Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Caracterización de la respuesta aCaracterización de la respuesta aestrés osmótico en Lactobacillusestrés osmótico en Lactobacillus

casei : rol del sistema proteolíticocasei : rol del sistema proteolítico

Piuri, Mariana

2003

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Piuri, Mariana. (2003). Caracterización de la respuesta a estrés osmótico en Lactobacillus casei :rol del sistema proteolítico. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3599_Piuri.pdf

Cita tipo Chicago:Piuri, Mariana. "Caracterización de la respuesta a estrés osmótico en Lactobacillus casei : rol delsistema proteolítico". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. 2003. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3599_Piuri.pdf

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Tesis para optar por el título de Doctorde la Universidad de Buenos Aires

Caracterización de la respuesta aestrés osmótico en Lactobacillus casei:

Rol del sistema proteolítico

Autor: Lic. Mariana Piuri

Director: Dra. Carmen Sanchez Rivas

Realizado en

Laboratorio de Microbiología, Departamento de Química BiológicaFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

2003

Dra. CARMEN SANCHEZ RIVASPROFESORWADO

DEPTO.cuach mmmFCEyN UBA

A mispadres, por su apoyo incondicionalA Martin, porque “yoya no soy uno, sino la mitad de dos”

Agradecimientos

A la Dra Carmen SanchezRivaspor haberme brindado la oportunidad de realizar esta tesisen su laboratorio y darme un lugar importante en su grupo de trabajo. Tambiénquiero agradecerlesu ayuda y sus aportes durante la realización, escritura y corrección de este trabajo.

A la Dra Ruzal (a San) por todos estos años de trabajo compartido, por haber participadoactivamente en miformación, por no haber escatimado nunca sus conocimientosy por el contrarioincentivarme a crecer profesionalmente cada dia más. Porque estos años compartidos de trabajojunto a ellafueron unplacer y no una obligación.

Al CONICETpor haberfinanciado la beca que mepermitió realizar esta tesis.

A mis compañeros del laboratorio, que partieron en busca de nuevas oportunidades, aAdriana, Marina, Claudia y principalmente a Alejandro por todas las veces que escuchó conatención mis resultados, por su aporte de ideas y sobretodo por haber sido un excelentecompañero. Ya las nuevas generaciones que se suman, Hernán, Mariano y Flor, por la pacienciaen mis dias de locura y de miles de experimentos a la vez.

A Luis Scolaro, Viviana Castilla, Nelly Candurra, a Cybele (por las charlas en losintervalos de TP) y la Sra. Isabel del laboratorio de Virología, por hacer que mis horas en lamateriafueran placenteras y por recibirme siempre con una sonrisa.

A las vecinas del laboratorio de Genética Bacteriana, Nancy, Julia y Jimena, por las vecesque me sacaron de un apuro y por hacerme sentir acompañada en el inmenso cuarto piso.

A Ia gente del laboratorio de Biología Molecular, Paula Portela,, Silvia Rossi y a la Dra.Silvia Moreno por haber sido una excelente docente y transmitir una inmensa claridad paraanalizar resultados. AIDr. Cánepa, Cecilia Varoney a Mariela por su ayuda en los ensayos de GelShift.

Al Dr. Juan Fló, Fernanda y Rubén, del laboratorio de Inmunoquímica, por su excelentedisposición a contestar preguntas en materia de anticuerpos.

A todos los integrantes de mifamilia porque son mi soporte silencioso, mi cable a tierra ypor apoyarme aunque sigan sin entender muy bien qué hago durante todas esas horas en ellaboratorio.

A los Edreira, por hacerme sentir una más de lafamilia y por todo el cariño que me brindansiempre.

A mis amigas del alma, Cecy y Cynthia porque (aunque se los diga poco) son sumamenteimportantes en mi vida.

A mis amigos de la Facultad, Gonzalo, Guillermo, Facundo, Sandra, Mariano, Vanesay alos chiquitos, Mariel, Male y el recientemente incorporado Fede; porque son lo mejor que me dejóel paso por Exactas. Y ojalá, a pesar de los caminos separados que tomemos, podamosencontrarnos en algún punto siempre.

A Martus, por la alegría que trajo al hogar y su compañía durante la escritura de estaTesis.

Resumen

Resumen

Lactobacillus casei es una bacteria que desde larga data ha sido empleada por el hombre enprocesos fermentativos para la producción de quesos y chacinados y en los últimos años haadquirido gran relevancia por su uso como probiótico. Durante los procesos mencionados y en eltracto gastrointestinal, Lb casei es sometida a diferentes tipos de estrés, entre ellos el estrésosmótico. El objetivo de este trabajo fue estudiar las modificaciones genéticas, fisiológicas yestructurales de este microorganismo cuando es sometido a un estrés hipersalino, priorizando elestudio de las actividades relacionadas con los procesos de elaboración de alimentos.En esta tesis se demostró que además de los solutos osmocompatibles generales glicín betaína ycamitina, di y tripétidos pueden aumentar la osmotolerancia de Lb casei. Además de estimular elcrecimiento en un medio hiperosmótico lograron restituir el grado de superenrollamiento del ADN(recuperación del linking number) de modo análogo a la camitina. La construcción y el análisis deuna mutante deficiente en el transporte de di-tripéptidos, dtpT, mostró que aquellos péptidos que noson transportados eficientemente no ejercen osmoprotección, mientras que sí lo ejercen aquellosque son transportados de manera eficiente.Así mismo, se describió la pérdida de la represión ejercida por péptidos en las actividades de PrtP yPer , dos de las enzimas principales del sistema proteolítico y principales proveedoras de péptidosen el extracelular e intracelular respectivamente. En el caso de PrtP, se pudo demostrar que elaumento de la actividad se debe a una pérdida de la represión a nivel transcripcional. Lademostración de la interacción de CodY (que había sido postulado como el efector de la represiónpor péptidos de varios componentes del sistema proteolítico en Lactococcus Iactis) de Lb casei conla región promotora de prtP apunta a que ésta proteína reguladora mediaría la pérdida de represiónen medio hiperosmótico. En un medio carente de péptidos y en alta sal, en cambio, la elevadaactividad de PrtP se debe a un aumento de la velocidad máxima de la enzima durante el crecimientoen alta sal y no a un aumento de la actividad transcripcional. Dado que PrtP se encuentra anclada ala pared celular, la modificación de la actividad de la enzima podría ser consecuencia demodificaciones en el entorno de la proteína. Se describió una sensibilidad diferencial a la lisis y aantibióticos que actúan a nivel de envolturas en células provenientes de un medio con alta sal. Elaumento de la sensibilidad a la lisis se debe directamente a alteraciones de la pared, ya que elmismo efecto se observó al emplear paredes purificadas. El análisis de las fotografias demicroscopía electrónica reveló un aumento en el tamaño de las células crecidas en alta sal y clarasdiferencias en la pared de la misma. De estos resultados, se desprende la posibilidad de emplear elprecrecimiento en NaCl como un método para facilitar la lisis de un microorganismo quenormalmente es resistente a la misma.Los resultados obtenidos en esta tesis, contribuyen al conocimiento de la fisiología de bacteriaslácticas en presencia de un efector de estrés que normalmente se encuentra durante los procesos enlos que estos microorganismos participan.

Palabras claves: Lactobacillus casei, estrés osmótico, sistema proteolítico, PrtP, Per, DtpT,CodY, pared celular.

Abstract

Since long time, Laclobacillus casei has been used for the production of Cheese and sausages. lnand the last few years they acquired relevance because of its use as a probiotic. During thefermentation process and in the gastrointestinal tract, Lb casei is subjected to a wide range ofstressors and particularly to osmotic stress. The aim of this work was the analysis of the genetic,physiological and stmctural changes in this microorganism when it grows in a hyperosmotic salinecondition, mainly the study of those activities related to the process involved in food production.ln this thesis, it was demonstrated that as well as generally osmocompatible solutes, camithine andglycin betaine, di and tripeptides can improve osmotolerance in Lb. casei. Besides their role instimulation of growth in high osmolarity media, they were able to re-establish the degree of DNAsupercoil (recovery of linking number) as camithine did. The construction and analysis of a mutant,deT, unable to transport di-tripeptides, enable to show that those inefficiently transported peptidescan not exert an osmoprotective role, in distinction from those efficiently transported.The lost of the repression exerted by peptides in PrtP and Per activities, two of the key enzymesof the proteolytic system and main providers of peptides was described. The lost of repression forPrtP took place at the transcriptional level. The interactíon of CodY protein of Lb casei with thepromoter region of prtP 'gene was demonstrated, this result suggests that this regulator proteinwould be involved in the lost of repression by peptides in a hyperosmotic media. In a hypersalinemedia in the absence of peptides, the high levels of PrtP activity were essentially through anincrease of apparent Vmaxinstead of an increment of transcriptional activity. Since PrtP is anchoredto the cell wall, the enzyme activity could be related to changes in the environment of the protein.The differences in the sensitivity to lysis and antibiotics, that exert their effect on the cell envelopein cells grown in the presence of salt, were indicative of these variations. The high level of lysis ofthe cells grown in NaCl, was also a direct consequence of changes in the cell wall; the same effectwas observed when purified cell walls were used instead of whole cells. The analysis of electronicmicroscopy photographs revealed and increase in the size of cells grown in high salt as well as cleardifferences in the cell wall. These results raises, that pregrth in hyperosmotic media could beused as an efficient method to improve lysis of this resistant to lysis bacteria.The results of this study, increase the knowledge about lactic acid bacteria physiology in thepresence of NaCl, a stress effector that is usually found in fermentative process.

Keywords: Lactobacillus casei, osmotic stress, proteolytic system, PrtP, Per, DtpT, CodY, cellwall.

Indice

Introducción

Introducción Parte l

l- Bacterias lácticas l2- Lacio/Jacillus 23- Laclobacillus casei 34-Aplicaciones biotecnológicas de Bacterias Lácticas 35- Sistema proteolítico de Bacterias l activas 45.1- Proteínasas de Bacterias Lácticas 5

5.1.1- Propiedades genéticas y bioquímicas de las proteínasas 55.] .2- Especificidad de sustrato 7

5.2- Sistemas de transporte de aminoácidos y péptidos 75.2. l -Sistema de transporte de aminoácidos 85.2.2-Sistema de transporte de di/tripéptidos (DtpT) 85.2.3- Sistema de transporte de oligopéptidos (Opp) 95.2.4- Sistema de transporte de di/tripéptidos (DtpP) 9

5.3- Peptidasas de bacterias lácticas lO5.3.l- Aminopeptidasas generales (PepN y PepC) 105.3.2- Endopeptidasas (PepO y PepF) 115.3.3- Glutamil aminopeptidasa (PepA) l l5.3.4- Tripeptidasas (PepT) I l5.3.5- Dipeptidasas (PepV) l l

5.4- Peptidasas involucradas en la hidrólisis de péptidos que contienen prolina ............................ l l5.4. 1-Aminopeptidasa (PepP) 125.4.2- Prolidasa (PepQ) 125.4.3- Proliliminopeptidasa (Pepl) y prolinasa (PepR) 125.4.4- X-prolil-dipeptidil-aminopeptidasa(Per) 135.4.5- Carboxipeptidasas 13

5.5- Localización de las peptidasas 135.6- El rol de las peptidasas en el desarrollo de aroma y sabor de productos lácteos ..................... 135.7- Regulación de la expresión de los componentes del sistema prntmlífím 14

5.7.1- Identificación de la señal y del represor en Lactococcus Iactis ......................................... l7

Introducción Parte II

2.Respuestas a estrés en Bacterias Acido Lácticas (BAI .) 202.1. La respuesta a estrés osmótico en Bacterias Lácticas, Lactococcus Iactis y Lactobacillusplantarrlm 22

2.1 .l .Respuesta fisiológica 232.1.2.Regulacióno 25

2.2. Identificación de otras fiJnciones involucrados en la respuesta osmótica en Lactococcus 1ac1i5272.3. Modificaciones en el grado de superenrrollamiento del ADN en respuesta a estrés ............... 27

lntrodución Parte lll

3. Modificaciones de la envoltura bacteriana durante el crecimiento en alta sal. .......................303.1.Envoltura bacteriana 30

3.1.1.Membrana-r' a 31

Indice

1.2. Pared celular1.2.1. Peptidoglicano1.2.2. Acidos teicoicos y ácidos teicurónicos1.2.3. Biosíntesis del peptidoglicano

3.3.3.3.

Materiales y Métodos

l.

N

3.Comparación del grado de superenrollamiento del ADN.

4.

5.

Medios de cultivo

. Técnicas moleculares

Cepas y transformaciones1.1.Cepas y plásmidos y utilizados.1.2.0btención y transformación de células competentes de Escherichia coli .................................1.3.Obtención y transformación de células competentes de Lactobacillus por electroporación....

313l3334

12383939

402.1. Técnicas moleculares básicas2.2. Extracción de ADN de Laclobacillus2.3. Extracción de ARN de Laclobacillus2.4.Aislamiento de ADN plasmídico2.6.0ligonucleótidos usados como cebadores2.5.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).2.7. RT-PCR semicuantitativa2.8.Southem Blot2.9. Northern Blm2.10.0btención de una mutante dtp'l' en Lb. case! ATCC 3932.] l.Pun'ficación de CodY(his(,) de B. sublilis.2.12. Electroforesis de proteínas2.13. Ensayos de Western Blot2.14. lnmunoprecipitación de CodY de Lb casei2.15. Ensayos de Gel shifl y Western Gel shift

3.]. Cálculo de la diferencia en el linking number entre dos muestras3.] .2.Determinación del ALken geles de agarosa con clnmqnina

3.2. Preparación de ADN plasmídico y determinación del ALkDeterminación de actividades ' "°4.1. Actividad PrtP

4‘

4.2. ActividadPer y PepI4.3. Actividad PepQ4.4. Actividad proteolítica por degradación de [3-caseínaEnsayos de pared5.1.Sensibilidad a mutanolisina de células enteras5.2. Obtención de paredes por tratamiento con SDS

5.2.1. Sensibilidad a mutanolisina de paredes purificadas

Apéndice Medios de Cultivo

Medio MRSMedio Luna-Bertani (LB)Medio leche r' ‘ "

4o4o4o414243434444454647474748

49494950

<151525253

¡1545454

¡6565656

Indice

Soluciones 56bel. 56beII 56

Medio CDM para Lactobacillus 57

Resultados

CAPÍTULO IRol de péptidos en la osmoprotección en Lactobacillus casei ATCC 393 .................................. ..58

1.1 Crecimiento de Lb casei ATCC 393 en medio hipprncmótirn 581.2 Compuestos osmoprotectores en la peptona de carne 60

1.2.1. Rol de la camitina en la osmoprotección. 621.3 Rol de los péptidos en la osmoprotección 621.4 La leche como proveedora de péptidos para la osmoprotección 63

CAPITULO llModificaciones de las actividades de los componentes del sistema proteolítico durante elcrecimiento en alta sal 66

2.1. Actividades de peptidasas y proteasas durante el crecimiento en un medio hiperosmótico 662.2 Actividades de Per y PrtP luego del choque nsmótim 692.3 Efecto de la fiJente de carbono en la actividad de PrtP 71

CAPITULO IIIRegulación de componentes del sistema proteolítico durante el crecimiento en alta sal ............ 73

3.1 Amplificación parcial de los genes per, pepQ y prlP de Lb. casei ATCC 393. .................... 733.2. Análisis transcripcional de prtl’ 773.3. Análisis de los niveles de PrtP. y cálculo de parámetros cinéfims 8]

CAPITULO lVModificaciones del grado de superenrollamiento del ADN durante el crecimiento en alta sal...84

1.1 Durante el crecimiento en un medio hipersalino ocurre un aumento en el grado desuperenrollamiento del ADN en Lb casei ATCC 393. 841.2 Efecto de la novobiocina en la viabilidad durante el crecimiento en NaCl ............................... 87

CAPITULO VIdentificación de posibles reguladores de componentes del sistema proteolítico relacionados conla respuesta a estrés nsmótim 90

5.1 Obtención de una mutante para el gen deT 905.1.1. Construcción de una mutante para el gen deT en Lb. casei ATCC 393. .......................... 905.1.2. Caracterización fenotípica de la mutante dtpT 915.1.3. Actividad PrtP y Pepx en Lb casei. deT 985.1.4. Efecto osmoprotector de péptidos en la mutante dtpT 99

5.2. Rol de CodY en la osmorregulación. 1015.2.1. La proteína CodY está presente en Lb casei ATCC 393. 1015.2.2. Interacción de CodY con el promotor de prtP 103

CAPITULO VIVariaciones en la pared celular durante el crecimiento en alta sal 112

III

Indice

6. l. Microscopía electrónica. l 126.2. Modificación de la sensibilidad a antibióticos durante el crecimiento en NaCl .................... l 136.3. Efecto de la Mutanolisina en células crecidas en NaCl y en paredes purificadas .................. l 16

Conclusiones y Discusión 121

Bibliografía 139

Abreviaturas 146

Indice Figuras y Tablas

Introducción

Introducción Parte l

Figura 1: Componentes del sistema proteolítíco de bacten'as lácticas 6Figura 2: Modelo de regulación por péptidos vía CodY 19Tabla lzPeptidasas específicas de prolina en bacten'as lácticas 12

Introducción Parte II

Figura 3: Principales osmoprotectores empleados por bacterias 23

Introducción parte lll

Figura 4: Esquema de la envoltura de una bacteria Gram positiva 32Figura 5: Estructura del peptidoglicano de Lb casei 33Figura 6: Biosíntesis del peptidoglicano que muestra los sitios de acción de varios inhibidores dela pared celular 36

Resultados

Indice Tablas

CAPITULO I

Tabla l: Velocidad de crecimiento de Lb case!"ATCC 393 en diferentes condiciones decrecimiento 59

CAPITULO ll

Tabla 2: Actividades especificas de PepQ y Pepl. 67Tabla 3: Actividadesespecíficas de Per y Prtp 67Tabla 4:Actividad específica PrtP en CDM con Glucosa y con Lactosa como fiJente de carbono 72

CAPITULO V

Tabla 5: Crecimiento de Lb casei wt y Lb casei deT con diversos péptidos como única firentede Leucina. 97Tabla 6: Actividadesespecíficas PrtP y Per en Lb casei deT. 99Tabla 7: Velocidad de crecimiento de la mutante dlpT en CDMN en presencia de péptidos. 100

CAPITULO VI

Tabla 8: Sensibilidad a antibióticos 115

Indice Figuras y Tablas

Indice Figuras

CAPÍTULO r

Figura 1: Efecto de la peptona durante el crecimiento en medio mínimo en alta osmolaridad 61Figura 2: Efecto estimulatorio de la peptona de carne durante el crecimiento en CDM adistintas concentraciones de NaCl. 61Figura 3: Efecto de camitina en el crecimiento de Lb casei en fiinción de la concentración deNaCl presente en el CDM. 62Figura 4: Rol de péptidos en la osmoprotección 64Figura 5: Crecimiento de Lb casei en leche y en lecheN 0,7M en función del tiempo 65

CAPITULO ll

Figura 6: SDS-PAGE de la hidrólisis de Bcaseína por Lb casei ATCC 393. 68Figura 7a: Crecimiento de Lb casei en CDM pc 0,5% sometido a un choque osmótico con NaCl0,7M final. 70Figura 7b: Actividades específicas de Per y PrtP antes y después del choque osmótico 70

CAPITULO III

Figura 8: PCR del gen pepQ 74F'gura 9: Esquema de los genesprIP yprtM de Lactobacillus paracaser' subspparacaseiNCDOl 51 75Figura 10: PCR del gen prIP 75Figura lla: Mapa de restricción deprlP 76Figura l lb: Restricción del fi'agmento de PCR prlP con BamHl 76Figura 12: Southern Blot de Lb casei ATCC 393 78Figura 13: Northern Blot del ARNm prtP 78Figura 14: RT-PCR semicuantitativa 80Figura 15:Relación entre la actividad transcripcional del gen prtP y la actividad específica dela enzima PrtP 80Figura 16: SDS-PAGE y Western Blot con anticuerpos anti PrtP 82Figura 17: Gráfico de Lineweaver-Burk (actividad PrtP en fimción de la concentraciónde sustrato) 82

CAPITULO IV

Figgra 18: Variación en el grado de superenrollamiento de plásmidos durante el crecimientoen MRS y MRSN. 85Figura 19: Variación en el grado de superenrollamiento de plásmidos durante el crecimientoen CDM. 86

Figura 20: Efecto de péptidos y camitina en el grado de superenrollamiento del ADNdurante el crecimiento en medio hiperosmótico. 88Figura 21: Efecto de novobiocina durante el crecimiento en un medio hiperosmótico. 89

CAPITULO V

Figura 22: Secuencia parcial del putativo gen deT de Lb delbrueckii Iactis LKT 93

Indice Figuras y Tablas

Figura 23: Construcción de la mutante Lb casei deT 94Figura 24: PCR de Lb delbrueckii Iacn's LKT, Lb casei wt y Lb casei dlpT 95Figura 25: Crecimiento de Lb casei ATCC 393 dtpT en MRS y CDM 95Figura 26: SDS PAGE y Western Blot de CodY de B subtilis 102Figura 27: Western Blot de CodY de Lb casei ATCC 393 empleando un anticuerpo antiCodY de B .s‘ubtilis 103

Figura 28: Gel shifi con extractos de E coli KSZ72 y de B subtilis. 105F'ggra 29: Gel shift con extractos de Lb casei ATCC 393 106Figgra 30: Gel shifl con concentraciones crecientes de extracto. 106Figura 31: Gel shifi con extractos de Lb casei crecido en CDM y CDM AP 2,5 mM cony sin NaCl 0,7M 107Figura 32: Gel shift con inmunoprecipitado de un extracto de Lb casei con un anticuerpoanti CodY 108Figura 33: Ensayo de supershifi lll

CAPITULO Vl

Figura 34: Microscopía electrónica de células de Lb casei provenientes de MRS y MRSN 1M 114Figura 35: Frecuencia de distribución en función del diámetro celular 115Figura 36: Sensibilidad a mutanolisína de células provenientes de la fase exponencialde crecimiento. ll7Figura 37: Sensibilidad a mutanolisína de células provenientes de la fase estacionariade crecimiento. 118Figura 38: Sensibilidad a mutanolisína de paredes pun'ficadas. ll9

Introducción Parte I

Introducción Parte]. Bacterias Lácticas y Sistemaproreolr'lico.

l- Bacterias lácticas

Desde hace mucho tiempo los hombres han aprovechado la capacidad de las bacterias lácticas de

producir ácido láctico a partir de sustratos fermentables como un método de preservación de

alimentos. La consecuente disminución del pH impide el crecimiento de la flora acompañante que

puede alterar los productos o resultar patógena para el hombre.

Desde los comienzos de la microbiología, los procesos de fermentación en los que participaban

bacterias lácticas adquirieron gran relevancia. Fue Lister en 1873 quien aisló a partir de la leche el

primer cultivo bacteriano puro que denominó Bacterium lactis, hoy Laclococcus Iaclis, tratando

determinar qué microorganismos participaban en las ferrnentaciones lácteas.

Aunque durante mucho tiempo los procesos de producción de alimentos se realizaron en forma

empírica, actualmente han adquirido un alto desarrollo tecnológico en el que prima mantener la

calidad y constancia de un producto. Este desarrollo tecnológico file posible en parte por la

acumulación de conocimientos de la biología de las bacterias lácticas.

Las bacterias lácticas son microorganismos Gram positivos, no esporoforrnadores, inmóviles,

anaerobios aerotolerantes, que carecen de catalasa. Su metabolismo es estrictamente ferrnentativo y

presentan altos requerimientos nutricionales. Algunos solo producen ácido láctico como producto

principal de la fermentación de carbohidratos (homofermentativos) o una mezcla de ácido láctico,

dióxido de carbono, etanol y/o ácido acético (heterofermentativos) (Kandler, 1983).

Esta amplia descripción comprende tanto cocos (lactococcus, Streptococcus, Vagococcus,

Pediococcus, Aerococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Tetragenococcus), como bacilos

(Lactobacillusy Carnobaclerium)

Existen evidencias genéticas, principalmente sobre la base de la secuencia de ARNr 16s,

(Stackebrand et al, 1988) que la agrupación bajo el término bacterias lácticas, definido bajo las

caracteristicas fisiológicas mencionadas anteriormente, concuerda con la relación real a nivel

filogenético. Pudiéndose agrupar en los Gram positivos dentro de la subrama Clostridium que

incluye organismos con un contenido G+C en el ADN inferior al 50%. Quedaría excluido del grupo

el género Bifidobacterium que se adscribe a la rama de Aclinomycetes con un porcentaje de G+C

superior al 50%.

Introducción Parte1. Bacterias Lácricasy Sistema proteolítico.

Las especies mas empleadas en los procesos fermentativos para la producción de alimentos

pertenecen a los géneros Laclobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococcus

pudiéndose encontrar fácilmente en productos cárnicos, vegetales, lácteos, frutas bebidas, pero

también en el tracto respiratorio, intestinal y genital del hombre y otros animales.

2- Lactobacillus

El género Lactobacillus es muy heterogéneo y presenta una gran variabilidad en su porcentaje de

G+C en el ADN (del 32 al 54%).

Kandler y Weiss (1986) dividieron al género en tres gmpos, siendo la base fisiológica de esta

clasificación la presencia o ausencia de las enzimas fructosa 1-6 difosfato aldolasa y fosfocetolasa,

enzimas clave en el metabolismo homo o heterofermentativo de las hexosas y pentosas

respectivamente.

o Grupo I: homofermentativos estrictos: fermentan las hexosas por la vía glucolítica produciendo

dos moles de ácido láctico por mol de glucosa. No utilizan pentosas ni gluconato. Poseen la

enzima fructosa 1-6 difosfato aldolasa y no la fosfocetolasa. Ejemplos: Lb. helveticus, Lb.

acidophilus, y Lb. delbrueckii.

o Grupo ll: heterofermentativos facultativos: fermentan hexosas, utilizan gluconato y pentosas

con producción de ácido láctico y acético. Presentan actividad 1-6 difosfato aldolasa y

fosfocetolasa pero ésta última es inducible por pentosas. Ejemplos: Lb. casei y Lb. plantarum.

o Grupo Ill: heterofermentativos estn'ctos: fermentan hexosas con formación de ácido láctico,

ácido acético (o etanol) y dióxido de carbono en cantidades equimolares. Utilizan las pentosas

por la vía del ácido 6-fosfoglucónico con producción de ácido láctico y acético. Ejemplos: Lb.

reuteri y Lb.fermenlum.

Cabe aclarar que esta es una clasificación artificial ya que las relaciones dentro de cada grupo no

concuerdan con parentescos naturales resultantes de análisis filogenéticos de las secuencias de

ARNr (Collins y col, 1991)

Introducción Parte1. Bacterias Lácticas y Sistemaproteolítico.

3- Lactobacillus casei

Lb. casei es una especie presente en hábitats variados: tracto intestinal y boca, productos vegetales

fennentados, carnes y productos lácteos, incluyendo leches fermentadas, yoghurt, quesos y

productos más recientes como Yakult Qo Actimel Q.

Además de las propiedades organolépticas que su metabolismo proporciona a los productos,

muchos autores sostienen el valor de ciertas cepas como probióticos, poseen la capacidad de regular

la actividad de la flora intestinal actuando en la prevención y cura de casos de diarrea y modulando

el sistema inmune (Sanders, 1993). Lb. casei puede atravesar el estómago tolerando el bajo pH para

colonizar luego el intestino (Greene y Klaenhammer, 1994).

Lb. casei es una especie que ha sido sometida actualmente a numerosos cambios de nomenclatura.

Estudios de hibridación ADN: ADN demostraron que la cepa tipo Lb. casei subsp casei ATCC 393

(empleada en este trabajo) presentaba un bajo nivel de similitud con el resto de las cepas de Lb.

casei (Collins el al, 1989), por tanto, el resto de las cepas fueron agrupadas en nuevas especies: Lb.

paracasei y Lb. rhamnosus, dejándose el nombre de Lb. casei únicamente para dos cepas (ATCC

393 y NCBF 173). Posteriormente Dellaglio el al (1991), basándose en estudios de hibridación de

ADN y perfiles de proteínas, propusieron la designación de la cepa ATCC 334 como la cepa tipo

para la especie Lb. casei subsp casei y la supresión de la especie Lb. paracasei.

Dicks en 1996 agrupa a las cepas ATCC 393 y NCBF 173 como un “cluster separado” junto con la

cepa ATCC 15820 bajo el nombre de la nueva especie Lb. zeae. Todos estos cambios están todavía

sujetos a controversia y no aparecen en las listas aprobadas de nombres bacterianos.

4-Aplicaciones biotecnológicas de Bacterias Lácticas

A diferencia de lo que ocurre en la fabricación de productos artesanales, en la industria, los cultivos

iniciadores o “starters” conteniendo uno o más microorganismos son empleados para mantener la

calidad organoléptica e higiénica de los productos. Los cultivos iniciadores son producidos

comercialmente por numerosas industrias y laboratorios y aseguran la reproducibilidad y

estandarización de los procesos.

Los avances en las técnicas de ADN recombinante en el campo de las bacten'as lácticas han

permitido la constmcción de cepas con caracteristicas mejoradas o añadidas que permitirán una

mayor calidad, variedad y valor nutricional a los productos, así como una mejora en los procesos de

producción industn'al.

Introducción Parte]. Bacterias Lácn'casy Sistemaproteolítico.

Las bacterias lácticas (y entre ellas los Lactobacillus) son excelentes candidatos para la ingenieria

metabólica pues su utilización para el consumo humano es de larga data y son normalmente

consumidos por el público en alimentos fermentados. Esto implica la calificación GRAS (“generally

recognized as safe”) que otorga la Food and Drug Administration (USA) y el Código Alimentario

Nacional y que debe presentar cualquier producto para consumo.

Varias propiedades metabólicas de las bacterias lácticas tienen un impacto directo o indirecto en

procesos como el desarrollo de sabor y aroma y maduración de productos lácteos (como quesos y

yoghurts). La degradación de las caseínas presentes en la leche juega un rol crucial en el desarrollo de

estos procesos. Mientras que ciertos péptidos contribuyen a la formación del sabor, otros péptidos

indeseables que producen un sabor amargo pueden llevar a un producto de sabor no deseado. Por eso

un estudio detallado de la proteólisis, en el que participa un complejo sistema proteolítico de la bacteria

(ver más adelante), podría conducir a la obtención de bacterias lácticas recombinantes con

caracteristicas proteolíticas mejoradas.

Sin embargo, a la hora de estudiar el metabolismo de estos microorganismos, con el fin del

mejoramiento de los mismos, no se tiene en cuenta el microambiente que se produce en el alimento

fermentado.

El agregado de sal, con el objeto de preservar alimentos, es una técnica empleada desde la antigüedad,

y en muchos alimentos las fermentaciones ocurren en un ambiente con una alta concentración de

solutos. Así mismo, el proceso de maduración en quesos de pasta dura ocurre luego del salado

momento en el que la participación de las bacterias lácticas en la determinación del sabor y el aroma

del producto es fiJndamental.

Es por eso que el objetivo principal de esta tesis es el estudio de las modificaciones fisiológicas de

Lactobacillus casei durante el crecimiento en alta sal y principalmente relacionado con las

modificaciones que ocurren en los componentes del sistema proteolítico durante esta condición de

crecimiento.

5- Sistema proteolítico de Bacterias Lácticas

Ha sido bien establecido que la mayoria de las bacterias lácticas, aisladas de productos lácteos,

presentan auxotrofias múltiples para aminoácidos. El requerimiento de aminoácidos es dependiente

de cada cepa y puede variar desde 4 hasta 14 aminoácidos (Chopin, 1993). En la leche, hay muy

poca cantidad de aminoácidos y péptidos libres. Por este motivo, las bacterias lácticas, dependen

Introducción Parte]. Bacterias Lácticasy Sistemaproteolítico.

para su crecimiento de un complejo sistema proteolítico que les permite degradar las proteínas

presentes en la leche (caseínas) y obtener los aminoácidos requeridos. Las caseínas constituyen

aproximadamente el 80% de las proteinas presentes en la leche bovina. Los cuatro tipos diferentes

de caseínas que se encuentran en la leche, as] -, 0162-, B-, y K- caseína están organizadas en micelas

formando complejos solubles. Las caseínas contienen todos los aminoácidos necesarios para el

crecimiento de las bacterias lácticas a altas densidades.

Los componentes estmcturales del sistema proteolítico pueden ser divididos en tres grupos de

acuerdo a su fimción (Kunji et al, 1996):

i. Proteinasas que degradan las caseínas en péptidos

ii. Peptidasas intracelulares que degradan los péptidos

iii. Sistemas de transporte que translocan los péptidos provenientes de la degradación de las

caseínas através de la membrana plasmática. (Figura 1).

Los principales trabajos sobre los diferentes componentes y su regulación han sido realizados en

Lactococcus lactis, aunque en los últimos años se ha prestado gran atención a otros

microorganismos dentro de los Lactobacillus, principalmente a aquellos de uso industrial.

5.1- Proteínasas de Bacterias Lácticas

Ha sido bien establecido que la degradación de caseínas es iniciada por una única proteínasa

extracelular anclada en la pared celular (PrtP). Las proteínasas de varias bacterias lácticas diferentes

han sido caracterizadas bioquímicamente, entre ellas la de Lactobacillus paracasei NCDO 151

(Holck y Naes, 1992) y dentro de las caracteristicas generales de las proteínasas se indicarán en

detalle las características de esta proteínasa.

5.1.1- Propiedades genéticas y bioquímicas de las proteínasas

La proteínasa madura es una serín-proteínasa monome'rica con un peso molecular entre 180-190

kDa, sin embargo durante el aislamiento suelen encontrarse productos de degradación de menor

tamaño (Laan y Konings, 1989). El gen que codifica para PrtP ha sido clonado y secuenciado en

varias cepas de Lactococcus Iactis y Lactobacillus. La forma no procesada de Lb. paracasei NCDO

15] consiste de 1902 aminoácidos. Las secuencias primarias de las enzimas de lactococos son un

98% idénticas entre sí y más de un 95% cuando se comparan con la de Lb. paracasei.

000.000.990.000...ooooooooooooooooo00000000900000

Introducción Parte1. Bacterias Lácticas y Sistemaproteolítico.

Figura l: Componentes del sistema proteolítico de bacterias lácticas

caseína

f Pm, Peptldos

pared celular y \

W , x,Aminopeptidasasfx" _ NEl. ji.

:1¡"pim- E‘eptïltEndopeptidasas y

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W. l . I’epl‘ a. ¿ llx," >"-1.._‘.’ i“? A. "Mit/o" a J 9’?-w-«n s \\

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e. y

“HW-"fl"Aminoácidos

Los alineamientos de secuencias aminoacídicas muestran que las proteínasas se encuentran

relacionada con las subtilisinas, que son serín-proteasas con dominios catalíticos similares. El

análisis de la secuencia N terminal de la enzima madura deducida de la secuencia de nucleótidos

revela una señal típica para una translocación Sec-dependiente y una prosecuencia que son

removidas por un procesamiento post-traduccional (Holck y Naes, 1992). El extremo N terminal de

la enzima madura constituye el dominio catalítico y contiene varios aminoácidos conservados

involucrados en la catálisis y el posicionamiento del sustrato (Ser 433, His94, Asp30, Asnl96 en la

enzima de SKll). Luego se encuentra un espaciador que no presenta homología con proteínas de

función conocida, pero podría exponer al dominio catalítico hacia el exterior de la célula. El

extremo C terminal es conservado en varias proteínas de superficie de bacterias Gram positivas y

posee una señal LPXTG seguida de una putativa oc hélice que atraviesa la membrana y una

pequeña cola cargada. Luego de la translocación , la secuencia LPXTJ/G es clivada (en la posición

indicada por la flecha) y el grupo carboxi-terminal de la treonina , probablemente, se una

covalentemente a una glicina N terminal que es parte de los puentes cruzados en el péptido glicano

(Kunji et al 1996).

Introducción Parte1. Bacterias Lácticas y Sistemaproreolílico.

En L. Iactis WG2, SKll y en Lb. paracasei NCDOISI ha sido identificada una enzima que está

involucrada en la maduración de la proteínasa (PItM). El producto del gen prtM es precedido por

una secuencia señal y tiene un sitio consenso para una lipomodificación.

La proteínasa PrtP es de localización extracelular y su estructura y fiinción son estabilizadas en

presencia de iones Ca2+.Laproteínasa puede ser liberada de la pared empleando buffers libres de

Ca2+o lisozima (Laan y Konings, 1989).

5.1.2- Especificidad de sustrato

Sobre la base de los patrones de degradación de c161-, 8-, y K- caseínas, las proteínasa de

Laclococcus pueden ser clasificadas en dos clases:

i. Tipo PI hidrolizan B-caseína

ii. Tipo Plll hidrolizan a“ ¿y B- caseína.

Ambos tipos de proteínasas hidrolizan en menor medida K-caseína (Pn'tchard y Coolbear, 1993).

La proteínasa de Lb. paracasei estaría más relacionada a las proteínasas de tipo PL hidrolizando

principalmente B-caseína (I-lolck y Naes, 1992).

A modo de resumen podn'amos decir que las propiedades bioquímicas de las proteínasas de varias

bacterias lácticas son similares. Por ejemplo, la mayoría de las enzimas, sino todas, son sen'n­

proteínasas de tamaño similar. Las comparaciones de secuencias revelan un alto grado de identidad,

aún cuando se comparan proteínasas de diferente especificidad o de diferentes organismos. Incluso

los productos formados parecen superponerse a pesar de la especificidad de clases y especies,

probablemente relacionado con el gran número de sitios de clivaje preferenciales que poseen. Se

forman muchos oligopéptidos diferentes que contienen todos los aminoácidos esenciales para el

crecimiento, y muchos de estos péptidos se producen en grandes cantidades. Sin embargo, los

péptidos que provienen de dos regiones de la B- caseína, entre 94 y 102 (GVSKVKEAM), y entre

161 y 190 (SVLSLSQSKVLPVPQKQKAVPYPQRDMPIQA

F) contiene todos los aminoácidos necesarios para el crecimiento excepto histidina para la cual

algunas cepas son auxótrofas (Kunji, et al 1998).

5.2- Sistemas de transporte de aminoácidos y péptidos

Introducción Parte1. Bacterias Lácticas y Sisremaproreolítico.

Como ya se mencionó, para poder obtener los aminoácidos necesarios para la síntesis de proteínas,

los productos de degradación de las caseinas deben atravesar la membrana para llegar al citoplasma

donde serán degradados por diversas peptidasas para proveer los aminoácidos que los componen.

5.2.l-Sistema de transporte de aminoácidos

Los Lactococos poseen al menos 10 sistemas de transporte de aminoácidos que presentan gran

especificidad para aquellos aminoácidos con estructuras similares, por ejemplo, Glu/Gln,

Leu/IleNal, Ser/Thr, Ala/Gly, Lys/Arg-Om (Konings et al, 1989)

La incorporación de Glu/Gln, Asn/Asp y Pro/GlyBetaína requiere de la energía provista por la

hidrólisis de ATP , mientras que los sistemas de transporte para Leu/Ile/Val, Ala/Gly, Ser/Thr y Met

dependen de la fiierza protón motriz. El antiporte Arg/Om está mediado por el gradiente de

concentración de ambos solutos (Konings, 2002).

5.2.2-Sistema de transporte de di/tripéptidos (DtpT)

Estudios de transporte en L. laclis mostraron que di y tripéptidos relativamente hidrofilicos son

transportados por un mecanismo impulsado por una fuerza protón motriz ya que los péptidos son

transportados simporter con un protón. (Smid el al, 1989). La secuencia de aminoácidos deducida

de la secuencia de nucleótidos de dtpT muestra muy poca similitud con otros transportadores

bacterianos, que pertenecen a la superfamila de transportadores ABC (ATP binding cassette). De

hecho DtpT pertenece a una nueva familia de transportadores de péptidos, llamada familia PRT, que

tiene contraparte solamente en células eucariotas (Steiner el al 1995).

La estructura secundaria de DtpT es similar a la de los transportadores secundarios de proteínas que

utilizan la fiierza protón motriz y consiste en 12 a hélices que atraviesan la membrana.

En un estudio exhaustivo realizado en el 2000 por Fang y colaboradores en Lactococcus Iactis se le

asignaron las siguientes caracteristicas a DtpT:

i. La afinidad de los péptidos testeados van’ade uM a mM.

ii. Un amino y carboxi terminal libres son importantes pero no suficientes para una alta afinidad

con DtpT

iii. Un grupo amino y una unión peptídica localizada en posición a es importante para una

interacción de alta afinidad.

xii.

Introducción Parte1. Bacterias Láclicas y Sistemaproreolitico.

Péptidos con una unión peptídica en trans interactúan con mayor afinidad que aquellos que

están en configuración cis.

La mayor afinidad es observada con isómeros L-a aminoácidos en el extremo amino y

carboxiterrninal

Aminoácidos hidrofóbicos localizados en la posición l del dipéptido aumentan la afinidad

Aminoácidos cargados localizados en la posición 2 del dipéptido disminuyen la afinidad.

Aminoácidos cargados localizados en la posición 3 del tripéptído disminuyen la afinidad.

Los dipéptidos tienen mayor afinidad que sus análogos tn'péptidos.

Los péptidos hidrofóbicos presentan mayor afinidad que los hidrofllicos.

Péptidos catiónicos, en la mayoría de los casos, tienen una menor actividad que sustratos

neutros o aniónicos.

Aminoácidos libres o péptidos mayores a tres aminoácidos no son aceptados como sustratos.

5.2.3- Sistema de transporte de oligopéptidos (Opp)

El sistema de transporte de oligopéptidos de Lactococcus Iactis (Opp) puede transportar péptidos

de hasta 18 residuos (Kunji et al, 1998). En base a estudios empleando inhibidores se concluyó

que este transportador es dependiente de ATP más que de la fiJerza protón motriz. Los genes que

codifican este transportador fueron clonados y secuenciados y expresados funcionalmente en L.

Iaclis. Sobre la base de la secuencia ha sido clasificado como perteneciente a la familia de

transportadores ABC. Las cinco subunidades de este sistema de transporte incluyen, una proteína

que une péptidos (OppA), dos proteínas integrales de membrana (OppB y OppC) y dos proteínas

que unen ATP (OppD y OppF).

OppA actúa como la proteina receptora que lleva los péptidos al complejo translocador a través

de la membrana. OppA puede unir péptidos de diferente tamaño y composición con alta afinidad

(Tame el al, 1994)

OppB y OppC son proteínas hidrofóbicas con 6 dominios transmembrana en una configuración

de a hélice. Por último OppD y OppF acoplan la hidrólisis de ATP a cambios conforrnacionales

en OppB/C permitiendo el pasaje de péptidos a través de la membrana.

5.2.4- Sistema de transporte de dí/tripéptidos (DtpP)

Mutantes defectivas en Opp y DtpT no pueden emplear di /tripéptidos hidrofilicos y

oligopéptidos, pero aún pueden utilizar un amplio rango de péptidos hidrofóbicos. Esta

9

Introducción Parte]. Bacterias Lácticas y Sistemaproleo/ílico.

observación llevó al descubrimiento de un tercer sistema de transporte, designado DtpP (Foucad

et al, 1995). Estudios empleando inhibidores indicaron que este sistema es dependiente de la

hidrólisis de ATP, similar al descripto para Opp.

A partir del análisis del genoma completo de L. Iactis 11,1403, Sanz y colaboradores (2001),

diseñaron cebadores que les pennitieron encontrar en L. laclis MG1363, un operón que codifica

para un putativo transportador de péptidos del tipo ABC. El análisis genético del mismo reveló la

presencia de 6 marcos de lectura abiertos, dppA, dppB, dppC, dppD, dppF y a’ppP (que se

encuentra interrumpido por un codón de terminación prematuro) La proteína especificada por

dppA, designada DppA presenta homología con las proteínas de unión a péptidos de los sistemas

de transporte de di/tri y oligope'ptidos. DppB y dppc, comparten homología con proteínas

integrales de membrana de transportadores ABC. DppD y DppF presentan alta homología con

proteínas que unen ATP, especialmente con aquellas presentes en los sistemas de transporte de

péptidos.

DppA fue sobrexpresado y purificado en L. Iactis AGSOOy se realizaron ensayos bioquímicos

empleando la proteína pura (Sanz el al, 2000). De ese análisis se desprendieron las siguientes

caracteristicas

Alta afinidad por di y tripéptidos

Requerimiento de un grupo 0Lamino N terminal y una unión peptídica a contigua al grupo

amino N terminal

Estereoespecificidad por isómeros L

Preferencia por dipéptidos conteniendo metionina o arginina y tripéptidos hidrofóbicos

constituidos por leucina o valina.

Sin embargo, es importante destacar, que en un medio completo (como M17) DppA no es

detectado salvo en ausencia de los otros transportadores, indicando que cumplin’a un rol

secundario en el transporte de péptidos en condiciones normales de crecimiento.

5.3- Peptidasas de bacterias lácticas

Luego de la hidrólisis de la caseína por PrtP los péptidos son transportados e hidrolizados en el

intracelular por un amplio conjunto de peptidasas. Presentamos un resumen de la peptidasas

identificadas hasta el momento y su especificidad.

5.3.1- Aminopeptídasas generales (PepN y PepC)

Introducción Parte1. Bacterias Láclicas y Sistema proreollrico.

Las aminopeptidasas generales son enzimas capaces de hidrolizar desde el extremo amino

terminal, di/tri y oligopéptidos en los cuales no se encuentran aminoácidos como prolina o ácido

glutámico. Varias aminopeptidasas de este tipo han sido purificadas de diferentes cepas de

lactococos (Exterkate el al, 1992; Mars y Monnet, 1995) y lactobacilos (Klein el al, 1994;

Vesanto el al, 1994). Las mejor caracterizadas son PepN y PepC. PepN es una metaloenzima

mientras que PepC es una cisteín-aminopeptidasa.

5.3.2- Endopeptidasas (PepO y PepF)

Se identificaron dos endopeptidasas diferentes (PepO y PepF) en L. Iaclis subsp cremorís, siendo

ambas metaloenzimas. PepO hidroliza oligopéptidos como Met-encefalina (péptido presente en

la B caseina), pero no degrada caseina (Tan et al, 1991). PepF actúa sobre péptidos que contienen

entre 7 y l7 residuos aminoacídicos con amplia especificidad, aunque no hidroliza Met­

encefalina (Monnet el 'dl, 1994)

5.3.3- Glutamil aminopeptidasa (PepA)

En L. Iaclis se identificó una glutamil aminopeptidasa (PepA), que libera ácido glutámico o

aspártico del extremo N terminal de di/tn' y oligopéptidos (Exterkate y Veer, 1987)

5.3.4- Tripeptidasas (PepT)

PepT es una metaloenzima específica que actúa sobre tn'péptidos (Mierau et al, 1994). Hidroliza

uniones del tipo XiXX salvo aquellos péptidos que contienen prolina en la segunda posición.

5.3.5- Dipeptidasas (PepV)

Se han caracterizado dipeptidasas (PepV) a partir de L. Iactis, Lb. bulgaricus, Lb. helvelicus y L.

lactis subsp cremoris (Tan el al, 1995; Dudley et al, 1996; Vongerichten el al, 1994). La

especificidad de estas enzimas está confinada a dipéptidos, con excepción de aquellos que

contienen prolina , glutamato y aspartato. Presenta preferencia hacia residuos N terminales

hidrofóbicos (Tan et al, 1995). No es capaz de hidrolizar tri y oligopéptidos.

5.4- Peptidasas involucradas en la hidrólisis de péptidos que contienen prolina

Introducción Parte1. Bacterias Lácticas y Sistemaproleolilico.

Las caseínas son proteínas con un elevado contenido de prolina (16,7% para la B caseína), por lo

tanto los productos generados por las proteínasas son n'cos en este aminoácido (Visser e! al,

1991). Sin embargo, la mayoría de las peptidasas no son capaces de liberar aminoácidos cuando

prolina es el penúltimo o el último aminoácido. Para degradar péptidos ricos en prolina se

necesitan peptidasas específicas. En la tabla 1 se muestran las peptidasas específicas para

prolina, esquematizando el sitio de corte de cada una.

Tabla l: Peptidasas específicas de prolina en bacterias lácticas

Enzima Nombre Sustrato

Prolidasa PepQ XlPro

Aminopeptidasa P PepP X1«Pro-(X)n

X-prolil-dipeptidil-aminopeptidasa Per X-ProMX)n

Prolinasa PepR ProJrX

Prolil-iminopeptidasa PepI ProsLX-(X).1

5.4.l-Aminopeptidasa (PepP)

Esta enzima es una metalopeptidasa y fue identificada en diferentes cepas de L. lactis subsp

cremoris y en L. lactis (Booth et al, l990a; Mars y Monnet, 1995)

PepP degrada exclusivamente oligopéptidos de hasta lO residuos conteniendo secuencias XiPro­

Pro-(X)n o Xserro-(X)n en el extremo N terminal.

5.4.2- Prolidasa (PepQ)

PepQ es una dipeptidasa que hidroliza dipéptidos que contienen prolina como segundo

aminoácido, es decir X-Pro dipéptidos (Stucky et al, 1995)

5.4.3- Proliliminopeptidasa (Pepl) y prolinasa (PepR)

Por definición, una proliliminopeptidasa reconoce tri y oligopéptidos que contienen secuencias

Pro-X en el extremo N terminal, mientras que PepR solo degrada Pro-X péptidos. Las

proliliminopeptidasas de van'os organismos han sido caracterizadas (Atlan et al, 1994; Gilbert et

al, 1994). Esta peptidasa puede aportar prolina libre en el intracelular.

Introducción Parlel. Bacterias Lácticasy Sistemaproteo/ílica.

5.4.4-X-prolil-dipeptidil-aminopeptidasa(Per)

Esta enzima hidroliza específicamente péptidos de la forma x-PI'O'Jr(X)nliberando dipéptidos X­

Pro del extremo N terminal. Van'os genes de per han sido clonados de diferentes bacterias

lácticas (Vesanto el al, 1995; Meyer-Barton el al, 1993).

5.4.5- Carboxipeptidasas

Hasta ahora no han sido caracterizadas carboxipeptidasas en bacterias láctjcas

5.5- Localización de las peptidasas

Aunque durante algún tiempo se generó una gran controversia con respecto a la localización de

las peptidasas, hoy es aceptado que son todas de localización intracelular. Muchos genes que

codifican para las peptidasas han sido secuenciados. El tamaño de la proteína, deducido de la

secuencia nucleotídica, se corresponde bien con el tamaño de la proteína obtenido a partir de

electroforesis en geles de poliacn'lamida (Kiefer-Partsch et al, 1989). El extremo N terminal no

contiene péptido señal y coincide exactamente con el determinado mediante secuenciación de la

proteína pura (Atlan e! al, 1994; Christensen et al, 1995). Estos datos indican que la peptidasa no

se procesa y que la localización es intracelular.

5.6- El rol de las peptidasas en el desarrollo de aroma y sabor de productos lácteos

Las bacterias lácticas tennófilas, como L. helveticus y L. delbrueckii tienen un rol clave en los

pasos de acidificación y proteólisis del queso. Una adecuada proteólisis es esencial para una

adecuada calidad del queso maduro. Las caseínas enteras son hidrolizadas por la proteasas

presentes en la leche (plasmina) y/o renet (quimosina y pepsina) en péptidos grandes y de

tamaños intermedios. Subsecuentemente, las proteinasas y peptidasas de los cultivos iniciadores

los hidrolizan en pequeños péptidos y aminoácidos, que son precursores de aroma (Deutsch et a1,

2000) Las enzimas que degradan péptidos conteniendo prolina son muy importantes en el

desarrollo de sabor. Mientras que dipéptidos que contienen prolina pueden dar sabor amargo al

producto, la prolina libre le da un sabor dulce al queso (Femandez-Esplá el al, 1997). En la

mayoría de las especies empleadas las enzimas intracelulares son liberadas luego de la lisis en el

cuajo, donde permanecen activas por varias semanas.

Introducción Parte]. Bacterias Lácticas y Sistemaproteolírico.

Aunque los productos resultantes de la degradación de las caseínas por la acción de las

proteínasas ya habían sido analizados in vitro usando enzimas purificadas de diferentes cepas de

L. [actis (Monnet el al, 1989, Reid et al 1991) y de Lb. helveticus (Yamamoto e! al, 1993),

Deutsch y colaboradores en el 2000 analizaron y secuenciaron los productos de degradación de

B- caseína obtenidos a partir de la proteólisis de bacterias lácticas termófilas. Para ello emplearon

como sustrato un hidrolizado tríptico/quimiotriptico de [3-caseína purificado que fue sujeto a la

degradación por proteasas y peptidasas de extractos de diferentes cepas en las condiciones

normales que ocurren durante la maduración de quesos, a fin de mimificar las condiciones

durante la confección del alimento. Los péptidos obtenidos fiJeron secuenciados y de este modo

pudieron comparar las actividades de cada cepa, ya que como comentamos anteriormente los

pequeños péptidos y aminoácidos son importantes precursores de aroma en los productos lácteos.

5.7- Regulación dela expresión de los componentes del sistema proteolítico

Existen numerosos trabajos donde se describe el aislamiento y purificación de distintos

componentes del sistema proteolítico (proteinasas y peptidasas), así como la caracterización

bioquímica de las actividades correspondientes; sin embargo poco se conoce acerca de la regulación

de estos componentes.

Los pn'meros trabajos se realizaron utilizando anticuerpos específicos para evaluar modificaciones

en los niveles de la proteínasa (PrtP) en diferentes condiciones de crecimiento (Hugenholtz er al,

1984). Luego se emplearon diversos sustratos colorimétricos para medir la modificación de diversas

actividades enzimáticas de los componentes de este sistema a fin de analizar posibles regulaciones a

nivel transcripcional (Meijer el al, 1996).

En 1994, Platteeuw y colaboradores describen el uso de un vector para el análisis de promotores en

bacterias lácticas. Este vector (el pNZZ72 y sus derivados) permite realizar una firsión

transcripcional al gen de la B-glucuronidasa de Escherichia coli (gusA) (sin su propio promotor) que

actúa como un gen reportero, ya que su actividad puede medirse fácilmente. Recordemos que la

mayoria de los vectores que se emplean en bacterias Gram positivas utilizan a la B-galactosidasa

(lacZ) como gen reportero y como muchas de las bacterias lácticas utilizan la lactosa como fuente

de carbono, poseen una actividad B-galactosidasa endógena por lo que no se pueden emplear este

tipo de construcciones. Empleando este vector se realizaron fusiones transcripcionales de los

promotores de los genes prlP y prIM pudiéndose estudiar la regulación de la expresión de los

mismos a nivel transcripcional en L. Iactis SKI 1 (Marugg et al, 1995),

Introducción Parte]. Bacterias Lácticas y Sistemaproteolítico.

Los genes, prlP y prtM, se transcn'ben divergentemente, y ambas proteínas son necesarias para la

producción de una serín-proteínasa activa. Este tipo de organización se mantiene en todas las cepas

analizadas.

Ya los pn'meros trabajos mencionados, indicaban que la producción de la proteínasa era

dependiente de la composición del medio. Los mayores niveles de producción se encontraban en

leche, mientras que la producción de la proteínasa era baja en medios de laboratorio, n'cos en

péptidos y aminoácidos. El análisis de los niveles de expresión empleando fusiones

transcripcionales indicaban, que la expresión desde ambos promotores en medios que contenían

bajos niveles de péptidos era alta, mientras que al aumentar la concentración de los mismos, su

expresión se reprimía. Además ciertos péptidos específicos, como prolil-leucina (PL)o leucil­

prolina (LP) afectaban de manera negativa la expresión de esos genes. Estos resultados sugen’anun

mecanismo regulatorio común a ambos promotores. Un análisis por deleción de la región promotora

(Marugg et al, 1996) apuntaba a la existencia de una proteína represora común que controlaba

negativamente el inicio de la transcripción desde ambos promotores en presencia de

concentraciones elevadas de péptidos específicos en el medio de cultivo.

No fiie sino hasta el 2001 que se encaró el estudio de los componentes más importantes del sistema

proteolítico en conjunto (Guédon et al, 2001a). La transcripción de 16 genes codificando 12

peptidasas (pepC, pepN, per, pepP, pepA, pepFZ, pepDA1,pepDA2, pepQ, pepT, pepM y pepOI ),

PI y PIlI, dos proteínasas (prIPl y prtp3) y tres sistemas de transporte (dtpT, dtpP y opp-pepOl) de

L. Iaclis MGl363 fue analizada en respuesta a diferentes condiciones ambientales. La fiJsión de los

promotores al gen de la luciferasa, empleado como reportero, así como el análisis del ARNm,

fueron empleados para estudiar el efecto de la fuente de carbono, temperatura de crecimiento y el

aporte de péptidos en la expresión de estos genes.

La represión de la transcripción por fiJentes de nitrógeno como casitona (un hidrolizado de caseína

que contiene un 80% de péptidos y un 20% de aminoácidos libres) file particularmente significativa

(5 a 150 veces) para prtl’l, prtl’3, per, pepN, pepC y el operón opp-pepOI. Aún más pepDAZ,

dtpP y dlpT estarían regulados por casitona. La actividad de sus promotores es comparable a la de

genes que se expresan en alto grado como aquellos que codifican para enzimas de la vía glicolítica.

Más aún, estudios fiincionales sugieren que cumplen un rol importante en la utilización de proteínas

como fuente de carbono y energía. La proteínasa PrtP y el transportador Opp son esenciales para el

crecimiento en leche ya que están involucrados en el primer paso de degradación de la caseína y en

la incorporación de los péptidos resultantes hacia el inten'or de la célula. Aunque la inactivación de

peptidasas individuales no suele disminuir el crecimiento en leche en forma drástica, la inactivación

Introducción Parte1. Bacterias Lácn'casy Sistemaproteolílico.

de pepN, pepC y pepOl conduce una disminución del crecimiento del 25, lO y 9% respectivamente

y una combinación de las mismas tiene un efecto drástico en el crecimiento (Mierau et al, 1996).

Esto sugiere un rol crucial en el metabolismo de péptidos en la célula. Por último, el crecimiento de

mutantes de ¡2er es claramente afectado cuando la caseína es la única fiiente de nitrógeno. PepN,

PepC y PepOl son las enzimas intracelulares más importantes para la degradación de oligopéptidos

provenientes de la degradación de la caseína y Per para péptidos que contienen prolina

(Christensen el al, 1999).

En contraste el producto de los genes, pepFZ, pepM, pepP y pepT parecen no estar involucrados en

la pepu'dolisis. Estos genes, asi como pepDA 1, pepA y pepQ, se expresan en bajos niveles y no son

modulados por la fiJente de péptidos. Estos resultados sugieren que podrían no estar involucrados en

la utilización de una fuente de péptidos externa sino más bien cumplir un rol en otros procesos

celulares.

La transcripción de prtP1,.prtP3, per, pepN, pepC, pepDAZy el operón opp-pepOI, que codifican

para los componentes principales del sistema proteolítico de L. Iactis, es controlada por fuentes de

nitrógeno complejas contenidas en el medio M17 y casitona. Dado que la casitona es un hidrolizado

proteolítico de caseína, este resultado sugiere que la señal para la regulación es un péptido o una

mezcla de péptidos. Además de la casitona, los casaminoácidos reprimen la transcripción de prtPl,

prtl’3, pepN, pepC, y el operón opp-pepOI aunque aproximadamente diez veces menos que una

mezcla compleja de péptidos como la casitona. Más aún, la adición de péptidos individuales como

LP o PL en el medio, disminuyen los niveles de transcripción de prlP3, pepN, pepC y opp-pepOI al

mismo nivel que los casaaminoácidos. Para estos péptidos ya se había reportado un efecto represor

en la transcripción de prtl’3 de aproximadamente 10 veces y una disminución en la actividad

enzimática de pepN y per de 1,7 y 1,5 veces respectivamente (Marugg et al, 1995; Meijer et al

1996). Sin embargo, la expresión de Per podn’aestar regulada de manera diferente, ya que en las

condiciones testeadas utilizando la fusión lux, la expresión de per es regulada por casitona pero no

por los dipéptidos LP o PL.

La naturaleza de la señal represora de la expresión de los genes es compleja. La adición de

casaminoácidos o dipéptidos específicos no tiene el efecto represor completo obtenido con la

casitona, esto sugiere que otros péptidos de la casitona pueden ser más activos o que se requiere una

mezcla de péptidos. Es interesante mencionar que el/los factor/es represores presentes en la casitona

son utilizados metabólicamente por L. Iaclis, ya que la duración del efecto represor se correlaciona

con la cantidad de casitona adicionada al medio.

Introducción Parte]. Bacterias Lácricasy Sistemaproreolítico.

5.7.1- Identificación de la señal y del represor en Lactococcus lactis

Con el fin de identificar la señal para la represión de la expresión de van'os genes del sistema

proteolítico y el posible regulador Guédon et al (2001b), construyeron diversas mutantes y

analizaron la expresión de las fusiones lux en diferentes condiciones de crecimiento.

En primer lugar analizaron la expresión de la fiJsión PoppA-lux por la adición de 67 péptidos

agregados individualmente y los clasificaron en péptidos regulatorios (grado de represión de 5 a 10

veces) y péptidos inactivos (de 1 a 1,5 veces). Los 36 péptidos regulatorios contenían al menos uno

de los tres aminoácidos de cadena lateral ramificada (AAsC-LR), I (Isoleucina), L (Leucina) y V

(Valina). Ninguno de los péptidos inactivos contenía AAsC-LR.

Luego encontraron que la incornoración de los péptidos era necesaria para reprimir la transcnnción.

Mutantes del transportador de péptidos DtpT (corroboradas ya que no crecían cuando un

aminoácido era depletado del medio y reemplazado por un péptido que lo proveía), perdían la

represión de la expresión de la fiisión Popp-lux durante el crecimiento en presencia de ese péptido.

El clivaie de los (Mdos era necesario para la represión de la transcripción. Si utilizaban LP o VP

como péptido represor, este efecto desaparecía en una mutante pepQ (recordar que PepQ hidroliza

dipéptidos del tipo X-Pro) indicando que la señal represora dependía de la hidrólisis del péptido en

el citoplasma de la célula).

Por último para determinar si la señal regulatoría eran los AAsC-LR o productos de su catabolismo,

se midió la expresión del operón en una mutante incapaz de catabolizar AAsC-LR que lleva a la

acumulación de los mismos en el citoplasma. La represión por péptidos individuales no se perdió en

esta mutante indicando que la señal no era un producto del catabolismo de AAsC-LR. Cabe destacar

que en la mutante en presencia o ausencia de péptidos regulatorios el grado de represión fiie mayor

a cinco veces, sugiriendo que la acumulación de AAsC-LR era responsable del alto grado de

represión observado. Por lo tanto la señal podría ser el nivel intracelular de AAsC-LR o un producto

del metabolismo secundario que depende de la disponibilidad de estos aminoácidos en la célula.

Para identificar a los factores genéticos involucrados en la represión de la expresión de los genes

mencionados, se realizó una mutagénesis al azar y se seleccionaron aquellos clones que perdían la

represión por péptidos. De las 42 mutantes encontradas 13 poseían inserciones en el mismo gen. El

análisis de la secuencia reveló que este marco de lectura codificaba un péptido de 262 aminoácidos

que comparte un 48% identidad con CodY de Bacillus subtilis y con van'os productos génicos

putativos de genomas parcialmente secuenciados de bacterias Gram-positivas. Como era de esperar

Introducción Parte1. Bacterias Lácricas y Sistemaproteolílico.

la represión ejercida por péptidos individuales en la expresión de la fusión Popp-qu se perdió por

completo en la mutante codY.

En B subtilis CodY fije inicialmente identificado como el represor del operón de la penneasa de

dipéptidos (dpp) y se vio que este regulador estaba involucrado en la represión nutricional de vanos

genes (Slack el al, 1995; Serror y Sonenshein, 1996; Mirel el al, 2000). En L. Iactis CodY regula al

menos tres unidades transcripcionales (pepN,pepC y el operón app-pepOl) indicando que CodY es

un regulador pleiotrópico. Es probable que la regulación de los otros genes regulados por péptidos,

comoprtP, pepDAZy¡2er dependa también de CodY.

La proteína CodY está presente en van'as bacten'as Gram positivas. En B sublilis, media la represión

por casaminoácidos de una docena de unidades transcripcionales (Ramayake-Lecamwasam e! al,

2001) y puede unirse, in vitro, a los promotores de dpp, srfA, comK y hu]. Aunque en L. Iaclis no se

puede excluir un efecto indirecto de CodY en la transcripción de app-pepa si el modelo de

regulación propuesto en B sublilis es válido para L. Iactis, CodY repn'min’a de manera directa la

transcripción de opp-pepOI en respuesta a una señal dependiente de péptidos.

Aunque la pérdida de la represión por péptidos individuales en la mutante codY es completa, aún '

existe un pequeño grado de represión cuando se miden las actividades en un medio completo como

M17, no se puede excluir la posibilidad de que las fuentes ricas en péptidos contengan otros

nutrientes, además de péptidos y aminoácidos, que puedan afectar la expresión independientemente

de CodY. Como ya se comentó, la expresión de 0pp-pep01 se repn'me 10 veces más por casitona

que por péptidos individuales, sugin'endo que su expresión podía estar regulada por al menos un

mecanismo adicional, como todos los genes de B subtilis controlados por CodY (Mirell et al, 2000).

La represión mediada por CodY sen'a independiente de la reSpuesta estricta. En B subtilis la

respuesta estricta no es esencial para la desrepresión de la expresión de dpp, un gen regulado por

CodY y además se ha demostrado que CodY puede interactuar con GTP in vitro, sugiriendo que la

represión nutricional por aminoácidos es mediada vía el pool intracelular de GTP (Ramayake­

Lecamwasam el al, 2001). Es probable que CodY de L. Iactis también pueda unir GTP, pero la

conexión entre los niveles de GTP y de AAsC-LR intracelulares aún no se conoce.

A modo de resumen, un modelo de regulación propuesto para el regulón CodY de L. Iactis, a partir

de los datos disponibles hasta este momento, sen’a(Figura 2)

Los productos claves involucrados en los pasos iniciales de la degradación de proteínas como fiJente

de nitrógeno, la proteínasa PrtP, el transportador Opp, y las peptidasas PepN, PepC y PepOl

(aminopeptidasas generales y una endopeptidasa) pertenecen al regulón CodY. La expresión de

Introducción Parte1. Bacterias Lácticas y Sistemaproteolílico.

estos genes coregulados es reprimida por CodY en respuesta al pool intracelular de aminoácidos de

cadena lateral ramificada. Luego de la degradación de las proteínas y asimilación de péptidos, la

disponibilidad de aminoácidos no sen’a limitante en la célula y CodY repn'min'a funciones cuya

expresión ya no sen'a necesan'a a altos niveles.

Independientemente de la respuesta estn'cta, el pool intracelular de AAsC-LR sen'a un sensor de la

disponibilidad de aminoácidos a través del represor CodY que conducin'a a la represión de los genes

involucrados en la proteólisis.

Figura 2: Modelo de regulación por péptidos vía CodY

En L. Iactis los genes que codifican enzimas importantes involucradas en la utilización de péptidos (Opp,PepN, PepC yPchl) son parte del regulón CodY. Las líneas llenas representan la represión transcripcional de estos genes por codY.La represión putativa de PrtP, Per y PepDA2 está simbolizada por lineas punteadas. También se incluye, como el pooldc AAsC-LR controla directa o indirectamente la actividad de CodY. Por último el pool de GTP es influenciado porvarias vías metabólicas, incluyendo la respuesta estricta, que puede ser inducida por un arresto en la síntesis deproteínas (líneas grises).

I Oligopéptidos._ ProteínasPrtP

--------------------.-----.“al--.

Péptidos

PepNPepC

OtrosPer tPepDA2 “s ‘

AAsC-LR ------ ---> CodY “é”,____M. GTP

Catabolismo AAsC-LR Síntesis de proteínas ___________"a Respuesta estricta

Introducción Parte II

Introducción Parte II. Respuestas a estrés en BAL

2. Respuestas a estrés en Bacterias Acido Lácticas (BAL)

Las bacterias lácticas constituyen un grupo heterogéneo de bacterias que pueden ser encontradas en

diversos ambientes desde el cuerpo humano y animal hasta plantas. Estas bacterias han sido

empleadas desde larga data en la producción de alimentos fermentados derivados de animales

(leche, carne, pescado, etc.) o plantas (vegetales, vino, aceitunas, etc.). La industrialización de las

bio-transformaciones de alimentos aumentó la importancia económica de las BAL. Aunque las

BAL son consideradas un ingrediente de bajo costo en los procesos alimentarios, juegan un rol

fundamental en el desarrollode las características organolépticas e higiénicas de los productos

fermentados. Por este motivo, la fidelidad de los cultivos iniciadores en términos de calidad y

propiedades funcionales (importantes para el desarrollo de aroma y textura), pero también en

términos de optimización del crecimiento y robustez de los mismos, se ha vuelto esencial para

obtener un proceso fermentativo exitoso (Guchte et al, 2002).

Asi, diferentes cepas de BAL, fueron seleccionadas por resistencia a bacteriófagos, por un rápido

crecimiento y acidificación, por sus propiedades proteolíticas, por su resistencia a bacteriocinas,

etc.. Sin embargo, estas cepas deben resistir también a las condiciones adversas encontradas en los

procesos industriales, por ejemplo durante el manipuleo y almacenamiento de los cultivos

iniciadores (liofilización, congelado, secado). El desarrollo de nuevas aplicaciones como vacunas

vivas (Mercenier et al, 2000) y alimentos probióticos (Schiffrin et al, 2001) reafirma la necesidad

de cepas robustas, ya que deben sobrevivir al tracto digestivo, resistir la flora intestinal,

eventualmente colonizar la mucosa digestiva o nro-genital y expresar funciones específicas en

condiciones desfavorables (por ejemplo durante la fase estacionaria, o el almacenamiento). Excepto

para las cepas probióticas donde la alta tolerancia a sales biliares ha sido empleada como un criterio

de selección, las BAL raramente han sido seleccionadas por su resistencia a algún tipo de estrés.

Sin embargo, las bacterias no solo son sometidas a cambios ambientales que potencialmente pueden

someterlas a estrés durante los procesos industriales. En la naturaleza se enfrentan a cambios

drásticos, y es esencial para su supervivencia, la capacidad de responder rápidamente frente a los

mismos.

Las BAL, como cualquier bacteria, poseen sistemas que le permiten sensar las señales de estrés y

soportar condiciones drásticas y cambios ambientales repentinos. En teoría, un microorganismo

podría tener reguladores específicos para cada una de sus funciones y adaptar su expresión de

acuerdo a sus necesidades, pero esto representaría un enorme gasto energético. En realidad, los

reguladores, generalmente controlan varios genes y a veces controlan también a otros reguladores

20

Introducción Parte II. Respuestas a estrés en BAL

(Van Bogelen et al, 1999). Las respuestas a estrés son un buen ejemplo de estos sistemas de

regulación integrados, pues dependen de la expresión coordinada de genes que alteran diferentes

procesos celulares (división celular, metabolismo de ADN, fiJnciones de mantenimiento,

composición de la membrana, transporte, etc.) y actúan en conjunto para mejorar la tolerancia de la

bacteria a estrés. Algunas de estas modificaciones son comunes a varios tipos de estrés mientras

otras son específicas del mismo. Esto tiene como consecuencia que un primer estrés despierte las

respuestas generales que permitan a la bacteria soportar un segundo tipo de estrés con un daño

menor.

El tamaño de los genomas de las BAL es relativamente pequeño, lo cual es consistente con sus

simples capacidades metabólicas. El genoma de Lactococcus Iactis ILl403 contiene 2365589 pares

de bases que codifican 2310 proteinas (Bolotin el al, 2001). Esto es aproximadamente la mitad del

tamaño de Escherichia coli. y de Bacillus subtilis. Aunque es importante destacar que en este

último microorganismo se vio, en un estudio reciente, que de los aproximadamente 4100 genes solo

271 serían indispensables (Kobayashi e! al, 2003). De las 2310 proteinas de Lactococcus Iactis, 138

serían potenciales reguladores, la mitad de ellas clasificadas por su similitud con familias de

proteínas conocidas. Muchos de estos reguladores tienen un rol directo como reguladores

transcripcionales, mientras que otros tienen funciones menos definidas en la regulación

transcripcional o tienen funciones mas generales en el ciclo de vida, como la familia de proteínas

que unen GTP. Una comparación de los reguladores de L. Iactis con los de B. subtilis revela algunas

diferencias claras, probablemente relacionadas con las diferencias ambientales que ambos

microorganismos deben enfrentar. Por ejemplo, hay solo 3 factores o en L. Iactis, mientras que hay

18 en B. subtilis (Bolotin el al, 2001). Durante el crecimiento exponencial el factor sigma RpoD

permite la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción de los llamados “promotores

vegetativos”. Este factor sima en L. Iactis puede ser reemplazado por dos factores sigma

alternativos, ComX y SigX. La función de ComX sería inducir genes de competencia, mientras que

a SigX no se le ha podido asignar una función a partir del análisis de la secuencia (Bolotin et al,

1999, 2001). Más aún L. Iactis posee 8 sistemas de dos componentes contra 34 presentes en B.

subtilis. Ambos tipos de reguladores están usualmente involucrados en la activación de grupos de

genes en respuesta a cambios en las condiciones ambientales (Guédon el al, 2001c).

L. Iactis puede servir como un organismo modelo de minimismo fisiológico Está adaptado a un

modo de vida heterotrófico mientras tiene solo partes rudimentarias de varias vías biosintéticas. A

pesar de su simplicidad ha adquirido una increíble variedad de mecanismos de adaptación y

21

Introducción Parte Il. Respuestas a estrés en BAL

supervivencia para convivir y sobrevivir en ambientes continuamente cambiantes y hostiles

(Konings, 2002).

2.1. La respuesta a estrés osmótico en Bacterias Lácticas, Lactococcus Iactis y Lactobacillusplantarum

En su hábitat natural, los microorganismos son frecuentemente expuestos a variaciones de la

presión osmótica del medio ambiente. La membrana plasmática de las bacterias es permeable al

agua pero constituye una barrera eficaz contra el pasaje de la mayoría de los solutos del medio y los

metabolitos presentes en el citoplasma.

Un aumento brusco de la osmolaridad del medio externo, provoca un rápido eflujo de agua hacia el

exterior de la célula, que en consecuencia provoca una disminución de la presión de turgencia, una

variación de la concentración citoplasmática de solutos y un cambio del volumen celular

(plasmólisis, en los casos extremos). A la inversa, un choque hipotónico provoca la entrada de agua

en la célula, un aumento del volumen celular y de la presión de turgencia. Los dos tipos de

variaciones osmóticas resultan deletéreas para las bacterias, por eso poseen sistemas de transporte

y/o de síntesis de osmoprotectores o solutos compatibles que aseguran el mantenimiento de la

homeostasis por su acumulación en el citoplasma o su expulsión dependiendo del tipo de estrés

osmótico (Csonka el al, 1989). Los solutos compatibles son compuestos orgánicos que pueden ser

acumulados a altas concentraciones en el citoplasma sin interferir con los procesos celulares. De

hecho, varios solutos compatibles son capaces de estabilizar la estructura de enzimas y otras

macromoléculas. La estabilización de la estructura nativa de la proteína involucra una exclusión

preferencial de los solutos compatibles de la superficie de la proteína. La exclusión preferencial

implica que la interacción entre las proteinas y los solutos compatibles es termodinámicamente no

favorable. Como una superficie mayor de la proteína es expuesta en la forma desnaturalizada que en

el estado nativo, la diferencia de energía libre para la transferencia del agua a la solución del soluto

compatible es mayor para la proteína desnaturalizada. Este alto valor de energía de Gibbs positivo,

hace que en presencia de solutos compatibles, la proteina sea termodinámicamente más estable en

su estado nativo que desnaturalizada (Poolman et al, 2002).

El espectro de solutos compatibles identificados comprende, aminoácidos (prolina, glutamato),¿'||4 "ll.uderivados de aminoácidos (ectoína, prolinbetaína), pequeños péptidos (N-m ru u

Introducción Parte ll. Respuestas a estrés en BAL

amida), metilaminas (glicín-betaína, carnitina), ésteres de sulfato (colina-O-sulfato), polioles

(glicerol), azúcares (trehalosa, sacarosa). Los más empleados en el mundo microbiano son glicín­

betaína, ectoína, prolína y trehalosa (Bacterial Stress Responses, 2000). (Figura 3).

Figura 3: Principales osmoprotectores empleados por bacterias

cn, ¡0u,c—x-<:u;—c(

l,‘ \ _ .Iu 0 2

| 0' N+ Lj‘ru, / \ ||_.('

Glicín-betaína Prolina Ectoína

En su ambiente natural, las bacterias lácticas son sometidas a fiiertes cambios en la concentración

de osmolitos en el medio, causados por ejemplo, por la desecación. Y en términos de su empleo en

procesos fermentativos industriales, por ejemplo, durante la salazón en la fabricación de quesos

(Romeo et al, 2001)

2.1.1. Respuesta fisiológica

Un aumento de la concentración de sal en el medio externo provoca un detenimiento del

crecimiento de las bacterias. Asi el crecimiento de L. Iactis en un medio con 2,5% NaCl (0,42M)

(concentración aproximada que se encuentra en ciertos quesos) reduce el crecimiento entre un 25 y

un 50% comparado con el crecimiento a una presión osmótica normal (Kilstrup et al, 1997).

En bacterias Gram negativas como E.coli y S.ophimurium, la respuesta inicial a un aumento de la

presión osmótica del medio consiste en una acumulación de iones K+ en el citoplasma a través de

dos transportadores Trk y de (Laimins et al, 1981; Scholosser et al, 1995). A fin de mantener la

electroneutralidad del medio intracelular, esta acumulación es acompañada por la síntesis de novo

de glutamato. El glutamato de potasio es progresivamente reemplazado por compuestos más

compatibles con los procesos fisiológicos de la célula, principalmente la glicín-betaina (Dinnbier et

al, 1988). Ciertas bacterias pueden sintetizar esta molécula por metilación de la glicina o por

oxidación de colina. Además, estos microorganismos, poseen un sistema de transporte que permite

23

Introducción Parte II. Respuestas a estrés en BAL

una importación rápida y masiva de compuestos del medio, el más importante es ProU, un sistema

que tiene alta afinidad por la glicin-betaína y también transporta prolina (Cairney et al, 1985).

En BaciIIus subtilis un aumento en la osmolaridad externa, provoca también un flujo de potasio

hacia el interior celular (Whatmore et al, 1990). La incorporación de potasio está mediada por dos

sistemas de transporte, uno de alta afinidad (KtrAB) y otro de baja afinidad (KtrCD). A pesar de la

importancia de este ion en'la respuesta a corto plazo, altas concentraciones del mismo podrian

interferir con las fimciones normales de las células. Por lo tanto éstas acumulan gran cantidad de

una variedad de compuestos orgánicos reduciendo la concentración del ion potasio en el intracelular

(Blount y Moe, 1999). B. subtilis es capaz de sintetizar prolina como osmoprotector en condiciones

de estrés osmótico (Kempf y Bremer, 1998) y además si ésta se encuentra en el medio puede

transportarla a través de un transportador específico OpuE (von Blohn et al, 1997). B. subtilis

también puede sintetizar Glicín-betaína a partir de colina que es transportada desde el medio a

través de OpuB y OpuC (Boch et al, 1994). Además la gran variedad de hábitats en los que se

encuentra B. subtilis ofrece una amplia gama de solutos compatibles que son producidos y liberados

al ecosistema.

En las bacterias lácticas, la respuesta difiere a la de bacterias Gram negativas y a la de B. subtilis.

En efecto, el citoplasma de las bacterias lácticas presenta en condiciones normales de cultivo una

concentración de potasio elevada, así como un pool elevado de aminoácidos, siendo abundante el

glutamato (Glaasker et al, 1996a, Glaasker et al, 1998a).

En respuesta a un estrés hiperosmótico, estas bacterias no acumulan potasio o sodio a niveles más

altos a los ya existentes en la célula no estresada.

Glaasker y colaboradores (l996a) determinaron la concentración de varios solutos compatibles en

Lb. plantarum crecido en presencia o ausencia de 0,8M KCI. Mostraron que principalmente los

aminoácidos prolina y glutamato se acumulan en las células crecidas en un medio hiperosmótico.

Como muchas otras bacterias, Lb. plantarum acumula preferencialmente glicín-betaína cuando está

presente en el medio. En ese caso, los niveles de prolina y glutamato son mucho menores que en

ausencia de glicín-betaina. Mientras que la incorporación de prolina y glicín-betaína es activada por

un choque hiperosmótico, no se observa una activación de la incorporación del glutamato.

A diferencia de las Enterobacterias y de B. subtilís, las bacterias lácticas no presentan las vías

biosínteticas para la síntesis de solutos compatibles. Lb. plantarum no es capaz de sintetizar glicín­

betaína, y su rápida acumulación depende exclusivamente de su transporte desde el medio

extracelular.

24

Introducción Parte II. Respuestas a estrés en BAL

Lb. plantarum posee un sistema de transporte de alta afinidad para glicín-betaína (Km: ISpM) y

camitina y de baja afinidad para la prolina (Km: 950trM), denominado QacT (transportador de

compuestos de amonio cuatemarios) (Glaasker et al, l998b).

Un aumento del transporte de glicín-betaína a través de QacT se observa luego de someter a Lb.

plantarum a un choque hipertónico. Cuando la osmolaridad del medio disminuye súbitamente

(choque hipoosmótico) estos compuestos deben ser liberados de la célula. Esto sucede debido a la

apertura de canales (canales mecanosensitivos) en la membrana citoplasmática, a través de los

cuales los osmolitos pueden salir rapidamente (Glaasker et al, 1996a; .Glaasker el al, l998b).

Los estudios en L. lactis demostraron la existencia de un operón que codifica para un sistema de

transporte con alta afinidad para glicín-betaína, llamado BusA u OpuA, cuya expresión aumenta

significativamente después deliun choque hípertónico (Bouvier et al, 2000). OpuA de L. Iactis

pertenece a la familia de transportadores de tipo ABC. En E coli el transportador de tipo ABC,

ProU, está localizado a nivel de la envoltura y está compuesto de tres proteínas: una proteína

citoplasmática que hidroliza ATP (ProV), una proteína de membrana o permeasa (ProW) que

permite el pasaje de la glicin-betaína y un polipéptido periplásmico que une el sustrato (ProX) (May

et al, 1989).

Aunque en L. Iactis el análisis de la secuencia del operón indica que pertenece a la familia de

transportadores ABC, revela una organización diferente. En efecto, el operón opuA está constituido

por dos genes. El primero, opuAA codifica una ATPasa homóloga a ProV. El segundo, opuABC

codifica una proteína homóloga a ProW en su extremo N terminal y a ProX en su parte C terminal.

Así la permeasa OpuAB y la proteína de unión a sustrato OpuAC se encuentran fusionadas

formando una proteína híbrida que une y transporta a la glicín-betaína (Obis et al, 1999).

2.1.2. Regulación genética

En respuesta a las variaciones osmóticas las bacterias han desarrollado sistemas de defensa eficaces

que se basan esencialmente en la acumulación de solutos compatibles dentro del citoplasma. La

activación de estos sistemas necesita que las células perciban las variaciones de la osmolaridad del

ambiente y que esa información se convierta en una señal que desencadene una respuesta a nivel

molecular. La primera parte de la respuesta, la percepción de la señal osmótica, no está totalmente

comprendida.

En L. Iactr's,el sistema de dos componentes KinD/Ler parecen'a estar involucrado en la respuesta

a estrés osmótico o salino. El análisis de mutantes para KinD sugiere que esta proteína es

25

Introducción Parte 11.Respuestas a estrés en BAL

imprescindible para el crecimiento /o supervivencia ya que a pesar de numerosos intentos no

pudieron obtenerse mutantes con ese gen inactivado (O'Connell-Motherway et al, 2000). Trabajos

recientes han asignado un papel importante a la interacción de los transportadores de membrana con

los lípidos en el osmosensado (ver más adelante) (Poolman el al, 2002).

Con respecto a la segunda etapa (la activación de fimciones), la regulación de los genes que

codifican ProU de E coli es el ejemplo más estudiado. No ha sido identificado un regulador

específico de proU y se ha propuesto que probablemente sea parte de un mecanismo más global.

Los resultados obtenidos a partir de sistemas reconstituidos in vitro sugieren que el glutamato de

potasio estimularía la expresión de ProU no por un aumento de la presión osmótica del medio, sino

por una interacción directa de los iones K+ (Pn'nce et al, 1990; Ramirez et a1, 1989). También

existen trabajos en los que se ha demostrado que las variaciones en el grado de superenrollamiento

del ADN en fiinción de la concentración salina jugarían un rol en la activación transcripcional de

proU (Higgins et al, 1988).

En Lb. plantarum la expresión del sistema de transporte QacT es semiconstitutiva e independiente

de las condiciones de osmolaridad (Glaasker et al 1998b). La regulación osmótica de este

transportador está dada por un aumento en la actividad del transportador y no por el aumento de su

expresión.

A diferencia de lo observado en Lb. plantar-um, la incorporación de glicín-betaína en L. Iactis es

sujeta a osmorregulación en dos niveles: expresión génica y actividad del transportador (Bouvier et

al, 2000; Van der Heide et al, 2001). La transcripción del operón opuA es inducida por un aumento

de la salinidad del medio. Esto sugiere la existencia de una o más proteínas capaces de controlar

específicamente la expresión de los componentes del transportador en función de la osmolaridad del

medio. La búsqueda de posibles reguladores de OpuA,permitió poner en evidencia la existencia de

una proteína denominada OpuR, capaz de reprimir específicamente la expresión de opuA (Romeo et

al, 2002). Una mutante del gen OpuR presenta una expresión aumentada de OpuAy prácticamente

constitutiva independientemente de la osmolaridad del medio. El estudio de la secuencia

aminoacídica de OpuR indica que posee un dominio homólogo a los transportadores putativos de

KÏ Por lo que ésta proteína podn’a ser sensible a la concentración de K+del citoplasma y reprimir o

no la expresión de OpuAen función de ese parámetro.

El transportador OpuA no solo actúa como osmorregulador, sino también como osmosensor.

Actualmente se cree que un cambio en la fuerza iónica intracelular sirve como señal primaria para

la activación de los transportadores y kinasas sensoras. En el caso de OpuA la señal es transducida

al complejo proteico a través de alteraciones en la interacción lípido proteína más que por el

26

Introducción Parte II. Respuestas a estrés en BAL

sensado directo de la fiierza iónica por la proteína (Van der Heide et a1, 2001; Poolman et al, 2002).

Las variaciones en la composición de ácidos grasos luego del crecimiento en un medio con alta

osmolaridad (Guillot et al, 2000) podrian afectar también el transporte.

2.2. Identificación de otras funciones involucrados en la respuesta osmótica en LactococcusIactis

Kilstrup y colaboradores (1997) emplearon electroforesis en dos dimensiones para identificar

proteínas inducidas luego de u‘nchoque hiperosmótico en L. Iactis. Encontraron que la mayoría de

las proteínas eran inducidas luego de un estrés con sal o con calor, aunque los grados de inducción

variaban. Dentro de las proteínas identificadas estaban las proteínas generales de estrés GroES,

GroEL, y DnaK. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la inducción de una proteína de

membrana como OpuA probablemente no haya sido detectada debido a las limitaciones inherentes a

la técnica. Otras dos proteínas asociadas a membrana, la proteasa FtsH (Nilsson et al, 1994) y la

proteasa extracelular de mantenimiento, HtrA (Foucaud el al, 2002), también han sido descriptas

con algún efecto en relación a la resistencia al estrés osmótico. Mutantes de estas proteasas

mostraron una sensibilidad aumentada al estrés por NaCl y la transcripción de htrA es

transientemente inducida bajo un estrés salino.

Además de los efectos sobre la tasa de crecimiento y de la composición de los ácidos grasos de

membrana, la osmolaridad del medio afecta la producción de exopolisacárido (Liu et al, 1998) y de

bacteriocinas (Uguen et al, 1999).

2.3. Modificaciones en el grado de superenrollamiento del ADN en respuesta a estrés

Todos los organismos vivientes poseen múltiples mecanismos de defensa contra los cambios

ambientales. Durante la adaptación de las bacterias a distintos tipos de estrés, ocurren cambios

rápidos en la expresión de genes. Dado que el superenrollamiento del ADN varia en respuesta al

ambiente y este superenrollamiento puede influir en la separación de las cadenas del ADN, y por lo

tanto en varios procesos vitales para la célula, incluyendo la transcripción; el superenrollamiento

podn’a servir como un mecanismo modulador a través del cual la expresión de muchos genes puede

ser influenciada por el ambiente.

Introducción Parte II. Respuestas a estrés en BAL

En el 2003, Rui y Tse-Dinh, revisaron la relación entre la topología del ADN y un número de

condiciones de estrés ambientales, incluyendo alta temperatura, estrés oxidativo y pH extremo. Y

aunque en muchos casos cambios en el superenrollamiento del ADN están relacionados a la

supervivencia en diversas condiciones de estrés, el mecanismo involucrado no puede generalizarse

y es propio de cada microorganismo y el tipo de estrés al que se enfrenta.

La actividad de la ADN girasa y la topoisomerasa I son fiJndamentales para determinar el grado de

superenrollamiento del ADN bacteriano. Las ADN topoisomerasas son enzimas que pueden alterar

el estado topológico del ADN y por lo tanto cumplen un papel importante en la replicación,

transcripción, recombinación y reparación del ADN. El ADN en las bacterias es mantenido en

estado superenrollado negativamente. Cambios en el superenrollamiento provocados por

mutaciones en la topoisomerasa pueden influir en la transcripción y en la expresión de un gran

número de genes (Steck et al, 1993).

La ADN girasa, codificada por los genes gyrA y gyrB, es una enzima tetramérica dependiente de

ATP capaz de convertir el ADN relajado en superenrollado negativamente a expensas de la energía

proveniente de la hidrólisis de ATP. La pérdida de esta actividad en las bacterias resulta en un

fenotipo letal. La ADN girasa es sensible a drogas quinolonas, como la cumarmicina y la

novobiocina, que inhiben la actividad ATPasa de la girasa y conducen a una disminución del

superenrollamiento negativo del ADN.

La topoisomerasa I, codificada por el gen topA, es una enzima monomérica que relaja al ADN

superenrollado negativamente a través de un mecanismo independiente de ATP. Las mutantes de E

coli que han perdido completamente la actividad topoisomerasa I solamente pueden ser aisladas en

presencia de mutaciones compensaton'as, usualmente en los genes y gyrB. La pérdida parcial de la

actividad de la topoisomerasa I resulta en un aumento del superenrollamiento negativo del ADN.

Está bien establecido que la función de un promotor, tanto in vivo como in vitro pede ser

influenciada por el grado de superenrollamiento presente en el ADN templado (Steck et al 1993).

Aunque en general el “melting” de la secuencia promotora es favorecido por el superenrollamiento

negativo del ADN, promotores de secuencias distintas responden a los cambios en el

superenrollamiento de diferente manera y no existe una regla general. Por ejemplo, ciertos

promotores se ven fuertemente afectados por cambios en el grado de superenrollamiento

provocados por mutaciones de topA o inhibidores de la girasa, mientras que otros promotores no se

ven afectados por el mismo tratamiento (Gmuender et al, 2001). El nivel del inicio de la

28

Introducción Parte II. Respuestas a estrés en BAL

transcripción de un gen que responde a una condición de estrés debe ser sensible al grado de

superenrollamiento alrededor de la secuencia promotora.

Higgins y colaboradores (1988) describieron, que cambios en al osmolaridad del medio de cultivo

alteran el grado de superenrollamiento del ADN en Salmonella iyphimurium y en E coli; estos

cambios serían responsables de la inducción específica de al menos un locus genético, proU, que

codifica para un transportador de glicín- betaína, y juega un papel fundamental en la adaptación en

alta osmolaridad.

En B. sublilis, el ADN extraído de células crecidas en un medio hiperosmótico presenta un mayor

grado de superenrollamiento negativo que el de células crecidas en un medio normal (Alice et al,

1997). Más aún, el agregado de novobiocina (que impide el aumento en el grado de

superenrollamiento) en concentraciones subletales al medio hiperosmótico inhibe el crecimiento de

la bacteria en esa condición. Estos resultados, apuntan a que este microorganismo requiere un ADN

altamente superenrollado negativamente para enfrentar el estrés osmótico que involucra la actividad

de la ADN girasa.

Introducción Parte III

Introducción Parte III. Envolturas bacterianas

3. Modificaciones de la envoltura bacteriana durante el crecimiento en alta sal.

Los lactobacillus se emplean en formulaciones probióticas con importantes beneficios para la salud

humana y se ha avanzado en el desarrollo de vacunas orales empleando a estos microorganismos

como vehículos (Pouwels et al, 2000). Desde el punto de vista de la selección de cepas para el

desarrollo de formulaciones probióticas, deben ser consideradas características como

hidrofobicidad, resistencia a barreras biológicas como lisozima (cavidad bucal e intestino) y ácidos

(Pelletier et a1. 1997). El intestino, presenta una alta osmolaridad (aproximadamente 0.3M NaCl)

que puede resultar en modificaciones in vivo. La tecnología recombinante, que emplea a los

lactobacilos como vehículos de presentación de antígenos para la producción de vacunas orales,

requiere de una eficiente liberación de los antígenos en ellos expresados (Pouwels et al, 2000). Por

otro lado, en el caso de alimentos fermentados disminuir los tiempos de maduración por adición de

enzimas proteolíticas puras a fin de acelerar la proteólisis como en los quesos (Sanz y Toldrá 1997) y

favorecer la liberación de endopeptidasas por lisis del cultivo iniciador es de uso con'iente (Meijer et

al, 1998; Ruyter et al, 1997). La liberación de peptidasas intracelulares en productos fermentados

acelera los pasos de la maduración y favorece la producción de sabor evitando el amargor. En

ambas tecnologías las características requeridas están relacionadas con constituyentes de las

envolturas de las bacterias ácido lácticas e involucran un estrés osmótico

3.1. Envoltura bacteriana

La envoltura celular de las bacterias Gram positivas consiste en una estructura multilaminar en la

cual se encuentra la membrana plasmática y la pared celular.

La biogénesis de las envolturas es uno de los procesos biológicos fundamentales durante el

crecimiento de los microorganismos, no obstante se sabe muy poco acerca de los mecanismos

involucrados. A pesar de ello, es evidente que el ensamblaje de los componentes de las envolturas

se produce sobre un templado provisto tanto por los lípidos y las proteínas de la membrana

plasmática como por el peptidoglicano de la pared. Por lo tanto el ensamblaje de la envoltura

celular no se lleva a cabo debido a una formación de novo, sino a la extensión a partir de la

inserción de diversos componentes sobre un molde preexistente en la célula. En la Figura 3 se

muestra un esquema de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva.

30

Introducción Parte III. Envalturas bacterianas

3.1.1.Membrana plasmática

Debajo de la pared celular rígida y en estrecha asociación con ésta se encuentra la membrana

citoplasmática, que posee una importancia vital para la célula. Las membranas son responsables de

alrededor del 30% o más del peso celular. Contienen entre 60 y 70% de proteínas, entre 30 a 40%

de lípidos y pequeñas cantidades de hidratos de carbono. Entre los constituyentes principales se

encuentran las fosfatidilenetanolaminas (75%), el fosfatidilglicerol (20%) y los glicolípidos; los

esteroides por lo general están ausentes. Los glicolípidos incluyen diglicosildiglicéridos, hallados

principalmente en las membranas de bacterias Gram positivas, las que también contienen ácidos

lipoteicoicos (ver más adelante).

Diversas actividades enzimáticas se asocian con las proteínas de membrana, sistemas de transporte

a través de la membrana plasmática, citocromos bacterianos y sistema de fosforilación oxidativa (en

aquellas bacterias que los poseen) y varios sistemas de síntesis de polímeros. Hasta un 90% de los

ribosomas pueden aislarse como un agregado ADN-polin'ibosoma-membrana.

En Lactococcus Iactis ha sido descripto el cambio en la composición de los ácidos grasos de la

membrana luego del crecimiento en alta osmolaridad (Guillot el al, 2000).

En otros microorganismos, por ejemplo en Bacillus subtilis también se ha estudiado el

comportamiento de los ácidos grasos y fosfolipidos durante el crecimiento en alta sal (Lopez et a1,

1998)

3.1.2. Pared celular

El componente mayoritario de la pared celular de las bacterias Gram positivas es el peptidoglicano,

aunque también contiene proteínas, ácidos teicoicos y lipoteicoicos y también puede presentar

ácidos teiCur'ónicos y polisa'cáridos.

3.1.2.1. Peptidoglicano

El componente rígido de la pared celular consiste en una única macromolécula gigante, constituida

por una red de uniones cruzadas de peptidoglicano. El componente glicano está constituido

invariablemente por dos arninoazúcares. Estos se presentan como residuos altemados, con enlaces

1-4 de N-acetil-D-glucosamina (GlcNac) y ácido N-acetil-D-murámico (MurNAc). Las cadenas

varían desde 10 hasta 170 unidades de disacárido. Las unidades de glicano y péptidos se unen a

31

Introducción Parte III. Envolturas bacterianas

través del grupo carboxilo del ácido láctico del MurNAc al aminoácido terminal de un tetrapéptido.

Los glicotetrapéptidos están unidos entre sí por las unidades tetrapeptídicas, que forman un marco

continuo. La característica constante del compuesto tetrapeptídico es la presencia de D-alanina, la

que siempre es la unidad de relación entre las cadenas de peptidoglicano.

Figura 4: Esquema de la envoltura de una bacteria Gram positiva

Acido Ieicoico

Proteina asociada a.ia pared

Acido ¡Spore-¡cnica

4.- Peptidugiicam)

Membranacitoplasmática

El compuesto peptídico que se une al ácido murámico en muchas bacterias es el tetrapéptido L-Ala­

D-iso-Glu-meso DAP (o L-Lis)-D-Ala. Las uniones cruzadas entre las dos cadenas de

peptidoglicano se pueden establecer de manera directa o a través de un puente peptídico interpuesto.

Escherichia coli y las demás bacterias Gram negativas establecen las uniones ¡de manera directa,

mientras que Staphylococcus aureus y otras bacterias Gram positivas, como los Lactobacillus,

realizan sus uniones a través de un puente peptídico interpuesto que puede estar constituido por uno

o muchos residuos aminoacídicos. Las uniones cruzadas directas de E coli, se pueden producir a

través de D-Ala-DAP o DAP-DAP, mientras que en los organismos Gram positivos se producen a

través de un puente cruzado D-Ala-(aminoácido)n-L-Lis. En Lactobacillus casei el puente es, D­

Ala-D-Asn-L-Lis (Ambrosini et al, 1996; Billot-Klein et al, 1997). En algunos microorganismos

también pueden incluir uniones cruzadas a través de puentes diamino por ácido isoglutámico, vis

iso-D-Glu(NH-diamino-NH)-D-Ala. En Lb. casei el 59% del peptidoglicano se encuentra O­

32

Introducción Parte 111.Envolturas bacterianas

acetilado (en el N-acetil murámico), similar al 60% encontrado en Lb acidophilus. Aunque el rol

fisiológico de la O-acetilación no está claro, se ha sugerido que servin'a para proteger a las cadenas

de peptidoglicano de la actividad hidrolítica de autolisinas tipo muramidasa (que hidrolizan los

enlaces O-glicosídicos entre los aminoazúcares del peptidoglicano) (Billot-Klein et al, 1997).

Figura 5: Estructura del peptidoglicano de Lb casei

ÓlcNAc-MurNAc-GlcNAc

J,L-AlaiD-Glu

J, s

(D-Ala); L-Lis —>DAsne i

L-Lis —)D-Asn —+L-AlaT

D-GluT

L-AlaT

GlcNAc—MurNAc-GlcNAc

3.1.2.2. Acidos teicoicos y ácidos teicurónicos

Los ácidos teicoicos son polímeros de polioles aniónicos ligados por residuos fosfodiester

repetitivos. Los ácidos teicoicos de la pared celular habitualmente contienen ribitol y en ocasiones

glicerol y están unidos de forma covalente al peptidoglicano a través de grupos fosfodiéster

sustituidos en el oxhidrilo del carbono 6 de los residuos de N-acetilmurámico. Hasta el 50% del

peptidodlicano en los bacilos puede estar combinado con ácidos teicoicos. Los ácidos lipoteicoicos

son polímeros de glicerofosfato que terminan en glucolípido, el cual está fijado en la membrana

33

Introducción Parte III. Envolturas bacterianas

plasmática. En las diferentes bacterias los ácidos teicoicos están modificados de forma específica

por el agregado a las unidades poliol de D-Alanina, D-Lisina mediante enlaces de tipo éster de

glucosa, galactosa o acetilglucosamina unidas por enlaces O-glicosídicos. Los ácidos teicoicos

sustituidos son importantes como antígenos de superficie de especies de Streptococcus,

Staphylococcus, Lactobacillus y Bacillus.

Los ácidos teicurónicos son polímeros compuestos por N-acetilglucosamina y ácido glucurónico,

unidos como una unidad disacárida repetitiva. Los ácidos teicurónicos no contienen fosfato pero

igual sirven como polianiones debido al carboxi10 de los ácidos urónicos. Están unidos al hidroxilo

del carbono 6 del ácido murámico por medio de una N-acetilglucosamina-lfosfodiéster. Los ácidos

teicurónicos se pueden encontrar en una misma célula junto con ácidos teicoicos, los ácidos

teicurónicos se sintetizan cuando las células carecen de fosfato con el cual elaborar los ácidos

teicoicos.

3.1.2.3. Biosíntesis del peptidoglicano

La biosíntesis de peptidoglicano consiste en tres estadios, cada uno de los cuales se produce en un

sitio diferente de la célula:(Figura 6)

1. En el primer estadío que tiene lugar en el citoplasma, las unidades iterativas de la estructura

vertebral de la mureína, N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmuramil-pentapéptido, se

sintetizan en la forma de sus derivados UDP. La D-cicloserina interfiere sobre esta etapa de

síntesis del peptidoglicano por medio de la inhibición de las reacciones que implican la

incorporación de la D-alanina dentro del pentape'ptido.

2. El segundo estadío de síntesis tiene lugar en la superficie interna de la membrana plasmática,

donde el N-acetilmuu "r ‘ r 'r‘idn es transferido del UDP a un lípido transportador y luego

es modificado para formar una subunidad compleja de peptidoglicano naciente. La naturaleza de

la modificación depende del microorganismo. Este estadío termina con la translocación de la

subunidad completa hacia el exterior de la membrana plasmática.

3. El tercer estadío de la síntesis comienza con la polimerización del peptidoglicano por

transglicosilación. El lípido-PP liberado en la reacción se recicla a través de la membrana y es

hidrolizado hacia el aceptor lípido-P. El inhibidor de la pared celular bacitracina interfiere en

este reciclaje por inhibición de la reacción de la pirofosfatasa. La vancomicina y la ristocetina

inhiben la transglicosilasa por unión al péptido terminal D-alanil-D-alanina de sus sustratos. El

estadío 3 de la biosíntesis continúa con la transpeptidación y con la unión del peptidoglicano

34

Introducción Parte III. Envolturas bacterianas

naciente soluble a la matriz insoluble de la pared celular preexistente de peptidoglicano por

ligaduras cruzadas (Figura 5, reacción 4). En algunos microorganismos, las modificaciones por

D, D-carboxipeptidasas pueden constituir una alternativa en esta etapa y dar lugar a la

eliminación de] residuo de D-alanina sin transpeptidación. El estadío 3 de la síntesis de la pared

celular es la fase durante la cual se produce la inhibición por penicilina y otros B-lactámicos.

El último estadío en la síntesis de la pared celular ha sido identificado como la fase durante la cual

se produce la inhibición. El sistema enzimático de uniones cruzadas del peptidoglicano como un

todo, es el blanco inhibido de forma específica por la penicilina. Durante esta etapa, en las cadenas

lineales de peptidoglicano se producen ligaduras cruzadas por una reacción de transpeptidación en

la cual se forma un enlace peptídico entre dos cadenas adyacentes con la eliminación de la D­

alanina terminal. Cuando las bacterias se desarrollan en presencia de penicilina se acumulan

intermediarios de síntesis de la pared celular, nucleótidos de uridina sin uniones cruzadas, y las

nuevas paredes no se pueden formar. La penicilina no solo inhibe las transpeptidasa responsables de

las uniones cruzadas sino también y de forma reversible, las D-alanina carboxipeptidasas, que son

las que eliminan de manera específica la D-alanina de la cadena pentapeptídica lateral. Para explicar

las bases moleculares de la acción de la penicilina se ha propuesto la existencia de una analogía

estructural entre la penicilina y la D-alanil-D-alanina terminal del pentapéptido en el precursor sin

uniones cruzadas de la pared celular. La unión lábil CO-N en el anillo B-lactámico de la penicilina

descansa en la misma posición que la unión peptídica implicada en la transpeptidación. Por lo tanto

se ha propuesto que la penicilina, que actuaría como un análogo del sustrato de la transpeptidación

normal, se combina con la transpeptidasa y así la inactiva de forma irreversible. Los anillos [3­

lactámicos se comportan químicamente como agentes acilantes, que reaccionan para producir

derivados peniciloicos. De esta manera se produce la acilación del sitio activo de la enzima con

formación de un complejo inactivo bastante estable.

35

Introducción Parte III. Envolturas bacterianas

Figura 6: Biosíntesis del peptidoglicano que muestra los sitios de acción de varios inhibidoresdela pared celular

UDP'Y‘ UDP-GIcNAc4‘ o—— PEP

D'GIU A, D-Glu, Bé x f

P——- D-Ala-D-Ala¿LTD-Ala7‘3L—Ala ®

UDP'rÁ‘AA D-Cialoseíina

D-qlilu

D-ieila

D-A'a UMP UDP-GIcNAc DPCITOPLASMA\7<i INTERNO Iipíio-P Ikido-PP-M/ Iípido-PP}A—G

pg Pi Pemapépíido penlapépiidoM

B BaCIrracina-- un)R lípido-PP-subnidad completa

a iipido-PP

A Iipido-PP-subunidadcompleta ®i.-.E.z<_T.I_E.RNo 1

----Mo-—G4—Mo—C4- MO—G.­

VancomicínaRisroceli‘na ‘

lipid -PP- Afo- G-—M¿—G.—Pépiido

beptidoglicano nacienteIípido- P-MC- G.­

Péi’flido é Pé'piido A Pégmo

En] Peni I/In Dhélu

mi“ e 15 D-ÏQCIO ©H\N/C NHaíli lipépii'do; (pérlflidoi H/N\C/CH3----l\"io—G----- ""M"‘G"' H’ \COOH

hidrólisis controlada.. . , ' ' oad acentenueva iranspeptidaCIon pephdoghcan' yunidad sinlelasa

peplidoglicanode pared celular

36

Objetivos

Objetivos

Aunque los componentes del sistema proteolítico de bacterias lácticas han sido ampliamente

estudiados, sólo en el último tiempo se ha comenzado a estudiar la regulación de los mismos y la

mayon'a de los estudios se han realizado en lactococcus Iactis. Hasta el momento no se ha

analizado si existen modificaciones de las actividades del sistema proteolítico cuando Lactobacillus

casei es sometido a un efector de estrés. En particular el estrés salino, debe ser enfrentado por este

microorganismo durante procesos fermentativos y en el tracto gastrointestinal. Por estos motivos el

objetivo principal de este trabajo fire:

> Estudiar las modificaciones genéticas, fisiológicas y estructurales que sufre Lactobacillus casei

cuando crece en un medio de elevada concentración salina, principalmente relacionadas con

cambios en componentes de su sistema proteolítico.

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

l. Cepas y transformaciones

1.1. Cepas y plásmidos y utilizados.

C93 Genotiporelevante OnlggLadobaa'llus casei Curada del plásmído IATA'|

ATCC 393 pLZl Sque codifica unReclasificada Lactabaciüus sistema lactosa permeasa/ [3

zeae galactosidasaLactabacillus casei EmrLb casei ATCC 393 Esta tesis

ATCC 393 dtpT dtpT luego de larecombinación homóloga de

¿RV3 00 drpTLadobacillus delbrueckíi Dr Raúl Raya, CERELAb

ladis LKT

Ladobaa'llus delbrueckü Dr Raúl Raya, CERELA"bulgaricus 420

Escherichia coli supE hsdA5 thi A(-Iac- Stock del laboratorio.TGl proAB) F’ (traD36proAB+

IacI" lacZAMl 5)Plásmidos

pGEM-T easy Apr,M13 ori pBR3220n', Promegavector de clonado deproductos de PCR.

pNZ273 Cm', derivado del pNZlZ4, NIZO°contiene el gen gusA de E

, coli sin su propio promotor.pRV300 Er’, Apr, vector integrativo, Monique Zagorec, INRAd

carece de un origen dereplicación gara Gram+

' Instituto de Agroquímica y Biotecnología de Alimentos, Valencia, España.

bCentro de Referencia para Lactobacillus, Tucumán, Argentina.

° NIZO, Food Resarch and Technology.

dInstitut National de Recherches Agronomiques, Jouy-en-Josas cedex, Francia.

38

Materiales y Métodos

1.2. Obtención y transformación de células competentes de Escherichia coli.

Las células competentes de Escherichia coli se prepararon tal como describe Hanahan (1983) con una alta

eficiencia de transformación

Brevemente: un cultivo de 16hs. fire diluído 1/60 en medio LB y crecido durante 3-4 hs.. Luego fue

oentrifugado 10 min. a 10.000rpm a 4°C y el pellet resuspendido en solución beI fría y mantenido en

hielo durante 5 min Posteriormente las células fueron centrifugadas al igual que en el paso anterior y el

pellet resuspendido en lml. de beII. Se alicuotaron las células de a 50ul y fueron conservadas hasta su

uso a —70°C.

Para la transformación se tomaron 50 ul de células competentes y se les agregó de 5-10 ul del plásmido

(l ug/ul) de interés. Se dejó 30 min. en hielo, se rulizó un choque térmico de 90-120 segundos a 42°C y se

colocó en hielo durante 2 min. Las células se diluyeron en 2001.11de LB líquido y se incubaron l hora a

37°C con agitación. Posteriormente se hicieron diluciones en LB y se sembraron en placas de selección

con el Ampicilina lOOpg/ul.

1.3. Obtención y transformación de células competentes de Ladobaa’llus por electroporación.

A partir de un cultivo de 16 hs. de Lactobacillus, se realizó una dilución 1/10 en MRS, 1% glicina y se

incubó a 37°C l hora. Las células se cultivaron hasta una DOsso entre 0,4 y 0,6.

El cultivo se enfrió en hielo 15 min, se oentrifugó a 4 °C y se lavó dos veces con bufi‘er fosfato potásico

5 mM pH 7,4 con MgClz SmM a 0 °C.

Tras los lavados las células se resuspendieron en 0,5 ml de PEB (“phosphate electroporation buffer”)

[0,3 M sacarosa; l mM MgClz; buffer fosfato potásico 5 mM pH 7,4 ] y se repartieron de a 50

microlitros en tubos eppendorf y fueron conservadas hasta su uso a —70°C.

A 50 ul de células se le añadió el ADN plasmídico en no mas de 5 microlitros (0,05 -4 microgramos) y

se electroporaron en cubetas de 0,2 cm de distancia en las siguientes condiciones: 25 microF, 1250 V

(6250 V/cm) y 100 Ohms. Las células se resuspendieron en MRS (lml volumen final) se incubaron l

hora a 37°C y se sembraron en placas de MRS con Cloranfenicol Spa/p.10Eritromicina ungl.

39

Materiales y Métodos

2. Técnicas moleculares

2.1. Técnicas moleculares básicas

Se siguieron los procedimientos estandar de clonado en Escherichia coli y electroforesis de ácidos

nucleicos en agarosa tal como se describe en Sambrook et al, 1989. Los fragmentos de ADN se aislaron

de geles de agarosa utilizando GFX‘IDPCR DAN and Gel Band Purification Kit de Pharmacia

Biosciences.

Las digestiones de ADN se realizaron con enzimas de restricción según las recomendaciones del

fabricante (Promega)

2.2. Extracción de ADN de Ladobaa'llus

Se recogieron por centrifugación las células de 10 ml de un cultivo en fase exponencial en MRS y se

lavaron con 10 ml de EDTA 50 mM

El pellet se resuspendió en 600 ul de Tris HCl 50 mM, EDTA 20 mM con Smg/ml de lisozima y 30 U

de mutanolisina y se incubó 2 hs. a 37°C.

Luego se agregó RNAsa 0,1mg/ml y proteínasa K 0,2 mg/ml

Las células se lisaron añadiendo SDS o Sarkosyl hasta una concentración final del 1% y se incubaron

durante 2 hs. a 50 °C o 16 hs. a 42 °C.

Se realizaron 2 extracciones con fenol/clorofonno/isoamílico (2522421)y otras 2 extracciones con

cloroformo/isoamílico (24: l).

Los ácidos nucleicos se precipitaron con 2 vol de etanol o 0,6 vol de isopropanol (dependiendo del

volumen final alcanzado) a -20 °C al menos l hora. En algunos casos luego de colocado el etanol el

ADN se recuperó empleando una varilla de vidrio, se dejó secar bien y la varilla se dejó toda la noche a

4 °C en agua o buffer TE (Tris HC] 10 mM pH 8, EDTA 1 mM). De esta manera se obtiene el DNA

menos fragmentado y libre de sales.

Cuando se realizó la precipitación, el ADN se recuperó por centrifugación, se lavó con etanol frío al

50% se secó, se resuspendió en 50 ul de TE y se guardó a 4 °C.

2.3. Extracción de ARN de Ladobacillus

Materiales y Métodos

Se resuspendió el pellet de 20-30 ml de cultivo DOsso 0,800 en 500 ul de Tris SOmMEDTA 2 rnM pH

8, acetato de amonio 0,2 M pH 4 (La solución resultante tiene pH 7).

Se agregó 1 vol de fenolzcloroformo ácido precalentado a 70 °C. Se mezcló bien empleando un

“vortex” y se calentó a la misma temperatura durante 5 min

Se volvió a mezclar con “vortex” y se dejó a temperatura ambiente durante 2-3 min. Se centrifugó 15

min a 13000 rpm a 4 °C.

Se tomó la fase acuosa y se precipitó el ARN con 1/10 de volumen de NaCl 5M y 2 volúmenes de

etanol. Se mantuvo a -20 °C al menos 2 horas.

Se centrifugó durante 15 min a 13000 rpm a 4 °C, el pellet se lavó con etanol 70% y se resuspendió en

50 ul de agua DEPC.

Para los ensayos de RT-PCR a una alícuota de ARN (aproximadamente 25 ug) se le agregaron 5 ul de

DNAsa (IU/ul) (Promega) y se incubó 30 min a 37 °C.

La DNAsa se inactivó calentando durante 15 min a 65 °C.

La ausencia de ADN en las muestras se oorroboró empleando la muestra de ARN como templado en

una reacción de PCR

Todas las soluciones que se emplearon en el protocolo de extracción fueron libres de RNAsa (Ambión).

2.4. Aislamiento de ADN plasmídico

El ADN plasmídico de Escherichia coli se aisló por el método de lisis alcalina según se describe en

Sambrook et al, 1989. Para el aislamiento de plásmidos para transformar L. casei ATCC 393 se

emplearon las columnas Qiagen-n'p100 (Qiagen GmbH). La extracción de plásmidos de Lb.casei, se

realizó siguiendo el mismo protocolo pero con una incubación previa a la lisis con Lisozima Smg/ml y

30 U de mutanolisina durante 2 hs. a 37 °C.

4l

2.6. Oligonucleótidos usados como cebadom

Materiales y Mélodos

Nombre Secuencia Criterio para el diseño deloligonucleótido

dtpT ldtpT2

5‘-TCAACAYYHGTTGGAGGCTGG - 3‘5‘-ACCNAHTGCAGCTAATGAGAA - 3‘

Oligonucleótídos degeneradosdiseñados a partir del análisis de lacomparación de secuencias de lasproteínas DtpT de LactococcusIacn'sy Lactobacillus helveticus

prtPlprtPZ

5‘-TCTCGGTI‘A'ITGACACTGGC —3‘5‘-ATCGTTGCTTGAAAGCTGAA —3‘

Derivados de la secuencia de pnPde Lactabacillus paracasei subspparacasei NCDO 151 (denucleótidos 2882-2302 y 2985­3005 respectivamente).

AReróslARerósZ

5‘-ACTGAGACACGGCCCAAA —3‘5‘-CGCA'ITTCACCGCTACACA —3‘

Derivados de la secuencia denucleótjdos de ARerós deLactobacillus casei ATCC 393 (denucleótidos 330-347 y 691-709respectivamente).

pelepepQ2

5‘—GACTTTGCYTTCMAGATYGGT —3‘5‘-MCCTGG'ITCAATGGAGAAGCA —3‘

Oligonucleótidos degeneradosdiseñados a partir del análisis de lacomparación de secuencias de lasproteinas PepQ de Lactabacillusdelbrueckii, Lactobacillus pentosusy Lactobacillus helveticus

perlperZ

5‘-TTGCGCTACAGCTC'ITGG —3‘5‘-TI‘CGCGATAGTAATCATACC —3‘

Oligonucleótidos diseñados a partirdel análisis de la comparación desecuencias de las proteinas Pepxde Lactobacillus rhamnosus yLactobacillus helveticus.

promPlpromPZ

5‘—TTGGATCC'I'I'I‘A’I'I‘CTAGCGTI‘GGC- 3‘5‘-'ITCTGCAGAGAACCAAATCAAACCC- 3‘

Derivados de la secuencia de prlPde Lactobacillus paracasei subspparacasei NCDO 151 (denucleótidos 1398-1423 y 1592­1607 respectivamente). Losnucleótidos subrayados indicansitios de restricción para BamHI enpromPl y para PstI en pxomPZ.

Los oligonucleótidos fueron obtenidos de Biosynthesis Incorporated, resuspendidos en agua estéril a

una concentración de 250uM y luego se realizó una dilución de trabajo de 25uM

42

Materiales y Métodos

2.5. Reacción en cadena dela polimerasa (PCR).

Las condiciones de rwcción para un volúmen de muestra de Soul fueron:

Buffer de Taq ADN Polimerasa (Promega o Gibco-BRL) 1X, MgClz 2,5mM, IU Taq ADN Polimerasa

(Promega o Gibco-BRL), dNTPs 0,2 mM, 10-50 ng de ADN templado y 0,5uM de cada cebador

(“primer”). En general cuando se usaron cebadores degenerados la concentración de los mismos fue de

1 a 2,5pM

Las temperaturas utilizadas para la reacción fueron las siguientes: un paso de desnaturalización inicial

de 5 min a 94°C seguido de 30 ciclos de 30 seg. a 94°C, 60 seg. a 50°C y 60 seg. a 72°C. Cuando fue

necesario, la temperatura deli‘paso de aparcamiento del cebador (“annealing”) fue modificada a la

temperatura indicada para cada oligonucleótido y si los amplicones eran mayores a 2,5Kpb se aumentó

el tiempo del mismo a 90 seg.

Cada reacción de PCR fue analizada por electroforesis en gel de agarosa 0,8% ó 1,5% en buffer TAE

(Tris acetato 40mM, EDTA lmM pH=8,0). Después de la tinción del gel con bromuro de etidio

Ing/ml. los geles fueron examinados con luz UV y fotografiados con una película Polaroid 667 o

digitalizados empleando un Fuji Las 1000 y el programa Image Gauge 3.122 (Fuji Film).

2.7. RT-PCR semicuantitativa

Para la transcripción reversa se emplearon 3 ug de ARN de cada muestra. El ADNc fue sintetizado

empleando 25 pmoles de los cebadores reversos específicos, prtP2 y ARerósZ. El ARN y los

cebadores se calentaron a 95°C durante 10 min (para eliminar las posibles estructuras secundarias del

ARN), se colocaron inmediatamente en hielo 2 min y se incubaron con lOOUde M-MLV transcriptasa

reversa (Ambion) durante l hora a 42 °C y por último 10 min a 92 °C.

Para realizar la cuantificación relativa de los niveles de ARNm, se calculó el número de ciclos

necesarios para alcanzar la fase exponencial de amplificación En esa fase, la cantidad de amplicones es

proporcional a la cantidad inicial de templado. Para ello se realizaron racciones de PCR entre 16 y 28

ciclos usando una cantidad fija de ADNcdeprtP y ARerós

El número de ciclos para prtP fue, 22 ciclos secuenciales a 95°C por 30 seg, 57°C por lmin y 72°C 1

min y para el ARNr 163, 12 ciclos a 95°C por 30 seg, 50°C por 1 min y 72°C 1 min. En la PCR se

emplearon, 3 ul de ADNc sin diluir, diluido 1/5 y 1/25 en agua.

43

Materiales y Métodos

15 pl de los productos de PCR de prtP y el ARNr 165 se sembraron en un gel de agarosa 2% y se

tiñeron con bromuro de etidio 1 ug/ml. En todos los casos se realizó un control de ausencia de ADN en

las muestras de ARN utilizando esas muestras como templado en la reacción de PCR. El análisis

densitométrico se realizó empleando el Fuji LAS 1000 y el programa Image Gauge 3.122.

2.8. Southern Blot

El ADN fue digerido con la enzima de restricción indicada y sembrado en un gel de agarosa 0,6%. El

gel fue teñido con bromuro de etidio l ug/ml y fotografiado. Posteriormente el ADN fue depurinizado y

desnaturalizado colocando el gel 10 min. en HCl 0,25M y 30 min. en NaOH 0,5N. El ADN fue

transferido a una membrana de nylon (GeneScreenTMNEN‘o Life Science Products) durante 90 min.

por vacio en un Vacuum Blotter (Bio Rad) y posteriormente fijado a la membrana colocándola 5 min.

en luz UV. La membrana fue prehibridada durante 2hs. a 50°C en solución de prehibridación (SSC 6X

[ClNa 52,59g/l, citrato de Na 26,46g/1], Denhardt’s 2X [Ficoll 0,2g/1, Polivinilpirrolidona 0,2g/l,

seroalbúmina bovina 0,2g/l], SDS 0,1%). Luego esta solución fue descartada y se colocó la solución de

hibridación (SSC 6X, fosfato de sodio ZOmM pH=7,5, Políetilenglicol (PEG) 8000 5%, ADN de

esperma de salmón lOOug/ml y la sonda correspondiente) y se incubó a 50°C durante 16-l8hs.. El

ADN utilizado para bloquear y el de la sonda fueron desnaturalizados previamente hirviendo las

muestras 10min. Los lavados fueron: durante 20 min. en SSC 2X/SDS 0,1% y de igual manera en SSC

0,2X/SDS 0,1% a temperatura ambiente; luego se rmlizó un lavado final una vez durante 20min. en

SSC 0,2X/SDS 0,1% a 45°C- 55°C según el caso.

El revelado fue realizado por quimioluminiscencia con PhototopeO-Star CDP-STAR (New England Bio

Labs), según describe el fabricante y las autorradiografias Kodak expuestas distintos tiempos en un

cassette Kodak Biomax MS o las membranas directamente analizadas en el Fuji LASIOOO.

Las sondas fueron marcadas por “random primers” con el sistema BIOPRIMEO DNA Labeling System

(Gibco-BRL) como indica el fabricante o por PCR agregando dCTP biotinilado a la mezcla de dNTPs.

2.9. Northern Blot

Materiales y Métodos

Para el Northern Blot, el ARN de cada muestra se corrió en geles desnaturalizantes con formaldehído.

Para eso se preparó el buffer de corrida con formaldehído 5X (0,1 M MOPS (pH 7), 40 mM acetato de

sodio o amonio pH 4, 5 mM EDTA (pH 8)). El gel se preparó fundiendo la cantidad apropiada de

agarosa ( entre 0,8 y 1.2%) en agua. A la agarosa mantenida a 60°C, se le agregó buffer 5X y

formaldehído 12.3 M en una relación: 3,5: 1,1:1 respectivamente. También se agregó bromuro de etidio

0,5 ug/ml final.

Las muestras se prepararon de la siguiente manera:

RNA (hasta 30 microgr.) 4,5 microlitros

buffer 5X 2,0 microlitros

formaldehído 3,5 microlitros

formamida 10,0 microlitros

Las muestras se incubaron 15 min a 65 °C y se enfriaron en hielo. Se centrifugaron durante 5 seg. para

depositar todo el líquido en el fondo del tubo.

Se agregaron 2 microlitros de buffer de siembra para ARN y se sembraron en el gel.

El gel se corrió a 80-100 Volts durante 2 hs. (el azul de bromofenol debe migrar aprox 8 cm).

Luego de la corrida, se alineó una regla transparente y se fotografió por transiluminación con UV.

El gel se lavó 2 veces con agua, 5 min. con agitación y luego durante 30 min. con SSC 10X para RNA.

La transferencia y revelado de la membrana se realizó igual que para el Southern Blot, salvo que luego

de fijado el ARN, se coloreó 1-2 min. con azul de metileno 0,03% en Acetato de sodio pH 5,2 0,3 M

Se lavó con agua hasta decolorar y se visualizaron los ARN ribosomales (de esta manera es facil

comparar la posición de las bandas con las que se observan en la autorradiografia).

2.10. Obtención de una mutante dtpT en Lb. casei ATCC 393

Los cebadores dtpTl y dtpT2 fueron utilizados para amplificar un fi'agmento del gen dlpT de Lb.

delbrueckii lacris. El fiagmento amplificado fue clonado en el vector pGEW-T Easy Vector

(Promega) de acuerdo a las indicaciones del proveedor y con la mezcla se transformaron células

competentes de Ecoli TGl. Las células se plaquearon en medio LB en presencia de ampicilina 100

ug/ml. Se seleccionó un clon que contenía el plásmido con el inserto dtpT. La presencia del inserto se

45

Materiales y Métodos

corroboró por PCR usando los cebadores dtpTl y dtpT2. El plásmido fue digerido con las enzimas

ApaI y PstI para liberar el fragmento dtpT. El fragmento obtenido fue subclonado en el plásmido

pRV3OOdigerido con las mismas enzimas. La ligación se realizó con Ligasa T4 (Promega) 16 hs. a 15

°C y la mezcla fue empleada para transformar células competentes de E. coli TG]. Se seleccióno uno

de los clones resistentes a ampicilina y la presencia del inserto dtpT se corroboró por PCR y por

restricción empleando las enzimas adecuadas. El plásmido se amplificó y se purificó empleando

Qiagen -tip 100 y se usó para transformar a Lb. casei ATCC 393 por electroporación Las células

fueron plaqueadas en medio MRS que contenía eritromicina a una concentración de 5 ¡ag/ml. El

plásmido pRV3OOno posee un origen de replicación para Gram + por lo tanto solo podrán crecer en

eritromicina aquellos clones donde se produjo la inserción del plásmido en el cromosoma de Lb casei

por recombinación homóloga a través del gen dtpT, provocándose la interrupción del mismo. Se

seleccionó uno de los clones crecidos en esa condición y se corroboró la identidad de la mutante por

Southern Blot, empleando ADN digerido con la enzima XbaI que tiene un sitio de corte en el plásmido.

2.11. Purificación de CodY(hisa) de B. sublilis .

La proteína CodY de B. subtilis se purificó a partir de un extracto de la cepa de Escherichia coli

KSZ72, para emplearla como un control positivo en ensayos de Western Blot. Esta cepa lleva el

plásmido pBAD30 con el gen codY completo de B subtilis. Es un vector de expresión controlada a

través de un promotor inducible por arabinosa. Esta construcción fusiona el gen codY a una serie de

nucleótidos que resultan en la expresión de una proteína con el agregado de varias histidinas (colita de

histidina). Esto permite a partir del extracto, obtener y purificar la proteína CodY utilizando el

protocolo que se describe.

Un cultivo de E. coli KSZ72 se creció hasta una DOsso de 0,6 y se le agregó Arabinosa hasta una

concentración final de 0,2%. Luego de 5 hs., se centrifugó el cultivo y se resuspendió en buffer de lisis

(NaH2P04 SOmMpH=8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM), se sonicó en presencia de bolitas de vidrio

de 106 micrones (Sigma) 3 ciclos de 20 seg. El sobrenadante obtenido luego de centrifugar la muestra

fue pasado por una columna de Ni-NTA (Níquel-ácido nitrilotriacético) (Ni-NTA Spin Columns,

Qiagen) y la proteína purificada como indica el fabricante. La muestra obtenida luego de la purificación

fue sembrada en un gel SDS-PAGE (Laemmli 1970) para verificar la purem de la proteína. Se observó

46

Materiales y Métodos

que la proteína CodY de B. subtilis era muy abundante en el extracto y no se encontraba en extractos de

la cepa de E. coli sin inducir.

2.12. Electroforesis de proteínas

Se siguó basicamente la técnica SDS-PAGE de Laemmli, 1970.

2.13. Ensayos de Western Blot

Para la detección de la proteína PrtP con anticuerpos, se hirvieron células enteras durante 5 min en

buffer reductor con SDS (Tris HCl 62,5 mM, pH 6,8; Glicerol 8,7% p/v, SDS 2%, 2-mercaptoetanol

5% v/v, azul de bromofenol 0,05% p/v) y las proteínas se separaron en un SDS-PAGE 7,5% en buffer

de corrida (Tris base 15 g/l, Glicina 72 gl], SDS 5 g/l) con una cuba Mini-Protean° II Electrophoresis

Cell (BioRad). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Nitrobind, Msci) en

buffer de transferencia (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, Metanol 20% v/v) empleando un Mini Trans

BlotQ Electrophoretic Transfer Cell (BioRad). Brevemente la membrana se bloqueó toda la noche en

buffer TES-Tween (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05%), con BSA 2% (seroalbúmina

bovina). Luego se incubó con un sobrenadante de un hibridoma que contenía un anticuerpo monoclonal

anti PrtP de Lactococcus lactis diluído 1/10, en el mismo bufi‘erpero conteniendo BSA 0,2% durante 2

hs. El anticuerpo anti PrtP fue adquirido en IMENZ Bioengineering (The Netherlands). La membrana

se lavó 3 veces durante 2 min con buffer TBS-Tween y luego se incubó con un anticuerpo anti ratón

biotinilado obtenido en conejo. Nuevamente la membrana se lavó 3 veces en el mismo buffer y el

revelado fue realizado por quimioluminiscencia con PhototopeO-Star CDP-STAR (New England Bio

Labs), según describe el fabricante, y se analizó en el Fuji LASIOOO.

2.14. Inmunoprecipitación de CodY de Lb.casei

250 ul (aproximadamente 400 ug) de extracto, obtenido a partir de células de Lb casei crecidas en la

condición indicada, se incubaron con una dilución 1:200 del anticuerpo anti CodY de B subtilis,

durante 2,5 hs a 4 °C en un agitador rotatorio. Los extractos se obtuvieron a partir de células

resuspendidas a una D0550nm= 15 y sonicadas en buffer fosfato de sodio 50 mM pH6,8, DTI‘ l mM y

47

Materiales y Métodos

PMSF 0,1 mM en presencia de bolitas de vidrio (Sigma). Se realizaron 4 ciclos de 30 seg con

intervalos de 1 min en hielo.

Transcurrido ese tiempo se agregaron 20 ul de proteína AG Agarosa (Santa sz Biotechnology) y se

incubó toda la noche a 4 °C en un agitador rotatorio.

El pellet se centrifiigó a 1000 x g durante 30 seg a 4 °C y se lavó 3 veces con PBS repitiendo el paso de

centrifugación cada vez.

El pellet se resuspendió en PBS y empleó en ensayos de gel shift.

2.15. Ensayos de Gel shift y Western Gel shift

El ensayo de Western Gel shifi permite revelar el retardo de un fragmento de ADN marcado por la

formación de un complejo ADN proteína, así como identificar si una proteína en particular está

formando parte de ese complejo empleando anticuerpos específicos.

Un fi'agmento de ADN biotinilado de la región promotora de prtP de aproximadamente 200 pb. se

incubó con extractos celulares de Lb. casei ATCC 393 provenientes de distintas condiciones de

crecimiento. El ensayo se realizó en un buffer de pegado (KCl 25 Mm, EDTA ZmM, Glicerol 7,5%,

BSA 0,1 ngml y 3 pg poli dI-dC ). Como control de sonda libre se incubó el fi'agmento marcado sin

extracto. Las muestras se incubaron durante 30 min a 30 °C.

Transcurrido ese tiempo se les agregó buffer de siembra para ADN (6X azul de bromofenol 0,25%,

glicerol 30%) y se corrieron en un gel de poliacrilamida 5 o 7,5 % en buffer TAE (Tris-acetato 0,04M,

EDTA lmM) entre 1-1,5 hs.

Para el gel shift, el gel se transfirió a una membrana de Nylon por electroü'ansferencia en buffer TBE

0,5X. La membrana se fijó y se reveló por quimiolumíniscencia con PhototopeO-Star CDP-STAR New

England Bio Labs, según describe el fabricante y se analizó en el Fuji LASIOOO.

Para el Western Gel shift el gel se transfirió simultáneamente a dos membranas de acuerdo al siguiente

esquema: Gel-membrana de Nitrocelulosa- papel Whatman- membrana de Nylon La transferencia se

realizó durante 1,5 hs. en Buffer de transferencia (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, Metan0120% v/v).

En este protocolo las proteínas quedan unidas a la primer membrana de nitrocelulosa y el ADN

atraviesa la primer membrana y queda retenido en la membrana de nylon

La membrana de nylon se reveló por quimioluminiscencia con Phototopeo-Star CDP-STAR New

England Bio Labs, según describe el fabricante y se analizó en el Fuji LASIOOO.

48

Materiales y Métodos

La membrana de nitrocelulosa de reveló como un Western Blot. Brevemente la membrana se bloqueó

toda la noche en buffer TES-Tween (Trís 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05%), con BSA 2%

(seroalbúmina bovina). Luego se incubó con un anticuerpo policlonal anti CodY de B subtilis hecho en

conejo, en el mismo buffer pero conteniendo BSA 0,2%. El anticuerpo anti CodY fue gentilmente

cedido por el Dr Sonenshein. La membrana se lavó 4 veces 20 min con buffer TES-Tween y luego se

incubó con un anticuerpo anti IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina. Nuevamente la

membrana se lavó 4 veces en el mismo buffer, se reveló por quimioluminiscencia empleando el

rmctivo PhototopeO-Star CDP-STAR New England Bio Labs, y se analizó en el Fuji LASIOOO.

3. Comparación del grado dé‘superenrollamiento del ADN.

3.1. Cálculo dela diferencia en el linking number entre dos muestras.

La diferencia en el “linking number” (ALk) (cambio en el número de veces que las dos cadenas del

ADN se entrecruzan) para un ADN circular está dado por:

ALk = AWr + ATw

donde AWr es el cambio en el “writhe” o torcedura del ADN (que describe la trayectoria del duplex de

ADN en el espacio) y ATw es el cambio en el “twist” o nivel de enroscado del ADN (número de pares

de bases por vuelta de la doble hélice de ADN)

3.1.2. Detenninación del ALken geles de agarosa con cloroquina

La cloroquina es una gente intercalante que desenrrolla la hélice de ADN (ATw negativo). Cuando la

cloroquina se une a una molécula de ADN circular cerrada, debe haber un cambio compensatorio

positivo en el AWr , porque el ALk no puede cambiar si el duplex se mantiene intacto. Por lo tanto, la

unión de la cloroquina al ADN reduce su “twist” y aumenta su “writhe”.

Un plásmido moderadamente superenrollado negativamente (AWr negativo) corre como una única

banda que migra rápido en un gel que no contiene cloroquina. En un gel que contiene cloroquina en

49

Materiales y Métodos

baja concentración, el plásmido une pequeñas cantidades de cloroquína que resultan en la pérdida de

algunos superenrollamientos que provocan un retardo en la migración y logran resolver algunos o todos

los topoisómeros. A concentraciones más altas de cloroquína, una suficiente cantidad de cloroquína

está unida al ADN como para desenrollar todos los superenrollamientos negativos y los topoisómeros

se encuentran relajados y migran con el círculo abierto (AWr =O). Más cloroquína en el gel origina

topoisómeros superenrollados positivamente (AWr positivo) que nuevamente vuelven a migrar más

rápido. A concentraciones aún más altas de cloroquína los topoisómeros migran como una única banda

de rápida movilidad una vez más. (Ver esquema de migración de topoisómeros)

Una vez resueltos los topoisómeros, para calcular la diferencia en el Lk entre dos muestras, se realiza

un análisis densitométn'co de los topoisómeros obtenidos a una concentración dada de cloroquína .

Cada pico corresponde a un topoisómero resuelto. La distancia entre los picos máximos (calculada

como número de picos) me da el valor del ALk sin necesidad de conocer el Lk de cada uno y permite

comparar el grado de superenrrollamiento de ambas muestras.

3.2. Preparación de ADN plasmídico y determinación del ALk

El plásmido pNZZ73 se empleó como reportero para calcular las diferencias en el grado de

superenrollamiento del ADN en las diferentes condiciones de crecimiento. Para ello, Lb.casei ATCC

393 se transformó con el pNZ273 por electroporación. Los plásmidos se extrajeron a partir de cultivos

en fase exponencial crecidos en MRS o CDM con cloranfenicol 5 ¡ug/mlen presencia o ausencia de

NaCl 0,7M y suplementado con los péptidos indicados. 200 ng de ADN se analizaron en geles de

agarosa 0,8% que contenían cloroquína 6 ¡ig/ml (se empleó esa concentración de cloroquína ya que

permitió separar correctamente el mayor número de topoisómeros). La electroforesis se realizó en

bufl'er TAE que contenía la misma concentración de cloroquína que el gel y se comieron durante 24 hs.

a 35 Volts. Los geles se lavaron en agua destilada cuatro veces 40 minutos cada vez, se tiñeron durante

1-2 hs. en bromuro de etidio lug/ml y se lavaron con agua destilada durante 30 min.

La imagen de los geles fue dígitalizada empleando el Fuji LAS 1000. El análisis de los picos se realizó

con el programa Image Gauge 3.122 (Fuji Film, Japan). La diferencia en el linking number (ALk) entre

50

Materiales y Métodos

las condiciones de crecimiento se obtuvo por inspección visual del análisis densitométrico como se

explicó anteriormente.

Esguema de migración de togoisómeros en función dela concentración de cloroguina en el gel

[cloroquina]’—>

0 + ++ +++ ++++

_ — CCC

CA: círculo abierto

CCC: círculo covalentemente cerrado

4. Determinación de actividades enzimáticas

4.1. Actividad PrtP

La actividad PrtP se midió empleando células enteras. Un cultivo en fase exponencial de crecimiento se

centrifugó y el pellet se lavó con bufi‘erTris HCl 50 mM pH 6,8 suplementado con ChCa 20 mM y las

células se resuspendieron en el mismo buffer a una D0550=50. Una alícuota se empleó para medir

Sl

Materiales y Métodos

concentración de proteínas y el resto se congeló a —20°C hasta su uso para determinar actividad

enzimática.

180 ug de la suspensión celular se incubaron con 900 ul del sustrato N-succinil-Ifalanil-Lralanil-Lr

prolil-fenil-alanin-4-metil-coumaril-7-amida (ICN) 100 [AMa 37 °C durante 30 min. La reacción se

detuvo por el agregado de 2 ml de ácido acético 1,6M. Luego de centrifugar la fluorescencia liberada al

sobrenadante se midió en un espectrofluorómetro SLM 4800 sometiendo la muestra a una onda de

excitación de 375 nm y midiendo la emisión a 440 nm.

La actividad específica se calculó como Unidades de Fluoresencia (UF) por minuto por miligramo de

proteína. Para los ensayos de afinidad se emplearon 100, 80, 40 y 20 uM de sustrato.

4.2. Actividad Pepx y PepI

La actividad de estas peptidasas se ensayó empleando células premeabilizadas.

Un cultivo en fase exponencial de crecimiento se centrifugó y el pellet se lavó con buffer Fosfato de

sodio 50 mM pH 6,8 y las células se resuspendieron en el mismo buffer a una D0550=20.Una alícuota

se empleó para medir concentración de proteínas y el resto se usó en el momento.

100 ul de células permeabilizadas se incubaron con 70 ul de sustrato (20 mM) en un volumen final de

700 ul en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8.

Para ensayar la actividad Per se empleó el sustrato cromogénico glicil-prolil-p-nitroanilida y para

Pep I, prolil-p-nitroanilida (Sigma). Las muestras se incubaron 30 min a 37 °C (este tiempo fue

seleccionado porque se observaban las máximas diferencias entre las muestras). La reacción se detuvo

por el agregado de ácido acético 85% (v/v). Luego de centrifugar, la liberación de nitroanilida en el

sobrenadante se midió a 410 nm La actividad específica se expresó como nmol de nitroanilida liberado

por minuto por miligramo de proteína, empleando un coeficiente de absorción e=8800 l/M cm

4.3. Actividad PepQ

La actividad PepQ se ensayó también empleando células permeabilizadas con el método de Cadmío­

ninhidrina. Las mezclas de reacción contenían 100 ul de células permeabilizadas y 100 ul de sustrato

(Len-Pro 2 mM). Se incubaron durante 30 min a 37 °C. La reacción se detuvo por el agregado del

reactivo Cadmio-ninhidrina (Ninhidrina 50 mM, C12Cd55 mM). El reactivo se preparó disolviendo 0,8

52

Materiales y Métodos

gr de ninhidrina en 80 ml de etanol, se agregaron 10 ml de Acido Acético Glacial y l gr de C12Cd

disuelto en 1 ml de agua destilada. Las muestras se calentaron a 84 °C durante 5 min, se centrifugaron y

el color en el sobrenadante se midió a 505 nm Con el valor obtenido se ingresó en una curva de

calibración realizada con Leu y Pro libres y se determinó la concentración de Leu y Pro liberada en

cada muestra. La actividad específica se expresó en nmol de Leu y Pro liberados por minuto por

miligramo de proteína.

4.4. Actividad proteolítica por degradación de [3-caseína

La actividad de células enteras provenientes de cultivos en leche, se evaluó midiendo la degradación de

[3-caseína (Sigma) en geles de poliacrilamida.

Para ello 100 ml de un cultivo en fitse exponencial de crecimiento en leche se colocó en hielo y se

agregó 1/10 vol de citrato de sodio 1M Se centrífugó a 8000 rpm durante 15 min a 4 °C.

El pellet se lavó en 2 ml de citrato de sodio 2% p/v. Para ello se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min a

4 °C.

El pellet se resuspendió en Tris HCl 50 mM pH7 C12Ca20 mM y se centrifugó a 5000 rpm, 5 min a

4°C. Se repitió el procedimiento una vez más y se resuspendió el pellet en 300 ul del mismo buffer.

Se tomo una alícuota para medir concentración de proteínas y el resto se congeló a - 70 °C hasta su

uso.

180 ug de células, llevadas a un volumen de 500 ul con buffer Tris HC] 50 mM pH7 ClzCa 20 mM, se

incubaron con 500 ul de una suspensión de B- caseína (5,4 mg/ml) durante 0, 2 y 4 hs a 30 °C. A los

tiempos indicados se tomaron 250 ¡.11y se les agregó 7 ul de PMSF (40 mM). Se centrifugó a 13000

rpm durante 5 min y a 100 ul del sobrenadante se le agregó buffer para proteínas. Las muestras se

hirvieron durante 3 min, se centrifugaron y el sobrenadante se sembró en un SDS PAGE 20%. Luego

de la corrida, el gel se tiñó con Coomasie Blue y se observaron las bandas de degradación de B-caseína

a los distintos tiempos de incubación

5. Ensayos de pared

53

Materiales y Métodos

5.1. Sensibilidad a mutanolisina de células enteras

Células enteras provenientes de cultivos en MRS o MRS NaCl 0,7M, de fase exponencial y

estacionaria de crecimiento, se resuspendieron a un Dom inicial aproximada de 0,6 en buffer fosfato

de sodio 50 mM pH 6,5 o en el mismo bufier con NaCl 0,7M Las supensiones se incubaron a 37 °C

con 0, 25 U/ml y 100 U/ml de mutanolisina. A los tiempos indicados se tomó una alícuota y se midió

Dom para evaluar la lisis celular.

5.2. Obtención de paredes por tratamiento con SDS

El pellet obtenido a partir de 300 ml de un cultivo en fase exponencial; se resuspendió en ‘/zvolumen

de agua y se agregó 30ml de SDS 4% y se calentó en baño de agua en ebullición durante 30 minutos.

Luego se dejó enfriar a temperatura ambiente y se volvió a centrífuga: a 3000 x g para precipitar

aquellas células que no se habían lisado. El sobrenadante correspondiente se centrifugó a 18000 x g a

25°C durante 20 minutos. El pellet resultante se resuspendió en 30ml de agua destilada y se calentó en

baño de agua a ebullición por unos 5 minutos. Se volvió a centrifugar a 18000 x g por 20 minutos a

temperatura ambiente. El pellet se lavó 5 veces con agua estéril y luego fue fraccionado y resuspendido

en lml de bufi‘er Tris HCl 100mM-20mM MgSO4 pH=7. Estas suspensiones fueron incubadas 2 horas

a 37°C con DNAsa 30ug/ml y RNAsa SOungl. De esta forma se hidroliza el DNA y RNA que puede

quedar adherido a la pared y dar por ende resultados erróneos en las determinaciones de fósforo y

azúcares. Posteriormente se incubaron las suspensiones a 37°C durante toda la noche con tripsina

SOOug/mly CaClz 10 mM de forma tal de hidrolizar la DNAsa, RNAsa y las proteínas remanentes. La

tripsina es una endoproteinasa que actúa únicamente sobre aminoácidos de configuración L y no sobre

el péptidoglicano que contiene aminoácidos tanto de configuración L como D. Este tratamiento elimina

aminoácidos presentes en el PG como impurezas.

La tripsina file luego inactivada calentando 5 minutos a 100°C. La pared se obtuvo por centrifugación a

18000 x g, se lavó con solución fisiológica, se resuspendió en agua destilada y se congeló a —20°C.

5.2.1.Sensibilidad a mutanolisina de paredes purificadas

Se ensayó el efecto de la mutanolisina sobre la pared celular purificada de células provenientes de las

condiciones indicadas. Para ello se prepararon suspensiones de las paredes obtenidas por tratamiento

54

Materiales y Métodos

con SDS en cubetas adaptables al espectrofotómetro Metrolab 325 BD (l ml) en buffer Tris HCl

lOOmM-MgSO420mM pH=6,8. Las suspensiones se prepararon de forma tal de que las densidades

ópticas iniciales fueran similares. La mutanolisina se empleó a una concentración de 27 U/ml. Las

suspensiones se incubaron a 37°C y se monitoreó la variación en la densidad óptica a intervalos de 10

minutos.

Apéndice Medios de Cultivo

Medios de cultivo

Medio MRS Medio Luria-Bertani (LB).Polipeptona 10 g/l Peptona de caseína 10 g/l.

Extracto de carne 10 g/l Extracto de levadura Sg/l.

Extracto de levadura 5 g/l ClNa lOg/l.

Glucosa 20 g/l Agar (cuando era necesario) ng/l

Tween 80 1,08 g/l

Fosfato dipotásico 2 g/l

Acetato de sodio 5 g/l

Citrato de Amonio 2 g/l

Sulfato de Magnesio 0,2 g/l

Sulfato de Manganeso 0,05 g/l

Medio leche suplementada

Leche en polvo descremada reconstitnída 100 g/l

SO4Mg 0,6 mM

SO4Mn 0,3 mM

Tween 80 lml/lt

Buffer fosfato de sodio pH7 50 mM

Extracto de levadura 1 g/l

Cada componente se prepara por separado y se autoclava ( principalmente la leche que NO DEBE MEZCLARSE CONSALES) y luego se mezcla hasta obtener las concentraciones adecuadas.

Soluciones

beI. beIIAcetato de Potasio 30mM. MOPS lOmM.

ClK lOOmM. C12Ca 75mM.

ClzCa lOmM. ClK lOmM.

C17Mn SOmM. Glicerol 15%.

Glicerol 15%. pH=6,5 con KOH

pH=5,8 con ácido acético.

Medio CDM para LactobacillusSe prepararon soluciones stock de doble concentración y se esterilizaron por el metodo que se indica. En el momento deusar el medio las soluciones se mezclaron como indica la tabla 2. El medio CDMN se realizó agregando NaCl a laconcentración indicada en cada caso. La mezcla resultante se filtro y se empleó para el crecimiento de Lb casei ATCC393. El procedimiento Xcomposición se muestra en la tabla .Solución Stock de observaciones 100 ml

100 ml (2X) CDM 2X{en ml!

l-Acetato sódico 4 g Autoclavar 121°C 15 min 10Tween 80 2 ml

2A-Nazl-{PO4 1,52 g Autoclavar 121°C 15 min lONaH2P04 1,98 g

ZB-KCl 6 g Autoclavar 121°C 15 min 10Citrato diamónioo 4 g

3- (4X)MnSO4 30,4 mg Autoclavar121°C 15 min 50,8g4- Autoclavar 121°C 15 minL-Asparragina 200 mg 10Glicina 200 mgL-Triptofano 200 mgL-Serina 200 mgL-Alanina 200 mgL-Fenilalanr'na 200 mgL-Histidina 200 mgL-Isoleucina 200 mgL-Leucina 200 rngL-Lisina 200 mgL-Metionina 200 mgL-Prolina 200 mgL-Treonina 200 mgL-Valina 200 mgL-Ar inina 200 mg5- L-Tirosina 200 mg Preparar en NaOH 0,01M. 10

Autoclavar121°C 15 min6- (1X)L-Cistelna 500 mg Preparar en el momento. 4L-Glutamina 500 mg Filtrar7- (1X)Acido paraaminobenzoico 4 mg Filtrar. Proteger de la luz. 2Pin'doxalAcido nicotínico 5 mgAcido fólico 17 mgPantotenato de Calcio 3,2 mg

10 mg8- Riboflavina 20 mg Disolver en Acido Acétioo l

0,02N. Filtrar. Proteger dela luz

9- Adenosina 80 rng Calentar para disolver. 10

10- Guanina 80 mg Se prepara en NaOH lO0,15M. Filtrar

ll-Uracilo 80 mg Se pgara en KOH0,1M 1012- Tiamina 200 gg Filtrar. Proteger de la luz. 0,113- Agu_aesteril Autoclavar 5,4

EL Glucosa40% 40 gr Filtrar 2,5

Apéndice Medios de Cultivo

57

Resultados

Resultados I. Rol de los péptidos en Ia osmoprotección.

CAPITULO I

Rol de péptidos en la osmoprotección en Lactobacillus casei ATCC 393

Las bacterias lácticas (BAL) cumplen un papel muy importante en los procesos fermentativos

lácteos y cárnicos e influyen en la calidad y la preservación de los productos finales. El rol primario

de las BAL es la producción de ácido láctico a partir de carbohidratos que resulta en una

disminución del pH así como la proteólisis para liberar pequeños péptidos y aminoácidos libres.

Estos compuestos afectan el sabor y textura de los productos.

La disminución de la actividad de agua por agregado de azúcar o sal es un método tradicional

empleado para preservar alimentos de la putrefacción y de bacterias patogénicas y es un paso muy

importante durante la maduración de ciertos quesos. La estrategia principal de las bacterias para

adaptarse a la alta osmolaridad consiste en la acumulación de osmoprotectores que aumentan la

osmotolerancia. El principal soluto compatible descripto en BAL es la glicín betaína (Romeo et al. ,

2001). Las BAL no son buenas transportadoras de prolina libre, aunque éste aminoácido ha sido

descripto como un buen osmoprotector en otras bacterias y su contenido en la caseína es de un lO a

un 35%. Además de los solutos compatibles clásicos, en Listeria monocytogenes donde la prolina

solo es un buen osmoprotector a altas concentraciones (10 mM) se describió que el agregado de

péptidos exógenos conteniendo prolina aumentaba la osmotolerancia (Amenzaga et a1. , 1995).

Decidimos comparar el crecimiento de Lb. casei ATCC 393 en presencia de distintos efectores de

estrés hiperosmótico y evaluar, principalmente, el rol que podían cumplir los péptidos en la

osmoprotección.

1.1 Crecimiento de Lb casei ATCC 393 en medio hiperosmótico

Evaluamos el crecimiento de Lb casei ATCC 393 en medio mínimo y completo a diferentes

concentraciones de NaCl, como efector de estrés osmótico. A fin de diferenciar estrés osmótico de

estrés salino iónico también se ensayó el efecto de sacarosa y glicerol (Tabla l).

58

Resultados I. Rol de los péptidos en la osmoprotección.

Tabla l: Velocidad de crecimiento de Lb. casei ATCC 393 en diferentes condiciones decrecimiento

' u, Velocidad de crecimiento en hs “'.Se muestra la velocidad de crecimiento calculada a partir de un cultivo en fase exponencial y entre paréntesis la Domfinal alcanzada. También se muestra la relación entre la velocidad de crecimiento en la condición control y en presenciadel efector de estrés indicado.

Medio CDM + p‘ y (D050 final) u control/ Medio MRS + p.y (D050 final) p.control!

p.estrés u estrés

0,16M NaCl 0,217 (2,28) l - 0,481 (5,94) 1

(control)

0,4M NaCl 0,210 (2,08) 1,03 0,4M NaCl 0,461 (5,27) 1,04

0,7M NaCl 0,095 (1,02) 2,28 0,7M NaCl 0,341 (3,75) 1,40

1M NaCl 0,023 (0,31) 9,4 1M NaCl 0,114 (2,1) 4,18

Sacarosa 1M 0,276 (3,22) 0,78 Glicerol 1M 0,358 (5,83) 1,34

Glicerol 2M 0,147 (2,3) 3,26

En todas las condiciones, salvo en Sacarosa 1M, se observó una disminución del crecimiento en el

medio hiperosmótico. El efecto observado fire proporcional a la concentración del efector de estrés

empleado. La sacarosa no resultó un buen efector de estrés debido a que Lb.casei utilizó la sacarosa

como fuente de carbono, esto se reflejó en el aumento de la velocidad de crecimiento observado.

Para una misma concentración (por ejemplo 1M) la disminución del crecimiento fue mayor

empleando NaCl como efector de estrés que glicerol (p. NaCl= 0,114 vs u glicerol= 0,35). Es

importante tener presente que durante el crecimiento en presencia de sal el microorganismo se

encuentra sometido tanto a un estrés osmótico así como a un estrés salino. Igualmente, decidimos

continuar nuestros experimentos empleando NaCl, ya que es el aditivo que se emplea en

preservación de alimentos y durante la maduración de quesos de pasta dura.

59

Resultados I. Rol de los péptidos en la osmoprotección.

Como se observa en la tabla 1, la osmotolerancia de este microorganismo fue mayor en un medio

complejo como MRS que en un medio mínimo como CDM.

La osmotolerancia observada puede ser atribuida a los componentes presentes en el medio

complejo. Asumimos que la principal contribución podía deberse a la presencia de peptona en el

medio MRS (1,5% p/v).

Como se muestra en la figura 1, el agregado de peptona de carne 0,1% p/v al medio CDMN (CDM

conteniendo 0,7M NaCl) resultó en una curva de crecimiento prácticamente idéntica a la de CDM

control.

Para todas las concentraciones de NaCl evaluadas se observó que el agregado de peptona de carne

0,1% p/v produce un efecto estimulatorio en el crecimiento en medio hiperosmótico. Mientras que

la adición de la peptona de carne 0,1% p/v al CDM resultó en una estimulación del crecimiento de

aproximadamente 2 veces (pCDM= 0,217i0,055 y uCDMpc = 0,452i0,011), el mismo agregado

en CDMN, resultó en una estimulación del crecimiento de 2,5 veces en CDMN 0,7M (uCDMN=

0,095j: 0,011 y uCDMNpc = 0,237i0,018) y de 6,7 veces en CDMN 1M ((uCDMN= 0,023i0.005

y uCDMNpc = 0,155i0,001) (Figura 2). La amplia diferencia en la velocidad de crecimiento en

presencia de peptona de carne en un medio hiperosmótico (CDMN vs CDMNpc), comparada con la

diferencia observada por agregado de la misma en medio control (CDM vs CDMpc) indicaba que

los componentes presentes en la misma no sólo ejercían un efecto nutricional sino un importante

efecto osmoprotector durante el crecimiento en alta sal.

1.2 Compuestos osmoprotectores en la peptona de carne

Considerando que la peptona de came aportaba sustancias que podían actuar como

osmoprotectores, decidimos desglosar los componentes presentes en la misma, para determinar

específicamente cuales ejercían ese rol. La peptona de carne, presenta altos niveles de camitina, un

conocido osmoprotector, además de una alta proporción de péptidos y pocos aminoácidos libres.

60

Resultados I. Rol de lospéptidos en la osmoprotección.

Figura l: Efecto de la peptona durante el crecimiento en medio mínimo en alta osmolaridad

Crecimiento en CDM (cuadrados) y CDMN 0,7M (círculos) en presencia (símbolos negros) o ausencia (símbolosvacíos) de peptona de came 0,1%

tiempo (hs)

Figura 2: Efecto estimulatorio de la peptona de carne durante el crecimiento en CDM adistintas concentraciones de NaCl.

Se muestra la velocidad de crecimiento en CDM en presencia de NaCl a las concentraciones indicadas en el gráfico enpresencia (barras blancas) o ausencia (barras grises) de peptona de carne 0,1%.

ooppobhbeb omomo

oho0.155

0,15

0,10 <

0,05

0,00

o,1 y m

CDMOJÓMN cmo,4w CDMOJMN CDM¡MN

velocidaddecrecí-¡ente[ls-1]

obM

61

Resultados I. Rol de lospéptidos en la osmoprotección.

1.2.1. Rol de la camitina en la osmoprotección.

Determinamos la velocidad de crecimiento de Lb. casei en medio CDMN suplementado con

camitina a distintas concentraciones de NaCl. Empleamos varias concentraciones de camitina, para

determinar la concentración óptima como osmoprotector (Figura 3).

Como se observa en la figura 3, en ausencia de NaCl la camitina no estimula el crecimiento de Lb

casei, pero a medida que aumenta la concentración de sal en el medio las diferencias en el

crecimiento en ausencia y presencia de camitina se acentúan. Aunque al aumentar la concentración

de NaCl, observamos un efecto de la camitina dependiente de la concentración de la misma, no

observamos diferencias a concentraciones de camitina mayores a 2,5 mM. Esto probablemente se

deba a la saturación del sistema de transporte de esta amina cuatemaria. Por lo tanto, esta

concentración fue seleccionada para los ensayos.

Figura 3: Efecto de camitina en el crecimiento de Lb casei en función de la concentración deNaCl presente en el CDM.

Rombos, camitina 0 mM; cuadrados camitina lmM; triángulos camitina 2,5mM y círculos, camitina 5 mM.

l_0o _¡

velcree(hs-1)

0,001 . I . . u

[NaCI]

1.3 Rol de los péptidos en la osmoprotección

Las peptonas son una mezcla compleja de péptidos derivados de la hidrólisis de proteínas animales

o caseína y contienen alrededor de un 80% de péptidos y un 20% de aminoácidos libres. En el caso

particular de la peptona de caseína, ésta presenta un alto número de péptidos que contienen prolina.

62

Resultados I. Rol de los péptidos en la osmoprotección.

Decidimos investigar el rol estimulario de diferentes di y tripéptidos. Para ello comparamos la

velocidad de crecimiento en presencia de distintos péptidos en medio CDM, en ausencia o presencia

de NaCl 1M (Figura 4).

Como se indica en la figura, el efecto nutricional ejercido por los péptidos es despreciable

comparado con su efecto en la osmoprotección. Consideramos un factor de dos veces o más como

indicativo de este efecto. Con este criterio, ni la prolina ni la Prolil-hidroxiprolina serían utilizados

como osmoprotectores en-Lb. casei, a las concentraciones testeadas. Esto puede deberse a un

transporte poco eficiente de este aminoácido; en Listeria monocytogenes es necesaria una

concentración de prolina de 19 mM para que actúe como osmoprotector (Beumer et al, 1994). Tanto

di como tn'péptidos mostraron un rol importante en la osmoprotección, independientemente de si

contenían o no prolina. La glicín-betaína ejerció un rol osmoprotector comparable al de la carnitina.

Cabe destacar que en el caso de la peptona de carne, el efecto osmoprotector es mucho mayor que el

efecto nutricional (6,7 veces de estimulación del crecimiento en un medio hiperosmótico, contra 1,7

veces en un medio control). De acuerdo a nuestros resultados, en este caso se observaría un efecto

aditivo por la presencia de péptidos y camitina en la peptona de carne.

1.4 La leche como proveedora de péptidos para la osmoprotección.

Decidimos evaluar el crecimiento de Lb. casei ATCC 393 en leche en presencia de NaCl. Los

procesos fermentativos lácteos emplean a la leche como sustrato para el crecimiento y es en este

medio donde el microorganismo se puede ver sometido a variaciones en la osmolaridad del medio

por agregado, por ejemplo, de sal.

A pesar de que el crecimiento de Lb. casei en leche es pobre, comparado con el crecimiento en

medio CDM o MRS, las diferencias observadas en el crecimiento de este microorganismo en leche

con y sin NaCl a una concentración de 0,7M son similares a las observadas en medio complejo

como MRS (uLeche= 0,144 y uLecheN= 0,177) (Figura 5).

63

F...O.O..0OO...OOO.OO.OO...OOOOOOOOOOOVOOQOOO0.0...

Resultados I. Rol de los péptidos en la osmoprotección.

Figura 4: Rol de péptidos en la osmoprotección

Velocidad de crecimiento (p) en función de los compuestos agregados. El gráfico superior corresponde a CDM y elgráfico inferior a CDMN 1M. E1 número dentro de las barras representa el factor de estimulación (p. con aditivorespecto a nada). Los aminoácidos fueron agregados a una concentmción de 2,5 mM y los di y tri péptidos a 5 mM

u ms")0,6

0,5

0,4 “

0,3

0,2

0,1

Mhs")o,15— T

6,70,1 —

5,2 5:4

0,05­

lil lm‘ lu! |25| ¡2.7,o [‘17 1,6 I Im!o N 0 o

e“ 6° 04‘ 0° g‘° <z‘° 9° 6° v3w o\\ o es ‘o' O 41‘ ‘o’

qc’ v° 9 Q Q‘OÑ‘ Q8

64

Resultados 1.Rol de los péptidos en la osmoprotección.

Figura 5: Crecimiento de Lb.casei en leche y en lecheN 0,7M en función del tiempo.

Los cuadrados representan el crecimiento en leche y los circulos en leche con NaCl 0,7M

00550

H0.1

tlempo (hs)

La leche se caracteriza por presentar un alto contenido de caseína entera, pocos péptidos y escasos

aminoácidos libres.

La bacteria depende para su crecimiento en este medio de un sistema proteolítico que le permite

degradar la caseína, transportar los péptidos hacia el intracelular, degradarlos y utilizar los

aminoácidos para la síntesis de sus propias proteínas. Considerando que hemos observado que los

péptidos pueden actuar como osmoprotectores, éstos podrían ser los responsables de la alta

osmorresistencia encontrada durante el crecimiento en leche. Sen'a de esperar, entonces, que las

actividades de aquellos componentes del sistema proteolítico que actúan como proveedores de

péptidos, se modificaran durante el crecimiento en un medio hiperosmótico.

65

Resultados II. Actividades de componentes del sistema proteolítico.

CAPITULO II

Modificaciones de las actividades de los componentes del sistema proteolíticodurante el crecimiento en alta sal

En el capítulo I se demostró el rol de los péptidos en la osmoprotección. En L monocytogenes, se

observó la acumulación de pequeños péptidos que contenían prolina y glicina como solutos

compatibles (Amezaga el ql, 1995). En ese trabajo, la concentración intracelular de péptidos se

modifica en respuesta a la alta osmolaridad. Es probable, entonces, que las actividades de las

peptidasas intracelulares también se modifiquen.

2.1. Actividades de peptidasas y proteasas durante el crecimiento en un medio hiperosmótico

A fin de comprobar si los péptidos contribuyen a un aumento de la concentración intracelular de

prolina (conocido osmoprotector) analizamos tres peptidasas intracelulares específicas para

péptidos que contienen prolina, PepQ, PepI, y Pepx. PepQ, es una prolidasa que cliva dipéptidos

del tipo X-Pro, PepI es una proliniminopeptidasa que cliva prolina del extremo N terminal de

péptidos de más de tres residuos. El efecto conjunto de ambas peptidasas conduciría a un aumento

del pool de prolina en el citoplasma.

Analizamos las actividades de estas enzimas en distintas condiciones de crecimiento, como se

indica en la tabla 2.

En presencia de péptidos, la actividad específica PepQ se mantuvo, y no varió de manera

significativa en presencia de sal. La actividad específica PepI, en cambio, disminuyó en presencia

de péptidos y la represión se perdió en presencia de sal.

Decidimos analizar las actividades de Per y PItP. Estas fueron analizadas en las mismas

condiciones de crecimiento ensayadas para PepI y PepQ y en presencia de péptidos individuales.

PrtP y Per pertenecen al grupo de enzimas principales del sistema proteolítico en BAL.

Resultados II. Actividades de componentes del sistema proteolln'co.

Tabla 2: Actividades específicas de PepQ y PepL

Ambas actividades fueron medidas empleando celulas permeabilizadas como se indica en materiales y métodosprovenientes de cultivos en fase exponencial de crecimiento en la condición indicada.' Actividad especifica: nmoles de Leu y Pro Imin mg.b Actividad especifica: nmoles p-nitroanilida Imin mg.ND no determinado.

Condición de crecimiento Asp"lPepQ Aspb PepI

CDM 13,1:t2,2 2,44i0, 18

CDM pc 0,5% l7,7:t2,5 l,67i0,l7

CDMN 0,7M pc 0,5% 18,5126 2,26:t0,13

CDMN0,7M 2,44i0,15

Tabla 3: Actividadesespecíficasde Per y Prtp

Las actividades fueron ensayadas con células penneabilizadas para Per y con células enteras para PrtP como Sedetalla en materiales y métodos.a Actividad especifica: nmoles p-nitroanilida Imin mg.b Actividad especifica: unidades de fluorescencia (UF)/ min mg.

“tw.

Aspa Pepx AspbPrtP

Agregado CDM CDMN CDM CDMN

Nada 78.0:L-0.7 122.2:l:l.2 28:|:5.6 57:l:11.4

Ala-Ala-Ala SmM 41.3:|:2 120.7:l:6 15:l:3 57:l:11.4

Ala-Pro SmM 54.4d:2.7 128.6i6.4 20i4 595:]1.8

Leu-Pro SmM 39.6:t1.9 103.4:t5.1 l3:l:2.6 54:l:10.8

Carnitina 2,5 mM ND ND 25i5 56:t12

Peptona de carne 0.1% 51.8:t0.5 87.9i0.8 21:l:4.2 36:l:7.2

Peptona de carne 0.5% 38.9il.5 55.17i2 7:l:l.5 18.2:l:3.6

Tn'ptona 0,5% 37.4i1.8 70.35:t2.5 8il.2 20:t2.5

Como se observa en la Tabla 3, la actividad de Per (X-prolil-dipeptidil- aminopeptidasa) fue

reprimida por péptidos, como ya había sido reportado en Lactococcus lactz's (Guedon et al, 2001).

67

'00...OOOOOOOOOOOOOODCOOÓOOOOOOOQQOOOOQOOOOOOOO...

Resultadole Actividadesde componentesdel sistemaproteolítica.

Sin embargo, en un medio con alta concentración de sal se perdió la represión y la actividad

aumentó notablemente.

A fin de encontrar un método adecuado para medir la actividad proteolítica PrtP, determinamos la

actividad de esta enzima por SDS-PAGE con B caseína como sustrato. Empleamos células enteras

(PrtP se encuentra anclada a la pared de la bacteria) provenientes de cultivos en leche, ya que en L

lactis se observa la máxima actividad caseinolítica en este medio y comparable a la de CDM. En la

figura 6 se observa la desaparición de la banda correspondiente a B caseína a lo largo del tiempo.

Aunque este método resultó efectivo para poner evidencia la actividad de esta enzima, el cálculo de

la actividad específica requiere incubaciones prolongadas y un análisis densitométrico de la

extinción de bandas. Por loatanto, preferimos emplear un método cuantitativo con un sustrato

fluorescente que nos permitiera comparar con más exactitud las diferencias entre las distintas

condiciones de crecimiento.

Figura 6: SDS-PAGE dela hidrólisis de Bcaseína por Lhcasei ATCC 393.

Células enteras de Lb casei ATCC 393 se incubaron con Bcaseína durante 0, 2 y 4 hs; callel, 2 y 3 respectivamente,como se indica en materiales y métodos, Los productos fueron separados en un SDS PAGE 20% y teñidos con Azul deCoomasie. En la calle 4 se muestra un control de Bcaseína incubado con buffer durante 4 hs.

68

Resultados II. Actividades de componentes del sistema proteolltico.

Para ello se utilizó el sustrato N-succinil-L-alanil-L-prolil-fenilalanina-4-metil-cumaril-7-amida,

que al ser clivado por PrtP, libera un compuesto que emite fluorescencia. Los resultados obtenidos

empleando este sustrato se muestran en la tabla 3.

Como ya había sido descripto en LIactis, para PrtP, la principal proveedora de péptidos, se observó

una disminución de la actividad en presencia de péptidos en el medio de cultivo. Existe una

correlación entre la concentración de peptona y el grado de represión observado. Altas

concentraciones de peptonas (0,5%) producen una mayor represión que los péptidos individuales

indicando que la mezcla de péptidos es más efectiva o que existe algún componente adicional en la

peptona que puede ejercer un efecto represor. Análogo a lo ocurrido con Per, se observó un claro

aumento de la actividad de PrtP en un medio hiperosmótico, aún en la presencia de péptidos. Esto

último indicaba una aparente pérdida del efecto represor durante el crecimiento en alta sal.

En presencia de peptona de carne, la pérdida de represión por péptidos en NaCl no es completa

como cuando se usan péptidos individuales y esto estan'a relacionado con la mayor represión

ejercida por la peptona que por los péptidos individuales. No existe represión de la actividad de PrtP

en presencia de camitina descartando que este compuesto esté involucrado en la regulación y

demostrando que el efecto represor observado en la peptona de carne es producto de los péptidos

presentes en la misma.

2.2 Actividades de Per y PrtP luego del choque osmótico

Observamos que cuando Lb. casei crece en un medio hiperosmótico, se pierde la regulación por

péptidos de dos importantes componentes del sistema proteolítico, Per y PrtP. Decidimos evaluar,

que sucedía con estas actividades enzimáticas en células que crecían en un medio con alto

contenido de péptidos y eran sometidas a un choque hiperosmótico por el agregado de NaCl.

Un cultivo de Lb.casei en medio CDM suplementado con peptona de carne 0,5% se creció hasta la

fase exponencial (aproximadamente 4 hs). A este tiempo el cultivo se dividió en dos y a una parte

se le agregó NaCl hasta una concentración de 0,16M (cultivo control) y a la otra NaCl hasta una

concentración final de 0,7M (cultivoN). A los tiempos indicados en la figura 7a, se tomaron

muestras y se ensayaron las actividades específicas Per y PrtP. Los resultados obtenidos en cada

punto se muestran en la Figura 7b.

69

'OÓOOOODOOOOO00.0.00.000000000000000000000Q.OOO...

Resultados II. Actividades de componentes del sistema proteolítico.

Figura 7a: Crecimiento de Lb.casei en CDM pc 0,5% sometido a un choque osmótico conNaCl 0,7M final.

Los cuadrados corresponden al cultivo control y los círculos al cultivo N. a, señala la muestra prechoque osmótico, bcorresponde a la muestra control luego de separados los cultivos y c corresponde a la muestra N luego del choqueosmótico (ver detalles en el texto)

10 z

. bE v

é í1‘:3 r. +o ; c

r

0,1 l | l I l i

0 2 4 6 8 10 12

tiempo(hs)

Figura 7b: Actividades específicasde I’er y PrtP antes y después del choque osmótico

Las barras grises corresponden a la actividad específica Per en nmoles p-m’troanilida/min mg. Las barras rayadascorresponden a la actividad especifica PrtP en unidades de fluorescencia (UF)/ min mg.a, b y c corresponden a las muesuas indicadas en la Figura 7a.

AspPepx

70

Resultados II. Actividades de componentes del sistema proteolltico.

Ambas actividades, Per y PrtP aumentaron notablemente luego del choque osmótico (comparar

los puntos b y c). Aún cuando Lb.casei crece en un medio de alto contenido peptídico (donde ambas

actividades se encuentran reprimidas), se observa un aumento de las actividades de estas enzimas al

ser enfrentadas a una alta concentración de sal. Esto indicaría que es la presencia de este efector de

estrés o una consecuencia de su presencia en el medio, la responsable de la pérdida de represión por

péptidos observada en células que crecen en un medio hiperosmótico.

Las actividades de PrtP y 'Per, principales proveedoras de péptidos del sistema proteolítico de

bacterias lácticas aumentan durante el crecimiento en un medio hiperosmótico. Más aún, la pérdida

de represión por péptidos se observa claramente luego de someter a las células a un choque

osmótico. Estos resultados apuntan a ambas enzimas como proveedoras de péptidos que pueden

actuar como osmoprotectores durante un estrés osmótico. Si bien la actividad de PepI se modificó

durante el crecimiento en alta sal, la actividad de PepQ no varió (aunque tampoco mostró

regulación por péptidos). Estos resultados no nos permiten inferir un rol de los péptidos como

proveedores de prolina libre en el intracelular que actúe como osmoprotector durante el crecimiento

en alta sal. Más aún, cabe recordar que ciertos péptidos que no contienen prolina (como Tn'Ala)

pueden actuar como osmoprotectores, como se mostró en el capítulo l, y la represión mediada por

ellos es sujeta a regulación en un medio hiperosmótico (Tabla 3).

2.3 Efecto de la fuente de carbono en la actividad de PrtP

Analizamos si existía modificación de la actividad de PrtP dependiente de la fiJente de carbono.

Medimos la actividad de esta enzima en CDM glucosa y CDM lactosa, en presencia y ausencia de

péptidos en un medio control y en un medio hiperosmótico. La lactosa es el hidrato de carbono

presente en la leche Los resultados se muestran en la tabla 3.

Como se observa en la Tabla 3, la actividad PrtP en CDM lactosa disminuyó levemente, pero no

hay diferencias significativas entre ambos valores. La represión por péptidos también se mantuvo en

esta condición de crecimiento, así como la desrepresión en presencia de NaCl. De acuerdo a estos

resultados, el cambio de lactosa por glucosa en el medio no modifica el efecto represor ejercido por

los péptidos y tampoco la pérdida de represión de los mismos en un medio hiperosmótico.

7l

Resultados II. Actividades de componentes del sistema proteolí tico.

Tabla 4: Actividad específica PrtP en CDM con Glucosa y con Lactosa como fuente decarbono

La actividad fue medida con células enteras cosechadas en la fase exponencial de crecimiento corno se indica enmateriales y métodos.' Actividad especifica: unidades de fluorescencia (UF)/ min mg.Entre paréntesis se indica la actividad especifica relativa. El CDM sin agregados se tomó como el 100%.

Asp PrtP ‘

agregado CDM Glucosa 0,5% CDM Lactosa 0,5%

Nada 22ztS.6 (100) 14.5:t4.2 (100)

pc 0,5% 6i1.5 (27) 2.2:}:0.6(15)

NaCl 0,7M 52m 1.4 (259) 22:t3.2 (38)

NaCl 0,7M + pc 0,5% 16.5:t3.4 (75) 5.511,2 (152)

Resultados ¡11.Regulación de componentes del sistema proteolltico.

CAPITULO III

Regulación de componentes del sistema proteolítico durante el crecimiento enalta sal

En el capítulo H describimos el aumento de las actividades de algunos componentes del sistema

proteolítico durante el crecimiento en alta sal. En particular, Per y PrtP perdían la represión por

péptidos en un medio hipersalino mientras que la actividad de PepQ permanecía sin modificaciones.

A fin de analizar a qué nivel se producía la regulación que explicara el aumento en las actividades

observado, intentamos realizar un análisis transcripcional de la expresión de los genesper, pepQ y

prtP.

3.1 Amplificación parcial de los genesper, pepQ yprtP de Lb. casei ATCC 393.

Con el objeto de obtener un fragmento de los genes per y pepQ, para emplearlo como sonda en

experimentos de Northern Blot que nos permitiera monitorear la expresión de estos genes en

diferentes condiciones de crecimiento, diseñamos cebadores a partir de las secuencias disponibles

en base de datos para ambos genes en varias especies de Lactobacillus (ver Materiales y Métodos).

Sin embargo y a pesar de haber empleado diferentes estrategias, con los cebadores empleados

(pele y pepQZ) solo logramos amplificar un fragmento de PCR a partir del gen pepQ en Lb.

delbrueckii Iactis LKT y Lb. delbrueckii bulgaricus 420, pero no en Lb. casei ATCC 393. Para

ambos microorganismos se obtuvo un fragmento del tamaño esperado, de aproximadamente 530pb

(Figura 8).

En el caso deper, con los cebadoresempleados(perl y perZ), no conseguimosamplificareste

gen en ninguno de los tres microorganismos.

Concluimos entonces, que la homología entre los genes pepQ y per entre Lb. casei y otros

[actobacillus y Lt lactis no es suficiente para poder amplificar un fiagmento de los mismos y

debería recurrirse a otra estrategia como por ejemplo el clonado y secuenciación del gen completo a

partir de una biblioteca genómica de Lb.casei ATCC 393.

73

OOO0.00GOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO...00.0.00...

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolítico.

Figura 8: PCR del genpepQ

Calle l: Fragmento de ADN amplificado apartir del gen pepQ de Lbdelbrueckz'i Iactis conlos cebadorespele y pepQZ.CalleZ:Fragmento de ADN amplifime a partirdel gen pepQ de Lbdelbrueckii bulgaricus conlos cebadorespele y pepQ2.Calle 3: PCR con los cebadorc pele ypepQ2 utilizando ADN de Lb.caseí ATCC 393como templado.Calle4: Fragmento de ADN amplificado a partirdel gen prtP de Lb. casei ATCC 393 con loscebadores prtPl y prtP2. (control)CalleS: Marcadores de peso molecular lOOpb.La banda más intensa corresponde a 500pb.Los fragmentos obtenidos fueron corridos en ungel de agarosa 1%, teñidos con Bromuro deEtidio y fotografiadosLas flechas indican el tamaño de los fragmentosamplificados.

En base a la secuencia de Lactobacillus paracasei subsp paracasei NCDO 151 (Holck y Naes,

1992), se diseñaron cebadores (prtPl y prtP2) para amplificar por PCR un fragmento del gen prtP

de Lb.casei ATCC 393 (Figura 9).

Por PCR amplificamos un fragmento del tamaño esperado (720pb) en Lb. casei ATCC 393 (Figura

10).

Para corroborar la identidad de este fragmento, realizamos un mapeo por restricción, empleando

una enzima que (de acuerdo a la secuencia conocida de Lb. paracasei) cortaba en un único sitio

dentro del fragmento (Figura 11a y llb).

Luego de la restricción con BamHI, obtuvimos dos fragmentos de aproximadamente 450pb y 270

pb coincidentes con lo esperado, indicando una elevada homología entre los genes prtP de Lb.

paracasei subspparacasei NCDO 151 y Lb. casei ATCC 393.

74

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolítico.

Figura 9: Esquema de los genesprtP yprtM de Lactobacillusparacasei subspparacasei

NCDOlSl

Se señala la posición de los cebadores prtPl y prtPZ empleados en este estudio.

per pr”)

700bp 1l___l C?prtPl prth

Figura 10: PCR del genprtP

Callel: Marcadores de peso molecular lOOpb.La banda más intensa corresponde a 500pb.Calle 2: Fragmento de ADN amplificado apartir del gen prtP de Lb. casei ATCC 393empleando los cebadores prtPl y prtP2.Los fragmentos fueron separados en un gel deagarosa 1% teñidos con Bromuro de Etidio yfotografiados.

75

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolítz’co.

Figura 11a: Mapa de restricción deprtP

Se indican en el mapa la posición de los sitios de corte de las enzimas de restricción empleadas para elmapeo del fragmento de PCRy para el Southern Blot. Los sitios se identificaron en la secuencia de prtP deLactobacillus paracasei subspparacasei NCDO 151

a a g Aa a? 9L s; a ga 3 a a g:5 É m á á a":

I/ l l l .

1 700bp 7817

sonda prtP

Figura 11b: Restricción del fragmento de PCR prtP con BamHl

M; Marcadoresde peso molecular lOOpb.

La banda más intensa corresponde a 500pb

Calle 2: Fragmentos obtenidos a partir de la

y ‘ 450 pb restricción del producto de PCR prtP conM ‘- BamHI.

m <- 270 pb Lasflechasindicanel tamañode losfragmentosobtenidos. Los fragmentos fueron separados en

._ 720pb

un gel de agarosa 1%, teñidos con Bromuro de

Etidio y fotografiados

El fiagmento de PCR, se marcó y se empleó como sonda en experimentos de Southern

Blot, con ADN cromosómico de Lb.casei ATCC 393 cortado con diferentes enzimas de

76

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolltico.

restricción. En el ADN cortado con EcoRI Se reveló una banda de 4000pb, del tamaño

esperado (Figura 12). En el ADN cortado con PstI se reveló una banda de 6000pb,

coincidente con lo esperado y otra banda de aproximadamente 4000pb. Considerando

que empleamos como referencia la secuencia de prtP de otro microorganismo distinto a

Lb casei ATCC 393, no podemos descartar la aparición de otro sitio de corte para PstI

en la secuencia del gen de este microorganismo. Este de sitio de corte sería interno al

fragmento de 6000pb.y fiiera de la secuencia correspondiente a la sonda. Cabe destacar

que la intensidad de la banda de 6000pb es menor que la intensidad de la banda de

4000pb, indicando que la primera podría provenir de una digestión parcial del ADN con

PstI. “

Ambos resultados (Mapeo por restn'cción y Southern Blot) fueron suficientes para

corroborar la identidad del fragmento amplificado.

3.2. Análisis transcripcional deprtP

La misma sonda empleada en el Southern Blot se utilizó en experimentos de Northern

Blot, a fin de evaluar si existían variaciones en el ARNm de prtP en distintas

condiciones de crecimiento. Con el fin de normalizar los datos y poder comparar

efectivamente los niveles de mensajeros provenientes de cada condición, se amplificó

un fragmento del gen del ARNr 16S de Lb.casei ATCC 393 que se utilizó como control.

En este caso los cebadores correspondientes (ARerósl y ARNr 1652)se obtuvieron a

partir de la secuencia del gen del ARNr 165 de Lb.casei ATCC 393, que se encuentra en

la base de datos. Para el Northern blot se empleó ARN de células provenientes de dos

condiciones de crecimiento, en Leche (donde la actividad de PrtP ha sido descripta a

niveles comparables a los de CDM) y MRS donde esta actividad se encuentra reprimida

debido a los altos niveles de péptidos presentes en el mismo. Los resultados se muestran

en la Figura 13. A pesar de reiterados intentos no logramos revelar una banda

correspondiente al ARNm de prtP. El tamaño esperado de este mensajero es de

aproximadamente 5600 pb. En todos los casos, al emplear la sonda para prtP, en la

hibridación solo revelamos dos bandas muy netas correspondientes a los ARNr

bacterianos 23S y 168. Esto ya ha sido observado para otros ARNm bacterianos de gran

tamaño que se degradan y corren atrapados en la trama de los ARN ribosomales. Este

efecto ha sido observado para el ARNm de prtP de Lb.casei ATCC 393. (Gaspar Perez

Martinez, comunicación personal).

Resultados III. Regulación de componentes del sistemaproteolítico.

Figura 12: Southern Blot de Lb.casei ATCC 393

<- 6000pb

,_ 4000pb

<- 700pb

Figura 13: Northern Blot del ARNmprtP

En todas las calles la sonda empleada fue elfragmento prtP obtenido por PCR, marcado conbiotinaCalle]: Fragmento de PCR prtP, sin marcar,empleado como control.Calle 2: ADN de Lb.casei ATCC 393 cortadocon EcoRI.Calle3: ADN de Lb. casei ATCC 393 cortadocon PstI.

M: ARNobtenidoa partirdecélulascrecidas en MRS.Calle 2 y 4 : ARN obtenido a partir de célulascrecidas en Leche.M Reveladoconunasondaobtenidaapartir del fragmento de PCRprtP.Calle 3 y 4: Revelado con una sonda obtenida apartir del fragmento de PCR ARNr 16s.Se indican las posiciones correspondientes alARNr 23s y el ARNr 165

78

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolltico.

Dado que resultaba imposible medir los niveles del mensajero prtP por esta técnica decidimos hacer

una RT-PCR semicuantitativa. Utilizamos los mismos cebadores que en la preparación de la sonda.

Con el mismo criterio, se amplificó el ADNc deprtP y del ARNr 165para normalizar los datos.

Empleamos ARN extraído de células crecidas en cuatro condiciones, CDM, CDM pc 0,5%, CDMN

(0,7M) pc 0,5% y CDMN. Decidimos emplear peptona de carne y no péptidos individuales debido a

la mayor densidad celular que alcanzaban los cultivos en esta condición. Los resultados se muestran

en la figura 14.

En la figura 15 se muestran los resultados del análisis por densitometría de la RT-PCR (que

corresponden a los niveles del ARNm correspondiente), comparados con los valores de actividad

específica PrtP medidos en cada condición de crecimiento.

Como se observa en la Figura 15 existe una correlación directa entre la disminución en los niveles

de ARNm prtP en CDM pc 0,5% y la disminución de la actividad PrtP en esta condición, indicando

que la represión por péptidos ocurre a nivel transcripcional. Así mismo, la pérdida de la represión

por péptidos en presencia de sal coincide con un aumento de los niveles del ARNm

correspondiente, indicando que la pérdida de represión es a nivel transcripcional. Llamativamente,

aunque la actividad de PrtP aumenta prácticamente al doble en CDMN comparado con la condición

control, los niveles de ARNm se mantuvieron sin cambio. Por lo tanto el aumento de la actividad

observado en esta condición de crecimiento no coincide con un aumento en los niveles del

mensajero correspondiente.

79

{O000......0..O0.0...OO0.00000000QOOOOOCOOO0.0.0.1

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolítico.

Figura 14: RT-PCR semicuantitativa

En el panel superior se muestra la RT-PCR de prtP, panel inferior RT-PCR de ARNr 16s a partir de ARN de: l, CDM;2, CDM pc 0,5%; 3 CDMN pc 0,5% y 4, CDMN. Las PCRs fueron realizadas usando como templado el ADNccorrespondiente, tal cual, diluido 1/5 y diluido 1/25.

buggy

Figura 15: Relación entre la actividad transcripcional del genprth la actividad específicadela enzima PrtP

Las barras rayadas corresponden a la densitometría de la RT-PCR (expresada como niveles relativos de ARNm prtP encada condición). Las barras lisas corresponden a la actividad específica relativa PrtP para las mismas condiciones decrecimiento. Se eligió la condición CDM como 100%.

200130

150 ­

°as 100 100E 100 33¡e es

50 — 41

n 25

0 - _® o\0 o\0 é

0° o? o? 0*a" <° °4‘ é

0° 00“

80

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolítico.

3.3. Análisis de los niveles de PrtP. y cálculo de parámetros cinéticos

Propusimos que el aumento de la actividad de PrtP en CDMN, sin una modificación en los niveles

del mensajero correspondiente podía ocurrir por dos motivos: un aumento en los niveles de la

proteína, debido a algún tipo de regulación postranscripcional o un cambio en la actividad

específica de la enzima durante el crecimiento en el medio hiperosmótico.

Para probar la primera hipótesis realizamos un Western Blot con anticuerpos monoclonales anti

PrtP de Lactococcus Iacn's (Figura 16).

Como se observa en la Figura 16, con el anticuerpo empleado solo fire posible revelar una banda de

aproximadamente 130 kDa, pero no la proteina entera de una tamaño aproximado de 190 kDa.

Cómo ya había sido descripto en Lactococcus lactis (Laan et al, 1988; Laan y Konings, 1991) esta

banda corresponde a un fragmento de autoproteólisis de PrtP. PrtP posee actividad autoproteolítica,

y a pesar de que la preparación de las células para el Western blot se hizo en un buffer en presencia

de Ca“, condición en la que se estabiliza la conformación de PrtP y se disminuye la autoproteólisis,

no fue posible revelar la proteinasa entera. Además, el anticuerpo empleado es un monoclonal

contra la proteinasa de Lactococcus lactis por lo que, aunque se emplea un gel desnaturalizante, el

epitope podria no estar accesible en la proteína entera en Lb.casei. No pudimos detectar la banda en

células provenientes de la condición control (CDM), esto podría deberse a que la autoproteólisis

estan'a disminuida en esa condición, o por el contrario se encuentra aumentada y el fragmento de

130 kDa es sujeto a posterior autoproteólisis y por lo tanto no es detectado en el Western Blot.

A partir de estos resultados, concluímos que al tratarse de una proteasa autoproteolítica no es

posible determinar por este método diferencias en la abundancia de la proteína en las distintas

condiciones de crecimiento, ya que esto puede conducir a diferencias en la abundancia relativa de

los fragmentos revelados en el Western Blot; al menos con el anticuerpo empleado.

Para probar la segunda hipótesis, se decidió analizar los parámetros enzimáticos Km y Vmax de

PrtP. Determinamos la actividad de PrtP en células enteras provenientes de CDM y CDMN a

diferentes concentraciones de sustrato. Estos experimentos nos permitieron obtener los valores de

Km y Vmax para esta enzima. Estos valores, aunque aparentes, ya que se calcularon con células

enteras y no con la enzima purificada, nos dieron información acerca de PrtP en estas condiciones

de crecimiento.

La figura 17 muestra un gráfico de Lineweaver-Burk de los resultados obtenidos

81

{OOO...OOOOOCOOOOOOUOOOOÓ.OOOOOOCOOOOÓOOOOOOOOOOOQ

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolltico.

Figura 16: SBS-PAGE y Western Blot con anticuerpos anti PrtP

La imagen de la izquierda muestra un SDS-PAGE 10% de células enteras provenientes de las condiciones decrecimiento indicadas. La última calle muestra los marcadores de peso molecular y el tamaño correspondiente. A laderecha, Western Blot con anticuerpo anti PrtP.

‘_ 130KDa

Figura 17: Gráfico de Lineweaver-Burk (actividad PrtP en función de la concentración de

sustrato)La actividad PrtP se ensayó con células enteras de la fase exponencial de crecimiento en CDM (cuadrados) y CDMN(círculos). Se gmficaron las inversas de la velocidad en unidades de fluorescencia (UF)/ min mg 'l en función de lainversa de la concentración de sustrato N-succinil-L-alanil-Lprolil-Lphenil alaInna-4metil-coumaril-7-amida en pM “l

0,05 0,1

1/[S]

82

Resultados III. Regulación de componentes del sistema proteolltico.

Como se desprende del gráfico de la Figura 17, no se observaron diferencias en la afinidad aparente

de PrtP por su sustrato en ambas condiciones (valor de Km aparente de 75 uM para CDM y 73 uM

para CDMN). Sin embargo, se encontró un aumento de dos veces en la Vmaxaparente en las células

crecidas en NaCl (33,6 UF/min mg en CDM y 69,5 UF/min mg en CDMN). Ya que el NaCl no está

presente durante el ensayo de actividad, las modificaciones observadas pueden estar relacionadas a

una activación de la enzima durante el crecimiento en un medio hiperosmótico.

PrtP se encuentra insertada en la envoltura de Lb. casei y esta localización es importante para su

actividad. En este contexto cabe remarcar las observaciones de modificaciones en las envolturas de

los microorganismos durante el crecimiento en alta sal (Lopez et al, 1998; Poolman et al, 2002 y

resultados de esta tesis). Por lo tanto las diferencias observadas pueden estar relacionadas conmodificaciones en el entorno de la proteína durante e] crecimiento en un ambiente hipersalino, que

le permitirían adoptar una configuración diferente que podría tener como consecuencia un aumento

de la actividad específica de la enzima.

En resumen, el aumento de la actividad máxima de la enzima durante el crecimiento en CDMN, nos

permitió explicar el aumento de la actividad observado en esta condición, sin que exista una

variación de los niveles del ARNm correspondiente.

Resultados IV.Modificaciones en el grado de superenrollamiento del ADN.

CAPITULO IV

Modificaciones del grado de superenrollamiento del ADN durante el crecimientoen alta sal

En Salmonella ophimurium y en Bacillus subtilis se ha descripto un aumento del grado de

superenrollamiento del ADN durante el crecimiento en alta sal (Higgins et al, 1988; Alice et al,

1997). En Salmonella typhimurium estos cambios estan'an relacionados, al menos, con la inducción

específica del gen proU, que es un transportador de glicín betaína que puede actuar como

osmoprotector. En Bacillus subtilis la pérdida del aumento del grado de superenrollamiento durante

el crecimiento en un medio hiperosmótico es letal, indicando que esta modificación es fundamental

para la supervivencia en altas concentraciones de sal.

1.1 Durante el crecimiento en un medio hipersalino ocurre un aumento en el grado desuperenrollamiento del ADN en Lb casei ATCC 393.

Se decidió analizar el grado de superenrollamiento del ADN de un plásmido empleado como

reportero en LA casei ATCC 393. Empleamos Lb.casei ATCC 393 transformada con el plásmido

pNZZ73.

En la Figura 18 se muestra la separación de topoisómeros en un gel de agarosa conteniendo

cloroquina, de plásmidos extraídos de células crecidas en medio MRS y MRSN (NaCl 0,7M).

Como ya había sido descripto en otros microorganismos. Se observó un aumento del grado de

superenrollamiento de plásmidos aislados de células crecidas en MRSN. La van'ación en el linking

number (A Lk) de células crecidas en el medio control y en el medio con NaCl fue de —3.

Dado que la mayor diferencia de crecimiento entre un medio hiperosmótico y un medio control se

obtuvo en CDM (Capítulo I), se analizaron las variaciones en esta condición de crecimiento (Figura

19)

Resultados IV.Modificaciones en el grado de superenrollamiento delADN.

Figura 18: Variación en el grado de superenrollamiento de plásmidos durante el crecimientoen MRS y MRSN.

Electroforesis en geles de cloroqm'na del plásmido pNZ273 extraído de células en crecimiento exponencial en: callelMRS, calle 2 MRS NaCl 0,7M. El gel contenía cloroquina 6 pg/ml. En estas condiciones los topoisómeros mássuperenrollados migran más rápido. Se muestra el análisis densitométn'co de la imagen. Las flechas señalan el pico deltopoisómero más representado.

85

O0...0.ÜOOOOOOOOOQ0.000-0......OOQOOOÓOOOOOOOOOO.

Resultados IV.Modificaciones en el grado de superenrollamiento delADN.

Figura 19: Variación en el grado de superenrollamiento de plásmidos durante el crecimientoen CDM.

Electroforesis en geles de cloroquina del plásmido pNZ273 extraído de células en crecimiento exponencial en: callelCDM, calle 2 CDM pc 0,1%, calle3 CDMN pc 0,1%, calle 4 CDMN. La concentración de NaCl empleada fue 0,7M. Elgel contenía cloroquina 6 img/ml.En estas condiciones los topoisómeros más superenrollados migran más rápido. Semuestra el análisis densitométn‘code la imagen. Las flechas señalan el pico del topoisómero más representado.

Resultados 1V.Modificaciones en el grado de superenrollamíento del ADN.

Se observó una diferencia en el linking number (ALk) de —3entre los plásmidos obtenidos de CDM

y CDMN 0,7M (Figura 19, calle l y 4). El agregado de peptona 0,1% durante el crecimiento,

disminuyó esa diferencia a un valor de —1(Figura 19 calle l y 3). Como control evaluamos si

existían modificaciones en el Lk por agregado de peptona al medio CDM. No observamos

diferencias en el superenrollamíento de plásmidos obtenidos de CDM y CDM pc 0,1% (Figura 19,

calles 1 y 2). i

De acuerdo a estos resultados, ciertos componentes presentes en la peptona de came lograban

revertir parcialmente el aumento observado en el grado de superenrollamíento del ADN durante el

crecimiento en un medio hipersalino.

Se decidió evaluar, entonces, el efecto en el grado de superenrollamíento del ADN, de péptidos

individuales agregados durante el crecimiento en CDMN (Figura 20). Cuando estos péptidos fueron

agregados al CDMN, se observó una recuperación del superenrollamíento del ADN semejante al de

la condición control en CDM (Figura 20 calles 4 y 5). El mismo comportamiento se vio en

presencia de camitina en CDM (Figura 20, calle 3).

Por lo tanto, la camitina (un conocido soluto osmocompatible) y los péptidos tuvieron un efecto

similar en la configuración del ADN, corroborando el rol de los péptidos como osmoprotectores, tal

como se propuso en el Capítulo I.

1.2 Efecto de la novobiocina en la viabilidad durante el crecimiento en NaCl.

La novobiocina es un inhibidor de la ADN girasa. Esta enzima es la responsable del aumento del

grado de superenrollamíento del ADN. Para evaluar si ese aumento en el grado de

superenrollamíento era esencial para la supervivencia del microorganismo en un medio hipersalino

se analizó el efecto del agregado de este inhibidor durante esa condición de crecimiento.

Los resultados se observan en la figura 21.

87

iCOOOOOOOOOOOOOOOOO0.00...OOO...OOOOOQOOOOOOOOOOOO

Resultados IV.Modificaciones en eI grado de superenrollamiento delADN.

Figgrg 20; Efecto de péptidos y camitina en el grado de superenrollamiento del ADN duranteel crecimiento en medio hiperosmótico.

Electroforesis en geles de cloroquina del plásmido pNZ273 extraído de células en crecimiento exponencial en: callelCDM, calle 2 CDMN, caile3 CDMN + 2,5 mM camitina, calle 4 CDMN + 5 mM Ala-Pro, calle 5 CDMN + Gli-Pro­Ala 5 mM. La concentración de NaCl empleada fue 0,7M. El gel contenía cloroquina 6 ¡Lg/m1.En estas condiciones lostopoisómeros más superenrollados migran más rápido. Se muestra el análisis densitométrico de la imagen Las flechasseñalan el pico del topoísómero más representado.

k...

v-vvñ..\...w

vetada“,

It

ey»- ._

88

Resultados IV.Modificaciones en el grado de superenrollamiento deIADN.

Figura 21: Efecto de novobiocina durante el crecimiento en un medio hiperosmótico.

La viabilidad se monitoreó a través de la variación de la D0550 en función del tiempo. En un experimento previo sedeterminó la concentración subletal de cloroquina que se empleó en el ensayo. Los circulos corresponden a CDM y lostriángulos a CDMN 0,7M. Los simbolos vacíos corresponden a cultivos conteniendo novobiocina 40 pgjml y los llenosa cultivos sin cloroquina.

00550

0.15

tlempo (hs)

La velocidad de crecimiento en un medio sin sal (CDM) disminuyó 1,18 veces por el agregado de

novobiocina 40 pg/ml (pCDM= 0,1756 vs uCDMnov= 0,148) y en un medio hiperosmótico

(CDMN) disminuyó en un nivel semejante, 1,14 veces (uCDMN= 0,099 vs uCDMNnov= 0,086).

De acuerdo a estos resultados, a diferencia de lo observado en Bsubtilis (Alice et al, 1997) donde la

inhibición parcial de la ADN girasa responsable del aumento en el grado de superenrollamiento del

ADN en un medio hiperosmótico resultaba letal, en Lb. casei ATCC 393 no se modificó la

viabilidad del microorganismo en un medio hipersalino por el agregado de este compuesto. Por lo

tanto, el aumento en el grado de superenrollamiento observado durante el crecimiento en medio

hiperosmótico no sería indispensable en la regulación de funciones esenciales para la supervivencia

frente a este efector de estrés, por lo menos en las condiciones testeadas.

Resultados V.Identificación de reguladores

CAPITULO V

Identificación de posibles reguladores de componentes del sistema proteolítico

relacionados con la respuesta a estrés osmótico

En el 2001, Guedon y colaboradores, tratando de identificar un regulador transcripcional que

mediara la represión por péptidos de los componentes principales del sistema proteolítico en L.

Iactís, buscaron mutaciones que desreprimieran la expresión de opp-pepOI en un medio que

contenía una mezcla de péptidos.

Encontraron que la mayoría de las cepas que presentaban el fenotipo desreprimido eran mutantes

para un homólogo del regulador pleiotrópico CodY de B. subtilis y algunas lo eran para el gen dtpT

que codifica para un transportador de di-tripéptidos. Era de esperar que una deficiencia en la

incorporación de péptidos a través de DtpT redujera la represión de la transcripción de opp-pepOI.

Como se demostró en el capítulo I y se corroboró en el capítulo IV, los péptidos pueden ejercer un

rol en la osmoprotección en Lh casei ATCC 393. Se decidió, entonces, construir una mutante para

el transportador de péptidos DtpT y analizar su comportamiento durante el crecimiento en alta sal.

También se determinó la presencia de la proteína CodY en Lb. casei ATCC 393 y se analizó su

participación en la pérdida de represión por péptidos del gen prtP observada durante el crecimiento

en un medio hiperosmótico.

5.1 Obtención de una mutante para el gen dtpT

5.1.1. Construcción de una mutante para el gen quT en Lb. casei ATCC 393.

Para construir la mutante, se intentó en primer término amplificar parcialmente el gen deT de Lb.

casei ATCC 393, para clonarlo en un plásmido y realizar una mutagénesis de ese gen por inserción

del plásmido en la secuencia homóloga en el cromosoma bacteriano. Sin embargo, con los

cebadores empleados (dtpTl y dtpT2) no fue posible amplificar un fiagmento en esta cepa. Se

amplificó, en cambio, un fragmento del gen dtpT (de aproximadamente 500 pb) de Lb.delbrueckii

Iactis LKT. La identidad del fragmento amplificado se corroboró mediante secuenciación (Figura

22). Se realizó un análisis de la secuencia empleando el programa BLASTpx, este programa traduce

la secuencia de nucleótidos en los 6 marcos de lectura posible (tres en cada dirección) y compara la

90

Resultados V.Identificación de reguladores

secuencia de aminoácidos obtenida con la de proteínas conocidas presentes en el banco de datos. La

secuencia aminoacídica presentó una identidad de un 99% con la proteína DtpT de Lactobacillus

plantarum WCFSl, indicando una elevada homología entre los productos génicos de ambos

microorganismos. Era probable que el gen dtpT de Lbdelbrueckii lactis presentara, también, una

alta homología con el gen dtpT de Lb casei, suficiente para que ocurriera una recombinación

homóloga.

El fragmento del gen dtpT fue clonado en el pGEMT easy vector (Promega) para luego subclonarlo

en el plásmido pRV300 (Leloup et a1, 1997). El vector pRV300 posee un cassette de resistencia a

eritromicina y carece de un origen de replicación de bacterias Gram positivas. Luego de transformar

a Lb.casei con este plásmido conteniendo el fragmento del gen dtpT de Lbdelbrueckii Iactis LKT y

plaqueando en un medio que contenga eritromicina, se seleccionarán aquellas bacterias en las que el

plásmido se insertó en el cromosoma bacteriano por un único evento de recombinación entre el gen

dtpT de Lb.delbrueckii lactis LKT y el gen dtpT endógeno.

En la Figura 23 se muestra un esquema del plásmido que lleva el fragmento del gen dtpT de Lb­

delbrueckii Iactis LKT y la construcción presente en el cromosoma bacteriano en caso de que haya

ocurrido la recombinación con el gen endógeno. A la cepa resultante se la denominó Lb.casei dtpT,

ya que en la misma el gen dtpT queda interrumpido por la inserción del plásmido pRV300.

Se realizó una PCR empleando los cebadores ampl y amp2 para verificar la inserción del plásmido

en la cepa receptora. Como se observa en la figura 24 con los cebadores ampl y amp2 solo se

amplificó un fragmento del tamaño esperado en la mutante, indicando la inserción del plásmido

pRV300, que lleva el gen de resistencia a ampicilina, en el cromosoma bacteriano. También se

muestra el fragmento arnplificado del gen dtpT de Lb.delbrueckii Iactis LKT (aproximadamente 500

pb) y su ausencia cuando se emplea ADN de Lb.casei ATCC 393 como templado.

5.1.2.Caracterización fenotípica dela mutante dtpT

Se comparó la velocidad de crecimiento de la cepa salvaje (Lb.casei wt) y mutante (Lb casei dtpT)

en medio completo (MRS) y en medio mínimo (CDM) en ausencia y presencia de NaCl. Las curvas

de crecimiento obtenidas se observan en la figura 25 a y b.

91

ResultadosV.Identificacióndereguladores

1GCACCCGGGCTTACGGACGTTGTTCTTCACTGAAATGTGGGAAACGAATTCAGTTACTACGGGATGCGTGCGCTACTGAT

CGTGGGCCCGAATGCCTGCAACAAGAAGTGACTTTACACCCTTTGCTTAAGTCAATGATGCCCTACGCACGCGATGACTA

FSYYGMRALLILbdelbmecláilacfileTFSYYGMRALLILb-plantarumWCFSl

81CTATTACATGTACTACAGTGTCGCTAAAGGTGGTCTTGGATTTGACCAAGTCACCGCAGCATCCATTATGTCAATCTATT

GATAATGTACATGATGTCACAGCGATTTCCACCAGAACCTAAACTGGTTCAGTGGCGTCGTAGGTAATACAGTTAGATAA

YYMYYSVAKGGLGFDQVTAASIMSIYSLhdelbrueckülactisIKTYYMYYSVAKGGLGFDQVTAASIMSIYSLb-plantarumWCFSl

161CGGCCTTAGTTTAbbllLLLHuLULLLLLbblbbbL11blAAGTGACCGTGTCTGGGGTAGCCGTAAGACCGTCTTTATT

GCCGGAATCAAATGCAAAGATCACAGGAGCCACCGAAAGATTCACTGGCACAGACCCCATCGGCATTCTGGCAGAAATAA _

ALVYVSSVLGGFLSDRVWGSRKTVFILb-delbrueckülacfisLKTALVYVSSVLGGFLSDRVWGSRKTVFIprlantarumWCFSl

241GGTGGGGTCTTCATCATGTTAGGCCACATCGTGTTATCAACGCCATTTGGAGTTGGCGCACTATTTGTTTCAATCGCACT

CCACCCCAGAAGTAGTACAATCCGGTGTAGCACAATAGTTGCGGTAAACCTCAACCGCGTGATAAACAAAGTTAGCGTGA GGVFIMLGHIVLSTPFGVGALFVSIALLbdelbrueclaïlamchKTGGVFIMLGHIVLSTPFGVGALFVSIALLb.plantarumWCFSl

321TATTGTCATTGGGACTGGGTTATTAAAGCCAAACGTCTCTGACATGGTTGGTCAATTGTATACAGTAGAAGATACACGTC

ATAACAGTAACCCTGACCCAATAATTTCGGTTTGCAGAGACTGTACCAACCAGTTAACATATGTCATCTTCTATGTGCAG

IVIGTGLLKPNVSDMVGQLYTVEDTRRLb-delbruechïladisLKTIVIGTGLLKPNVSDMVGQLYTVEDTRRthlantarumWCFSl

401GGGATGCTGGTTTTAGTATTTCCGTCTTCGGGATTAACTTAGGTTCATTGGTTGCACCAGCCTTAGTTGGTCGGATCGGC

CCCTACGACCAAAATCATAAAGGCAGAAGCCCTAATTGAATCCAAGTAACCAACGTGGTCGGAATCAACCAGCCTAGCCG

DAGFSISVFGINLGSLVAPALVGRIGLbdelbruecfiilacfisLKTDAGFSIFVFGINLGSLVAPALVGRIGthlantarumWCFSl

481TTAAATGTTAACTTCCACTTAGGCTTCTCATTAGCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATA

AATTTACAATTGAAGGTGAATCCGAAGAGTAATCGACGTCCAGCTGGTATACCCTCTCGAGGGTTGCGCAACCTACGTAT LNVNFHLGFSLAALbdelbruechïlamlsLKT LNVNFHLGFSLAAprhuwumWCFSI

561GCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGGTTAATC

CGAACTCATAAGATATCACAGTGGATTTATCGAACCGCATTAGTACCAGTATCGACAAAGGACACACTTTAACCAATTAG

641CGCTCACAATTCCACACAAAATACGAGCCGGGAAAGCATTAAAAGTGTTAAAGCCTGGGGGTGCCTTAATGAATGNACTT

GCGAGTGTTAAGGTGTGTTTTATGCTCGGCCCTTTCGTAATTTTCACAATTTCGGACCCCCACGGAATTACTTACNTGAA

721ACTCCCACATTTTAATTNGGGTTGGGGCCCACAm1bbbbbbbl11LL.LbbbbbL-IAAACCTNTCTTGGCCACGTNTNAAG

TGAGGGTGTAAAATTAANCCCAACCCCGGGTGTGTAcLbuuLuAAAbbbLbbuLL1.L.l. vc......1“M‘CGGTGCANANTTC

801AATCGGGCACAC

TTAGCCCGTGTG

Figura22:SecuenciaparcialdelputativogendandeLb-tlelbrueckiiIactisLKT SemuestralasecuenciapamialdelgendtpTdeLhdelbruecla'ilactisLKTylasecuenciaparcialdeaminoácidosdelaproteínaDtpTcomparadaconladeDtpTdeLb. plantarumWCFSl(verdetalleseneltexto)

Resultados V.Identificación de reguladores

FiEra 23: Construcción de la mutante Lb casei dtpT

A) Se muestra un esquema de la inserción del plásmido pRV300 que porta un fragmento del gen deT de Lbdelbrueckii Iactis LKT y la recombinación con el gen dtpT de Lb casei ATCC 393.

B) Construcción presente en la cepa mutante luego de la recombinación.

A)

pRV300

3556bp

dtpTLb casei ATCC 393

B)

dtpT erm amp dtpT

dtÏTl am: ian dthZ

94

i000...0000000000OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0...

Resultados V.Identtficación de reguladores

Figura 24: PCR de Lb.delbrueckii Iactis LKT, Lb.casei wt y Lb.casei dtpT=

Calles 1, 2 y 3: se empleó ADN de Lb.delbruecla'i Iactis LKT como templado.Calles 4, 5 y 6: se empleó ADN de LAcasei wt como templado.Calles 8, 9 y 10: se empleó ADN de Lb casei dtpT como templado.Calle 7 y 11: marcadores de peso molecular 100 pb.En las calles l, 4 y 8 se emplearon aran y amp2 como cebadores.En las calles 2, S y 9 se emplearon dtpTl y dtpTZ como cebadores.En las calles 3, 6 y 10 se emplearon prtPl y prtP2 como cebadores. La amplificación parcial del gen prtP seempleó como coan en todas.las reacciones (tamaño esperado del fragmento 700 pb).Los fragmentos fueron separados en un gel de agarosa 1,5% teñidos con Bromuro de etidio y fotografiados.

8 910 ll

<_ 700pb <- 700b<- soopb p

4.—. 300pb

Figura 25: Crecimiento de Lb.casei ATCC 393 dipT en MRS y CDM

En la figura a) se compara el crecimiento de la cepa mutante dtpT con la cepa salvaje en medio completoMRS y en la figura b) en CDM. Triángulos, 393 y cuadrados 393 dtpT. Los símbolos llenos corresponden almedio control y los vacíos al medio suplementado con NaCl 0,7M.

a) 1o M10

E1 70% ES É 1 / /'8 0,1­

l

0,01 . . . 0,1 L .

o 1o 20 30 o 15 30 45

tiempo (hs) tiempo (hs)

95

Resultados V.Identificación de reguladores

Como se desprende de la figura 25 a) la velocidad de crecimiento de la mutante dtpT en

MRS es menor que la de la cepa salvaje (uwt MRS= 0.446 vs. udtpT MRS=0.204). La

diferencia principal es que la mutante presenta un “lag” pronunciado al inicio del

crecimiento. Sin embargo, la mutante prácticamente logra equiparar la densidad celular de

la cepa salvaje. El medio MRS presenta una concentración elevada de péptidos y pocos

aminoácidos libres. La mutante carece de uno de los sistemas de transporte de di-tripéptidos

que explicaría el retardo ‘óbservado en el crecimiento. En Lactococcus lactis se observó

que, para la mayoría de los péptidos, la ausencia de un transportador puede ser suplida por

los otros transportadores presentes en la membrana (Sanz et al, 2001) lo que finalmente le

permitiría incorporar los péptidos que aporten los aminoácidos necesarios para el

crecimiento. Estos resultados son análogos a lo observado en la mutante Lb casei dtpT.

Como se observa en la figura 25 b), la mutante presentó un comportamiento similar al de

MRS en medio mínimo CDM Este medio contiene todos los aminoácidos necesarios para

el crecimiento y carece de péptidos. Aunque en esta condición se esperaría un crecimiento

de la mutante semejante al de la cepa salvaje, en Lactococcus Iactis también se observó una

marcada disminución de la velocidad de crecimiento de una mutante de varios

transportadores, comparada con la cepa salvaje, aún en un medio que aportaba todos los

aminoácidos requeridos.

Por otro lado, la mutante dtpT resultó ser más osmosensíble que la cepa salvaje. Mientras

que para la cepa salvaje la relación entre la velocidad de crecimiento en ms y MRSN

0,7M es de aproximadamente 1,4 veces, en la mutante dtpT es de aproximadamente 3 veces

(uwt MRS= 0,446 vs uwt MRSN 0,7M= 0,325 y udtpT MRS=0,204 vs pdtpT MRSN

0,7M= 0,066). Además mientras que la cepa salvaje en medio hiperosmótico alcanza la

misma densidad óptica fmal que en medio control, la cepa mutante no puede hacerlo. Lb.

casei dtpT no logró crecer en medio CDM en presencia de NaCl 0,7M corroborando su

mayor osmosensibilidad. De estos resultados se desprende que una mutante deficiente en el

transporte de péptidos, es más osmosensíble que la cepa salvaje.

Con intención de caracterizar el fenotipo (ausencia del transportador DtpT) de la cepa

mutante, se empleó un medio CDM sin leucina en el que se agregaron varios péptidos como

la única fuente de este aminoácido. El microorganismo solo podía crecer en esa condición

si el péptido correspondiente era transportado y proveía el aminoácido correspondiente ya

Resultados V.Identificación de reguladores

que Lb. casei ATCC 393 es auxótrofa para Leucina. El crecimiento se evaluó midiendo la

Dom“ a los tiempos indicadosen la tabla 5.

Tabla 5; Crecimiento de Lb.casei wt y Lb.casei dtpT con diversos péptidos como únicafuente de Leucina.

L (Leucina), P (Prolina), T (Treonina), G (Glicina), K (Lisina)

. D0 550nmCondición de 393 393 dtpTcrecimiento

CDM sin L + D555.)24hs D055.)24hs Do55048hs

- 0.103 0.103 ND

L 0.75mM 2.23 0.953 2.1L 0.1mM ND ND 0.808

LP lmM 2.63 1.4 1.6LPO.1mM 1.96 ND 0.936

'I'leM 2.34 0.515 1.5TLO.lmM 1.85 ND 0.783

GL lmM 2.32 0.621 1.59GL 0.1mM ND ND 0.676

LL l mM 1.9 1.41 1.84LL 0.1mM ND ND 0.865

KL lmM 2.3 0.487 1.6KL 0.1 mM ND ND 0.414

De acuerdo a los resultados de la tabla 5 ninguno de los péptidos ensayados es transportado

exclusivamente por DtpT ya que todos fueron capaces de suplir la ausencia de Leucina en

el medio.

Aunque en la cepa salvaje los valores de densidad óptica alcanzados fueron similares si la

leucina era suplementada por el péptido o si se encontraba libre en el medio, en la mutante

estos resultados fueron variables. Con tres de los péptidos (TL, GL y KL) se observaron

diferencias significativas en la densidad celular alcanzada cuando el aminoácido faltante

97

Resullados V.Identificación de reguladores

era suplementado por el péptido y cuando estaba libre en el CDM. Principalmente para KL

esas diferencias fueron aún más marcadas empleando una concentración del péptido de

0,1mM.

En Lactococcus Iacn's, la diferencia entre una doble mutante (Opp',DtpT) y una triple

mutante (Opp',DtpT,Dpp') solo pudo ponerse en evidencia empleando un dipéptido W

(valina-valina) a una concentración de 0,035 mM, ya que a concentraciones mayores podía

ser transportado por un cuarto sistema de transporte que aún no ha sido caracterizado en ese

microorganismo (Sanz er al, 2001). La presencia de varios transportadores con actividades

solapadas hace casi imposible encontrar un péptido que sea transportado de manera

exclusiva por un único transportador.

En este caso, la diferencia observada en los péptidos a bajas concentraciones indicaría que

la afinidad de los otros transportadores adicionales por ese péptido es menor que la que

posee DtpT y se hace evidente cuando el mismo se encuentra en concentraciones limitantes.

5.1.3.Actividad PrtP y Pepx en Lb. caseí deT

En el capítulo 3 se mostró que las actividades de dos de los principales componentes del

sistema proteolítico, PrtP y Per se encontraban reprimidas en presencia de péptidos.

En una mutante incapaz de transportar un péptido determinado, se esperaría la ausencia de

represión de las actividades de PrtP y Per en presencia de ese péptido en el medio de

cultivo.

Aunque no encontramos ningún péptido que en Lb. casei ATCC 393 fuera transportado de

manera exclusiva por DtpT, varios péptidos en ausencia de este transportador pueden

ingresar en la célula pero de un modo menos eficiente. En lactococcus Iactis péptidos que

son transportados por un transportador altemativo, diferente de DtpT, no reprimen

completamente la expresión del gen oppD evaluada empleando una fiJsión transcripcional

PoppD-qu (Guedon et al, 2001).

98

Resultados V.Identificación de reguladores

Medimos las actividades PrtP y Per en la cepa salvaje y la mutante en presencia de TL

(uno de los péptidos que en ausencia de DtpT podía ser intemalizado a la célula por un

transportador alternativo pero con menor eficiencia).

Los resultados se resumen en la tabla 6.

Tabla 6: ActividadesespecíficasPrtP y Per en Lb. casei dtpT.

Las actividades fueron ensayadas con células permeabilizadas para Per y con células enteras para Prtl"como se detalla en materiales y métodos.a Actividad específica: unidades de fluorescencia (UF)/ min mg.b Actividad específica: nmoles p-nitroanilida /min mg.c % represión con respecto a la actividad en CDM en ausencia del péptido.

¡o

Medio wt dtpT

Asp PrtPl % l'ePI'e-‘Jiólf Asp PrtP'l % “Presión'CDM 19.6 i 2.5 0 9.5 i 1.2 0CDM + TL lmM 8.9 i 1.3 55 5.4 i 2.2 43

Asp Pepxb % "¡pl'efióllc Asp PepxT % l"BIJI‘99¡<'>II°CDM 75.65i 2 0 35.21i1.7 0

CDM + TL lmM 49:26,_i._1_-,.5 35 .7.__27_:Q..1_.i 3 23

Ambas actividades PrtP y Per se encontraron disminuidas en la mutante dtpT con

respecto a la cepa salvaje en CDM (los valores absolutos fueron aproximadamente la

mitad). Estos datos son coincidentes con los reportados por Guedon et al (2001) en una

mutante dtpT en Laclococcus Iacn's, al evaluar actividad luciferasa en una fusión PoppD­

lux.

La mutante presentó un grado de represión menor que la salvaje por el péptido TL,

verificando que el transporte de este péptido es poco eficiente en esta cepa y corroborando

entonces el fenotipo DtpT'.

5.1.4.Efecto osmoprotector de péptidos en la mutante dtpT.

La mutante a'tpT resultó ser más osmosensible que la cepa salvaje. En un medio completo

como MRS, esto podría explicarse debido a una deficiencia en el transporte de péptidos que

podrían actuar como osmoprotectores.

99

Resultados V.Identificación de reguladores

Evaluamos el efecto de dos péptidos individuales en la osmoprotección en Lb casei dtpT.

Para ello se comparó la velocidad de crecimiento de la cepa mutante y la salvaje en medio

CDM en presencia de TriAla (que había sido descripto como un excelente osmoprotector

en el capítulo I) y KL, un péptido cuyo transporte era deficiente en la cepa mutante. Los

resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7; Velocidad de crecimiento de la mutante dtpT en CDMN en presencia depéptidos.

a El factor de estimulación corresponde a la p en presencia del péptido respecto al CDM solo.

La velocidad de crecimiento se calculó a partir de cultivos en CDM suplementados con

NaCl lM para la cepa salvaje ya que a esa concentración de sal se observaron las mayores

diferencias en el crecimiento en ausencia y presencia del péptido. Para la cepa mutante se

empleó una concentración de NaCl 0,5M ya que, como se describió anteriormente, no se

obtuvo crecimiento en NaCl 0,7M En la cepa salvaje, en presencia de TriAla y KL en el

medio de cultivo se obtuvo una estimulación del crecimiento de 3 y 2,5 veces

respectivamente. En la cepa mutante, en cambio, mientras que TriAla provocó un aumento

del crecimiento comparable al de la cepa salvaje (2,8 veces) el dipéptido KL no logró

estimular el crecimiento en un medio hiperosmótico.

La ausencia de un efecto osmoprotector de un péptido que no es transportado de manera

eficiente, a diferencia de uno que sí lo es, demuestra de manera convincente el rol de los

péptidos como osmoprotectores durante el crecimiento en alta sal.

5.2. Rol de CodY en la osmorregulación.

En la búsqueda de un regulador involucrado en la pérdida de la represión por péptidos

en un medio hiperosmótico, decidimos analizar el rol de CodY.

En [actococcus Iaclis la proteína CodY, homóloga al represor pleiotrópico de B subtilis,

o el producto de un gen regulado por esta proteína es responsable de la represión por

péptidos de la expresión de los componentes principales del sistema proteolítico.

Guedon y colaboradores (2001), encontraron que en una mutante codY de L Iactis se

pierde la represión por péptidos de los genes opp, pepN y pepC, y se sospecha que

ocurra lo mismo para otros genes comoprtP, pepDA2 yper. Aunque se sospecha una

interacción directa de CodY con los promotores, como ocurre en B subtilis, no se ha

puesto en evidencia la interacción de esta proteína con los promotores de estos genes. El

objetivo de esta parte de la tesis es evaluar la presencia de CodY en extractos de Lb

casei provenientes de distintas condiciones de crecimiento, ensayar si existe la

interacción de CodY con el promotor del gen prtP y si la misma se modifica durante el

crecimiento de Lb casei en alta sal.

5.2.1. La proteína CodY está presente en Lb casei ATCC 393.

Para verificar la presencia de la proteína CodY en extractos de Lb. casei se realizaron

ensayos de Western Blot empleando anticuerpos anti CodY de B. subtilis.

En primer lugar se purificó la proteína CodY de B subtilis a partir de un extracto de la

cepa de Escherichia coli KSZ72, para emplearla como un control positivo en ensayos

de Western Blot. Esta cepa lleva el plásmido pBAD30 con el gen codY completo de B

subtilis. pBAD3O es un vector de expresión controlada a través de un promotor

inducible por Arabinosa. La proteína CodY lleva una colita de histidina que pennite su

purificación en un sistema adecuado (ver detalles en Materiales y Métodos). En la

Figura 26 se muestra el SDS PAGE con extractos provenientes de la cepa KSZ72

inducidas y no inducidas con arabinosa y de B subtilis. Y el Western Blot

correspondiente empleando un anticuerpo anti CodY de B subtilis. El tamaño esperado

para CodY de B subtilis es de 29 Kda.

lOl

i.0.0.000......0.0.CCOO...OOOOOOOOO‘OOOOOOOOOOOO0..

Resultados V.Identificación de reguladores

Figura 26: SDS PAGE y Western Blot de CodY de B.subtilis.

Calle 1: Marcadores de peso molecular. A laizquierda de la imagen se muestran los tamaños enkDaCalles 2 y 5: Extracto de E. coli KSZ72 sininducir.

4- Calles 3 y 6: Extracto de E. coli KSZ72 inducidocon arabinosa.Calles 4 y 7: Extracto de B.subtilis 168.Calles 2, 3 y 4: SDS PAGE teñido con CoomasieBlue R-250.Calles 5, 6 y 7: Western Blot empleando unanticuerpo anti CodY de Bsubtilis.Las flechas indican el monómero y elhomodímero de CodY (ver detalles en el texto)

123456766kDa­

31 kDa­ T14 kDa­

En la Figura 26, se observa un aumento en los niveles de la proteína CodY en Ecoli KSZ72

luego de la inducción con arabinosa (aunque la expresión no se encuentra completamente

reprimida en ausencia del inductor).Con el anticuerpo empleado pudo revelarse la proteína

codY de Bsubtilis que tiene un peso molecular de 29 kDa. Es importante destacar que a

pesar de que el gel se realizó en condiciones desnaturalizantes, en el extracto de Bsubtilís

se detectó una banda adicional que de acuerdo al tamaño podría corresponder al

homodímero de la proteína (aproximadamente 62 kDa). Este dímero no se detectó en los

extractos de E coli que sobreexpresaban la proteína.

Luego se evaluó si el anticuerpo anti CodY de B. subtilis podía reconocer una proteína

homóloga de CodY de Lb.casei ATCC 393.

Al realizar un ensayo de Western Blot con extractos de Lb casei provenientes de distintas

condiciones de crecimiento (CDM, CDM AP, CDMN AP y CDMN), el anticuerpo anti

CodY de B.subtilis reveló una banda de aproximadamente 26 Kda (Figura 27). Esta banda,

de menor tamaño comparado con el tamaño de CodY de B.subtilis, coincide sin embargo

con el tamaño de la proteína estimado a partir de la secuencia de nucleótídos del gen codY

de Lactococcus Iactis. También se reveló una banda adicional de mayor intensidad que

podría corresponder a un homodímero ya que el tamaño es aproximadamente el doble del

102

Yiooooooooooooooooooooo-ooooooooooooo

Resultados V.Identificación de reguladores

realizaron en condiciones desnaturalizantes no fire posible obtener solamente la forma monomérica de

la proteína.

si

Figura 27: Western Blot de CodY de Lb.casei ATCC 393 empleando un anticuerpo anti CodY deB subtilis

Calle]: Extracto de Lb.casei ATCC 393 crecido enCDM.Calle 2: Extracto de Lb.casei ATCC 393 crecido enCDM AP.Qauej; Extracto de Lb.casei ATCC 393 crecido enCDMN AP.Calle 4: Extracto de Lb.caseí ATCC 393 crecido enCDMN.Calle 5: Proteína CodY de B.subtilis purificadaA la derecha de la imagen se muestra la posición de losmarcadores de peso molecular.Las flechas señalan el monómero de CodY y elhomodímero

- 205an

- 66 ItDa

-3IkDa

Los niveles de CodY no se modificaron sustancialmente en los extractos provenientes de las distintas

condiciones de crecimiento empleadas. En B.subtiIis no se encontraron diferencias en los niveles de la

proteína CodY en las distintas fases de crecimiento (exponencial y estacionaria) a pesar de que la

proteína ejerce la represión de genes durante el crecimiento exponencial (Ramayake et al, 2001). Este

resultado está en concordancia con el modelo regulatorio propuesto para CodY que no ocurre a través

de la regulación de su expresión (ver más adelante).

5.2.2. Interacción de CodY con el promotor deprtP.

Para evaluar si existía una interacción directa entre la proteína CodY y la región promotora del gen

prtP se realizaron ensayos de gel shifi. En primer lugar, se evaluó si la proteína CodY de B súbtilis

podía interactuar con el promotor de prtP de Lb.casei (Figura 28). La proteína CodY de L Iactis

103

Resultados V.Identificación de reguladores

5.2.2. Interacción de CodY con el promotor deprtP.

Para evaluar si existía una interacción directa entre la proteína CodY y la región promotora

del gen prtP se realizaron ensayos de gel shifi. En primer lugar, se evaluó si la proteína

CodY de B.subtilis podía interactuar con el promotor de prtP de Lhcasei (Figura 28). La

proteína CodY de Llactis presenta una alta homología con la de B.subtiIr's,principalmente

en la región HI'H (“Helix Turn Helix”) que corresponde al dominio de interacción con el

ADN (Guedon et al, 2001.):Para ello un fragmento de la región promotora del gen prtP (de

aproximadamente 200 pb) fire amplificado con los cebadores (prompl y promp2). El

mismo se marcó y se incubó con extractos provenientes de E. coli KSZ72 no inducida e

inducida y de metilis. La interacción del fragmento de ADN con una/s proteína/s produce

un retardo de la migración del fiagrnento en un gel de poliacrilamida. La posición de la

sonda de ADN puede ser revelada empleando un sistema adecuado (ver detalles en

Materiales y Métodos).

Como se observa en la figura 28 se observó la formación de un complejo de movilidad

retardada cuando se empleó un extracto de Ecoli KSZ72 inducido (es decir que expresaba

la proteína CodY), pero este complejo estaba ausente en extractos de células no inducidas,

indicando que el retardo observado correspondía a la interacción de la proteína CodY de B

subtilis con el promotor del gen prtP. También se observó un retardo en la movilidad de la

sonda cuando se empleó un extracto de B,subtilis. Es importante destacar que en geles de

poliacrilamida 7,5% pudo observarse una banda adicional de movilidad retardada en los

controles con sonda libre. La secuencia de la región promotora del gen prtP de

Lactobacillus paracasei subsp paracasei NCDO 151 (I-Iolcky Naes, 1992) que se empleó

para el diseño de los cebadores prompl y promp2, es rica en AT. Esta característica está

presente en las secuencias promotoras de otros genes prtP de Lactococcus y otros

lactobacillus. En todos los casos se encontraron repeticiones invertidas TATAAT en la

región promotora y en Lactococcus Iactis la mutagénesis de estas regiones conduce a una

pérdida de la represión por péptidos del gen prtP. El ADN rico en AT exhibe un plegado

(“bending”) y curvatura (Crothers et al, 1990) que puede modificar su movilidad y

explicaría la aparición de una banda retardada.

104

l.OOOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0....OOOCOOOOOOOOOOOOOOOO

Resultados V.Identificación de reguladores

Se realizaron luego ensayos de gel shifi con extractos de Lb, casei crecido en medio

CDM. Los resultados se muestran en las figuras 29 y 30.

En la figura 29 se vela formación de un complejo ADN + proteína cuando se emplea en

el ensayo el extracto de Lb casei. El complejo formado reconocería de manera

específica el fragmento promotor, ya que disminuye en intensidad cuando es competido

con la sonda no marcada.

En la figura 30 se muestra un ensayo en el que se emplearon concentraciones crecientes

de extracto. La intensidad del complejo aumenta a medida que aumenta la cantidad de

extracto empleada y de manera inversa disminuye la cantidad de sonda libre.

Figura 28: Gel shift con extractos de Ecoli KSZ72y de B,subtílis.

ADN +proteina _,

M Sondasolasonda I Calle 2: Extracto de E coli KSZ72 sin inducir.libre Calle 3: Extracto de E coli KSZ72 inducido.curvada Calle 4: Extracto de B,subtilis.

I Las flechas indican la posición de la sonda libre,aida la sonda libre curvada y el complejo ADN +

proteínas.

105

yo

Resultados I/ÍIdentificación de reguladores

Figura 29: Gel shift con extractos de Lb.casei ATCC 393.

ADN + _ iproteína 5"" Calle l: sondasola

' Calle 2: Extracto de Lb.casei ATCC 393 crecidoen CDMCalle 3: Extracto de Lb.casei ATCC 393 crecidoen CDM en presencia de sonda fría.Las flechas indican la posición de la sonda libre,la sonda libre curvada y el complejo ADN +proteínas

e.

sondalibre _>curvada

sondalibre ___,

Figura 30: Gel shift con concentraciones crecientes de extracto.

Gel shift con cantidades crecientes de extracto de Lb.casei ATCC 393 crecida en CDM. Calle 1, 2, 3 y 4,ensayos en presencia de 5, 10, 15 y 20 pg de extracto respectivamente.

ADN+ —>proteína r

sonda libre ’

106

>OOOOOOOOOOOOO...OO...OCOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOÓOOÓO

Resultados V.Identificación de reguladores

Se realizó luego un ensayo de gel shifi empleando los mismos extractos que se habían empleado en

el Western Blot, es decir obtenidos a partir de células de Lb. casei crecidas en, CDM, CDM AP,

CDMN AP y CDMN. Los resultados se muestran en la Figura 31.

Figura 31: Gel shift con extractos de Lb.casei crecido en CDM y CDM AP 2,5 mM con y sinNaCl 0,7M.

Calle 1: sonda libre_C_a_ll_e_2:Extracto Lbacasei crecido en CDMCalle 3: Extracto Lb casei crecido en CDM AP 2,5mM.M: ExtractoLb.caseicrecidoen CDMNAP 2,5mM.Calle 5; Extracto Lb.casei crecido en CDMN.

l 2 3 4 5

ADN +proteína

Sonda ’libre

Se observaron diferencias en la abundancia relativa de los complejos ADN + proteínas con

extractos de diferentes condiciones de crecimiento, indicando que la cantidad o la interacción de los

factores involucrados era diferente de acuerdo ala condición de crecimiento de la que provenían.

Sin embargo, como el ensayo se realizó empleando un extracto crudo no era posible saber si el

retardo se producía por la interacción de CodY o de otra/s proteína/s (incluyendo o no a CodY) que

pudieran interactuar con la región promotora deprtP

Para verificar si CodY de Lb.casei podía unirse a la región promotora del gen prtP. Se realizó un

ensayo de gel shift empleando un inmunoprecipitado obtenido a partir de un extracto de Lb.casei

(crecido en CDM) con el anticuerpo anti CodY de B,subtilis. Los resultados se muestran en la figura

32.

107

Resultados V.Identificación de reguladores

Figura 32: Gel shift con inmunoprecipitado de un extracto de Lb casei con un anticuerpo antiCodY

93115;; 2 ul inmunoprecipitado con anticuerpo antiCodY

Qa_lle2: 4 ul inmunoprecipitado con anticuerpo antiCodYfile 3: controlcon proteínaAG agarosa

ADN+ —>CodY '

Sonda --——> ,libre

Como se desprende de la Figura 32 se reveló una banda (señalada por la flecha) que correspondería

al inmunoprecipitado que produce un retardo de la migración de la sonda. La intensidad de la banda

aumenta conforme se aumenta la cantidad de inmunoprecipitado empleado (comparar calles 1 y 2).

En la calle 3 se muestra un control empleando la proteína AG agarosa con la que se precipitan los

inmunocomplejos (ver detalles en Materiales y Métodos). Aunque aparece una banda tenue, que

está presente en las otras dos calles es distinguible de la banda en la que existe una interacción

específica. Además el inmunocomplejo + la proteína AG agarosa produce un retardo mayor del

ADN coincidente con el mayor peso molecular del mismo. Por lo tanto, de acuerdo a estos

resultados, CodY de Lb.casei puede interaccionar con la región promotora del gen prtP y podría

entonces actuar como modulador de la expresión de este gen en las distintas condiciones de

crecimiento.

Para verificar si CodY era el responsable del retardo en la movilidad del fragmento promotor

cuando se empleaban extractos crudos, y de esta manera analizar una condición más cercana a lo

que ocurre in vivo, se realizó un Western Gel shifi. El ensayo consiste en realizar el gel shifi y luego

108

Resultados V.¡demi/¡cación de reguladores

transferir simultáneamente a dos membranas, en una de ellas se revela el ADN marcado y en la otra

se realiza un Western Blot empleando anticuerpos específicos. De esta manera si la proteína de

interés se encuentra formando parte del complejo ADN-proteína, se revela una banda en la misma

posición que la del fragmento de ADN retardado. Empleando esta técnica, no fue posible revelar

una proteína por Western Blot cuya posición coincidiera con la del ADN retrasado. Sin embargo ha

sido descripto, empleando esta misma técnica, que puede no detectarse la presencia de una proteína

si ésta se encuentra formando parte de un complejo proteico, ya que el epitope que reconoce el

anticuerpo puede estar enmascarado por las demás proteínas involucradas en la interacción con el

ADN (Demczuk et al, 1993).

Se realizó entonces, un ensayo de supershifi. Para ello, previamente al ensayo de gel shift, se incuba

el anticuerpo con el extracto a ensayar. Si la proteína que reacciona con el anticuerpo se une al

ADN, se observa la aparición de una banda de menor movilidad producto del complejo antígeno­

anticuerpo-ADN formado.

En la figura 33 se muestran los resultados obtenidos empleando esta técnica con extractos de células

crecidas en CDM AP y CDMN AP.

Como se observa en la figura 33 los resultados obtenidos no fireron los esperados de acuerdo a las

predicciones teóricas, aunque se observaron claras diferencias en el ensayo en ausencia y en

presencia del anticuerpo. En las calles en las que el extracto había sido preincubado con el

anticuerpo anti CodY, en lugar de observarse un supershift de la banda superior como se esperaba,

se observó la aparición de una banda intensa de movilidad intermedia entre la sonda libre y el

complejo ADN proteína que estaba ausente en las calles donde el ensayo se realizó con extracto sin

anticuerpo. Cabe destacar, que este complejo logra unir casi por completo la sonda libre que

quedaba remanente en los otros ensayos, indicando una firerte interacción con el ADN.

Sin embargo este resultado podn’a explicarse a través de dos hipótesis, las mismas se esquematizan

en la figura 33.

Esquema A: de acuerdo a los resultados del Western Gel shift, si CodY se encontraba formando

parte de un complejo proteico podría no ser reconocida por el anticuerpo específico ya que los

epitopes estarían enmascarados. A1preincubarse el extracto con el anticuerpo anti CodY, la proteína

se unin’a al mismo y entonces CodY sola se uniría al ADN produciendo un complejo ADN-CodY

de menor tamaño y de movilidad mayor. Sin embargo de acuerdo a esta hipótesis, salvo que CodY

se encontrara en exceso, se hubiera esperado una disminución de la intensidad del complejo ADN +

109

Resultados V.Identificación de reguladores

proteínas ya que el anticuerpo provocaría un “secuestro” de CodY disminuyendo así la formación

del complejo. Sin embargo el análisis por densitometría de la imagen y su posterior cuantificación

no mostró una disminución de la intensidad del mismo.

Esquema B: En esta segunda hipótesis se partió del supuesto de que al unirse CodY al fragmento de

ADN empleado como sonda solo provocaría un leve retardo de la migración del mismo, que no

puede diferenciarse de la' sonda libre ya que migran prácticamente en la misma posición. El

agregado del anticuerpo produce entonces un supershift de ese complejo y es ahora detectado como

una banda de movilidad inteiinedia entre la sonda libre y el complejo superior de ADN + proteína.

En esta segunda hipótesis, CodY podría o no formar parte del complejo ADN + proteína que había

sido detectado hasta el momento.

Los resultados expuestos permitieron determinar la interacción de la proteína CodY con el promotor

del gen prtP. La proteína CodY de B.subtilis logró unirse al fragmento empleado como sonda y

provocar un retardo de la movilidad en un gel. La proteína CodY de Lb caser' también pudo unirse

al fragmento del promotor del genprtP. Esta interacción pudo ser puesta en evidencia a través de un

ensayo de retardo en gel en el cual se empleó un inmunoprecipitado de un extracto con un

anticuerpo anti CodY. Sin embargo, los resultados no fiieron tan concluyentes al tratar de

determinar la presencia de CodY en los complejos ADN + proteínas obtenidos al emplear extractos

crudos provenientes de diferentes condiciones de crecimiento, aunque fireron suficientes para

proponer la formación de un complejo CodY- promotorprtP.

Considerando entonces, que CodY sería uno de los moduladores de la expresión del gen prtP, y que

en L lactis es el responsable del efecto represor en presencia de péptidos de la expresión de varios

genes que codifican componentes del sistema proteolítico, es altamente probable que esté

involucrado en la pérdida de represión por péptidos de prtP observada durante el crecimiento en un

medio hiperosmótico.

110

'00...OO...0.0.0.0...00.0.000000000000000000COO...

Resultados V.Identificación de reguladores

Figura 33: Ensayo de supershift

Callel: sonda libreCalle 2: extracto de Lb.casei crecido en CDM APCalle 3: idem 2, preincubado con anticuerpo anti CodYQalle 4: extracto de Lb.casei crecido en CDMN APCalle 5: ídem 4, preincubado con anticuerpo anti CodY

PromotordeprtRProteína CodY de Lb.casei

Otras proteínas de unión al ADN

12345Esquema B IEsquema A

ADN+ —>proteína

ADN +CodY+ —>anticuerpo

Sonda libre ——>

111

Resultados VI.Modificaciones en las envolturas

CAPITULO VI

Variaciones en la pared celular durante el crecimiento en alta sal

En el Capítulo HI se describió el aumento de la actividad enzimática de PrtP (proteasa anclada a la

pared) en células crecidas en alta sal. Los altos valores obtenidos se explicaron por un aumento de

la Vmax de la enzima que podría se adjudicado a cambios en su conformación relacionados con

variaciones en el entorno de la misma. Se decidió por lo tanto analizar si existían variaciones en la

pared celular de Lb.casei en un medio hiperosmótico. Los Lactobacillus se caracterizan por ser muy

resistentes a la lisis por lisoiima u otras enzimas que hidrolizan la pared. Esta caracteristica es

beneficiosa a la hora de seleccionar una cepa que será empleada como probiótico. Por el contrario,

la lisis es importante durante la maduración de quesos (para permitir la liberación de las peptidasas

intracelulares) y también durante el desarrollo de vectores de expresión que deben liberar su

contenido en el momento adecuado. Por lo tanto el estudio de las modificaciones de las envolturas

de este microorganismo por alta sal es importante para el desarrollo de “starters” y probióticos.

6.1. Microscopía electrónica.

Cuando Lb. casei ATCC 393 crece en un medio con alta concentración de NaCl, presenta

alteraciones morfológicas con respectos a células de medio control.

En la figura 34 se muestran células de la fase exponencial de crecimiento crecidas en MRS y

MRSN 1M. El agregado de NaCl al medio de cultivo resultó en un aumento significativo del

tamaño celular comparado con las células control.

En la figura 35 se muestra la distribución de frecuencias en función del diámetro celular para

células provenientes medio MRS y MRSN 1M. Mientras que la mayoría de las células control

presentaron un diámetro aproximado de 400 nm, en células provenientes de medio con agregado de

sal fue entre 630-660 nm, alrededor de un 60% más grandes. También se observa una varianza

mayor en las mediciones de células de MRSN 1M, comparada con las células control.

Además del aumento en el tamaño, las células crecidas en NaCl presentaron claras diferencias a

nivel de la pared celular. Aunque no se encontraron diferencias en el grosor de la pared (control=

23:1:6 nrn vs N= 24 i 15), estas se observaron más laxas y menos definidas que en las células

control. Se observó en varios casos, que las paredes se hallaban separadas de la membrana celular.

112

Resultados VI.Modificaciones en las envolturas

La visualización de varios campos permitió determinar que en células provenientes de medio

hipersalino, la septación resultó incompleta.

Un aumento del tamaño celular puede atribuirse a la inhibición de la división celular. En el capítulo

I se describió una disminución de la velocidad de crecimiento de 4 veces en MRSN 1M con

respecto al control. En Escherichia coli se ha reportado un alargamiento de las células en alta

osmolaridad atribuida a la división celular inhibida (Meury et al, 1988). En Staphylococcus aureus

también se observó un aumento del tamaño de células crecidas en NaCl (Vijaranakul et a1, 1995).

En ese trabajo, el aumento del tamaño celular se correlacionó con un peptidoglicano menos

entrecruzado y una separación celular retardada. Más aún, el acortamiento de los puentes

interpeptídicos puede atribuirse a una alteración del proceso de síntesis de peptidoglicano general,

probablemente por alteraciones en la integridad de la membrana causadas por el medio hipersalino.

Se han reportado alteraciones a nivel de las membranas de microorganismos crecidos en alta sal

(Lopez et al, 1998, Poolman et al, 2002) y recientemente se han descripto las alteraciones que

ocurren en la membrana de Lb.casei ATCC 393 en esa condición de crecimiento (Machado et al,

2003)

6.2. Modificación dela sensibilidad a antibióticos durante el crecimiento en NaCl

A fin de caracterizar las diferencias observadas a nivel de las envolturas, se evaluó el

comportamiento de Lb casei ATCC 393 frente a diversos antibióticos que interfieren con la síntesis

de la pared bacteriana o actúan sobre la membrana plasmática, en células crecidas con y sin NaCl.

Los resultados se muestran a continuación en la tabla 8

Como se desprende de la Tabla 8, la concentración inhibiton'a mínima para todos los antibióticos

testeados disminuyó significativamente en células crecidas en NaCl, indicando un aumento de la

sensibilidad frente a los mismos. Esto sucedió tanto para antibióticos que interfieren con la síntesis

de la pared, así como para antibióticos que actúan directamente sobre la membrana plasmática

como la nisina. La nisina es una bacteriocina producida por Lactococcus Iactis que interactúa

directamente con la membrana celular, provocando un poro en la misma, que conduce a la lisis de la

célula. Esta bacteriocina es la única aprobada para su uso en la preservación de alimentos.

Los resultados obtenidos condujeron a pensar que podían ocurrir modificaciones en la pared y en la

membrana durante el crecimiento en alta sal.

113

Figura34:MicroscopíaelectrónicadecélulasdeLbcaseiprovenientesdeMRSyMRSN1M. aybcélulascontrolydeNaClrespectivamente(12000X).cydcélulascélulasdeNaCl(ZOOOOX);eyfcélulascontrol(20000X).

Resultados V7.Modificaciones en las envolturas

Figura 35: Frecuencia de distribución en función del diámetro celular

Las banas llenas corresponden a mediciones de células connol (MRS) y las barras vacías a células de mediohiperosmótico (MRSN 1M).

Frecuenciadistribución

360 400 440 570 600 630 660 690 750

diametro (nm)

Tabla 8: Sensibilidad a antibióticos

La CIM pam cada antibiótico se determinó por el método de dilución en tubo.

CM (concentracióninhibitoriaAntibiótico CONTROL NaCl

Vancomicina ¡ig/ml 2274 i 633 523 i 6

Bacitracina mg/ml > 0.625 0.27

Ampicilina (Etest) ¡ig/ml 1 i 0.5 0.16 i 0.046

Penicilina G ¡Lg/ml 1.5 i- 0.99 0.2

Fosfomicina mg/ml 22.75 i 3 < 3

Nisina ¡ig/ml 10 i 0.5 2 i 0.6

Control: células crecidas en MRSNaCl: células crecidas en MRS NaCl 1M

115

Resultados VI.Modificaciones en las envolturas

6.3. Efecto de la Mutanolisina en células crecidas en NaCl y en paredes purificadas

La mutanolisina es una enzima que hidroliza los enlaces B 1-4 entre el N-acetilmurámico y la N­

acetilglucosamina. Esta enzima es empleada en bacterias lácticas para sensibilizar el péptido

glicano de la pared celular -yfavorecer la lisis de la bacten'a.

Evaluamos el efecto de esta enzima sobre células provenientes de la fase exponencial de

crecimiento y de la fase estacionaria. Para evaluar la lisis empleamos células enteras o paredes

purificadas. Las células enteras fueron ensayadas en un buffer fosfato y en el mismo buffer en

presencia de NaCl 0,7M (concentración empleada durante el crecimiento) con la intención de tratar

de reproducir el ambiente de la bacteria cuando crece en el medio hipersalino. Los resultados se

observan en las Figuras 36 y 37.

Claramente se observa una lisis diferencial de las células crecidas en NaCl. El efecto fire mucho

más marcado en células de la fase exponencial de crecimiento que en células de la fase estacionaria.

Indicando, como ya ha sido reportado en varios microorganismos que existen modificaciones de las

envolturas dependientes de la fase de crecimiento. En Lb.fermentum aumenta el grado de O­

acetilación cuando el microorganismo ingresa en la fase estacionaria de crecimiento disminuye

concomitantemente su sensibilidad a Lisozima (Logardt et al, 1975). En Lb. casei el 59% del

péptido glicano se encuentra O-acetilado (Billot- Klein et al, 1997). Como se esperaba, para células

provenientes de la condición control, la lisis se vio favorecida en un medio hipo o isosmótico

(buffer fosfato) comparado con un medio hiperosmótico (buffer fosfato + NaCl 0,7M). Sin embargo

estas diferencias desaparecieron en células provenientes de NaCl. Indicando que la modificación de

la pared durante el crecimiento en alta sal sensibiliza a la misma y disminuye la resistencia a la

acción de la mutanolisina a niveles tales que la lisis de la bacteria es independiente de la

concentración de osmolitos en el extracelular.

116

Resultados VI.Modificaciones en las envolturas

Figura 36: Sensibilidad a mutanolisina de células provenientes de la fase exponencial decrecimiento.

Se muestra la van'ación en la D05” nm luego de agregada la mutanolisina de células enteras provenientes de cultivos enfase exponencial en MRS, a) y c) y de cultivos en medio hiperosmóüco, MRS NaCl 0,7M b) y d). Se emplearon 0, 25 y100 unidades de mutanolisina/ml (rombos, cuadrados y triángulos respectivamente). En a) y b) la reacción se llevó acabo en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,5. En c) y d) la reacción se llevó a cabo en el mismo buffer suplemenmecon NaCl 0,7M '

c) 0,8

0.6

2 0,40,2

00 10 20 0 10 20

tlempo(ha) fiethS)

0 10 20 0 10 20

tiempo (hs) tlempo (ha)

117

Resulraa'os VI.Modificaciones en las envolturas

Figura 37: Sensibilidad a mutanolisina de células provenientes de la fase estacionaria decrecimiento.

Se muestra la van'ación en la D05» nm luego de agregada la mutanolisina de células enteras provenientes de cultivosen fase estacionaria en MRS, a)_y c) y de cultivos en medio hiperosmótico, MRS NaCl 0,7M b) y d). Se emplearon 0,25 y 100 unidades de mutanolisina/ml (rombos, cuadrados y triángulos respectivamente). En a) y b) la reacción se llevóa cabo en bufl‘er fosfato de sodio 50 mM pH 6,5. En c) y d) la reacción se llevó a cabo en el mismo buffer suplementadocon NaCl 0,7M . .

a) 0.6 c) 0.6

00550

o N00550

0.2\

0 . . o . .

0 10 20 0 10 20

tlem po (hs) tlompo (hs)

b) 0,6 d) 0.a

\‘ 0,20 1 . 0 . .

0 lO 20 0 10 20

llempo (hs) tlompo (ha)

118

Resultados VI.Modificaciones en las envolturas

Se evaluó también el efecto de la mutanolisina en paredes purificadas (Figura 38) de células

provenientes de cultivos control y en NaCl.

Análogo a lo observado para células enteras, las paredes provenientes de cultivos en un medio

hipersalino fileron notablemente más sensibles a la lisis por mutanolisina. Estos resultados indican

que la lisis diferencial observada en células enteras, es consecuencia directa de alteraciones en la

pared de este microorganismo. Un aumento en el grado de entrecmzamiento del péptido glicano,

que da una mayor rigidez al‘ mismo, conduce a una disminución de la susceptibilidad a la lisis

(Meijer et al, 1998). La disminución en el grado de entrecruzamiento del péptido glicano, podria

estar relacionada con un aumento a la sensibilidad a mutanolisina. El análisis de la composición de

las paredes provenientes de medio control y con NaCl por HPLC, o algún otro método, permitiría

explicar la sensibilidad diferencial observada.

Figura 38: Sensibilidad a mutanolisina de paredes purificadas.

% absorbancia residual a 550nm de la pared purificada luego de agregada la mutanolisina. Las paredes se obtuvieroncomo se indica en Materiales y Métodos de células en crecimiento exponencial en MRS (cuadrados) y en MRSN 0,7M(círculos) y los tiempos indicados se monitoreó la absorbancia a 550nm.

°/nAbs

x1O

0 100 200 300

min

Las diferencias observadas por microscopía electrónica, así como los resultados de resistencia a

antibióticos, lisis diferencial de células enteras y de paredes purificadas, claramente indican que

existen modificaciones en la pared celular de Lb.casei ATCC 393 cuando crece en un medio

hipersalino. Estas diferencias podrían relacionarse con los cambios en la actividad de PrtP durante

el crecimiento en alta sal (descriptos en el Capítulo IH), ya que modificaciones en el entorno de la

119

Resultados V].Modificaciones en las envolturas

proteína podrían provocar variaciones en la actividad de la misma. Así mismo, los resultados

indican que el crecimiento en NaCl fragiliza la pared de este microorganismo haciéndolo más

susceptible a la lisis. Este resultado, es de suma importancia ya que el precrecimiento en alta sal

podría emplearse como un método para facilitar la lisis de una bacteria que normalmente es

resistente y podría tener importantes implicancias en su uso a nivel tecnológico.

Conclusiones y Discusión

Conclusiones y Discusión

En este trabajo se analizó el efecto de la hiperosmolaridad por agregado de NaCl ya que es el

efector de estrés que se encuentra presente en los procesos fermentativos en los que participa Lb

casei.

Los resultados que se muestran en el Capitulo I indican que el crecimiento de Lb casei se encuentra

disminuido en un medio hiperosmótico (que contiene NaCl, glicerol) (Tabla 1). Claramente este

microorganismo resultó más osmosensible en un medio químicamente definido (CDM), que

contiene sólo los requerimientos esenciales para su crecimiento, que en un medio complejo (MRS).

Al evaluar los componentes del medio que podían ejercer un efecto osmoprotector, se encontró que

esta bacteria puede emplear una serie de solutos osmocompatibles para sobrellevar el aumento en la

osmolaridad del medio de crecimiento. Las ampliamente distribuidas, glicín betaína y camitina

resultaron ser osmoprotectores muy eficientes (Figuras 3 y 4). La prolina libre, en cambio, a las

concentraciones testeadas no fue buen osmoprotector. Esto probablemente se deba a un transporte

poco eficiente de este aminoácido. En Lb.plantarum el transportador QacT que se activa luego de

un choque osmótico, presenta alta afinidad por glicín betaína y camitina y baja afinidad por prolina

(Glaasker et al, l998b). Los péptidos también lograron promover el crecimiento en un medio

hiperosmótico y dado que no mejoraron el crecimiento en un medio control pueden ser

considerados buenos osmoprotectores (Figuras 2 y 4). Aunque su efecto es menor que el de la

camitina y la glicín betaína, podn'an ser una excelente alternativa en ausencia de los primeros,

permitiendo el crecimiento en alta sal. La naturaleza de los péptidos que actuaron como

osmoprotectores fue variada (tanto di como tripéptidos) e independiente de la presencia de prolina

en los mismos. La acumulación de péptidos durante la osmorregulación ya había sido observada en

varias especies, pero en general involucraba la síntesis de novo y no eran acumulados desde el

medio (Smith y Smith, 1989; Mc Laggan et al, 1990). En Listeria Monocytogenes se demostró que

puede acumular péptidos desde el medio que contribuyen a la osmotolerancia, en especial aquellos

conteniendo prolina y glicina. (Amezaga et al, 1995). La acumulación del péptido entero o de sus

aminoácidos dependía de la identidad del mismo, pero en todos los casos la acumulación de

aminoácidos y péptidos del ambiente lograba mantener la turgencia de la célula y podía sustituir los

solutos compatibles convencionales. Muchos procesos fermentativos en los que Lb.casei participa

tienen como sustrato a la leche. En la leche hay pocos aminoácidos libres y éstos se encuentran

formando parte de proteínas enteras (caseínas) que la bacteria degrada en péptidos que son

intemalizados para ser usados como firente de aminoácidos para el crecimiento. Lb.ca.sei presentó

121

Conclusionesy Discusión

una osmorresistencia en leche comparable a la de medio completo, y los péptidos que se obtienen a

partir de la caseína serían un buen candidato para explicar esta similitud (Figura 5).

De acuerdo a esta observación, aquellas actividades involucradas en la provisión de péptidos y en su

hidrólisis en el citoplasma podrian modificarse durante el crecimiento en alta sal.

En el Capítulo II se analizó la variación de las actividades de varios componentes del sistema

proteolítico de Lb.casei.

PrtP es la proteasa que cliva la caseína liberando péptidos de diferente tamaño en el extracelular y

una vez intemalizados, Per (X-prolil-dipeptidil- aminopeptidasa) libera dipéptidos que contienen

prolina desde el extremo N terminal de los péptidos. Estas dos enzimas se consideran claves del

sistema proteolítico, PrtP provee los péptidos y Pepx es la enzima principal en la degradación de

péptidos que contienen prolina. Cabe destacar que la caseína presenta un alto contenido de prolina,

así mismo la prolina ingresa a la célula con baja eficiencia mientras que los péptidos conteniendo

prolina ingresan fácilmente a través de los distintos transportadores de la membrana. Por estos

motivos, Per cumple un rol fundamental en la provisión de este aminoácido para el crecimiento.

PepQ, es una prolidasa que cliva dipéptidos del tipo X-Pro (es decir que su sustrato son los péptidos

provenientes de la hidrólisis por Per) y PepI es una proliniminopeptidasa que cliva prolina del

extremo N terminal de péptidos de más de tres residuos. El efecto conjunto de ambas peptidasas

conduce a un aumento del pool de prolina en el citoplasma.

En Lb. casei, Las actividades de PrtP y de Per se encontraron disminuidas en presencia de

péptidos en el medio de cultivo (Tabla 3). Esto fire análogo a lo observado para Lactococcus Iactis

por varios autores, que posteriormente determinaron se debía a la represión de la expresión de

ambos genes en presencia de péptidos (Marugg et a1, 1995; Meijer et al, 1996; Guedon et al,

2001a)

Llamativamente las actividades de ambas enzimas se encontraron aumentadas en un medio

hiperosmótico (casi dos veces con respecto a un medio control) y en esta condición se perdió por

completo la represión ejercida cuando se agregaban péptidos individuales al medio de crecimiento.

Cuando se empleó una mezcla de péptidos, como la peptona de carne o tn'ptona, la pérdida de la

represión en alta sal no fiie completa, aunque si proporcional a la concentración de peptona

empleada, indicando que el consumo de los componentes presentes en la peptona conduce a la

pérdida de la señal represora. En Lactococcus Iactis ya había sido descripto que péptidos

individuales no tienen el efecto represor alcanzado por una mezcla de péptidos como la casitona (un

hidrolizado de caseína que contiene mayoritariamente péptidos y pocos aminoácidos libres),

122

Conclusionesy Discusión

sugiriendo que ciertos péptidos presentes en la casitona o una mezcla de péptidos específicos se

requieren para obtener una represión completa (Guedon et al, 2001a).

Hasta el momento, no había sido reportada una condición de crecimiento que llevara a la pérdida de

represión de las actividade's'de estas enzimas en presencia de péptidos.

El mismo resultado se obtuvo al someter a células creciendo en un medio que contenía peptona a un

choque osmótico por agregado de NaCl, indicando que el efecto de desrepresión observado es una

consecuencia directa de la presencia del efector de estrés (Figura 7).

Los resultados indican que tanto las actividades de PrtP como Per, principales proveedoras de

péptidos, aumentan notablemente en alta sal e incluso pierden la represión por péptidos en el medio,

apuntando a un rol en la provisión de péptidos para la osmorregulación en un medio hiperosmótico.

La actividad PepQ, en cambio, no se modificó sustancialmente en presencia de péptidos (Tabla 2),

esto ya había sido descripto para la enzima de Lb, delbrueckii subsp. bulgaricus (Rantanen et al,

1997) y permaneció sin cambios en un medio con alta sal. Este resultado, aunque preliminar,

apuntaría a que la hidrólisis de los péptidos producto de Per (X-Pro dipéptidos), cuya actividad se

encuentra aumentada durante el crecimiento en alta sal, no son mayormente degradados en esa

condición de crecimiento. Esto conduciría a un aumento del pool de dipéptidos conteniendo prolina

en el intracelular que ayudaría a mantener la presión de turgencia celular. Sin embargo, sería

necesario efectuar un análisis del contenido intracelular de péptidos luego del crecimiento en un

medio control y un medio hiperosmótico, para corroborar que realmente ocurre la acumulación de

este tipo de péptidos en el citoplasma luego de un estrés salino.

A diferencia de lo observado para PepQ, la actividad de PepI disminuyó en presencia de péptidos y

se perdió la represión ejercida por los mismos en un medio suplementado con sal (Tabla 2). No

obstante los valores de actividad enzimática en medio hiperosmótico nunca superaron los de la

condición control, a diferencia de lo observado para PrtP y Per, indicando que su rol en la

provisión de prolina libre en el intracelular durante el crecimiento en alta sal sería secundario.

Nuevamente, una comparación del pool de aminoácidos en el citoplasma de células provenientes de

las dos condiciones de crecimiento, permitiría determinar efectivamente si la modificación

observada en la actividad de PepI produce un aporte sustancial al pool de prolina libre en el

intracelular.

Considerando que los procesos industriales en los que participa Lb.casei suelen realizarse en leche y

que la misma contiene lactosa como fiiente de carbono, analizamos si existían modificaciones en la

actividad de PrtP en un medio que contenía este disacárido en lugar de glucosa (Tabla 4). No se

encontraron diferencias significativas al emplear lactosa como hidrato de carbono en el medio y los

123

Conclusionesy Discusión

efectos de represión por péptidos y pérdida de represión por crecimiento en alta sal se mantuvieron

dentro de los mismos niveles.

Guedon (2001c), compara el- crecimiento en CDM al crecimiento en leche durante la fase

exponencial, ya que en esta etapa la leche es pobre en péptidos y la expresión de los genes del

sistema proteolítico es máxima. En cambio, luego, la caseína es degradada y los péptidos

comienzan a liberarse al medio y a ejercer un efecto represor sobre diversas actividades. Esto se

refleja por una disminución de las actividades en leche durante la fase estacionaria. Por lo tanto

nuestros resultados en CDM y CDM con peptona podn’an ser extrapolables a lo que ocurre durante

el crecimiento de Lb. casei en leche durante la fase exponencial y estacionaria respectivamente y

reflejar las modificaciones que ocurren en las actividades de las enzimas analizadas en el alimento.

Se podn’a pensar, que durante‘ la salazón de quesos de pasta dura, aún en presencia de los péptidos

provenientes de la hidrólisis de la caseína, las actividades de ciertas peptidasas intracelulares no se

encontrarían reprimidas por los mismos y al producirse la lisis de las bacterias se liberarían grandes

cantidades de las mismas para la degradación completa de los péptidos. De esta manera se pueden

obtener los aminoácidos responsables del aroma y sabor de los productos lácteos y degradar los

péptidos "responsables del sabor amargo.

Se muestra un esquema con los cambios químicos que ocurren durante el proceso de maduración

del queso luego de la salazón:

Queso

Proteólisis Lipólisis Glicólisis

Caseína Acidos grasos

_ l _ (butírico,Polipeptidos caproico, etc)de alto PM

Polipéptidosde bajo PM

Aminas Compuestossulfurados

NH4

AldehídosAlcoholesCetoácidos

124

Conclusionesy Discusión

En el capítulo III se estudió la regulación de los componentes del sistema proteolítico en alta sal. Se

intentó explicar a qué nivel ocurrían las modificaciones encontradas en las actividades de las

enzimas analizadas. Para ello se intentó amplificar un fragmento de los genes per y pepQ de Lb

casei para emplearlo en experimentos de Northern Blot. Esto pemiitiría analizar si lasmodificaciones de las actividades eran reflejo de modificaciones en los niveles de expresión de los

genes correspondientes. Sin embargo, aunque se diseñaron cebadores degenerados en base a la

comparación de secuencias de genes clonados en otros Lactobacillus no fue posible amplificar un

fragmento de los mismos en Lb.casei. Un fragmento del gen pepQ logró amplificarse empleando

ADN de Lb. delbruecla'i como templado (Figura 8). Los oligonucleótidos empleados como

cebadores tienen aproximadamente 20 nucleótidos y si la homología entre los genes no es elevada

puede no ser suficiente para unirse al ADN y originar un producto por PCR.

En el caso de prtP, fire posible amplificar un fragmento del gen por PCR que coincidió con el

tamaño esperado de acuerdo a la secuencia de Lb.paracasei subsp.paracasei NCDO 151 (Holck y

Naes, 1992) a partir de la que se diseñaron los cebadores correspondientes (Figura 10). La identidad

del fragmento pudo comprobarse a través de un análisis por restricción y Southern Blot de acuerdo

a la secuencia de Lb.paracasei subsp.paracasei NCDO 151 (Figuras ll y 12). Las secuencias

primarias de las enzimas de Lactococos son más de un 98% idénticas entre sí y más de un 95%

cuando se comparan con la de praracasei (Kunji et al, 1996).

Empleando una técnica de RT-PCR semicuantitativa se compararon los niveles del mensajero prtP

aislado a partir de diferentes condiciones de crecimiento (Figura 14). Claramente se observó que la

disminución de la actividad en presencia de péptidos se correlacionaba con una disminución de los

niveles de mensajero (Figura 15). Por lo tanto el efecto represor de los péptidos ocurn'a a nivel

transcripcional análogo a lo descripto en Lactococcus Iactis (Marugg et al, 1995; Meijer et al, 1996;

Guedon et al, 2001a).

La pérdida de la represión por péptidos en un medio hiperosmótico se correlacionó con un aumento

en los niveles del mensajero correspondiente. Este resultado mostraba que la actividad aumentada

de PrtP, se debía a la pérdida de la represión transcripcional mediada por péptidos que provocaba un

aumento de los niveles del mensajero cuando el microorganismo crecía en alta sal. Por pn'mera vez

se mostró la pérdida de represión por péptidos y se corroboró que esto ocurría a nivel de la

transcripción.

Sin embargo, aunque la mayor actividad de PrtP se midió en medio hiperosmótico en ausencia de

péptidos, los niveles de mensajero en esta condición no aumentaron y se mantuvieron semejantes a

los de la condición control. Por lo tanto en este caso durante el crecimiento en CDMN la actividad

125

Conclusionesy Discusión

PrtP se modificaba sustancialmente (casi dos veces comparado con el control) pero no podía

explicarse por un aumento en los niveles del mensajero correspondiente.

De modo que el aumento observado podía deberse a algún tipo de regulación postranscripcional que

condujera a un aumento de los niveles de la proteína o a una modificación que provocara un

aumento de la actividad especifica de la enzima en alta sal.

No fue posible corroborar la primera hipótesis, ya que PrtP posee actividad autocatalítica y resultó

imposible obtener la proteína entera y analizar si existían modificaciones en los niveles de la misma

por Western Blot (Figura 16). Aunque esta técnica había sido empleada para comparar los niveles

de PrtP en distintas condiciones de crecimiento en Lactococcus lactis (Sanz et al, 2001), no fue

aplicable a nuestro sistema. En varios trabajos se describió la autoproteólisis de PrtP de

Lactococcus lactis, así como la obtención de un fi‘agmento y no de la proteína entera durante la

purificación de la misma (Laan et al, 1988; Laan et al, 1991; Haandrikman et al, 1991).

Para corroborar la segunda hipótesis se determinaron parámetros cinéticos aparentes de la enzima

(Figura 17). Los parámetros son aparentes ya que se calcularon empleando los datos de actividades

en condiciones estándar y a partir de células enteras y no con enzimas purificadas. El valor de Km

no se modificó en células provenientes de la condición control y células crecidas en medio

hipersalino (CDM= 75 uM, CDMN= 73uM) indicando que la afinidad de la enzima por su sustrato

no se alteraba. En cambio, el valor de Vmax fue el doble para células crecidas en NaCl (69.5

UF/min mg) en comparación al control (33.6 UF/min mg). Los ensayos se realizaron en ausencia de

NaCl, por lo tanto los valores observados serían consecuencia de cambios ocurridos durante el

crecimiento en medio hipersalino.

La enzima PrtP se encuentra anclada a la pared bacteriana de Lb.casei. Su localización así como su

conformación es importante para su actividad. Por ejemplo, la presencia de iones CaH influye en la

actividad de la enzima, estabiliza su conformación y la protege de la degradación autoproteolítica,

es justamente en ausencia de Ca++que la enzima puede ser liberada de la pared.

Es importante destacar, que durante el crecimiento en medios salinos e hiperosmóticos, la

composición de los lípidos de la membrana (ácidos grasos y fosfolípidos) de bacterias varían

notablemente (Lopez et al, 1998; Machado et a1, 2003; Poolman et al 2002). También se muestra en

esta Tesis que la pared se modifica durante el crecimiento en alta sal, tal como lo indican las

diferencias en sensibilidad a antibióticos relacionados con la síntesis de la pared celular, así como el

aumento de la lisis de células enteras por mutanolisina. Esta mayor sensibilidad se observa también

con paredes purificadas, donde la lisis es claramente favorecida en paredes provenientes de células

crecidas en NaCl comparadas con paredes de células control. La observación de fotografias de

126

Conclusionesy Discusión

microscopía electrónica de cultivos de células crecidas en NaCl, mostró un aumento del tamaño

celular, así como diferencias en la pared y una septación incompleta en la mayoría de los casos. En

S aureus, el aumento del tamaño celular en células crecidas en medio hipersalino, se correlacionó

con una disminución del grado de entrecruzamiento del peptidoglicano y una separación celular

retardada (Vijaranakul et al, 1995). En B. subtilis también se han observado variaciones importantes

del tamaño de la pared. Un aspecto importante a determinar es no solo la composición de la pared,

sino también el grado de'entrecruzamiento del peptidoglicano. Cabe destacar que los resultados

obtenidos en este trabajoÏ pueden tener importantes implicancias en el uso tecnológico de los

Lactobacillus pues en los ultimos años se han buscado y ensayado numerosos métodos tendientes a

favorecer la lisis de estos microorganismos.

Estas modificaciones tanto de pared como de membrana, modificarían el entorno de las proteínas

presentes en envolturas, lo que resultaría en alteraciones de su conformación y por ende de su

actividad y Aunque PrtP no se encuentra inserta en la membrana, debe atravesarla en su camino

hacia el extracelular para luego anclarse a la pared donde ejercerá su actividad. En un trabajo del

2002, Poolman propone cómo sería el mecanismo de osmosensado de sistemas de transporte de

membrana.

La concentración iónica (o fiJerza iónica) serviría como señal para la activación de transportadores y

quinasas sensoras que aumentan su actividad en medio hiperosmótico. Por lo menos para un

sistema, OpuA de Llaclis, existe una fiJerte evidencia de que la señal es transducida al complejo

proteico a través de la alteración en las interacciones lípido-proteína más que por el sensado directo

de la concentración o fuerza iónica por las proteínas (van der Heide et al, 2001). De acuerdo a esto,

la membrana donde la proteína se encuentra embebida actuaría como mediador. Los cambios en la

concentración de iones pueden alterar las interacciones específicas entre lípidos (iónicos) y

proteínas alterando por lo tanto su actividad. Se encontró que la fracción de lípidos aniónicos

(cargados) es de suma importancia para la activación osmótica de OpuA, mientras que variaciones

en la longitud de las cadenas carbonadas y la posición y cantidad de dobles ligaduras tenían efectos

menores. Aumentando la fracción de lípidos aniónicos (6-13-25%), OpuA puede ser convertida de

un estado inactivo, a un estado constitutivamente activo y a un estado osmóticamente controlado

respectivamente. Dado que los perfiles de activación de OpuA por osmolitos iónicos son similares a

los que se observan por alteraciones en la fracción de fosfolípidos aniónicos, estos datos sugieren

que OpuA sensa el estrés osmótico vía perturbaciones en la interacción iónica entre la proteína y los

lípidos de la bicapa.

127

Conclusionesy Discusión

De acuerdo a los resultados obtenidos sobre la activación de PrtP en un medio hiperosmótico y

considerando las modificaciones que ocurren en las envolturas, sería interesante analizar si los

transportadores DtpT y Opp del sistema proteolítico están sujetos a un mecanismo de activación por

osmorregulación. Estos transportadores son los encargados de intemalizar los péptidos productos de

la hidrólisis de la caseína por PrtP. Una actividad aumentada de estos transportadores de membrana

corroboran’a el rol de los péptidos en la osmoprotección.

En el Capítulo IV se analizó si existían modificaciones en el grado de superenrollamiento del ADN

durante el crecimiento en alta sal. En varios microorganismos se han descripto variaciones en la 'topología del ADN en condiciones de estrés (Rui et al, 2003). El ADN de un plásmido empleado

como reportero extraído de células en medio hiperosmótico, presentó un grado de

superenrollamiento mayor que el de células control. Resultados similares se obtuvieron en, E.coIi, S.

ophimurium y B-subtilis. El aumento en el grado de superenrollamiento pudo determinarse por una

diferencia en el Lk de —3(Figuras 18 y 19). Este valor es bajo, comparado por ejemplo con una

diferencia en el Lk de —9obtenido de células en crecimiento exponencial de B.subti1is en medio

control y con NaCl (Alice et al, 1997). Debido a su metabolismo fermentativo, las bacterias lácticas

acidifican el medio durante el crecimiento disminuyendo notablemente el pH. La disminución del

pH ha sido descripta, como una de las condiciones ambientales que puede modificar el grado de

superenrollamiento (Karem et al, 1993). Es posible que el ADN de Lb.casei, debido a este factor,

presente un grado de superenrollamiento mayor comparado con el de otros mieroorganismos y que

el efecto del estrés salino solo modifique levemente esta característica y de cuenta de la baja

diferencia en el Lk observada. Experimentos empleando ADN extraído de células crecidas en un

medio de pH controlado, podrían corroborar esta hipótesis. I

En S.t)phimurium, el agregado de un osmoprotector (glicín betaína) durante el crecimiento en alta

sal, provoca una recuperación del grado de superenrollamiento comparable al de la condición

control (Higgins et al, 1988). En este trabajó se mostró que el ADN extraído de células crecidas en

un medio hiperosmótico suplementado con camitina presenta el mismo grado de

superenrollamiento que células crecidas en un medio control. El mismo resultado se obtuvo cuando

el medio hiperosmótico se suplementaba con péptidos individuales (Ala-Pro y Gli-Pro-Ala), que

provocaban una estimulación del crecimiento en alta sal (Figura 20). Por lo tanto, la camitina, un

conocido osmoprotector y los péptidos provocaban un efecto similar en la topología del ADN

cuando eran agregados a un medio hiperosmótico. Este resultado permitió corroborar el efecto

osmoprotector de los péptidos. Cuando un osmoprotector es agregado al medio de células sometidas

128

Conclusionesy Discusión

a estrés osmótico, se revierten varios de los efectos de la osmolaridad en la fisiología celular. Por

ejemplo, en S.th}phimurium, la inducción osmótica de la expresión deproU es mínima en presencia

de glicín betaína en el medio (Higgins et al, 1988). La presencia de un osmoprotector en medio

hiperosmótico, que disminuye los efectos deletéreos del estrés y por lo tanto las señales indicativas

del mismo, podn’a explicar la ausencia de un aumento en el grado de superenrollamiento del ADN

observada.

En varios casos, se encontró una relación entre la variación en el grado de superenrollamiento del

ADN y la expresión de ciertos genes cuyas fiJnciones son importantes para la supervivencia durante

condiciones de estrés. Motaciones en las topoisomerasas o el agregado de inhibidores de estas

enzimas, que no permiten cambios en al topología del ADN y por lo tanto afectan la regulación de

la expresión de genes, pueden afectar la viabilidad de los microorganismos durante la exposición al

efector de estrés (Alice et al, -1997;Karem el al, 1993; Bebbington et al, 2001).

En Lb casei, el agregado de novobiocina, en una concentración subletal, no modificó la viabilidad

durante el crecimiento en un medio hiperosmótico (Figura 21). Este resultado, aunque preliminar,

indicaría que el aumento del grado de superenrollamiento del ADN observado durante el

crecimiento en alta sal, no sería indispensable para la regulación de funciones esenciales para la

supervivencia en presencia de ese factor de estrés.

En nuestro conocimiento, modificaciones en la topología del ADN por variaciones ambientales, no

habían sido reportadas hasta el momento en Lactobacillus.

En el Capítulo V se intentó identificar posibles reguladores de componentesdel sistema proteolítico

relacionados con la respuesta a estre's osmótico.

Ya se había observado que en una mutante incapaz de transportar un péptido determinado, la

presencia de ese péptido en el medio de cultivo no provocaba la represión de la expresión del gen

oppD (Guedon et al, ZOOlb),ni una disminución en los niveles de las proteínas PrtP, PepN y PepC

(Sanz et al, 2001). Estos resultados indican que los péptidos deben ser intemalizados para ejercer un

efecto represor.

De acuerdo a estos resultados, en una mutante dtpT en Lb. casei, ciertos péptidos que fueran

intemalizados de manera exclusiva por este transportador, dejarían de ejercer un efecto

osmoprotector.

A diferencia de lo observado para Llactis MG1363 por Guedon, (2001b) en Lb.casei ATCC 393,

entre los péptidos testeados, no fire posible encontrar un péptido que fuera transportado de manera

exclusiva por DtpT (Tabla 5). Sanz y colaboradores (2001) describieron que incluso una mutante

129

Conclusionesy Discusión

para los tres sistemas de transporte (Opp', DtpT' y DtpP') comparada con una mutante Opp' DtpT,

solamente no crece en un medio carente de valina suplementado con el dipéptido W, sólo si éste es

aportado a una muy baja concentración (0,035 mM). La ausencia de diferencias en las tasas de

crecimiento empleando otros di o tripéptidos sugieren la existencia de un cuarto sistema de

transporte de péptidos funcional cuya especificidad se solapa con la de DtpP (Foucad et al, 1995).

La presencia de varios sistemas de transporte en bacterias lácticas, que pueden tener especificidad

solapada, dificulta encontrar un péptido que sea transportado de manera exclusiva por uno solo de

los transportadores de la membrana.

Sin embargo encontramos ilue tres de los péptidos testeados (TL, GL y KL) resultaron ser

transportados de manera poco eficiente en la mutante, ya que los valores de densidad óptica

alcanzados eran diferentes si el aminoácido se encontraba libre en el medio o era suplementado por

el péptido (Tabla 5).

En valores absolutos las actividades PrtP y Per de la mutante resultaron ser un 50% menor que los

de la cepa salvaje (Tabla 6) (este resultado es coincidente con lo observado en L Iactis en una fiJsión

transcripcional pOppD-qu). Cuando se midió el grado de represión ejercido por la presencia de TL

durante el crecimiento, éste resultó menor que el observado en la cepa salvaje. Para PrtP, un 55% de

represión en la cepa salvaje y un 33% en la mutante DtpT; y para Per un 35% de represión en la

salvaje versus un 23% en la mutante. Se corroboró entonces, que al igual que en L. lactis los

péptidos deben ser transportados para ejercer un efecto represor y que un péptido que es

transportado menos eficientemente disminuye su efecto represor.

Estos resultados permitieron corroborar el fenotipo DtpT' de la cepa mutante construida en esta

tesis.

La mutante mostró un retardo en el crecimiento con respecto a la cepa salvaje en medio MRS

(medio rico en péptidos y con pocos aminoácidos libres), sin embargo los valores de densidad

óptica alcanzados fueron semejantes, indicando nuevamente que la deficiencia en uno de los

transportadores puede ser suplida por los otros (Figura 26). Sorprendentemente, resultados similares

se encontraron en medio CDM, aunque este medio contiene todos los aminoácidos libres necesarios

para el crecimiento. La disminución en la velocidad de crecimiento de una mutante para el

transporte de péptidos en CDM también fue reportada para una doble mutante Opp' DtpT en L.

Iactis (Sanz et al, 2001). A1 menos dos actividades enzimáticas medidas en la mutante dtpT, en

medio CDM, resultaron disminuidas, no puede descartarse que suceda algo semejante con otras

actividades del metabolismo general. Esto podria explicar el retardo en el crecimiento observado,

aún en un medio carente de péptidos. Por otro lado, la mayoría de los aminoácidos son

130

Conclusionesy Discusión

transportados por un mecanismo de simporte con protones, similar al que emplea DtpT (Poolman et

al, 2002). No es posible determinar a priori si la ausencia de este transportador en la membrana

puede provocar una modificación del gradiente de protones y alterar también el transporte de

aminoácidos.

La mutante dtpT resultó ser más osmosensible que la cepa salvaje (Figura 26). En medio MRS, no

solo se observó un retardo en el crecimiento en NaC] sino que no logró alcanzar la densidad celular

máxima del control. Esto podría adjudicarse a una deficiencia en la incorporación de ciertos

péptidos que como ya se demostró anteriormente pueden actuar como osmoprotectores durante el

crecimiento en medio hiperosmótico.

Para verificar esta hipótesis se comparó el crecimiento de la cepa salvaje y la mutante en medio

CDM conteniendo dos péptidos diferentes TriAla y KL (Tabla 7). En presencia de TriAla en el

medio de cultivó la cepa mutante presentó una estimulación del crecimiento en medio

hiperosmótico comparable al de la cepa salvaje (aproximadamente tres veces más que en ausencia

de péptido). En la mutante dtpT, no se observó un efecto osmoprotector en medio hipersalino por la

presencia de KL (un péptido que es transportado de manera poco eficiente). La cepa salvaje, en

cambio, mostró una estimulación del crecimiento en presencia de KL, semejante al ejercido por

TriAla. Este resultado indica claramente que los péptidos deben ser transportados para ejercer un rol

en la osmoprotección y que en una mutante deficiente en el transporte de péptidos éstos no podrán

ejercer su efecto en la estimulación del crecimiento en medio hiperosmótico; corroborando su

importancia en la osmoprotección.

En el capítulo III, se describió que la pérdida de represión por péptidos en medio hipersalino ocurría

a nivel transcripcional. Se intentó entonces identificar un posible regulador involucrado en este

mecanismo.

En un trabajo del 2001 (Guedon et al, 2001b) realizaron una mutagénesis al azar en L. Iactis,

buscando aquellas que on'ginaran un fenotipo desreprimido de componentes del sistema proteolítico

en presencia de péptidos. La mayoría de las mutaciones encontradas, interrumpían la secuencia de

un gen que codificaba para una proteína homóloga al regulador pleiotrópico de B.subti1is CodY.

Esta proteína se encuentra ampliamente conservada entre especies Gram+ de bajo contenido G+C.

En B.subtilis la proteína CodY está involucrada en la regulación negativa de numerosos genes que

se expresan tempranamente en la fase exponencial de crecimiento (Ratnayake et al, 2001). CodY

controla la regulación nutricional de varios genes involucrados en la competencia y el metabolismo

de nitrógeno y acetato en respuesta a la tasa de crecimiento. En la tabla se muestra un resumen de

131

Conclusionesy Discusión

los promotores regulados por CodY en B subtilis. Los altos niveles de represión de genes del

metabolismo del nitrógeno por CodY, ocurren en células que se encuentran creciendo rápidamente

en medios ricos en aminoácidos y la represión se pierde al final de la fase exponencial de

crecimiento.

Promotor blanco Función o producto génico

Transporte

dpp Transporte de dipéptidos

gabP Transporte de y-aminobutirato

Metabolismo

hut Degradación de histídina

bkd Degradación de aas ramificados

citB Aconitasa

ure Degradación de urea

Quimiotaxis y movilidad

hag Flagelina

Competencia/antibióticos

sr]?! Síntesis de surfactina

comK Competencia

Regulación

rapA SpoOF-P fosfatasa

rapC ComA-P fosfatasa

Esporulación

spoOA Factor de transcripción

En L Iactis, CodY media la represión de opp-pepOI, pepN y pepC y se postula que la regulación de

otros genes regulados por péptidos, como prtP, pepDAZ y per también depende de CodY

Recientemente se describió, en L Iactis la regulación por CodY de las aminotransferasas AraT y

BcaT, responsables de la transaminación de aminoácidos aromáticos, ramificados y metionina e

involucradas en su síntesis y catabolismo (Chambellon et al, 2003).

En el 2001, Ratnayake y colaboradores identificaron a los niveles de GTP como la señal indicadora

de la concentración de nutrientes y que por lo tanto regularía la actividad de CodY. CodY es un

regulador transcripcional que sensa GTP. La secuencia aminoacídica de CodY presenta un motivo

característico de unión a nucleótidos guanidínicos y en el mismo trabajo demostraron la unión de

GTP a CodY in vitro. El GTP no parecen’atener un efecto importante sobre el pegado al ADN, pero

132

Conclusionesy Discusión

la capacidad de CodY de bloquear la transcripción es fiiertemente dependiente de GTP. La

represión requiere concentraciones fisiológicas de GTP, del orden milimolar, correspondientes a las

encontradas en células en rápido crecimiento. En resumen, cuando las concentraciones de GTP en

las células son elevadas, CodY reprime la transcripción de los genes que se hayan bajo su control.

Cuando el crecimiento es lento, o se acerca la fase estacionaria los niveles de GTP disminuyen,

debido a la síntesis de (p)ppGpp o una reducción en la síntesis de GTP o ambas. Como resultado,

CodY ya no se encuentra unido a GTP y no puede bloquear la transcripción. (Esquema 1). CodY

cumple con todos los requerimientos para actuar como un regulador global de la expresión de genes

de la fase postexponencial sensando directamente los niveles intracelulares de GTP. El sistema

CodY sería uno de los pocos conocidos que sensa el “status” nutricional de la célula y transduce

esta información fisiológica en una respuesta transcripcional adaptativa (Dworkin y Losick, 2001).

Esguema 1: Regulación transcripcional mediada por CodY

En ambas condiciones de crecimiento CodY puede unirse a los promotores de los genes que regula. Pero solo a bajos

niveles de GTP pierde su capacidad represora y comienza la transcripción Los círculos grises representan el nivel de

GTP en la célula. Las flechas indican transcripción.

Limitación de nutrientesbajo GTP

Exceso de nutrientesalto GTP

En este trabajo, se pudo verificar la presencia de CodY en extractos de Lb.casei ATCC 393. Los

niveles de esta proteína no se modificaron en las diferentes condiciones de crecimiento ensayadas

(Figura 28). En B. subtilis la presencia y concentración de CodY no se modifica por la fase de

crecimiento o por la composición del medio de cultivo(Ratnayake et al, 2001). Aunque en L lactis

se propuso a CodY como el efector de la represión ejercida por péptidos, ya que mutantes codY

presentaban un fenotipo desreprimido, no se demostró la interacción de la proteína con los

133

Conclusionesy Discusión

promotores de los genes regulados. En esta tesis se intentó verificar si CodY podía interactuar con

el promotor del gen prtP de Lb.casei.

Extractos de E coli KSZ72, en los que CodY de B.subtilis habia sido sobreexpresada, produjeron un

retardo en la migración en gel de un fragmento que contenía una parte de la región promotora de

prtP. El mismo efecto se vio empleando extractos de Bsubtilis 168. Es decir que la proteína CodY

de Bsubtilis podía reconocer la región promotora del gen prtP de Lb.casei (Figura 29).

La proteína CodY presente en diferentes especies Gram + se halla altamente conservada,

principalmente en la región de unión al ADN. CodY posee un motivo HTH (“helix-tum-helix”)

pero la secuencia primaria de esta proteína no se parece a la de otras proteínas de unión al ADN

descriptas (Serror y Sonenshein, 1996) y aún no se ha reconocido una secuencia consenso en el

ADN para el pegado de laÏmisma. Sí en cambio, se ha observado que las regiones a las que se une

CodY son ricas en AT (Serror y Sonenshein, 1996; Bergara et al, 2003) y al menos en el caso de

uno de los promotores (dop) incluye una repetición directa ATAATTT. Las secuencias ricas en AT

pueden presentar una curvatura intrínseca en el ADN. Por ello se postula que la estructura

tridimensional del ADN podn’adeterminar el pegado de CodY o influir en el mismo.

Del análisis de la secuencia del promotor del gen prtP de Lactobacillus paracasei subspparacasei

NCDO 151 (Holck y Naes, 1992) y de varios Lactococcus surge, que presentan un alta proporción

de AT y que poseen una región de simetría par posicionada alrededor de los sitios de inicio de la

transcripción. El grado de simetría difiere en las distintas cepas (Marugg et al, 1996).

Particularmente en L Iaclis SKll una casi perfecta repetición invertida de 18 pb, se encuentra en la

región promotora (TATATAATATAATAGTAT ATAATATTATATTATA

E). Una deleción en esta región o inserciones que rompen la simetría del palíndrome, provocan un

aumento de los niveles del ARNm prtP a altas concentraciones de péptidos. Por lo tanto estas

secuencias en cis, cercanas a los sitios de iniciación de la transcripción están involucradas en el

reconocimiento o unión de una proteína reguladora.

El retardo de la migración del ADN conteniendo el promotor prtP, cuando este se incuba con un

complejo CodY de Lb casei + anticuerpo anti CodY (inmunoprecipitado), demuestra la interacción

de esta proteína con el promotor (Figura 33). Esta interacción, aunque in vitro, indica un rol directo

de CodY en la regulación de la expresión de este gen. Hasta el momento, en L Iaclis solo se había

mostrado que una mutante codY pierde la represión por péptidos, pero no se había demostrado la

interacción directa de esta proteína con los promotores de los genes que regula y no podía

asegurarse entonces si CodY actuaba de manera directa o regulando la expresión de otra proteína

que actuara como represor. En base a los resultados que se presentan en este trabajo, CodY puede

134

Conclusionesy Discusión

unirse al promotor de prtP y de acuerdo al modelo conocido en B. subtilis, podría modular su

expresión. Es probable que ocurra lo mismo para otros genes que forman parte del mismo regulón

comopepN, opp-pepOIyper.

Aunque los resultados de Western Gel shift empleando extractos crudos de Lb.casei no permitieron

determinar la presencia de CodY en los complejos ADN + proteína observados, la aparición de una

banda de retardo diferencial cuando se incuba el extracto con un anticuerpo anti CodY (supershift),

demuestra la interacción específica de CodY con el fragmento empleado como sonda (Figura 34).

Aunque preliminares, los resultados obtenidos en el supershifl indicarían que no hay diferencias en

el pegado de CodY al menos. en extractos provenientes de dos condiciones de crecimiento, CDM

AP y CDMN AP, ya que la intensidad del complejo específico formado en presencia del anticuerpo

no se modifica en ambas condiciones. Apoyando estos resultados, no se habían observado

modificaciones en los niveles de la proteína CodY en extractos de distintas condiciones de

crecimiento incluyendo las antes mencionadas. Estos resultados estan'an en concordancia con lo

observado en B.subtilis, sugiriendo un mecanismo regulatorio común de esta proteína en Lb.casei.

¿Podría sólo CodY mediar la pérdida de represión por péptidos observada durante el crecimiento en

alta sal? Aunque en Bsubtilis varios promotores a los que se une CodY también pueden unirse otros

reguladores, por ejemplo dpp al que se une también Aer, ambos reguladores no se unirían de

manera simultánea y es CodY el responsable de la regulación por fiJente de nitrógeno. Los

resultados de gel shifi, obtenidos en esta tesis, con extractos crudos indican el pegado de otras

proteínas además de CodY al promotor de prtP. De todos modos, considerando que los

conocimientos teóricos que se tienen hasta el momento sobre el papel de CodY en la regulación

avalan su participación en la represión observada en presencia de péptidos, se podría pensar que

también está involucrada en la pérdida de represión que se describió en este trabajo en un medio

hiperosmótico. De acuerdo a los resultados obtenidos en esta tesis y los resultados obtenidos en L

Iactis por otros autores, se postula un modelo que podría explicar la pérdida de represión observada

(Esquema 2)

La proteínasa PrtP, el transportador Opp, y las peptidasas PepN, PepC y PepOl (aminopeptidasas

generales y una endopeptidasa) así como Per son regulados por CodY. Durante el crecimiento en

un medio control (no hiperosmótico) una vez que las proteínas fueron degradadas y los péptidos

internalizados y degradados, el nivel de aminoácidos en la célula no resulta limitante y CodY

reprimiria la expresión de genes cuyos productos no son necesarios en altos niveles (Ver Figura 2,

Introducción). De acuerdo a Guedon, (2001b) el nivel intracelular de aminoácidos de cadena lateral

135

Conclusionesy Discusión

ramificada sería un indicador de la disponibilidad de aminoácidos en la célula; cuando este nivel

disminuye puede desencadenarse la respuesta estricta y con ella una disminución de los niveles de

GTP que es precursor de la síntesis de (p)ppGpp. Cuando L Iactis crece en CDM (donde las

actividades del sistema proteolítico son máximas) solo se encuentra un nivel basal de (p)ppGpp

(Rallu et al, 2000). También podría ocurrir la disminución de los niveles de GTP por otra vía, ya

que se vio que la respuesta estricta no es esencial para la pérdida de represión de genes regulados

por CodY en B.subti1is (Ratnayake et al, 2001). Esta disminución en los niveles de GTP conduciría

a una pérdida de la represión de los genes regulados por CodY, ya que esta proteína perdería su

capacidad represora.

Durante el crecimiento en un medio hiperosmótico no se observa represión por péptidos

individuales de dos de los principales componentes del sistema proteolítico (PrtP y Per) y

claramente los niveles de represión disminuyen cuando se emplea una mezcla de péptidos compleja.

Guedon (2001b) reportó que en L lactis, los péptidos (en particular aquellos que contienen

aminoácidos de cadena lateral ramificada) deben ser degradados para ejercer un efecto represor y

que son los aminoácidos y no un producto de su catabolismo los responsables de la represión. En

esta tesis se ha demostrado que los péptidos pueden actuar como osmoprotectores, y se describió un

aumento en las actividades de enzimas relacionadas con la provisión de éstos en la célula. También

se mostró que por lo menos las actividades de dos enzimas relacionadas con la liberación de

aminoácidos a partir de dipéptidos y tripéptidos no se modifican durante el crecimiento en alta sal.

Una acumulación de péptidos sin hidrolizar en el intracelular, tendría como consecuencia una

disminución de los niveles de aminoácidos libres en el citoplasma que podría desencadenar la

respuesta estricta y con ello una disminución de los niveles de GTP (o disminuir por otra vía). La

disminución de los niveles de GTP provocaría la pérdida de represión de los genes regulados por

CodY. Una mutante pepQ de Llactis no presenta represión de la expresión de una fusión PoppD­

qu en presencia de LP o VP que son hidrolizados específicamente por esta enzima (Guedon et al,

2001b), es decir que si los péptidos no son hidrolizados, no hay efecto represor. Sin embrago, para

corroborar esta hipótesis sería esencial medir el contenido intracelular de péptidos durante el

crecimiento en alta sal.

Por otro lado, en un trabajo realizado en L Iactis (Rallu et al, 2000) en la búsqueda de mutantes

resistentes a estrés ácido y múltiples estrés se encontró que van'as de las mutantes poseían

mutaciones en genes relacionados con el metabolismo de purinas. En ese trabajo, concluyeron que

en L- lactis, nucleótidos de guanina y (p)ppGpp están involucrados en la tolerancia a múltiples

136

Conclusionesy Discusión

estrés. La variación en los niveles de estos metabolitos parecería inducir funciones que protegen

componentes celulares del daño por estrés. Modificaciones del flujo de la vía de los nucleótidos

purínicos o un aumento en la concentración de (p)ppGpp son percibidos como señales intracelulares

de estrés en Llactis, generando una tolerancia a estrés múltiples. En este caso, una disminución de

los niveles de GTP como señal de estrés, desencadenada por una vía diferente al hambreado por

falta de aminoácidos también podria provocar una pérdida de la represión de genes regulados por

CodY.

Conclusionesy Discusión

Esguema 2: Modelo propuesto para la pérdida de represión de genes regulados por CodY

durante el crecimiento en alta sal.

Las enzimas subrayadas corresponden al producto de genes propuestos como pertenecientes al regulón CodY. Laslíneas punteadas indican actividades de peptidasas no ensayadas pero que de acuerdo a la hipótesis planteada no semodificar-{anen alta sal provocando la acumulación de péptidos en el intracelular.

lAAs ...... --, CodY «wm ¿GT?inactiva ;/\ á»

Catabolismo AAs Síntesis de proteínas ___________"a Respuesta estricta

138

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H8

aasADN

AspATCCBALCDMDO

LbLklt

m8min

MRS

nmPAGEPcPCR

Abreviaturas

Abreviaturas

microgramomicromolaraminoácidosAcido DesoxirribonucleicoAcido RibonucleicoActividad específicaAmerican Type Culture CollectionBacterias Acido LácticasMedio Químicamente Definidodensidad ópticagramohorasLactobacillus“linking number”litromolarmiligramosminutosmilimolarMedio para Lactobacillus según de Man, Rogosa y SharpeNaClnanomoles“Poliacrylamide Gel Electrophoresis”peptona de came“Polymerase chain reaction”velocidad de crecimiento“wild type”