines filaires)

Les chitinases ont déjà fait l’objet de plusieurs thèses du laboratoire de parasitologie

Les chitinases de certains nématodes parasites ont été proposées comme cible pour des vaccins

Hypothèses

1. Des chitinases sont présentes chez C. elegans et doivent avoir des rôles différents que le seul supposé dans la transmission des nématodes parasites par les vecteurs

2. Des chitinases spécifiques des plantes sont – elles présentes chez C. elegans? si oui, il s'agit d'une nouvelle découverte

Objectifs

Rechercher les chitinases de la Famille * et de la Famille * chez le nématode libre appelé C. elegans et caractériser les chitinases de la Famille *, spécifiques aux plantes

Identifier les chitinases de la Famille * chez les vers parasites Ascaris suum, Heterorhabditis megidis,Brugia malayi et B. pahangi

Méthodologie

Base de données (traitement par ordinateur des informations disponibles)

Comparaison des séquences disponibles

Clonage pGEM-T

Clonage pPIC/pGEXProtéine recombinante Digestion

Séquençage

PurificationAmorces PCR

Méthodologie Où se trouve l’ADN?

Ver Cellule

ChromosomeADN de nématodes

Résultats

40 gènes de chitinases trouvés pour C. elegans

34 gènes pour la Famille *

6 gènes pour la Famille *(jusqu’à maintenant spécifique aux plantes)

Analyse des bases de données

Résultats Identification de la présence des chitinases de la Famille *

chez C. elegans

Présence confirméepar séquençage

Résultats Identification de la présence des chitinases de la Famille *

chez A. suum

Présence confirmée

Confirmation de ces résultats par une publication

(Geng, 2002)

Résultats Identification de la présence de chitinase de la Famille * chez

H. megidis

Présence confirméepar séquençage

Résultats Identification de la présence de chitinases de la Famille * chez

B. pahangi et B. malayi

Présence confirméepar séquençage

Résultats Séquençage

H.megidis KRDLAAFFAHAIQETRENNNYLYT--ALPDQEASNCFYRGGFYNWFEGGPSSNFLNPETP||||||||||||||| ||||||||--||||||||||||||||||||||||||||||||||

C.elegans KRDLAAFFAHAIQETGENNNYLYT--ALPDQEASNCFYRGGFYNWFEGGPSSNFLNPETP

H.megidis GHSPTDGNSCTSAGRYCSASDQITFFYPCSNSTISNPAAPYKGCYFGRGGIQISYNYNY|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

C.elegans GHSPTDGNSCTSAGRYCSASDQITFFYPCSNSTISNPAAPYKGCYFGRGGIQISYNYNY

B.malayi : KRDVATFFAHALQETGENDASVY--NNTDLTLEQAHECFYRGGFYNWFERGPNSTFLSPAA-|||||||||||||||||||||||--||||||||||||||||||||||||||||||||||||-

C.elegans : KRDVATFFAHALQETGENDASVY--NNTDLTLEQAHECFYRGGFYNWFERGPNSTFLSPAA-

B.malayi : -PGFSPFDGKRCTDEGRYCKSDPIIDFWYPCNSDIESHSDKEYHKGYYFGRGALQLSWNYNY-||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||

C.elegans : -PGFSPFDGKRCTDEGRYCKSDPIIDFWYPCNSDIESHSDKEYHKGCYFGRGALQLSWNYNY

Résultats

Alignements conservés pour les chitinases de la Famille *

Séquences de nématodes plus longues que celles de plantes ou bactérie

Différences dans les résidus conservés

Synthèse des résultats

Recherche informations dans les bases de données

Dessin des amorces

Optimisation des conditions de PCR

Clonage des gènes d’intérêt

Séquençage

Expression des protéines recombinantes(système bactérien et de levure) à poursuivre

Alignement des séquences

Conclusion1. Vue que des chitinases sont présentes chez C. elegans, les

chitinases doivent avoir des rôles différents

→ La présence confirmée de nombreuses chitinases souligne que les chitinases sont des molécules importantes pour des fonctions diverses

2. Si des chitinases de la Famille * sont effectivement présentes chez C. elegans, il s'agit d'une nouvelle découverte

→ La présence de ces chitinases a été confirmée et élargie chez C. elegans. Ces chitinases sont aussi présentes chez A. suum, H. megidis, B. malayi et B. pahangi

3. Les chitinases de la Famille * deviennent ainsi de nouvelles cibles possibles pour l’élaboration de vaccin contre les nématodes parasites

Perspectives

→Acquisition des chitinases de la Famille * chez les nématodes par transfert génétique horizontal (HGT)?

→ Présence des chitinases de la Famille * chez les vers parasites de plantes? Expression chez les deux sexes? Dans tous les stades de développement?

→ Système d’expression des chitinases de la Famille *?Rôles et fonctions de ces chitinases? Implication dans la pathogénicité?

Merci!