Figure i15 Plateforme de recrutement des facteurs impliqueacutes dans les modifications co-traductionnelles
preacutecoces du N-terminal des proteacuteines chez le ribosome drsquoE coli A) Repeacutesentation des diffeacuterents facteurs
intervenant au niveau du tunnel de sortie du peptide B) Localisation des diffeacuterents acteurs des modifications
preacutecoces du N-terminal aux abords du tunnel de sortie du peptide Lrsquoeacutetoile jaune repreacutesente la sortie du tunnel
du peptide TF pour trigger factor PDF pour peptide deformylase SRP pour laquo signal recognition particle raquo et
La synthegravese des eacutetudes reacutealiseacutees sur ces diffeacuterents facteurs a donc permis de deacuteterminer
la localisation des diffeacuterents RPBs sur le ribosome (Figure i15A) et ainsi drsquoeacutetablir des modegraveles
dynamiques de la reacutegulation des modifications co-traductionnelles (Figure i15B)
Chez E coli la PDF interagit au niveau des proteacuteines ribosomales bL17 et uL22 91 et
la MetAP au niveau des proteacuteines ribosomales bL17 et uL23 (Figure i15B ) 94 Bien que ces
sites de fixation soient distincts ils sont suffisamment proches lrsquoun de lrsquoautre pour entraicircner un
encombrement steacuterique si les deux proteacuteines se fixaient en mecircme temps au ribosome
conduisant agrave une compeacutetition entre la PDF et la MetAP (Figure i15B) 94 La deacuteformylation
ayant lieu obligatoirement avant lrsquoexcision de la meacutethionine initiatrice 129 la PDF intervient
neacutecessairement sur la chaicircne avant la MetAP Ainsi la cineacutetique rapide de la PDF sa faible
affiniteacute pour le ribosome et sa faible abondance (environ 1300 PDF par cellule pour 50000
ribosomes) sont autant de facteurs suggeacuterant qursquoelle pourrait scanner le ribosome et agir
rapidement sur la chaicircne pour ensuite se deacutecrocher et laisser la MetAP agir Jusqursquoagrave preacutesent
aucune donneacutee ne suggegravere que la longueur de la chaicircne peptidique a une influence sur
Introduction
34
lrsquointeraction 94 De plus des eacutetudes in vitro nrsquoont pas montreacute de speacutecificiteacute de substrat 130
Actuellement il nrsquoa donc pas eacuteteacute observeacute que lrsquoeacutetat de traduction du ribosome avait une
influence sur le recrutement de la PDF En ce qui concerne lrsquoexcision de la meacutethionine il
apparaicirct que cet eacutevegravenement intervient lorsque la chaicircne peptidique atteint une longueur de 40 agrave
50 acides amineacutes 94 et que la nature du second acide amineacute ainsi que les 4-5 suivants ont une
influence sur les paramegravetres cineacutetiques de la MetAP 131 Une eacutetude reacutealiseacutee avec des ribosomes
bloqueacutes ayant une chaicircne de 40 acides amineacutes nrsquoa cependant pas montreacute une influence de la
chaicircne peptidique sur lrsquoaffiniteacute de la MetAP avec le ribosome (Kd = 24 plusmn 04 microM) 94 Il est
supposeacute que les cineacutetiques rapides drsquointervention de ces deux enzymes permettent de
compenser leur faible abondance dans la cellule 94 Cependant la litteacuterature ne donne encore
que tregraves peu drsquoinformations sur la reacutegulation de lrsquointervention de ces deux enzymes
Nous avons vu que le TF interagit avec le ribosome au niveau des proteacuteines ribosomales
uL23 et uL29 (Figure i15B) Mecircme si le TF possegravede une forte affiniteacute pour le ribosome (Kd =
2 nM pour des ribosomes en cours de traduction et 100 nM pour des ribosomes deacutepourvus de
chaicircne naissante) 132 il a eacuteteacute montreacute que plus la chaicircne peptidique est longue plus le TF a
drsquoaffiniteacute pour le complexe ribosomechaicircne naissante (RNC) 107108 Une chaicircne de 43 acides
amineacutes peut interagir avec le TF mais crsquoest agrave partir de 90 acides amineacutes que la chaicircne naissante
engage le plus drsquointeractions avec le TF notamment avec le domaine PPIase Ainsi les auteurs
ont suggeacutereacute que le meacutecanisme drsquoassistance au repliement effectueacute par le TF a lieu de faccedilon
optimale lorsque la chaicircne peptidique atteint une longueur de 90 acides amineacutes 64 Cependant
eacutetant donneacute que lrsquoaffiniteacute du TF pour les ribosomes vide est assez importante 132 que la nature
du peptide naissant preacutesent dans le tunnel influence son affiniteacute 133 et que sa dureacutee de fixation
sur le ribosome est relativement longue (entre 15s et 50s suivant les caracteacuteristiques du peptide
en cours de synthegravese et partant du principe que les ribosomes assemblent entre 10 et 20 acides
amineacutes par seconde) 1108 les auteurs ont supposeacute que ce facteur peut interagir avec le ribosome
degraves le deacutebut de la traduction et qursquoil reste fixeacute aux abords du tunnel de sortie du peptide jusqursquoagrave
ce que le peptide atteigne une longueur drsquoenviron 150 agrave 200 reacutesidus 64 Cette hypothegravese reste
valide si on tient compte du fait que ce facteur nrsquoentre pas en compeacutetition avec la PDF et la
MetAP 91 En 2008 alors que les donneacutees drsquointeraction de la MetAP avec le ribosome nrsquoeacutetaient
pas encore disponibles le site de fixation du TF au ribosome eacutetant diffeacuterent de celui de la PDF
il a tout drsquoabord eacuteteacute proposeacute qursquoil puisse interagir simultaneacutement avec la PDF et la MetAP (en
supposant que celle-ci nrsquoentrait pas en compeacutetition avec la PDF) Cela permettant de diriger la
chaicircne eacutemergente vers lrsquoune ou lrsquoautre des deux enzymes se trouvant de part et drsquoautre du TF
Introduction
35
(Figure i15B) 91 Pourtant des eacutetudes in vivo plus reacutecentes proposent une forme de compeacutetition
entre le TF et la PDF 94132 car la surexpression du TF semble provoquer une croissance
cellulaire leacutegegraverement reacuteduite pheacutenotype particuliegraverement eacutevident lorsque les cellules qui
expriment la PDF endogegravene drsquoE coli ont eacuteteacute traiteacutees avec un inhibiteur de PDFs lrsquoactinonine
Cette inhibition cellulaire par surexpression de TF est eacutegalement exacerbeacutee lorsque les cellules
inhibeacutees par lrsquoactinonine expriment la version tronqueacutee en C-terminal de la PDF drsquoE coli Etant
donneacute que les 21 derniers reacutesidus de lrsquoheacutelice C-terminale de la PDF drsquoE coli ne sont pas
neacutecessaires pour assurer le caractegravere essentiel de la PDF in vivo 94 mais qursquoune interaction de
celle-ci avec le ribosome a eacuteteacute observeacutee les donneacutees in vivo ci-dessus ne trouvent pas
drsquoexplication agrave ce jour Pour compliquer encore davantage le sceacutenario plusieurs donneacutees
drsquointeraction in vitro montrent que TF et PDF ou MetAP peuvent se lier simultaneacutement agrave
ribosomes ou RNC 94132 Mecircme si des compeacutetitions partielles entre ces facteurs ont pu ecirctre
observeacutees 94 il a eacuteteacute proposeacute que TF reste lieacute lorsque la PDF interagit avec les RNCs speacutecifiques
ou les ribosomes vides mais avec des agencements modifieacutes (des modifications partielles ougrave
aucune alteacuteration du Kd pour la liaison du TF au ribosome nrsquoa eacuteteacute observeacutee en preacutesence de
concentrations croissantes de PDF) 132 Les mecircmes reacutesultats ont eacuteteacute rapporteacutes pour la MetAP
drsquoE coli 132 Neacuteanmoins il faut rappeler qursquoune eacutetude preacuteceacutedente sur la localisation de la
MetAP bacteacuterienne sur le ribosome 94 a suggeacutereacute qursquoune compeacutetition pouvais exister entre la
PDF et la MetAP due agrave la promiscuiteacute des sites drsquointeraction des deux enzymes et de leur
encombrement steacuterique De plus bien qursquoil nrsquoy ait pas eu de compeacutetition observeacutee concernant
lrsquointeraction du TF et de la MetAP sur le ribosome 132 lrsquoefficaciteacute de lrsquoexcision de la meacutethionine
est plus faible lorsque le TF est deacutejagrave preacutesent sur le ribosome suggeacuterant que sa fixation reacuteduit
lrsquoefficaciteacute de la MetAP et que le TF doit intervenir apregraves lrsquoexcision de la meacutethionine 94 Cela
est probablement ducirc au fait que malgreacute des sites de fixation distincts le recouvrement du
peptide naissant par le TF le rend inaccessible pour la MetAP (Figure i16)
Bien que les reacutesultats ne sont pas encore tregraves clairs et parfois mecircme contradictoires au
premier abord il semblerait que le modegravele admis actuellement consiste en lrsquointervention
seacutequentielle de ces facteurs agrave savoir la PDF dans un premier temps suivie de la MetAP puis
enfin du Trigger factor (Figure i17C)
La particule SRP se fixe tout comme le TF au niveau des proteacuteines ribosomales uL23
et uL29 suggeacuterant une compeacutetition entre ces deux enzymes (Figure i16) Cependant les
donneacutees de la litteacuterature sont encore contradictoires certains reacutesultats indiquant une interaction
simultaneacutee 123134135 et drsquoautres une compeacutetition entre ces deux enzymes 77136137 Une autre
Introduction
36
eacutetude indique que la SRP et le TF peuvent interagir en mecircme temps mais que cela impose un
reacutearrangement du complexe ribosomefacteur reacutearrangement reacutesultant en un avantage
compeacutetitif en faveur de la SRP 132 Il a eacuteteacute montreacute preacuteceacutedemment que la SRP pouvait interagir
avec le ribosome et reconnaicirctre un peptide signal alors mecircme que celui-ci est encore contenu
dans le tunnel 110 Dans ce cas de figure la SRP peut intervenir soit avant soit agrave la place du TF
Il apparaissait ainsi que ces deux enzymes entraient en compeacutetition la nature du peptide en
cours de synthegravese permettant de discriminer lrsquointervention de lrsquoune ou lrsquoautre de ces deux
enzymes pour un repliement co-traductionnel de la chaicircne ou son adressage agrave la membrane Il
a eacuteteacute proposeacute que le TF empecircche la fixation de la SRP dans un contexte ou le peptide est peu
hydrophobe 22 Le TF et la particule SRP reconnaissent lrsquohydrophobiciteacute du peptide eacutemergent
sans toutefois que lrsquoon ait pu deacuteterminer des seacutequences speacutecifiquement reconnues par la SRP
ou le TF Un eacutetude plus reacutecente a montreacute que la SRP reconnaicirct preacutefeacuterentiellement les domaines
transmembranaires hydrophobes et exclut plutocirct les seacutequences signal de proteacuteines de la
membrane externe prises en charge probablement par la voie Sec 138 Ce travail propose un
fonctionnement universel pour la SRP drsquoE coli dans lrsquoadressage des proteacuteines agrave la membrane
interne (IMP pour inner membrane protein) agrave lrsquoexception des courts IMPs (ie YbgT and
YbhT) suggeacutereacutes comme eacutetant pris en charge par YidC138 Cela nrsquoexclut pas qursquoun groupe
important soit eacutegalement substrat des SRP incluant des proteacuteines cytoplasmiques comme la
chaperonne DnaK Dans ce travail tregraves reacutecent il a eacuteteacute montreacute eacutegalement que lrsquoadressage des
proteacuteines meacutedieacute par la SRP nrsquoest pas influenceacute par le TF qui semble ne pas partager le mecircme
ensemble de substrats Ainsi en opposition avec drsquoautres donneacutees les auteurs ont trouveacute que le
TF nrsquoaugmente pas la speacutecificiteacute de SRP (la surexpression de TF nrsquoaffecte pas le binding de
SRP agrave ses substrats mais au contraire la deacuteleacutetion de TF augmente lrsquointeraction avec des IMPs
et reacuteduit lrsquointeraction avec les proteacuteines cytosoliques) Enfin les reacutesultats de cette eacutetude ne sont
pas en accord avec drsquoautres donneacutees montrant que la SRP peut lier indistinctement tous les
ribosomes au deacutebut de la traduction avant que leur N-terminus eacutemerge 139 Les donneacutees de
proteacuteomique et de lrsquointeractome de la SRP ont en effet montreacute que les SRP semblent se lier au
RNC lorsque les chaicircnes naissantes sont drsquoenviron 50 agrave 100 reacutesidus de long138 Enfin il
semblerait que la SRP et la PDF ou MetAP nrsquoentrent pas en compeacutetition mecircme si le ribosome
traduit une chaicircne naissante posseacutedant une seacutequence signal pour la SRP 94 indiquant que la
PDF ou la MetAP peuvent probablement agir et permettre ensuite agrave la SRP de prendre en charge
le complexe RNC pour lrsquoadresser agrave la membrane 140 (Figure i17A)
Introduction
37
A
B
Figure i16 Intervention spatiale des diffeacuterents RPBs A) Structure des proteacuteines PDF MetAP TF et SRP en
interaction avec le ribosome126 b) Evolution du modegravele drsquointeraction de diffeacuterents RPBs sur le ribosome depuis
les derniegraveres anneacutees 91126132
Enfin il a eacuteteacute montreacute que le translocon SecYEG peut eacutegalement interagir avec le
ribosome au niveau de la proteacuteine ribosomale uL23 et uL29 138Cependant bien qursquoaucune
donneacutee ne soit disponible concernant la taille du peptide naissant lors de cette interaction les
auteurs soupccedilonnent que celle-ci a lieu apregraves lrsquointervention de la SRP (Figure i17B) Pour finir
la proteacuteine SecA interagit au niveau des mecircmes proteacuteines ribosomales que le TF et la SRP
(uL23) et possiblement avec les proteacuteines uL22 et uL24 et intervient relativement tard durant
la synthegravese du peptide afin de repeacuterer une seacutequence signal Lrsquoinfluence de la seacutequence
peptidique sur son recrutement nrsquoa pas eacuteteacute deacutemontreacutee Les seules donneacutees disponibles indiquent
qursquoelle ne peut interagir avec le complexe RNC lorsque la chaicircne peptidique deacutepasse 166 acides
amineacutes mais nous ne savons pas quelle est la taille minimum du peptide naissant pour que SecA
puisse interagir
Introduction
38
Figure i17 Intervention temporelle des diffeacuterents RPBs Drsquoapregraves Gloge et al 2014 126
A) Intervention spatiale des RPBs dans un contexte de translocation co-traductionnelle La SRP se fixe tregraves
tocirct durant la synthegravese puis interviennent la PDF et la MetAP Suite agrave lrsquoexcision de la meacutethionine la SRP
reste fixeacutee sur le ribosome jusqursquoagrave la prise en charge du RNC par le complexe SecYEG B) Intervention
spatiale des RPBs dans un contexte de translocation post-traductionnelle La SRP est la premiegravere enzyme agrave
intervenir sur le ribosome mais se retire avant intervention de la PDF et la MetAP Suite agrave lrsquoexcision de la
meacutethionine SecA se fixe au ribosome et par lrsquointervention de SecB le peptide est adresseacute au complexe
SecYEG C) Intervention spatiale des RPBs dans un contexte de repliement du peptide dans le cytosol La
SRP est preacutesente avant lrsquointervention de la PDF et la MetAP puis suite agrave lrsquoexcision de la meacutethionine le TF
intervient pour que le peptide soit ensuite pris en charge par les chaperones DnaKJ et GroELES
En conclusion bien que des modegraveles ont eacuteteacute proposeacutes (Figure i16 et i17) les donneacutees
actuelles concernant lrsquointervention des facteurs impliqueacutes dans les modifications preacutecoces du
N-terminal ne sont pas toutes en adeacutequation Srsquoil apparaicirct que la PDF intervient avant la MetAP
nous ne savons pas reacuteellement ce qursquoil en est concernant le TF et la SRP Ces deux enzymes
peuvent entrer en compeacutetition mais ce nrsquoest pas toujours le cas et bien que leur intervention
soit favoriseacutee par lrsquoeacutemergence de seacutequences peptidiques particuliegraveres agrave la sortie du tunnel des
signaux envoyeacutes depuis lrsquointeacuterieur du tunnel tregraves preacutecocement durant la synthegravese servent de
signal pour leur recrutement Il est fortement probable que la seacutequence en cours de traduction
permette de reacuteguler lrsquointervention des diffeacuterentes enzymes en favorisant la NME etou le
repliement etou lrsquoadressage du peptide durant la traduction
Introduction
39
C-La voie de lrsquoexcision de la meacutethionine N-terminale la NME
Le premier reacutesidu incorporeacute lors de la synthegravese peptidique est dans la grande majoriteacute
des cas une meacutethionine de rares exceptions ont toutefois eacuteteacute observeacutees chez les bacteacuteries les
eucaryotes et les proteacuteines virales ougrave la synthegravese proteacuteique peut deacutebuter par un reacutesidu Val Leu
ou Gln 141ndash144 Chez les bacteacuteries et dans les organites (mitochondries et chloroplastes) la
meacutethionine initiatrice possegravede un groupement formyl ajouteacute sur le groupement amino-terminal
de la meacutethionine chargeacutee sur lrsquoARNtMet initiateur (Met-ARNtMet Fo-Met-ARNtMet) par la
meacutethionyl-ARNt formyltransferase (FMT) la formylation permet vraisemblablement de
stabiliser le complexe ribosomal durant lrsquoinitiation de la traduction 4 Pourtant la plupart des
proteacuteines perdent leur meacutethionine initiatrice ou la formyl-meacutethionine gracircce agrave un processus co-
traductionnel proteacuteolytique appeleacute excision de la meacutethionine N-terminale (NME) Ce
meacutecanisme est universel et irreacuteversible et a eacuteteacute mis en eacutevidence dans lrsquoensemble du regravegne du
vivant 142 Ce processus essentiel a lieu aussi bien chez les procaryotes que dans le cytoplasme
et les organites des eucaryotes (mitochondries et chloroplastes) La NME est assureacutee par deux
enzymes la peptide deacuteformylase (PDF) qui enlegraveve le groupement formyl quand il est preacutesent
(dans les bacteacuteries et organelles) et la meacutethionine aminopeptidase (MetAP) qui clive la
meacutethionine initiatrice uniquement apregraves lrsquoaction preacutealable de la PDF 129 La deacuteformylation
concerne plus de 90 du proteacuteome chez la bacteacuterie et dans les chloroplastes et ne concerne
que quelques proteacuteines dans les mitochondries En effet le nombre de proteacuteines codeacutees dans le
geacutenome mitochondrial est variable en fonction de lorganisme (par exemple 13
chez lhomme et 33 dans la plante modegravele Arabidopsis thaliana) A cause de leur forte
hydrophobiciteacute la caracteacuterisation chimique de ces proteacuteines et en particulier de leur extreacutemiteacute
N-terminale est resteacutee inaccessible durant longtemps En mesurant la masse moleacuteculaire de la
plupart des 13 proteacuteines mitochondriale de cœur de bœuf il a eacuteteacute suggeacutereacute que probablement
seule la proteacuteine CoxII subit le processus NME Neacuteanmoins il a eacuteteacute deacutemontreacute que la PDF
mitochondriale humaine est capable de deformyler efficacement au moins in vitro 7 peptides
formyleacutes tous deacuteriveacutes de lextreacutemiteacute N-terminale des proteacuteines mitochondriales Enfin le
seacutequenccedilage de 8 des 32 proteacuteines mitochondriales drsquoA thaliana reacutevegravele clairement que toutes
les proteacuteines seacutequenceacutees avec une seule exception ont leur N-formyl-Met exciseacutee 47140145
Lrsquoexpression et la fonction des PDF et MetAP sont tregraves finement reacuteguleacutees durant le
deacuteveloppement cellulaire La NME est impliqueacutee dans la formation de tumeurs en reacuteponse agrave
des stresses biotiques et abiotiques 146ndash148 suggeacuterant lrsquoimportance de cette reacuteaction dans
Introduction
40
diverses fonctions meacutetaboliques Plusieurs hypothegraveses ont eacuteteacute proposeacutees pour expliquer le
clivage preacutecoce de la meacutethionine initiatrice
- consideacuterant que la meacutethionine est un acide amineacute tregraves peu abondant dans les cellules 149 que
les animaux ne savent pas syntheacutetiser et dont la biosynthegravese est coucircteuse chez les bacteacuteries les
archeacutees et les plantes la NME permettrait de maintenir continuellement un reacuteservoir de
meacutethionine libre dans la cellule 150 Cela permettrait alors drsquoinitier en permanence des synthegraveses
proteacuteiques sans atteindre de carence en meacutethionine
- eacutetant donneacute que la meacutethionine libre srsquooxyde facilement il est suggeacutereacute que cet acide amineacute a
la possibiliteacute de proteacuteger les cellules contre le stress oxydatif en jouant un rocircle drsquoanti-oxydant
En effet les meacutethionines peuvent reacuteagir avec les ROS (laquo reactive oxygene species raquo) et former
de la meacutethionine sulfoxide La plupart des cellules contiennent une ou plusieurs meacutethionine
sulfoxide reacuteductases permettant de catalyser la reacuteduction de meacutethionine sulfoxide en
meacutethionine reacuteaction deacutependante de la thioreacutedoxine 151152 Ainsi la meacutethionine libre aurait un
rocircle dans la gestion des ROS lors de conditions de stress oxydatif Les meacutethionines internes aux
proteacuteines preacutesentes en surface permettraient elles aussi de proteacuteger la proteacuteine contre
lrsquooxydation en srsquooxydant elle-mecircme afin de proteacuteger le site actif 153
- le clivage de la meacutethionine N-terminale permet eacutegalement de geacuteneacuterer une tregraves grande diversiteacute
de reacutesidus N-terminaux (laquo N-end rule raquo) chez les proteacuteines qui peuvent ecirctre ainsi des signaux
potentiels de stabilisation ou de deacutestabilisation influant donc sur la demi-vie et lrsquohomeacuteostasie
des proteacuteines 47154ndash156 En effet un systegraveme de deacutegradation reconnaicirct speacutecifiquement le N-
terminal des proteacuteines les N-recognines pour les eucaryotes qui avec lrsquoubiquitination du N-
terminal envoie le peptide dont le signal est deacutestabilisant au proteacuteasome On retrouve chez les
procaryotes la proteacuteine ClpS qui dirige la proteacuteine dont le N-terminal est deacutestabilisant vers la
proteacutease ClpAP pour sa deacutegradation 157
La proportion de proteacuteines dont la meacutethionine N-terminale est exciseacutee varie beaucoup
selon les organismes ou les compartiments eacutetudieacutes Ainsi la NME concerne plus de 50 du
proteacuteome chez les bacteacuteries environ 70 du proteacuteome cytoplasmique des eucaryotes plus de
40 dans les chloroplastes et un peu plus de 10 dans les mitochondries mais les pourcentages
varient selon les organismes eacutetudieacutes 7145158159 47 Lrsquoexcision de la meacutethionine N-terminale
existe eacutegalement chez les archeacutees environ 40 des proteacuteines sont concerneacutees 47
La NME peut ecirctre suivie drsquoautres modifications co-traductionnelles qui affectent
lrsquoextreacutemiteacute N-terminale des proteacuteines en cours de synthegravese comme la N--aceacutetylation catalyseacutee
Introduction
41
par des N-aceacutetyltransfeacuterases (Nat) ou la myristoylation catalyseacutee par des N-
myristoyltransfeacuterases (NMT) dans les organismes eucaryotes 47 Il est donc neacutecessaire que ce
meacutecanisme soit finement reacuteguleacute afin de ne pas perturber lrsquoensemble du processus de
modification de la chaicircne naissante et ainsi son devenir
C1 ndash Les meacutethionine aminopeptidases (MetAP)
1) Diffeacuterentes classes de MetAP et diffeacuterentes localisations
Les MetAP sont des enzymes essentielles identifieacutees dans tout le regravegne du vivant des
bacteacuteries aux eucaryotes supeacuterieurs 142147 Ce sont des meacutetalloproteacuteases contenant deux cations
divalents (comme Fe2+ Co2+ Mn2+ ou Zn2+) indispensables au meacutecanisme enzymatique mais
dont la nature exacte reste encore deacutebattue
Les MetAP se distinguent en 2 groupes (1 et 2) et plusieurs sous-groupes (1a 1b 1c 1d
et 2a 2b) Les MetAP ne preacutesentent qursquoune faible homologie de seacutequences entre elles mais
preacutesentent de fortes homologies de structure au niveau du site actif et du site de liaison aux
meacutetaux Les organismes eucaryotes possegravedent les deux types de MetAP (1 et 2) contrairement
aux bacteacuteries qui ne possegravedent que des MetAP1s et les archeacutees qui nrsquoont que des MetAP2
(Figure i18) Les MetAP1a se retrouvent dans le cytoplasme des eucaryotes Elles sont
eacutegalement preacutesentes chez les bacteacuteries ainsi que les MetAP1arsquo reacutecemment deacutecouvertes chez
Streptococci et Lactobacilli 160 posseacutedant une insertion dans le corps de la proteacuteine Les trois
MetAP1b 1c 1d srsquoobservent dans les organites eucaryotes (Figure i 18) Drsquoautres bacteacuteries
comme les actinobacteacuteries possegravedent une autre MetAP de type 1c qui possegravede en N-terminal
un domaine de fixation aux domaines SH3 (laquo SH3 binding motif raquo) contenant le motif typique
P-X-X-P De plus les MetAP eucaryotes possegravedent une extension N-terminale de 50 agrave 100
reacutesidus qui nrsquoest pas preacutesente chez les MetAP procaryotes 142 (Figure i18) La diffeacuterence
majeure qui permet de distinguer les deux types de MetAP est lrsquoexistence de deux insertions au
sein du domaine catalytique des MetAP de type 2 dont la fonction est encore inconnue Par
ailleurs la MetAP2b possegravede eacutegalement un domaine additionnel en N-terminal47 Le rocircle de ce
domaine suppleacutementaire qui nrsquoest pas neacutecessaire pour lrsquoactiviteacute catalytique 161 reste encore
inconnu mais il serait probablement impliqueacute dans les interactions avec diffeacuterents partenaires
dans le but de reacuteguler le processus de NME Il a par exemple eacuteteacute montreacute que le domaine N-
terminal riche en lysines de la MetAP2b permet de preacutevenir la phosphorylation du facteur
drsquoeacutelongation eIF2 afin drsquoeacuteviter lrsquoinhibition de lrsquoinitiation de la traduction 162163 Il a eacutegalement
eacuteteacute proposeacute mais non prouveacute que le domaine en doigt de zinc des MetAP1b et le laquo SH3 binding
motif raquo des MetAP1c seraient impliqueacutes dans lrsquointeraction avec les ribosomes 9597 Cependant
Introduction
42
des travaux reacutecents ont proposeacute que crsquoest une boucle chargeacutee positivement et situeacutee au cœur du
domaine catalytique de la MetAP1a drsquoE coli qui serait responsable de la formation du
complexe avec le ribosome 94 Si lrsquointeraction MetAPribosome a bien eacuteteacute mise en eacutevidence 94ndash
96 le mode drsquointeraction preacutecis reste donc agrave eacutelucider
Figure i18 Les diffeacuterentes classes de MetAPs et leur reacutepartition par compartimentsorganismes La
localisation des diffeacuterentes classes de MetAPs est preacutesenteacutee cependant les cellules ne possegravedent que certaines
classes de MetAPs et non pas lrsquoensemble de celles preacutesenteacutees dans la figure au sein drsquoune cellule
2) Activiteacute peptidase des MetAP et theacuterapeutique
La speacutecificiteacute de substrat des MetAPs les conduit agrave ne cliver la meacutethionine initiatrice
que si celle-ci est suivie drsquoun acide amineacute dont la chaicircne lateacuterale est peu volumineuse Val
Gly Cys Pro Ala Ser et Thr 131164ndash166 Bien qursquoin vitro les MetAPs de types 1 et 2 semblent
Introduction
43
partager la mecircme speacutecificiteacute de substrat la situation in vivo est leacutegegraverement diffeacuterente Ainsi
lrsquoinactivation de la MetAP1 induit chez la levure un fort retard de croissance alors que ce
pheacutenotype est moins fort lors de lrsquoinactivation de la MetAP2 167168 Au contraire les cellules
de mammifegraveres sont plus sensibles agrave lrsquoinactivation de la MetAP2 Enfin chez Arabidopsis
thaliana la fonction des deux types drsquoenzyme peut ecirctre interchangeable 147
Les meacutethionine aminopeptidases eacutetant des enzymes essentielles agrave la survie des cellules
les avanceacutees dans la compreacutehension de leurs meacutecanismes drsquoaction ont fait drsquoelles des cibles
theacuterapeutiques prometteuses En effet le fait que les cellules procaryotes ne possegravedent qursquoun
seul gegravene codant une MetAP celle de type 1 la deacutecouverte de composeacutes inhibiteurs agrave large
spectre est envisageacutee De plus lrsquoimplication de ces enzymes dans un grand nombre de
pathologies comme le deacuteveloppement tumoral et lrsquoangiogenegravese ont attiseacute lrsquointeacuterecirct des
chercheurs 169ndash171 Cependant lrsquoinconveacutenient majeur reacuteside dans le fait que les cellules
humaines possegravedent eacutegalement des MetAP de type 1 cytoplasmiques et mitochondriales qui
risquent drsquoecirctre eacutegalement inhibeacutees par des anti-MetAP1 et ainsi provoquer des effets
secondaires Il est donc important de connaicirctre avec preacutecision le meacutecanisme drsquoaction des MetAP
agrave travers lrsquoensemble des organismes du regravegne du vivant
La fumagilline un composeacute drsquoorigine naturelle provenant du champignon Aspergillus
fumigatus est un inhibiteur naturel des MetAPs de type 2 Des deacuteriveacutes syntheacutetiques de ce
composeacute ont eacuteteacute deacutecouverts et ont pu montrer leur rocircle dans lrsquoarrecirct de la prolifeacuteration cellulaire
drsquoun grand nombre de ligneacutees de cellules canceacutereuses 172ndash174 Lrsquoimplication de la MetAP dans
un grand nombre de processus cellulaires implique qursquoelle est actuellement une cible
theacuterapeutique drsquoimportance pour la lutte contre certains types de cancers ainsi que drsquoautres
pathologies comme lrsquoobeacutesiteacute 175
De plus jusqursquoalors il eacutetait admis que les MetAP pouvaient agir sur un peptide seul
indeacutependamment du ribosome les tests drsquoactiviteacute eacutetant reacutealiseacutes in vitro avec de courts peptides
portant une meacutethionine Cependant des donneacutees reacutecentes indiquent que ces enzymes ont la
capaciteacute drsquointeragir avec le ribosome aux niveau des proteacuteines ribosomales bL17 et uL23 gracircce
agrave une boucle chargeacutee positivement proche du site actif et contenant un brin β 94 (Figure i12B)
Bien que ces reacutesultats concernent la MetAP drsquoE coli il est reconnu que cette interaction existe
eacutegalement chez les eucaryotes 9596 Cependant les sites de fixation des MetAP eucaryotes avec
le ribosome ne sont pas encore identifieacutes
Introduction
44
C2 ndash Les peptides deacuteformylases
Comme deacutecrit plus haut la meacutethionine initiatrice des proteacuteines bacteacuteriennes et des
proteacuteines codeacutees par les geacutenomes mitochondriaux ou chloroplastiques possegravede un formyle au
niveau de son groupement amino-terminal lequel est geacuteneacuteralement exciseacute La peptide
deacuteformylase (PDF) est la premiegravere enzyme qui modifie le N-terminal des proteacuteines Cette
reacuteaction de deacuteformylation est essentielle et irreacuteversible 142 Les PDF sont des meacutetalloenzymes
contenant 140 agrave 200 reacutesidus en moyenne qui neacutecessitent la preacutesence drsquoun ion meacutetallique au
sein de leur site actif Les PDF ont eacuteteacute identifieacutees chez les bacteacuteries les archeacutees les
chloroplastes et les mitochondries et sont absentes dans le cytoplasme eucaryote et les levures
Il est agrave noter que les PDF mitochondriales et chloroplastiques sont codeacutees par le geacutenome
nucleacuteaire et sont donc exprimeacutees dans le cytoplasme puis adresseacutees vers les organites gracircce agrave
une extension N-terminale de 50 agrave 100 acides amineacutes servant de peptide signal 176ndash178
Les peptides deacuteformylases preacutesentent une faible identiteacute de seacutequence globale environ
20 agrave 30 179180 mais une forte homologie au niveau de trois motifs conserveacutes (Figure i19A)
participant agrave la structure du site actif GΦGΦAAxQ (motif 1) EGCΦS (motif 2) et
HEΦDHxxG (motif 3) Φ eacutetant un acide amineacute hydrophobe et x un acide amineacute quelconque
179180 Certaines PDFs preacutesentent des insertions typiques conduisant agrave des particulariteacutes
structurales qui ont permis drsquoeacutetablir une classification en diffeacuterents sous-types 142181182 Les
PDFs de type 1B dont le repreacutesentant est lrsquoenzyme codeacutee par E coli sont geacuteneacuteralement
trouveacutees chez les bacteacuteries agrave Gram neacutegatif ainsi que dans les chloroplastes et mitochondries des
plantes (Figure i19B) Les PDFs de type 2 exprimeacutees par les bacteacuteries agrave Gram positif (Figure
i19B) preacutesentent deux agrave trois insertions dans le cœur globulaire de la proteacuteine Le type 1A est
speacutecifique des organites (Figure i19B) et contient une longue insertion entre les motifs 1 et 2
Les PDFs de type 3 retrouveacutees chez les protistes et dont la structure et le rocircle sont encore
inconnus contiennent des mutations critiques dans les motifs conserveacutes les rendant inactives
ou peu actives (Figure i19A)
Introduction
45
A
B
Figure i19 Les diffeacuterentes classes de peptides deacuteformylases A) Alignement des seacutequences proteacuteiques des
domaines catalytiques et C-terminaux de plusieurs types de deacuteformylases Les trois motifs du site actif sont
repreacutesenteacutes Deux seacutequences repreacutesentatives de chaque groupe sont preacutesenteacutees Les PDF1B sont repreacutesenteacutees par
les seacutequences des peptides deacuteformylases drsquoEscherichia coli et Pseudomonas aeruginosa Les types 2 sont
repreacutesenteacutes par Bacillus stearothermophilus et Streptococcus aureus Les types 3 sont repreacutesenteacutes par
Trypanosoma brucei et Leishmania major Les 38 et 90 derniers reacutesidus des PDFs de types 3 ne sont pas
repreacutesenteacutes Les reacutesidus strictement conserveacutes sont en blanc sur fond rouge et les reacutesidus majoritairement
conserveacutes sont rouges B) Reacutepartition des diffeacuterentes classes de peptides deacuteformylases dans les organismes et
organites
Les diffeacuterents types de deacuteformylases possegravedent geacuteneacuteralement un corps globulaire et
diffegraverent fortement au niveau de leur extreacutemiteacute C-terminale (Figure i20) La plupart des
repreacutesentants des types 1B possegravedent une reacutegion C-terminale structureacutee en heacutelice α alors que
les PDF1A ont une reacutegion C-terminale relativement deacutesordonneacutee Les PDFs de type 2 possegravedent
quant agrave elle un brin β Aucune structure de PDF de type 3 nrsquoa encore eacuteteacute reacutesolue mais les
programmes de preacutediction de structures secondaires indiquent que leur extreacutemiteacute C-terminale
pourrait se replier en heacutelice α
Introduction
46
Figure i20 Structure et position du domaine C-terminal des diffeacuterents types de PDF 47 A) Structure
des PDF drsquoEcoli B stearothermophilus et H sapiens repreacutesentant respectivement les PDF de type 1B 2 et
1A Les trois motifs du site actif sont coloreacutes en magenta lrsquoextreacutemiteacute C-terminale en vert et les insertions en
bleu et rouge B) Comparaison du repliement du domaine C-terminal des PDF de types 1A 1B et 2 par
superposition sur le corps globulaire de la PDF drsquoEcoli
Les geacutenomes codent geacuteneacuteralement une seule PDF mais on rencontre parfois deux gegravenes
notamment chez les bacteacuteries Nous ne savons pas quelles sont les conseacutequences physiologiques
pour un organisme qui exprime diffeacuterentes PDFs et si celles-ci peuvent se lier simultaneacutement
au mecircme ribosome Chez certaines bacteacuteries seule une des deux PDF serait fonctionnelle car
lrsquoune des deux isoformes est inactive 183184 Pourtant comme deacutecrit plus haut les plantes codent
et expriment deux PDFs toutes deux fonctionnelles au niveau des chloroplastes et
mitochondries Ces deux isoformes preacutesentent quelques diffeacuterences qui pourraient leur confeacuterer
des rocircles speacutecifiques Il a par exemple eacuteteacute montreacute que les deux PDFs de plante nrsquoutilisent pas
le mecircme ion en guise de co-facteur Ainsi la PDF1A possegravede naturellement un ion zinc alors
que la PDF1B contient vraisemblablement un ion fer 185
Les trois motifs conserveacutes deacutecrits plus haut (GΦGΦAAxQ EGCΦS et HEΦDHxxG)
participent agrave la structure du site actif et sont impliqueacutes aussi bien dans la reconnaissance et la
fixation du substrat que dans le meacutecanisme enzymatique Il a eacuteteacute montreacute que contrairement aux
MetAP les PDF nrsquoont pas de speacutecificiteacute de substrat et peuvent ainsi virtuellement agir sur tous
les peptides qui se preacutesentent agrave elle 93186ndash188 Le site de fixation du ligand est composeacute de trois
Introduction
47
laquo poches raquo distinctes appeleacutees S1rsquo S2rsquo et S3rsquo (Figure i21) La poche S1rsquo fortement
hydrophobe et tregraves conserveacutee accueille la chaicircne lateacuterale de la meacutethionine formyleacutee 130 Il est agrave
noter que les PDF de type 1A ont une poche S1rsquo plus eacutetroite et moins flexible que celle retrouveacutee
chez les PDFs bacteacuteriennes 189 Chez la PDF humaine la poche S1rsquo est par ailleurs consideacutereacutee
comme la seule veacuteritable poche permettant de recevoir le substrat formyleacute 158 Les poches S2rsquoet
S3rsquo sont moins conserveacutees et ne participent que peu agrave la reconnaissance du substrat La cysteacuteine
du motif 2 et les deux histidines du motif 3 combineacutees agrave une moleacutecule drsquoeau participent agrave la
fixation du meacutetal 90190191 Le meacutetal naturel de la plupart des PDF est le fer Fe2+ mais celui-ci
eacutetant tregraves sensible agrave lrsquooxydation il contribue agrave rendre lrsquoenzyme particuliegraverement instable 192193
Cependant il a eacuteteacute deacutemontreacute que les deacuteformylases peuvent ecirctre actives et plus stables en
substituant drsquoautres ions comme le Ni2+ 192194 ou le Co2+ 195 Il est agrave noter que certaines
enzymes comme la PDF1A drsquoA thaliana possegravedent naturellement du zinc et sont
naturellement actives avec ce meacutetal 185 Ainsi lrsquoobtention de PDFs recombinantes pleinement
actives est difficile et neacutecessite la mise au point de protocole de purification adapteacute consistant
agrave tester plusieurs concentrations et types drsquoions dans les tampons ainsi que diffeacuterents pH La
glutamine du motif 1 et le glutamate du motif 2 sont essentiels dans le meacutecanisme de catalyse
et directement impliqueacutes dans la reconnaissance du groupement formyl 130190196 Les autres
reacutesidus du motif 1 sont impliqueacutes dans la reconnaissance et la fixation du substrat 130
Figure i21 Le site actif des peptides deacuteformylases Repreacutesentation scheacutematique du site actif fixant un substrat
formyleacute Le peptide est repreacutesenteacute en vert et les liaisons hydrogegravene en rouge Le X repreacutesente nrsquoimporte quelle
chaicircne agrave condition qursquoelle ne soit pas chargeacutee neacutegativement Le meacutetal est repreacutesenteacute en rose Drsquoapregraves Ragusa et al
1999 130
Introduction
48
Les peptides deacuteformylases eacutetant des enzymes essentielles elles sont depuis leur
deacutecouverte consideacutereacutees comme des cibles theacuterapeutiques inteacuteressantes 130196ndash199 Un puissant
inhibiteur naturel des PDFs lrsquoactinonine a eacuteteacute deacutecouvert il y a deacutejagrave plusieurs anneacutees 200201
Cette moleacutecule ne peut ecirctre utiliseacutee en theacuterapie car i) elle est cytotoxique 202ndash205 ii) elle est
rapidement eacutelimineacutee par les bacteacuteries via des pompes drsquoefflux 206ndash208 iii) des pheacutenomegravenes de
reacutesistance apparaissent rapidement 183184209ndash211 iv) des homologues sensibles agrave lrsquoactinonine
existent chez les eucaryotes notamment chez lrsquohomme 178203204212213 et enfin v) elle semble
affecter agrave haute concentration drsquoautres aminopeptidases 214215 De nombreux autres composeacutes
anti-PDFs deacuteriveacutes ou non de lrsquoactinonine ont eacuteteacute deacutecrits et certains drsquoentre eux sont entreacutes en
phase drsquoessais cliniques sans avoir pu agrave ce jour aboutir agrave une autorisation de mise sur le marcheacute
Cependant les PDFs restent une cible attractive pour la conception de nouveaux antibiotiques
et les tentatives de mise au point de nouveaux inhibiteurs de PDF continuent 216217
D-Probleacutematique
La NME est un processus essentiel chez tous les organismes vivants Les avanceacutees
scientifiques des derniegraveres anneacutees ont montreacute son importance dans la reacutegulation du
deacuteveloppement cellulaire et drsquoun grand nombre de pathologies Certains composeacutes anti-NME
ont eacuteteacute identifieacutes et sont freacutequemment utiliseacutes en laboratoire pour les eacutetudes sur les meacutecanismes
catalytiques de ces enzymes Neacuteanmoins il reste encore beaucoup de zones drsquoombres
concernant la reacutegulation de la NME et son implication dans diverses cascades de reacuteactions
meacutetaboliques
Comme nous lrsquoavons vu preacuteceacutedemment les peptides deacuteformylases jouent un rocircle crucial
dans la maturation des proteacuteines nouvellement syntheacutetiseacutees et sont preacutesentes dans la quasi-
totaliteacute des geacutenomes du regravegne du vivant De leur action deacutecoule toute une cascade de reacuteactions
permettant drsquoaboutir agrave des proteacuteines fonctionnelles Ces enzymes sont eacutetudieacutees depuis plus de
20 ans et leur meacutecanisme enzymatique est maintenant fortement documenteacute Jusqursquoalors les
moyens techniques ne permettaient pas de deacutemontrer que les deacuteformylases pouvaient interagir
au niveau du ribosome La deacutemonstration que la PDF drsquoE coli interagit avec le ribosome au
niveau du tunnel de sortie du peptide en cours de synthegravese a ouvert la voie agrave de nouvelles
perspectives concernant la reacutegulation de la NME et de la traduction en regravegle geacuteneacuterale En effet
lrsquointeraction de ces enzymes au niveau drsquoune plateforme de reacutegulation de la synthegravese proteacuteique
sur le ribosome suggegravere une reacutegulation fine du meacutecanisme drsquointervention des deacuteformylases Le
fait que le domaine C-terminal des PDF1B soit preacutesenteacute comme le deacuteterminant majeur
Introduction
49
permettant lrsquointeraction de lrsquoenzyme au ribosome il est alors possible que drsquoautres structures
preacutesentes en C-terminal chez les diffeacuterentes sous-familles permettent des formes de reacutegulation
diffeacuterentes de la traduction Actuellement aucune information nrsquoest encore disponible quant au
mode drsquointeraction des autres types de PDFs ne disposant pas de lrsquoheacutelice α Le modegravele deacutecrit
chez E coli nrsquoest donc pas geacuteneacuteralisable agrave lrsquoensemble des voies NME preacutesentes dans le regravegne
du vivant Il paraicirct ainsi eacutevident que des diffeacuterences concernant la localisation de lrsquoenzyme sur
le ribosome son affiniteacute ainsi que le laquo moment raquo de son intervention sont autant de paramegravetres
permettant de reacuteguler la synthegravese proteacuteique De plus nous ne savons pas reacuteellement qursquoelle est
lrsquoinfluence de la chaicircne naissante sur lrsquoaffiniteacute de la PDF puisque seuls des ribosomes bloqueacutes
avec une chaicircne naissante de 40 acides amineacutes ont eacuteteacute utiliseacutes dans les expeacuteriences drsquointeraction
PDFribosome Il ressort ainsi des eacutetudes que lrsquoaffiniteacute de la PDF pour le ribosome est tregraves
faible lui permettant de laquo scanner raquo rapidement les ribosomes afin drsquointervenir sur le peptide
lorsqursquoil eacutemerge du tunnel de sortie puis de libeacuterer instantaneacutement son site de fixation pour
lrsquointervention drsquoautres facteurs comme la MetAP ou le TF Il semble donc important de reacuteussir
agrave deacutecrypter ces meacutecanismes chez les diffeacuterentes sous-familles de peptide deacuteformylases
Durant cette thegravese je me suis ainsi inteacuteresseacute agrave la fonction du domaine C-terminal en heacutelice
α des PDF1B Je me suis plus particuliegraverement inteacuteresseacute agrave une PDF1B drsquoorigine virale
Vp16PDF codeacutee par le bacteacuteriophage Vp16T 218 dont le rocircle est encore inconnu Cette enzyme
preacutesente un inteacuterecirct tout particulier Tout drsquoabord parce que crsquoest lrsquoune des seacutequences de peptide
deacuteformylase les plus courtes connues agrave ce jour et ne posseacutedant pas a priori drsquoheacutelice α C-
terminale comme crsquoest le cas pour EcPDF Ainsi cette enzyme semblait ecirctre un bon outil pour
lrsquoeacutetude du rocircle du domaine C-terminal des PDF dans leur interaction et leur localisation sur le
ribosome De plus jusqursquoagrave tregraves reacutecemment lrsquoexistence de ce type drsquoenzyme eacutetait encore
insoupccedilonneacutee chez les virus Ainsi jrsquoai tenteacute de reacutepondre agrave un certain nombre de questions
Le gegravene homologue de peptide deacuteformylase deacutecouvert chez le phage Vp16T permet-il
de coder pour une enzyme agrave fonction deacuteformylase in vivo Si oui quelles sont ses
particulariteacutes biochimiques structurales et enzymatiques lui confeacuterant un inteacuterecirct
eacutevolutif pour le phage Pour reacutepondre agrave ces questions jrsquoai donc eacutetudieacute la
compleacutementation fonctionnelle in vivo de ce gegravene chez E coli et reacutealiseacute une eacutetude
structure-fonction in vitro afin de deacuteterminer ses paramegravetres cineacutetiques
La peptide deacuteformylase du phage Vp16T bien que ne posseacutedant pas drsquoheacutelice α en C-
terminal peut-elle tout de mecircme interagir avec le ribosome Si oui sa localisation et
son affiniteacute sont-elles diffeacuterentes par rapport agrave une enzyme preacutesentant une heacutelice α en
Introduction
50
C-terminal Jrsquoai donc reacutealiseacute des eacutetudes in vitro drsquointeraction avec les ribosomes par
seacutedimentation pontage chimique et analyse en Western-blot et spectromeacutetrie de masse
Pour la PDF drsquoE coli une eacutetude a montreacute que la taille de la chaicircne peptidique en cours de
synthegravese ne modifie pas son affiniteacute pour le ribosome 94 Cependant une enzyme preacutesentant
un domaine C-terminal modifieacute pourrait montrer une diffeacuterence de comportement durant la
synthegravese peptidique
Ainsi la taille de la chaicircne peptidique en cours de synthegravese a-t-elle une influence sur
lrsquoaffiniteacute de lrsquoenzyme pour le ribosome Pour cela jrsquoai reacutealiseacute des eacutetudes drsquointeraction
par seacutedimentation en utilisant des ribosomes bloqueacutes en cours de synthegravese posseacutedant
diffeacuterentes longueurs de chaicircnes peptidiques
Enfin quel pourrait-ecirctre lrsquointeacuterecirct pour les virus et plus particuliegraverement le phage Vp16T
drsquoexprimer une peptide deacuteformylase Pour reacutepondre agrave cette question jrsquoai eacutetudieacute
lrsquoimpact in vivo que pouvait avoir lrsquoexpression de cette enzyme chez la bacteacuterie E coli
Les reacuteponses agrave ses diffeacuterentes probleacutematiques ont pour objectif drsquoapprofondir les connaissances
sur la reacutegulation de la NME et son lien avec les autres modifications affectant la synthegravese des
proteacuteines De plus la peptide deacuteformylase eacutetant une cible theacuterapeutique faisant lrsquoobjet de
nombreuses recherches il semble inteacuteressant de pouvoir deacutecrypter ses meacutecanismes
drsquointeraction en vue de rechercher des composeacutes theacuterapeutiques non plus cibleacutes uniquement
sur lrsquoactiviteacute enzymatique mais eacutegalement sur la capaciteacute des enzymes agrave interagir avec le
ribosome
Introduction
51
Chapitre I
52
Chapitre I Caracteacuterisation structurale et
fonctionnelle drsquoune peptide deacuteformylase
atypique drsquoorigine virale Vp16PDF
Chapitre I
53
Chapitre I
54
A - Identification drsquohomologues de PDFs chez des virus et bacteacuteriophages
A1 - Identification et caracteacuterisation de seacutequences codant des PDFs
virales Durant les 15 derniegraveres anneacutees des seacutequences codant des PDFs ont eacuteteacute trouveacutees dans la
majoriteacute des geacutenomes (eucaryotes et procaryotes) et en 2003 deux seacutequences tregraves proches des
peptides deacuteformylases ont eacutegalement eacuteteacute mises en eacutevidence chez les phages Vp16T et Vp16C
de la bacteacuterie Vibrio parahaemolyticus 218 Un travail pionner plus reacutecent portant sur lrsquoanalyse
des donneacutees meacutetageacutenomiques des oceacuteans (GOS) et des donneacutees provenant du seacutequenccedilage de
viromes et de microbiomes marins a reacuteveacuteleacute la preacutesence de nombreux gegravenes meacutetaboliques
auxiliaires (AMGs) incluant des homologues de proteacuteines impliqueacutees dans la traduction telles
que des proteacuteines ribosomales des facteurs drsquoinitiation des phosphorylases et des peptides
deacuteformylases 219 Il est drsquoailleurs inteacuteressant de noter que les seacutequences de peptide deacuteformylase
sont les plus freacutequemment retrouveacutees parmi les AMGs Les geacutenomes de nombreux autres
phages et virus ont depuis eacuteteacute seacutequenceacutes et des seacutequences de peptide deacuteformylases ont ainsi eacuteteacute
observeacutees dans lrsquoensemble de ces organismes 219220
Un alignement de seacutequences entre diffeacuterentes PDFs retrouveacutees chez des virus ainsi que
des repreacutesentants des divers types de PDFs retrouveacutees chez les procaryotes et les eucaryotes
nous permet de mettre en eacutevidence certaines caracteacuteristiques des PDFs virales (Figure I-1) Tout
drsquoabord il faut signaler que la plupart des deacuteformylases ont une faible homologie de seacutequence
globale ce qui contraste fortement avec la forte homologie retrouveacutee au niveau des motifs du
site actif 142 Ainsi les trois motifs conserveacutes participant agrave la structure du site actif et
caracteacuteristiques des PDFs (GΦGΦAAxQ EGCΦS et HEΦDHxxG ougrave Φ est un acide amineacute
hydrophobe et x un acide amineacute quelconque) sont bien preacutesents dans lrsquoensemble des seacutequences
des PDFs putatives retrouveacutees chez les virus permettant de les classer comme homologues de
peptides deformylases (Figure I-1A)
Apregraves avoir identifieacute les motifs laquo signature raquo des PDFs la comparaison des seacutequences
et des structures permet de classer ces enzymes en trois groupes distincts 1 2 et 3 Les PDFs
de type 1 se reacutepartissent en deux sous-groupes les 1A et les 1B Les deacuteformylases de type 1B
et en particulier la PDF drsquoE coli (EcPDF) sont consideacutereacutees comme les peptides deacuteformylases
modegraveles Une de leur principale caracteacuteristique est une extreacutemiteacute C-terminale se repliant sous
forme drsquoheacutelice α 191221222 Le sous-type 1A se distingue par la preacutesence drsquoune longue insertion
dans le corps de la proteacuteine et par une extreacutemiteacute C-terminale non structureacutee adoptant une
conformation eacutetendue 158189 Les PDFs de type 2 possegravedent quant agrave elles plusieurs insertions
Chapitre I
55
par rapport au type 1 et une extreacutemiteacute C-terminale qui a tendance agrave former des brins β 181
Enfin les PDFs de type 3 dont aucune structure nrsquoa encore eacuteteacute deacutetermineacutee preacutesentent des
substitutions cruciales au niveau des motifs I et II les rendant tregraves peu ou totalement inactives
47223 Drsquoapregraves lrsquoensemble des donneacutees issues de la litteacuterature et de lrsquoalignement de seacutequences
(Figure I-1A) il apparaicirct que les peptides deacuteformylases virales se rapprochent plus
particuliegraverement du sous-groupe 1B En effet celles-ci ne preacutesentent pas drsquoinsertion particuliegravere
dans le corps de la proteacuteine les distinguant des PDFs de type 1A et 2 et les trois motifs du site
actif sont conserveacutes
Il ressort donc clairement que les PDFs virales identifieacutees et analyseacutees sont apparenteacutees
aux PDFs de type 1B avec toutefois une extreacutemiteacute C-terminale fortement tronqueacutee Les PDF
virales forment alors un sous-groupe parmi le type 1B (Figure I-1B) Par ailleurs toutes les
PDF virales appartiennent agrave ce nouveau sous-groupe et correspondent aux seacutequences de
deacuteformylases putatives actives les plus courtes parmi lrsquoensemble des seacutequences reacutepertorieacutees
A
Figure I-1 Comparaison de seacutequences proteacuteiques de peptide deacuteformylases provenant de divers organismes A) Alignement
de seacutequences de PDFs appartenant aux types 1A 1B 2 et 3 Les PDFs virales marines sont surligneacutees en gris celles de
cyanobacteacuteries en vert celles de picoeucaryotes oceacuteaniques photosyntheacutetiques en bleu et enfin la PDF du bacteacuteriophage Vp16C
en beige Les PDFs de type 3 sont quant agrave elles surligneacutees en orange La numeacuterotation des acides amineacutes est baseacutee sur la seacutequence
drsquoEcPDF Figure tireacutee de Sharon et al 2011 219 B) Classification des peptides deacuteformylases dans un arbre phylogeacuteneacutetique baseacute
sur la comparaison de 192 seacutequences choisies pour repreacutesenter la diversiteacute des PDFs drsquoapregraves Sharon et al 2011 219 (supplementary
figure S2 de la publication citeacutee)
Chapitre I
56
Chapitre I
57
A2 - Deux PDFs preacutesentes dans deux bacteacuteriophages de Vibrio
parahaemolyticus Vp16T et Vp16C
Notre laboratoire a focaliseacute son attention sur les seacutequences de peptide deacuteformylases
provenant des phages Vp16T et Vp16C 218 car ce sont les seacutequences de PDFs parmi les plus
courtes identifieacutees agrave ce jour Lrsquoanalyse de la seacutequence de ces deux enzymes a reacuteveacuteleacute qursquoelles
appartiennent agrave la mecircme classe que la PDF drsquoE coli mais qursquoelles preacutesentent des
caracteacuteristiques distinctes notamment au niveau de leur extreacutemiteacute C-terminale (Figure I-1 et I-
2A) Les motifs conserveacutes du site actif ne preacutesentent pas de mutations pouvant suggeacuterer une
deacuteficience dans lrsquoactiviteacute de la proteacuteine comme crsquoest le cas pour les PDFs de type 3 224 ou
certaines PDF1A comme la peptide deacuteformylase humaine178 De plus aucune insertion
particuliegravere nrsquoest observable par rapport agrave la seacutequence drsquoEcPDF et des PDFs de type 1B en
geacuteneacuteral Cependant lrsquoextreacutemiteacute C-terminale diffegravere puisque elle ne preacutesente pas lrsquoextension
permettant le repliement sous forme drsquoune heacutelice α Une eacutetude preacuteceacutedemment reacutealiseacutee avec
EcPDF indique que la proteacuteine peut ecirctre active en deacutepit de lrsquoabsence de son heacutelice α3 C-
terminale tant que la deacuteleacutetion nrsquoa pas lieu trop pregraves du motif 3 permettant la structure du site
actif Ainsi chez EcPDF une deacuteleacutetion en amont du 139egraveme acide amineacute (Val) aboutit agrave une perte
totale drsquoactiviteacute alors qursquoune deacuteleacutetion agrave partir du reacutesidu 141 (Lys) nrsquoempecircche pas la
compleacutementation in vivo du gegravene endogegravene 92 Le dernier acide amineacute des deacuteformylases de
phage (Ile) correspond au 143egraveme acide amineacute drsquoEcPDF (Figure I-1A) ce qui signifie que
malgreacute leur tregraves courte seacutequence celle-ci sont potentiellement drsquoune taille suffisante pour coder
une proteacuteine active Finalement les seacutequences des PDFs des phages Vp16T et Vp16C ne
montrent pas de mutation dans les motifs conserveacutes du site actif ne preacutesentent pas drsquoinsertion
particuliegravere suggeacuterant un repliement diffeacuterent drsquoEcPDF et lrsquoextreacutemiteacute C-terminale tregraves courte
ne semble pas reacutedhibitoire pour la conservation de lrsquoactiviteacute de la proteacuteine Il est donc probable
que le gegravene des peptides deacuteformylases identifieacute chez ces phages code pour deux enzymes
actives
Ainsi lrsquoidentification de seacutequences nucleacuteotidiques codant potentiellement des proteacuteines
ayant toutes les caracteacuteristiques des peptides deacuteformylases neacutecessite de caracteacuteriser ces
proteacuteines Jusqursquoagrave preacutesent seule la PDF identifieacutee dans le geacutenome du cyanophage S-SSM7 a
eacuteteacute caracteacuteriseacutee 225 indiquant que cette proteacuteine est en tout point similaire aux PDFs connues
jusqursquoalors Au cours de ce travail nous avons souhaiteacute aller plus loin en caracteacuterisant la PDF
preacutesentant la plus courte seacutequence identifieacutee agrave ce jour mais potentiellement active et avons
alors choisi la PDF codeacutee par le bacteacuteriophage Vp16T 218 la plus proche homologue de la PDF
Chapitre I
58
de Vp16C (Figure I-2A) Nous avons proceacutedeacute agrave une caracteacuterisation structure-fonction pousseacutee
de cette proteacuteine chercheacute agrave caracteacuteriser la faccedilon dont elle interagit avec les ribosomes bacteacuteriens
(voir chapitre II) et enfin tenteacute de comprendre les conseacutequences de lrsquoexpression du gegravene lors
de lrsquoinfection de bacteacuteries par le phage (voir chapitre III)
La proteacuteine recombinante Vp16PDF que jrsquoai eacutetudieacutee au cours de cette thegravese est codeacutee
par un gegravene syntheacutetique (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) contenu dans diffeacuterents plasmides en
fonction du type drsquoapproche expeacuterimentale utiliseacutee Les phages Vp16T et VpP16C ayant un
contenu en bases GC eacuteleveacute 218 le gegravene a eacuteteacute conccedilu avec optimisation de codons pour une
expression optimale en systegraveme bacteacuterien La proteacuteine est composeacutee de 137 acides amineacutes
(Figure I-2B) elle a une masse moleacuteculaire theacuteorique de 147832 Da ainsi qursquoun point
isoeacutelectrique (pI) calculeacute de 700
B - Le gegravene codant une PDF putative chez le bacteacuteriophage Vp16T possegravede une
activiteacute deacuteformylase Compleacutementation fonctionnelle in vivo Avant de deacutemarrer une eacutetude structure-fonction sur la proteacuteine recombinante Vp16PDF
nous avons chercheacute agrave savoir si cette proteacuteine preacutesente une activiteacute deacuteformylase in vivo crsquoest-agrave-
dire si elle est capable de deacuteformyler les proteacuteines dans un contexte cellulaire Nous avons pour
A
B 10 20 30 40 50 60
MKILKDDAPE LHAIAAEVPH GEDVKDLVLD MTAAMTAAGG IGLAGNQVGV LKRIIVLRCP
70 80 90 100 110 120
TFKGCVINPI ITRHTDGHVY SPEGCLSYPG KTVAKKRRNK VVVEGYDMDW QPITIAAKGL
130
TAFCLQHEID HLNGVTI
Figure I-2 Seacutequence de la proteacuteine Vp16PDF recombinante eacutetudieacutee au cours de cette thegravese A) Alignement
de seacutequence des PDFs de Vp16C et Vp16T Lrsquoalignement a eacuteteacute reacutealiseacute avec Clustal Omega Les eacutetoiles indiquent
les reacutesidus identiques B) Seacutequence proteacuteique de Vp16PDF Les motifs conserveacutes typiques des PDFs sont indiqueacutes
en rouge (motif I GΦGΦAAxQ motif II EGCΦS motif III HEΦDH ou Φ est un acide amineacute hydrophobique
et x un acide amineacute quelconque)
Chapitre I
59
cela reacutealiseacute des expeacuteriences de compleacutementation fonctionnelle selon un protocole mis au point
preacuteceacutedemment au laboratoire (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) Lrsquoexpeacuterience est baseacutee sur
lrsquoutilisation drsquoune souche drsquoE coli leacutetale conditionnelle (PAL421Tr) dont le gegravene
chromosomique codant la PDF endogegravene a eacuteteacute inactiveacute et posseacutedant un plasmide pMAK
portant le gegravene codant EcPDF sauvage (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) 226 Ce plasmide preacutesente
une origine de reacuteplication thermosensible 227 Ainsi pour des tempeacuteratures infeacuterieures ou eacutegales
agrave 37degC (tempeacuteratures dites permissives) le plasmide peut se reacutepliquer durant les divisions
cellulaires les cellules filles possegravedent alors le plasmide et peuvent survivre Pour des
tempeacuteratures supeacuterieures agrave 37degC (tempeacuteratures dites non permissives) le plasmide nrsquoest plus
reacutepliqueacute durant les divisions les cellules filles ne possegravedent plus le plasmide ni aucun gegravene de
deacuteformylase aboutissant agrave la mort cellulaire Lrsquoutilisation de ce plasmide permet ainsi une
expression thermosensible de la PDF drsquoE coli sauvage Lors drsquoune expeacuterience de
compleacutementation fonctionnelle visant agrave eacutetudier une activiteacute deacuteformylase in vivo la souche
PAL421Tr est transformeacutee par un plasmide pBADMyc-HisA portant le gegravene codant la proteacuteine
drsquointeacuterecirct Lrsquoexpression de la proteacuteine codeacutee dans ce plasmide est inductible par lrsquoarabinose En
reacutealisant une gamme de concentration drsquoarabinose dans le milieu de croissance il est ainsi
possible de moduler et controcircler le niveau drsquoexpression de la deacuteformylase testeacutee Ce protocole
permet de disposer drsquoune souche pour laquelle nous pouvons controcircler aussi bien lrsquoexpression
du gegravene EcPDF sauvage que celle du gegravene de compleacutementation Vp16PDF en jouant sur la
tempeacuterature drsquoincubation des bacteacuteries etou lrsquoajout drsquoarabinose dans le milieu de culture La
croissance des bacteacuteries est alors suivie sur milieu solide agrave 30 et 42degC (tempeacuteratures permissive
et non permissive respectivement) Ainsi agrave 42degC et avec ajout drsquoarabinose dans le milieu seule
lrsquoexpression de la PDF porteacutee par le plasmide pBAD est assureacutee Si cette proteacuteine est active
crsquoest-agrave-dire qursquoelle est capable drsquoassurer la deacuteformylation des proteacuteines drsquoE coli la souche
pousse si la proteacuteine est inactive la souche ne pousse pas
Preacutealablement agrave lrsquoexpeacuterience de compleacutementation fonctionnelle un controcircle est reacutealiseacute
agrave 30degC sur milieu solide contenant du glucose et non de lrsquoarabinose qui reacuteprime lrsquoexpression
du gegravene porteacute par le plasmide pBAD Ainsi seul le gegravene porteacute par le plasmide pMAK (codant
ici EcPDF wt) est exprimeacute et les bacteacuteries doivent pousser correctement quel que soit le gegravene
inseacutereacute dans le plasmide pBAD Des gouttes de dilutions successives reacutealiseacutees agrave partir drsquoune
culture bacteacuterienne en milieu liquide sont deacuteposeacutees sur boicircte et incubeacutees agrave 30degC permettant de
srsquoassurer que les quantiteacutes de bacteacuteries testeacutees sont eacutequivalentes pour chacune des constructions
testeacutees controcircles inclus Le controcircle preacutealable agrave 30degC sur milieu glucose ayant eacuteteacute concluant
Chapitre I
60
(Figure I-3A) nous avons pu reacutealiser lrsquoexpeacuterience de compleacutementation fonctionnelle agrave 42degC en
preacutesence drsquoarabinose Comme attendu les bacteacuteries posseacutedant le plasmide pBAD vide ne
poussent pas alors que celles posseacutedant le gegravene codant EcPDF wt poussent (Figure I-3B) Les
bacteacuteries exprimant le gegravene Vp16PDF poussent eacutegalement agrave 42degC en preacutesence drsquoarabinose
(Figure I-3B) ce qui indique que lrsquoenzyme est active in vivo et est capable drsquoassurer la
deacuteformylation du proteacuteome drsquoE coli
A B
Figure I-3 Mesure de la fonction deacuteformylase du gegravene du bacteacuteriophage Vp16T codant une PDF putative
par un test de compleacutementation fonctionnelle Des gouttes de dilutions successives de 10 en 10 preacuteleveacutees sur
une culture liquide pousseacutee une nuit agrave 30degC sont deacuteposeacutees sur milieu geacuteloseacute Les bacteacuteries de la souche
PAL421Tr contiennent le plasmide pMAK portant le gegravene codant EcPDF wt et sont transformeacutees avec un
plasmide pBAD vide ou portant les gegravenes codant EcPDF ou Vp16PDF wt A) Les boicirctes contenant 05 de
glucose sont incubeacutees une nuit agrave 30degC B) Les boicirctes contenant 2 drsquoarabinose sont incubeacutees une nuit agrave 42degC
C - Caracteacuterisation biochimique de la PDF du phage Vp16T
C1 - Purification agrave homogeacuteneacuteiteacute de Vp16PDF en utilisant les protocoles
mis au point pour les formes bacteacuteriennes Vp16PDF a initialement eacuteteacute purifieacutee dans les conditions habituellement utiliseacutees au
laboratoire pour drsquoautres PDFs ce qui inclut la preacutesence de nickel dans les tampons de lyse et
de purification En effet les deacuteformylases sont des meacutetalloenzymes utilisant un ion meacutetallique
lors du meacutecanisme enzymatique drsquohydrolyse du groupement formyl de la meacutethionine N-
terminale des proteacuteines 190 A lrsquoeacutetat natif il srsquoagit geacuteneacuteralement de fer Fe2+ 192193 Or le Fe2+
srsquooxyde facilement en Fe3+ ce qui conduit agrave lrsquooxydation de la Cys catalytique rendant lrsquoenzyme
inactive 193228 De plus le Fe2+ a une faible affiniteacute pour les PDFs et est facilement remplaceacute
spontaneacutement par du zinc dont lrsquoaffiniteacute pour les PDFs est bien supeacuterieure 142229 Cependant la
plupart des PDFs sont tregraves peu actives lorsqursquoelles sont complexeacutees agrave du Zn2+ 230 Il est toutefois
possible de substituer le meacutetal catalytique natif par drsquoautres cations divalents lors de la
Chapitre I
61
purification des PDFs notamment du Ni2+ permettant de purifier des proteacuteines recombinantes
dont lrsquoactiviteacute enzymatique est preacuteserveacutee 230
Vp16PDF eacutetant une PDF de type 1B nous avons choisi dans un premier temps de suivre
le protocole utiliseacute pour purifier la PDF drsquoE coli 230 qui est la proteacuteine de reacutefeacuterence pour le
type 1B Apregraves surexpression de la proteacuteine codeacutee par le gegravene contenu dans le plasmide pBAD
dans un milieu contenant de lrsquoarabinose la lyse des bacteacuteries a ainsi eacuteteacute effectueacutee en preacutesence
de 20mM NiCl2 concentration qui permet de preacuteserver lrsquoactiviteacute drsquoEcPDF mais eacutegalement de
preacutecipiter de nombreuses proteacuteines Une concentration de 5mM NiCl2 a ensuite eacuteteacute utiliseacutee au
cours des diffeacuterentes eacutetapes de purification afin de maintenir lrsquoion Ni2+ dans le site actif de
lrsquoenzyme De maniegravere classique les PDFs purifieacutees au laboratoire ne possegravedent pas drsquoeacutetiquette
drsquoaffiniteacute et sont purifieacutees sur colonne eacutechangeuse drsquoions Compte tenu du point isoeacutelectrique
inhabituel de Vp16PDF (pI = 70 contre 55 pour EcPDF) nous avons lyseacute les bacteacuteries dans
un tampon agrave pH55 permettant agrave la proteacuteine drsquoecirctre chargeacutee positivement et ainsi de srsquoaccrocher
agrave une colonne eacutechangeuse de cations (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) Lrsquoanalyse de la proteacuteine sur
gel drsquoeacutelectrophoregravese en conditions deacutenaturantes apregraves cette premiegravere eacutetape de chromatographie
a reacuteveacuteleacute la preacutesence de nombreux contaminants (Figure I-4 puits 2) ce qui nous a conduits agrave
proceacuteder agrave une seconde eacutetape de purification sur tamis moleacuteculaire (voir Mateacuteriels et
Meacutethodes) Nous avons ainsi pu obtenir une proteacuteine pure agrave 95 (Figure I-4 puits 3 4 et 5)
Figure I-4 Suivi de la purification
de Vp16PDF par analyse sur gel
SDS-PAGE 14 coloreacute au bleu de
Coomassie Puits 1 Surnageant de
lyse Puits 2 Proteacuteine partiellement
purifieacutee sur SP-Sepharose Puits 3 4 et
5 respectivement 1microg 5microg et 10microg de
proteacuteine purifieacutee sur tamis
moleacuteculaire La flegraveche indique la
position de la proteacuteine Vp16PDF
C2 - Vp16PDF purifieacutee dans des conditions classiques est peu active
Lrsquoactiviteacute enzymatique de la proteacuteine purifieacutee comme deacutecrit ci-dessus a eacuteteacute mesureacutee in
vitro et compareacutee agrave lrsquoactiviteacute drsquoautres PDFs bien caracteacuteriseacutees Jrsquoai utiliseacute le test drsquoactiviteacute
Chapitre I
62
deacuteformylase coupleacute agrave lrsquoactiviteacute de la formyl deacuteshydrogeacutenase reacutealiseacute comme deacutecrit dans la
litteacuterature 231 Dans ce test la PDF clive le groupement formyl de son substrat (geacuteneacuteralement
un tripeptide formyleacute) lequel est oxydeacute par la formate deacuteshydrogeacutenase pour reacuteduire une
moleacutecule de NAD+ en NADH (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) La production du NADH est suivie
au cours du temps par mesure drsquoabsorbance agrave 340 nm Les vitesses initiales de reacuteaction obtenues
sont exprimeacutees en fonction de la concentration en peptide formyleacute utiliseacute dans le test et
lrsquoeacutequation de Michaeumllis-Menten permet alors de deacuteterminer les constantes cineacutetiques de la PDF
testeacutee
Comme attendu suite aux reacutesultats de compleacutementation Vp16PDF preacutesente bien une
activiteacute deacuteformylase En revanche dans les conditions de purification deacutecrites ci-dessus
lrsquoefficaciteacute catalytique de Vp16PDF srsquoest reacuteveacuteleacutee particuliegraverement faible kcat Km = 915 M-1s-
1 contre kcat Km = 54000 M-1s-1 pour EcPDF par exemple (Tableau I-1) Cette faible efficaciteacute
catalytique nrsquoest pas due agrave lrsquoaffiniteacute pour le substrat qui est comparable agrave celle geacuteneacuteralement
obtenue pour drsquoautres PDFs actives quel que soit le type (Km de lrsquoordre de 1 agrave 6 mM voir
Tableau I-1) mais agrave la vitesse de reacuteaction En effet kcat = 3 s-1 pour Vp16PDF lagrave ougrave on obtient
une valeur supeacuterieure agrave 20 s-1 pour les PDFs actives pouvant mecircme aller jusqursquoagrave 1007 s-1 pour
les enzymes les plus actives (Tableau I-1) Ainsi la vitesse de reacuteaction de Vp16PDF se
rapproche plus de celle mesureacutee avec des PDFs connues pour ecirctre constitutivement peu actives
comme les enzymes humaine178 ou issue de Plasmodium falciparum 232 ou de celles dont le
meacutetal catalytique est un Zn2+ et non un Ni2+ (Tableau I-1) Lrsquoactiviteacute de Vp16PDF est eacutegalement
similaire agrave celle mesureacutee pour la peptide deacuteformylase du phage S-SSM7 225
Chapitre I
63
Tableau I-1 Constantes cineacutetiques de Vp16PDF et autres PDFs Les vitesses initiales de reacuteaction ont eacuteteacute
mesureacutees en utilisant le test coupleacute agrave la FDH et du Fo-Met-Ala-Ser (fMAS) comme substrat 194 et les paramegravetres
cineacutetiques ont eacuteteacute calculeacutes en utilisant le logiciel Sigma Plot Pour la PDF de Synechococcus elongatus et du phage
associeacute S-SSM7 les tests drsquoactiviteacute ont eacuteteacute reacutealiseacutes avec les substrats fMTSI fMLIS fMTTA fMAKK fMARI
fMSRV Pour la PDF de Plasmodium falciparum (PfPDF) le test drsquoactiviteacute a eacuteteacute reacutealiseacute selon le protocole de Wei
et al 1997 233avec le substrat formyl-Met-Leu-p-nitroanilide Ec pour Escherichia coli Tt pour Thermus
thermophilus Se pour Synechococcus elongatus At pour Arabidopsis thaliana Vp16 pour phage Vp16T S-SSM7
pour phage de Synechococcus elongatus Hs pour Homo sapiens Bst pour Bacillus stearothermophilus Sa
(Streptococcus agalactiae Pf pour Plasmodium falciparum Tb pour Trypanosoma brucei Ni et Zn indiquent que
la proteacuteine purifieacutee est une forme avec nickel ou zinc respectivement lorsque le meacutetal a eacuteteacute identifieacute
PDF kcat (s-1) Km (mM) kcat Km (M
-1s-1) Reacutefeacuterence
Type 1B
Bacteacuteries
Zn-EcPDF 56 plusmn 15 70 plusmn 20 80 plusmn 22 Ragusa et al 1998 194
Ni-EcPDF 210 plusmn 13 39 plusmn 06 54000 plusmn 8000 Ragusa et al 1998 194
TtPDF ND gt10 ND Ragusa et al 1998 194
Ni-TtPDF 27 plusmn 3 23 plusmn 05 11739 plusmn 2500 Ragusa et al 1998 194
SePDF 150-250 1-19 88-313 Frank et al 2013 225
Organites AtPDF1B 13 plusmn 2 82 plusmn 02 1600 plusmn 40 Serero et al 2001 185
Ni-AtPDF 75 plusmn 15 56 plusmn 19 13300 plusmn 1500 Serero et al 2001 185
Phages Vp16PDF 3 32 915 Ce travail
S-SSM7 PDF 583-800 03-13 449-2204 Frank et al 2013 225
Type 1A
Organites
AtPDF1A 22 plusmn 2 025 plusmn 007 88000 plusmn 150 Serero et al 2003 178
HsPDF 0030
plusmn 0005 16 plusmn 04 18 plusmn 2 Serero et al 2003 178
Type 2
Bacteacuteries Gram+
BstPDF ND gt10 ND Ragusa et al 1998 194
Ni-BstPDF 1007 plusmn 191 41 plusmn 12 245000 plusmn 10000 Ragusa et al 1998 194
Ni-SaPDF 50 plusmn 3 120 plusmn 08 41993 Fieulaine et al accepteacute
Type 3
Archeacutees
et Trypanosomes
Ni-PfPDF ND ND 13700 plusmn 1000 Bracchi-Ricard et al 2001 232
Zn-TbPDF ND ND 8 Bouzaidi-Tiali 2007 224
Chapitre I
64
La mesure drsquoune faible activiteacute de Vp16PDF suggegravere une mauvaise substitution du meacutetal
catalytique natif par le nickel au cours de la purification de la proteacuteine impliquant que le
protocole suivi nrsquoest pas optimal Cependant drsquoautres hypothegraveses pourraient expliquer la faible
activiteacute catalytique de cette proteacuteine En effet il est possible que Vp16PDF soit naturellement
peu active et ce pour plusieurs raisons Il est par exemple connu que les PDFs mitochondriales
des mammifegraveres preacutesentent deux mutations critiques dans les motifs consensus qui caracteacuterisent
la famille des PDFs 178 expliquant la faible activiteacute mesureacutee pour lrsquoenzyme humaine
158178204213234 Or comme deacutecrit plus haut (Figure I-1A) lrsquoanalyse de la seacutequence de Vp16PDF
ne permet pas drsquoidentifier une quelconque mutation qui pourrait alteacuterer le meacutecanisme
enzymatique conduisant agrave une faible vitesse de reacuteaction Une autre explication tiendrait agrave
lrsquoextreacutemiteacute C-terminale atypique de Vp16PDF qui est la plus courte deacutecouverte agrave ce jour (voir
paragraphe A2) Enfin il nrsquoest pas exclu que Vp16PDF adopte un repliement atypique etou
qursquoelle ait une speacutecificiteacute de substrat inhabituelle
Ainsi bien que cette premiegravere tentative de purification de la proteacuteine Vp16PDF ne nous
ait pas permis drsquoobtenir une proteacuteine tregraves active la haute pureteacute de lrsquoeacutechantillon (Figure I-
4) ainsi que le bon rendement de purification (8 mg de proteacuteine pure pour 2 litres de culture
bacteacuterienne) nous ont permis de caracteacuteriser la proteacuteine par diffeacuterentes approches afin de mettre
en eacutevidence ses particulariteacutes eacuteventuelles (voir sections C4 agrave C6) En parallegravele jrsquoai eacutegalement
optimiseacute les conditions de purification de Vp16PDF dans le but de disposer drsquoune proteacuteine dont
lrsquoactiviteacute enzymatique est preacuteserveacutee (voir section D)
C3- Production drsquoanticorps dirigeacutes contre Vp16PDF Lrsquoobtention de la proteacuteine Vp16PDF pure nous a permis de stimuler la production
drsquoanticorps dirigeacutes contre la proteacuteine par immunisation de lapins (voir Mateacuteriels et Meacutethodes)
La caracteacuterisation de ces anticorps sur des extraits bruts bacteacuteriens nous a permis de deacutemontrer
leur speacutecificiteacute ils reconnaissent exclusivement la PDF de phage et pas celle drsquoE coli (Figure
I-5) Un signal unique et intense est observeacute dans les extraits bruts surexprimant Vp16PDF
correspondant agrave une proteacuteine ayant une taille drsquoenviron 14 kDa comparable agrave celle attendue
drsquoapregraves sa seacutequence codante (Figure I-2) Ces anticorps speacutecifiques et de haute affiniteacute sont
devenus un outil tregraves puissant pour la suite de mes eacutetudes Ils sont utiliseacute agrave une dilution de
15000 durant les expeacuteriences
Chapitre I
65
Figure I-5 Test des anticorps-anti-Vp16PDF Pour chaque gel 10ng 50ng et 100ng de proteacuteine purifieacutee ont
eacuteteacute deacuteposeacutes et compareacutes agrave un aliquote drsquoextrait brut (EB) Chaque membrane a eacuteteacute incubeacutee avec une dilution
drsquoanticorps primaire variable (11000 12000 15000 et 110000) suivie drsquoune incubation en preacutesence
drsquoanticorps secondaire porteur drsquoun fluorophore La fluorescence a ensuite eacuteteacute deacutetecteacutee reacuteveacutelant une bande
speacutecifique entre 10 et 15 kDa qui correspond agrave Vp16PDF
C4 - Lrsquoextreacutemiteacute C-terminale tregraves courte de Vp16PDF stabilise fortement
la proteacuteine Gracircce agrave diffeacuterentes collaborations nous avons pu caracteacuteriser la stabiliteacute thermique de
Vp16PDF en utilisant deux techniques diffeacuterentes
En collaboration avec la plateforme laquo Mesures drsquointeraction des macromoleacutecules raquo
(PIM) de lrsquoI2BC la stabiliteacute thermique de Vp16PDF a eacuteteacute mesureacutee par la technique DSC
(laquo differential scanning calorimetry raquo) qui mesure la variation de capaciteacute calorifique associeacutee
agrave la deacutenaturation de la moleacutecule lorsque celle-ci est chauffeacutee agrave vitesse constante Le
thermogramme obtenu permet alors de deacuteterminer une tempeacuterature de transition noteacutee Tm
A titre de comparaison la valeur Tm a eacuteteacute mesureacutee pour Vp16PDF ainsi que pour
drsquoautres PDFs (la valeur Tm associeacutee agrave la PDF1B drsquoA thaliana (AtPDF1B) est tireacutee de
preacuteceacutedentes expeacuteriences reacutealiseacutees dans les mecircmes conditions 235) Il est agrave noter que les proteacuteines
ont systeacutematiquement preacutecipiteacute agrave haute tempeacuterature donnant des thermogrammes qui ne
peuvent pas ecirctre pleinement analyseacutes (crsquoest-agrave-dire que les variations drsquoenthalpie et drsquoentropie
ne sont pas quantifiables) mais permettant tout de mecircme une bonne estimation du Tm associeacute agrave
chaque proteacuteine testeacutee
Les PDF 1Bs drsquoE coli et A thaliana ont une stabiliteacute thermique semblable avec un Tm
de 60degC et 61degC respectivement (Figure I-6 et 235) Le Tm de la PDF1B de Thermus
thermophilus (TtPDF) est bien plus eacuteleveacute (73degC Figure I-6) vraisemblablement car elle est
produite par une bacteacuterie hyperthermophile De maniegravere inteacuteressante le Tm mesureacute de Vp16PDF
Chapitre I
66
est eacutegalement eacuteleveacute avec une valeur de 68degC (Figure I-6) Cette valeur est tregraves proche de celle
obtenue avec une version de la PDF drsquoE coli dont lrsquoextreacutemiteacute C-terminale a eacuteteacute tronqueacutee
(variant 1-148 Tm = 72degC Figure I-6) Ce reacutesultat signifie que lrsquoabsence drsquoheacutelice alpha en C-
terminal stabilise significativement les PDFs de type 1B effet qui avait deacutejagrave eacuteteacute observeacute lors
drsquoune preacuteceacutedente eacutetude avec EcPDF 92
La stabiliteacute thermique de Vp16PDF a eacutegalement eacuteteacute analyseacutee par la technique de
thermofluor ou FTSA (laquo Fluorescence-based Thermal Shift Assay raquo) en collaboration avec
Eric Jacquet agrave lrsquoInstitut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN Gif-sur-Yvette) Cette
technique est baseacutee sur lrsquoanalyse des variations de lrsquointensiteacute de fluorescence de colorants
fluorescents tels que le Sypro Orange en preacutesence de la proteacuteine et en fonction de la
tempeacuterature le fluorophore fluoresce lorsqursquoil est en contact avec les reacutegions hydrophobes des
proteacuteines reacutegions qui sont progressivement exposeacutees agrave mesure que la proteacuteine est deacutenatureacutee par
la tempeacuterature croissante Les courbes de fluorescence obtenues sont deacuteriveacutees afin drsquoavoir accegraves
agrave la tempeacuterature de demie-deacutenaturation Tm
La deacutenaturation thermique de Vp16PDF a eacuteteacute mesureacutee pour diffeacuterentes concentrations
de proteacuteine (de 13 agrave 49 microM) la proteacuteine eacutetant stockeacutee dans un tampon 50 mM MES-KOH
pH55 5 mM NiCl2 et dilueacutee dans un tampon 50 mM MES-KOH pH55 sans NiCl2 une quantiteacute
reacutesiduelle de NiCl2 eacutetait preacutesente dans les eacutechantillons (de 208 agrave 750 microM) Cette premiegravere seacuterie
Figure I-6 Stabiliteacute thermique de diffeacuterentes PDFs de type 1B dont Vp16PDF La stabiliteacute thermique de
diffeacuterentes PDFs de type 1B a eacuteteacute mesureacutee par la technique DSC Les tempeacuteratures apparentes de transition Tm
ont eacuteteacute deacuteduites des thermogrammes apregraves correction de la ligne de base En rouge Vp16PDF bleu EcPDF
vert EcPDF variant 1-148 noir TtPDF
Chapitre I
67
de tests a permis de deacuteterminer un Tm eacutegal agrave 67 plusmn 1degC (Figure I-7A courbes bleues) eacutegal agrave celui
deacutetermineacute par DSC (Figure I-6) Lrsquoajout de 75 mM EDTA a fortement modifieacute le
comportement de Vp16PDF En effet nous avons pu observer i) une augmentation de la
fluorescence du fluorophore associeacutee agrave la deacutenaturation de Vp16PDF ii) une diminution
significative du Tm (61 plusmn 1degC) et iii) lrsquoapparition drsquoune phase preacutecoce de deacutenaturation entre 30
et 45degC (Figure I-7A courbes vertes) Ce reacutesultat suggeacuterait une influence du NiCl2 sur la
conformation et la stabiliteacute de la proteacuteine son absence contribuant agrave une stabiliteacute moindre Nous
avons alors purifieacute Vp16PDF en absence totale de nickel afin de proceacuteder agrave de nouveaux tests
La proteacuteine ainsi purifieacutee en absence de NiCl2 srsquoest aveacutereacutee aussi stable que ce soit en absence
ou en preacutesence de NiCl2 suppleacutementaire dans lrsquoeacutechantillon (Tm = 70 plusmn 1degC et 68 plusmn 1degC Figure
I-7B courbes noire et verte respectivement) En revanche lrsquoajout de 2 mM EDTA a comme
preacuteceacutedemment modifieacute le comportement de la proteacuteine (diminution du Tm (62 plusmn 1degC) et
apparition drsquoune phase preacutecoce de deacutenaturation voir Figure I-7B courbe rouge) La proteacuteine
testeacutee ayant eacuteteacute purifieacutee en absence de nickel ce dernier reacutesultat suggegravere un lien entre la stabiliteacute
de Vp16PDF et la preacutesence drsquoun ou plusieurs meacutetaux lieacute(s) intrinsegravequement agrave la proteacuteine et non
pas ajouteacutes au cours de la purification ou de lrsquoexpeacuterience De plus Vp16PDF ayant un pI
particuliegraverement eacuteleveacute en comparaison drsquoautres PDFs nous avons souhaiteacute tester lrsquoinfluence du
pH sur sa stabiliteacute (les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees en utilisant la proteacuteine purifieacutee en absence
de NiCl2) Nous avons ainsi pu constater que la proteacuteine eacutetait deacutestabiliseacutee lorsqursquoelle eacutetait dilueacutee
dans un tampon agrave pH 40 au lieu de 55 (Tm = 52 plusmn 1degC avec une forte diminution de la
fluorescence Figure I-7C courbes bleues) De plus les reacutesultats preacuteceacutedents ont eacuteteacute confirmeacutes
agrave savoir une stabiliteacute inchangeacutee par lrsquoajout de 2 mM NiCl2 (Tm = 51 plusmn 1degC) mais diminueacutee en
preacutesence drsquoEDTA (Tm = 45 plusmn 1degC) (Figure I-7D courbes vertes et rouges respectivement)
Bien que ces reacutesultats soient encore preacuteliminaires et meacuteriteraient drsquoecirctre approfondis il
en ressort un lien eacutevident entre la stabiliteacute de la proteacuteine et le tampon dans lequel elle est purifieacutee
etou dilueacutee tant au niveau de lrsquoinfluence du pH que du meacutetal lieacute au niveau du site actif etou agrave
drsquoautres sites non identifieacutes jusqursquoici
Chapitre I
68
Figure I-7 Influence des meacutetaux et du pH sur la stabiliteacute thermique de Vp16PDF La stabiliteacute thermique de
Vp16PDF a eacuteteacute mesureacutee par la technique de thermofluor Lrsquoeffet du NiCl2 de lrsquoEDTA et du pH a eacuteteacute testeacute Les
tempeacuteratures apparentes de transition Tm ont eacuteteacute deacuteduites agrave partir de la deacuterivation des courbes de fluorescence
obtenues en fonction de la tempeacuterature Pour chaque condition lrsquoexpeacuterience est reacutepeacuteteacutee deux fois A) Vp16PDF
stockeacutee dans un tampon 50 mM MES-KOH pH 55 5 mM NiCl2 a eacuteteacute dilueacutee dans un tampon 50 mM MES-KOH
pH 55 conduisant agrave une concentration reacutesiduelle de NiCl2 de 750 microM et contenant ou non de lrsquoEDTA agrave 75 mM
B) Vp16PDF purifieacutee en absence totale de NiCl2 et stockeacutee dans un tampon 50mM MES-KOH pH 55 a eacuteteacute dilueacutee
dans un tampon contenant au final 2 mM de NiCl2 ou drsquoEDTA A titre de controcircle la proteacuteine a eacuteteacute dilueacutee dans le
tampon 50mM MES-KOH pH 55 seul (courbe noire) C) Vp16PDF purifieacutee en absence totale de NiCl2 et stockeacutee
dans un tampon 50 mM MES-KOH agrave pH 55 ou 40 D) Mecircme expeacuterience que C mais avec ajout de 2 mM de NiCl2
ou drsquoEDTA
Chapitre I
69
C5- La structure cristalline de Vp16PDF reacutevegravele un repliement PDF classique
assorti de quelques particulariteacutes
Dans le but de deacuteterminer si lrsquoextreacutemiteacute C-terminale tregraves courte etou un repliement atypique de
Vp16PDF pourraient expliquer la faible activiteacute mesureacutee nous avons reacutesolu sa structure cristalline La
proteacuteine purifieacutee en preacutesence de faibles concentrations en nickel eacutetait parfaitement adapteacutee pour la
technique de cristallographie des rayons X car purifieacutee agrave homogeacuteneacuteiteacute en relativement grande quantiteacute
et stable (voir reacutesultats preacuteceacutedents)
De maniegravere inattendue nous avons obtenu plusieurs dizaines de formes cristallines en utilisant
des kits de cristallisations disponibles agrave la plateforme de cristallographie de lrsquoI2BC (voir Mateacuteriels amp
Meacutethodes) La diffraction des cristaux a pu ecirctre testeacutee directement agrave partir des plaques de cristallisation
(voir Mateacuteriels amp Meacutethodes) et une douzaine drsquoentre eux a diffracteacute agrave une reacutesolution comprise entre 2
et 45 Aring Lrsquooptimisation manuelle de ces cristaux a eacuteteacute reacutealiseacutee avec succegraves pour deux conditions de
cristallisation Les cristaux ainsi obtenus ont permis de reacutesoudre la structure cristalline de Vp16PDF agrave
17 Aring de reacutesolution par remplacement moleacuteculaire en utilisant la structure de la PDF de Pseudomonas
aeruginosa (code PDB 1LRY 181) priveacutee de son extreacutemiteacute C-terminale qui preacutesente une identiteacute de
seacutequence de 34 Les deux formes cristallines obtenues sont parfaitement superposables (rmsd lt 05
Aring pour 100 des C) et seule lrsquoune drsquoelle a ensuite eacuteteacute consideacutereacutee pour lrsquoanalyse structurale
Vp16PDF adopte un repliement classique comparable agrave celui des autres PDFs de type 1B
connues notamment celles de Vibrio cholerae (code PDB 3FWX) et E coli (code PDB 2AI8 182) qui
sont les plus proches homologues structuraux ainsi qursquoavec la PDF du phage S-SSM7 (code PDB
3UWA 225) Elle possegravede sept brins β (β1 agrave β7) deux heacutelices α (α1 et α2) ainsi que deux heacutelices 310 (η1
et η2) (Figure I-8) Bien que la structure de Vp16PDF soit classique plusieurs diffeacuterences sont notables
Figure I-8 Comparaison structurale de plusieurs PDFs de type 1B La structure de Vp16PDF (agrave gauche)
est compareacutee aux structures des PDFs drsquoE coli (milieu) et du phage S-SSM7 (droite) Les heacutelices α et les brins
β sont repreacutesenteacutes en violet et vert respectivement Les trois motifs caracteacuteristiques des PDFs constituant le site
actif sont repreacutesenteacutes en jaune Lrsquoheacutelice 310 (η3) preacutesente chez E coli et S-SSM7 est entoureacutee en rouge
Chapitre I
70
La diffeacuterence la plus importante concerne lrsquoextreacutemiteacute C-terminale de Vp16PDF La
proteacuteine srsquoarrecircte quelques reacutesidus apregraves lrsquoheacutelice α2 elle ne comporte donc ni lrsquoheacutelice α C-
terminale ni lrsquoheacutelice 310 3 typiques des PDFs de type 1B que lrsquoon retrouve par exemple chez
EcPDF (Figure I-8) Or cette heacutelice 310 est preacutesente dans quasiment toutes les PDFs de structure
connue (voir Figure S1 dans 235) et constitue une reacutegion critique pour lrsquoactiviteacute de la proteacuteine
En effet comme deacutecrit plus haut (section C5) une deacuteleacutetion de la proteacuteine EcPDF au niveau
des reacutesidus 139 agrave 143 situeacutes avant ou dans cette heacutelice η3 conduit agrave une inactivation partielle
ou totale de la proteacuteine 92
Lrsquoextreacutemiteacute C-terminale de Vp16PDF nrsquoest pas flottante elle est colleacutee contre le cœur
globulaire de la proteacuteine agrave proximiteacute du site actif La chaicircne lateacuterale de la Thr136 lavant-
dernier reacutesidu fait une liaison hydrogegravene avec la chaicircne lateacuterale de la Tyr88 tandis que la
chaicircne lateacuterale de Ile137 est enfouie agrave linteacuterieur dune poche hydrophobe constitueacutee de reacutesidus
provenant des brins 4 et 5 (Figure I-9) Enfin un pont salin maintient le groupement
carboxyle terminal du dernier reacutesidu (Ile137) avec lrsquoextreacutemiteacute de la chaicircne lateacuterale de la Lys91
(Figure I-9) Ce reacuteseau drsquointeractions a eacuteteacute compareacute agrave celui existant dans les PDFs drsquoE coli et
du cyanophage S-SSM7 La seule interaction conserveacutee entre ces trois PDFs est le contact
hydrophobe mentionneacute ci-dessus Cette interaction implique geacuteneacuteralement un reacutesidu Phe ou Tyr
(que lrsquoon retrouve dans plus de 93 de PDFs y compris celle du cyanophage S-SSM7) et il
est relativement rare de trouver une Ile dans cette position (moins de 2 des cas) La PDF de
Thermotoga maritima repreacutesente lrsquoune des exceptions puisqursquoelle possegravede une Ile agrave cette
position et non une Phe ou une Tyr Cependant la preacutesence de ce reacutesidu ne modifie pas le
reacuteseau drsquointeractions dans cette zone (Figure I-9) Il est eacutegalement inteacuteressant de souligner
qursquoune Ile est systeacutematiquement retrouveacutee agrave la place des reacutesidus conserveacutes Phe ou Tyr dans la
plupart des PDFs de classe 3 qui sont inactives (Figure I-1) 219
Malgreacute ces particulariteacutes lrsquoenvironnement de lextreacutemiteacute C-terminale de la proteacuteine
semble finalement assez similaire agrave celui observeacute dans dautres PDFs et ne permet donc pas
drsquoexpliquer la faible efficaciteacute catalytique observeacutee in vitro avec la proteacuteine purifieacutee dans les
conditions deacutecrites preacuteceacutedemment
Chapitre I
71
Figure I-9 Zoom sur les extremiteacutes C-terminales de plusieurs PDFs de type 1B Les structures de la PDF
du phage Vp16T du phage S-SSM7 drsquoE coli et T maritima sont repreacutesenteacutees A) Repliement de la structure
C-terminale pour les diffeacuterentes PDFs B) Interactions entre la reacutegion C-terminale et lrsquoextreacutemiteacute de la proteacuteine
pour les diffeacuterentes PDFs
Il a eacuteteacute montreacute que le domaine C-terminal des deacuteformylases ne joue pas un rocircle majeur
dans lrsquoactiviteacute enzymatique 92 mais qursquoil est neacutecessaire pour lrsquointeraction avec le ribosome 91
A ce jour lrsquointeraction PDFribosome a eacuteteacute montreacutee uniquement pour la proteacuteine drsquoE coli
indiquant que cette interaction est meacutedieacutee par lrsquoheacutelice α3 C-terminale drsquoEcPDF qui entre en
contact avec la proteacuteine ribosomale uL22 via des contacts hydrophobes et eacutelectrostatiques
(Figure i12 de lrsquointroduction) 91 Or comme deacutecrit plus haut nous savons que les PDFs de type
1A et 2 nrsquoont pas drsquoheacutelice α en C-terminal et que certaines PDFs de type 1B ont une extreacutemiteacute
C-terminale tregraves courte sans eacutequivalent de lrsquoheacutelice α3 drsquoEcPDF Ainsi en supposant que toutes
les PDFs sont capables drsquointeragir avec le ribosome ce qui reste agrave deacutemontrer drsquoautres types
drsquointeractions sont agrave envisager Quelques particulariteacutes structurales ont pu ecirctre releveacutees sur la
structure de Vp16PDF qui pourraient entrer en jeu lors de lrsquointeraction avec le ribosome le cas
eacutecheacuteant
En raison de son point isoeacutelectrique moins acide que celui calculeacute pour les autres PDFs
(pI =700 contre 40-55 habituellement) la reacutepartition des charges en surface de Vp16PDF est
leacutegegraverement modifieacutee En effet il apparaicirct clairement que la surface de Vp16PDF est globalement
moins chargeacutee que drsquoordinaire en particulier autour du site de fixation du ligand (Figure I-
10A) Cela est particuliegraverement valable en comparaison drsquoEcPDF (Figure I-10A Panneau du
haut) Etonnement cette alteacuteration de reacutepartitions de charges ne srsquoapplique pas pour la PDF tregraves
courte du cyanophage S-SSM7 dont le pI calculeacute est de 545 (Figure I-10A) De plus bien
Chapitre I
72
qursquoaucun patch acide ou basique ne soit caracteacuteristique de tel ou tel type de PDF un faible
patch basique est observable sur la proteacuteine Vp16PDF (Figure I-10A) Par ailleurs la reacutepartition
des reacutesidus hydrophobes semble ecirctre alteacutereacutee chez Vp16PDF avec une heacutelice α1 qui preacutesente
une surface accessible au solvant particuliegraverement hydrophobe (Figure I-10B) Enfin avec un
tour en moins agrave son extreacutemiteacute N-terminale lrsquoheacutelice α1 de Vp16PDF est significativement plus
courte que celle des autres PDFs quel que soit le type
Il nrsquoest pas exclu que lrsquoensemble de ces particulariteacutes puisse moduler lrsquointeraction avec
le ribosome et seules des eacutetudes compleacutementaires permettront de valider ces hypothegraveses
Enfin les cartes de densiteacute eacutelectronique ont reacuteveacuteleacute la preacutesence drsquoun ion meacutetallique dans
le site actif de la proteacuteine Vp16PDF coordonneacute de faccedilon classique agrave la cysteine du motif 2
aux deux histidines du motif 3 et agrave une moleacutecule drsquoeau Cet ion srsquoest aveacutereacute ecirctre un Zn2+ et non
un Ni2+ La preacutesence drsquoun ion zinc dans le site actif des PDFs est courante car lrsquoaffiniteacute de ce
meacutetal pour les PDFs est tregraves eacuteleveacutee cet ion provient geacuteneacuteralement de la solution de
cristallisation Or Vp16PDF a cristalliseacute dans des conditions de cristallisation sans zinc (voir
Mateacuteriels et Meacutethodes) ce qui suggegravere une mauvaise substitution du meacutetal lors de la
purification de la proteacuteine ayant conduit agrave lrsquoincorporation de Zn2+ et non de Ni2+ Cette
hypothegravese est renforceacutee par une expeacuterience de spectromeacutetrie de masse native sur la proteacuteine
purifieacutee (reacutealiseacutee en collaboration avec Sarah Cianferani au LSMBO de Strasbourg) qui
indique une masse moleacuteculaire expeacuterimentale de 14847 plusmn 1 Da Cette masse correspond
exactement agrave la masse moleacuteculaire theacuteorique de Vp16PDF (MM = 147832 Da) complexeacutee agrave
un atome de Zn2+ (MM theacuteorique = 6538 Da)
Ces reacutesultats suggegraverent fortement que nous ne sommes pas parvenus agrave substituer le meacutetal
endogegravene de lrsquoenzyme (probablement du Fe2+ comme beaucoup drsquoautres PDFs) par du nickel
au cours de la purification de lrsquoenzyme En preacutesence de faibles concentrations en nickel nous
aurions donc produit une forme Zn-Vp16PDF ce qui expliquerait la faible activiteacute enzymatique
mesureacutee in vitro
Chapitre I
73
Figure I-10 Reacutepartition des reacutesidus chargeacutes ou hydrophobes agrave la surface de diffeacuterents types de PDFs
Les structures de PDFs de type 1B (issues de Vp16T E coli et S-SSM7) de type 2 (issue de B
stearothermophilus) et de type 1A (issue drsquoA thaliana) ont eacuteteacute compareacutees A) La surface des proteacuteines est
repreacutesenteacutee et coloreacutee selon la reacutepartition des reacutesidus basiques (arginine lysine et histidine) et acides (aspartate
et glutamate) respectivement en bleu et rouge Un patch chargeacute positivement (entoureacute en rouge) est preacutesent sur
Vp16PDF B) Les reacutesidus hydrophobes sont repreacutesenteacutes en orange
D - Deacutetermination des conditions neacutecessaires pour la preacuteservation de lrsquoactiviteacute
de Vp16PDF in vitro
Lrsquoensemble des reacutesultats obtenus et deacutecrits dans la premiegravere partie de ce chapitre
montrent que Vp16PDF est une proteacuteine tregraves semblable aux autres PDFs deacutecrites avec quelques
particulariteacutes de seacutequence et de structure Les reacutesultats indiquent eacutegalement que lrsquoincorporation
du nickel dans le site actif nrsquoa vraisemblablement pas eacuteteacute effective conduisant agrave une mauvaise
activiteacute enzymatique et donc agrave lrsquoimpossibiliteacute de deacuteterminer totalement les proprieacuteteacutes
enzymatiques de cette PDF de bacteacuteriophage notamment sa speacutecificiteacute de substrat Dans cette
deuxiegraveme partie jrsquoai donc naturellement chercheacute agrave optimiser la purification de Vp16PDF dans
le but de disposer drsquoune proteacuteine pleinement active En plus de jouer sur la concentration en
nickel au moment de la lyse des bacteacuteries qui surexpriment la proteacuteine jrsquoai eacutegalement testeacute
lrsquoinfluence du pH dans les tampons de lyse Par ailleurs voulant augmenter les rendements de
purification jrsquoai produit la proteacuteine agrave partir du gegravene sous-cloneacute dans un plasmide pET16b
inductible agrave lrsquoIPTG (voir Mateacuteriels et Meacutethodes)
Chapitre I
74
D1 - Lrsquoactiviteacute de Vp16PDF est significativement plus eacuteleveacutee lorsque lrsquoon
augmente la concentration en nickel dans le tampon de lyse
Il est connu que la concentration en nickel du tampon dans lequel est effectueacutee la lyse
des bacteacuteries surexprimant une PDF recombinante repreacutesente un point critique pour
lrsquoincorporation de ce meacutetal 194 Crsquoest pourquoi jrsquoai fait varier la concentration en nickel dans le
tampon de lyse et mesureacute la vitesse initiale de reacuteaction de Vp16PDF sur les extraits bruts
solubles ainsi obtenus Le test drsquoactiviteacute a eacuteteacute reacutealiseacute dans les conditions classiques agrave 37degC en
utilisant le substrat de reacutefeacuterence fMAS agrave 4 mM
Jrsquoai ainsi constateacute qursquoentre 0 mM et 20 mM drsquoion nickel dans le tampon de lyse
lrsquoactiviteacute mesureacutee eacutetait pratiquement nulle et qursquoil fallait utiliser des concentrations supeacuterieures
agrave 20 mM pour observer une augmentation significative de lrsquoactiviteacute (Figure I-11A courbe
bleue) Ces concentrations eacuteleveacutees eacutetant inhabituelles jrsquoai reproduit lrsquoexpeacuterience en utilisant
une plus forte concentration de substrat (6 mM au lieu de 4 mM) afin de veacuterifier que la
concentration de NADH formeacute eacutetait bien en lien avec lrsquohydrolyse du substrat et donc lrsquoactiviteacute
deacuteformylase Les vitesses initiales de reacuteaction mesureacutees eacutetaient significativement supeacuterieures
(Figure I-11A courbe rouge) indiquant que lrsquoactiviteacute mesureacutee eacutetait bien due agrave Vp16PDF et non
agrave un artefact De plus jrsquoai voulu savoir si lrsquoactiviteacute de Vp16PDF mesureacutee in vitro pouvait ecirctre
moduleacutee par la tempeacuterature Jrsquoai donc reproduit lrsquoexpeacuterience preacuteceacutedente en testant quatre
tempeacuteratures (25degC 30degC 37degC et 42degC) agrave une concentration fixe de fMAS (4 mM) Les
vitesses initiales de reacuteaction mesureacutees ont eacuteteacute significativement plus eacuteleveacutees lorsque le test
drsquoactiviteacute eacutetait reacutealiseacute agrave 37 ou 42degC compareacute agrave 30 ou 25degC avec une diffeacuterence drsquoautant plus
marqueacutee que la concentration en nickel dans le tampon de lyse eacutetait plus eacuteleveacutee 229 (Figure I-
11B) Ce comportement est courant pour une PDF et les tests drsquoactiviteacute suivants ont donc eacuteteacute
reacutealiseacutes classiquement agrave 37degC
Chapitre I
75
Cette premiegravere eacutetape de lrsquooptimisation du protocole de purification a montreacute une
deacutependance au nickel de Vp16PDF inhabituelle indiquant que la concentration en nickel
utiliseacutee au moment de la lyse des bacteacuteries lors des premiegraveres purifications de la proteacuteine eacutetait
loin drsquoecirctre optimale conduisant agrave une activiteacute enzymatique tregraves faible La premiegravere gamme de
concentration testeacutee mrsquoa permis de montrer que le tampon de lyse doit contenir un minimum
de 30 mM de NiCl2 pour pouvoir preacuteserver efficacement lrsquoactiviteacute enzymatique de Vp16PDF
Durant les tests suivants jrsquoai encore augmenteacute cette concentration afin de deacuteterminer la
concentration optimale agrave utiliser lors de la lyse des bacteacuteries De plus je me suis inteacuteresseacute au
point isoeacutelectrique particulier de la proteacuteine
D2 - Lrsquoactiviteacute de Vp16PDF est fortement augmenteacutee lorsque le tampon
de lyse est de bas pH et qursquoil contient de tregraves fortes concentrations en
nickel
Comme deacutecrit plus haut Vp16PDF possegravede un point isoeacutelectrique theacuteorique inhabituel
eacutegal agrave 700 conduisant agrave une reacutepartition atypique des charges en surface de la proteacuteine (voir
section C5 Figure I-10) De plus nous avons montreacute que des variations de pH influencent la
stabiliteacute de la proteacuteine (voir section C4 Figure I-7) Au cours drsquoune deuxiegraveme seacuterie de tests
jrsquoai donc chercheacute agrave eacutevaluer lrsquoinfluence du pH sur lrsquoactiviteacute de Vp16PDF en modifiant le pH du
Figure I-11 Influence de la concentration en nickel dans le tampon de lyse sur lrsquoactiviteacute de Vp16PDF
dans des extraits bruts solubles Des aliquotes de culture bacteacuterienne ayant surexprimeacute Vp16PDF ont eacuteteacute
resuspendus dans du tampon de lyse agrave pH55 en preacutesence de diffeacuterentes concentrations de NiCl2 (de 3 agrave 30 mM)
La vitesse initiale de reacuteaction (v0) a ensuite eacuteteacute mesureacutee sur les extraits bruts solubles ainsi obtenus et reporteacutee
sur le graphique en fonction de la concentration en nickel preacutesente dans le tampon de lyse A) Le test drsquoactiviteacute
a eacuteteacute reacutealiseacute agrave 37degC et deux concentrations en substrat fMAS ont eacuteteacute testeacutees 4 mM et 6 mM repreacutesenteacutes en
bleu et rouge respectivement B) Le test drsquoactiviteacute a eacuteteacute reacutealiseacute agrave diffeacuterentes tempeacuteratures 25degC 30degC 37degC et
42degC (repreacutesenteacutes respectivement en jaune vert rouge et bleu) en utilisant 4 mM de fMAS
Chapitre I
76
tampon de lyse des bacteacuteries ayant surexprimeacute la proteacuteine Lrsquoensemble des tests drsquoactiviteacute a eacuteteacute
reacutealiseacute agrave partir des extraits bruts solubles ainsi obtenus agrave 37degC et en utilisant 4 mM de fMAS
Outre le tampon de lyse agrave pH 55 (celui utiliseacute lors de la premiegravere seacuterie de tests voir
section preacuteceacutedente) jrsquoai testeacute deux pH lrsquoun infeacuterieur (pH 40) et lrsquoautre proche du pI
theacuteorique (pH 75) permettant agrave la proteacuteine drsquoecirctre globalement chargeacutee positivement dans un
cas et globalement neutre dans lrsquoautre Jrsquoai commenceacute par tester lrsquoactiviteacute sur des bacteacuteries
lyseacutees dans un tampon contenant 0 10 ou 50 mM de NiCl2 Une augmentation de la vitesse
initiale de reacuteaction a pu ecirctre observeacutee agrave 50 mM de nickel pour des bacteacuteries lyseacutees dans un
tampon agrave pH 55 compareacute agrave 75 (Figure I-12A courbes rouge et noire) Une activation bien plus
importante a pu ecirctre mesureacutee pour des bacteacuteries lyseacutees dans un tampon agrave pH 40 (Figure I-12A
courbe bleue)
Une concentration de 50 mM NiCl2 eacutetant relativement eacuteleveacutee jrsquoai voulu veacuterifier la
solubiliteacute des proteacuteines dans les eacutechantillons testeacutes Jrsquoai donc analyseacute sur gel drsquoeacutelectrophoregravese
en conditions deacutenaturantes les fractions solubles et insolubles des extraits bruts lyseacutes dans les
diffeacuterents tampons Comme observeacute preacuteceacutedemment on retrouve Vp16PDF majoritairement
dans la fraction insoluble quel que soit le pH (Figure I-12B puits laquo 0 raquo) De plus au contraire
des contaminants qui preacutecipitent Vp16PDF reste stable en preacutesence de 10 ou 50 mM de nickel
et reste partiellement soluble agrave pH 40 (Figure I-12B puits laquo 10 raquo et laquo 50 raquo) Ces reacutesultats eacutetaient
particuliegraverement inteacuteressants car ils montraient que lyser les bacteacuteries dans un tampon agrave pH 40
et fortement concentreacute en nickel permettait non seulement drsquoactiver Vp16PDF (Figure I-12A)
mais eacutegalement de la purifier partiellement en preacutecipitant de nombreux contaminants Jrsquoai donc
par la suite testeacute une gamme plus large de concentrations en nickel (jusqursquoagrave 100 mM) afin de
deacuteterminer la concentration la plus eacuteleveacutee que je pouvais utiliser dans le tampon de lyse pour
obtenir lrsquoactiviteacute maximale de lrsquoenzyme mais eacutegalement eacuteliminer le maximum de
contaminants Ainsi pour chaque aliquote de culture bacteacuterienne lyseacute dans un tampon agrave pH 40
et contenant des concentrations croissantes en NiCl2 jrsquoai mesureacute la vitesse initiale de reacuteaction
et quantifieacute les proteacuteines contenues dans les eacutechantillons testeacutes la vitesse initiale de reacuteaction a
eacutegalement eacuteteacute mesureacutee pour un tampon agrave pH 55 Jrsquoai ainsi montreacute que lrsquoactiviteacute de Vp16PDF
est fortement augmenteacutee en utilisant un tampon de lyse contenant jusqursquoagrave 80 mM de NiCl2
concentration au-delagrave de laquelle un plateau semble ecirctre atteint (Figure I-12C) Par ailleurs
lrsquoactivation semble meilleure avec un tampon de lyse agrave pH 40 compareacute agrave pH 55 De plus
comme attendu suite aux tests preacuteceacutedents la quantiteacute totale de proteacuteines diminue agrave mesure que
lrsquoon augmente la concentration en nickel (Figure I-12C) De maniegravere surprenante jrsquoai mecircme pu
Chapitre I
77
observer une augmentation de la quantiteacute totale de proteacuteines au-delagrave de 50 mM de nickel (Figure
I-12C) qui semble correspondre agrave lrsquoaugmentation de la quantiteacute de Vp16PDF soluble (Figure
I-12B)
Figure I-12 Influence du pH et de la concentration en nickel dans le tampon de lyse sur lrsquoactiviteacute de
Vp16PDF dans des extraits bruts solubles Des aliquotes de culture bacteacuterienne ayant surexprimeacute Vp16PDF
ont eacuteteacute resuspendus dans du tampon de lyse agrave pH variable en preacutesence de diffeacuterentes concentrations en NiCl2
La vitesse initiale de reacuteaction (vo (A340min-1)) a ensuite eacuteteacute mesureacutee sur les extraits bruts solubles ainsi obtenus
et reporteacutee sur le graphique en fonction de la concentration en nickel preacutesente dans le tampon de lyse De plus
les eacutechantillons ont eacuteteacute analyseacutes sur gels drsquoeacutelectrophoregravese en conditions deacutenaturantes coloreacutes au bleu de
Coomassie A) Le test drsquoactiviteacute a eacuteteacute reacutealiseacute agrave 37degC et 4 mM de fMAS agrave partir drsquoeacutechantillons lyseacutes dans un
tampon agrave pH 40 55 ou 75 (courbes en bleu rouge et noir respectivement) B) Les eacutechantillons testeacutes en A ont
eacuteteacute analyseacutes sur gel C) Le test drsquoactiviteacute a eacuteteacute reacutealiseacute agrave 37degC et 4 mM de fMAS agrave partir drsquoeacutechantillons lyseacutes
dans un tampon agrave pH 40 ou 55 (courbes en bleu et rouge respectivement) avec des concentrations en NiCl2
allant jusqursquoagrave 100 mM La quantiteacute de proteacuteines totales dans les eacutechantillons a eacuteteacute mesureacutee et les valeurs
reporteacutees sur le graphique D) Lrsquoactiviteacute speacutecifique (vitesse initiale diviseacutee par la quantiteacute de proteacuteines totales)
est repreacutesenteacutee en fonction de la concentration en nickel dans le tampon de lyse pour chacun des deux pH (40
et 55 courbes en bleu et rouge respectivement)
Chapitre I
78
Lrsquoensemble des reacutesultats preacuteceacutedents mrsquoa permis de deacuteterminer le tampon de lyse adeacutequat
(50 mM MES-KOH pH4 avec 80 mM de NiCl2) permettant agrave la proteacuteine Vp16PDF drsquoecirctre agrave la
fois soluble et de preacuteserver son activiteacute Par ailleurs un avantage non neacutegligeable de ce tampon
est qursquoil permet une purification partielle de la proteacuteine via lrsquoeacutelimination drsquoun grand nombre de
contaminants Cependant avant de proceacuteder agrave une nouvelle purification de Vp16PDF en
utilisant ce tampon optimiseacute jrsquoai voulu veacuterifier si lrsquoon pouvait diminuer la concentration en nickel
apregraves la lyse crsquoest-agrave-dire durant la purification sans affecter lrsquoactiviteacute enzymatique En effet dans la
suite de ma thegravese (voir Chapitre II) jrsquoai eacutetudieacute les interactions de Vp16PDF avec les ribosomes
bacteacuteriens qui sont tregraves sensibles aux ions meacutetalliques 236 Nous avons donc chercheacute agrave travailler
avec des concentrations de nickel les plus faibles possible pour ne pas risquer de perturber leur
inteacutegriteacute Ainsi une dialyse de la fraction soluble active obtenue en lysant les bacteacuteries ayant
surexprimeacute Vp16PDF dans le tampon 50 mM MES-KOH pH40 80 mM NiCl2 a eacuteteacute effectueacutee
contre un tampon 50 mM MES-KOH pH40 contenant des concentrations plus faibles en NiCl2
(2 mM 5 mM 10 mM et 15 mM) Lrsquoanalyse des eacutechantillons dialyseacutes sur gel drsquoeacutelectrophoregravese
en conditions deacutenaturantes a montreacute que diminuer la concentration en nickel apregraves lrsquoeacutetape de
lyse nrsquoaltegravere pas la solubiliteacute de la proteacuteine quelle que soit la concentration en nickel (Figure
I-13A) Les eacutechantillons contiennent donc tous la mecircme quantiteacute de Vp16PDF et des tests
drsquoactiviteacute ont donc pu ecirctre reacutealiseacutes La mesure des vitesses initiales de reacuteaction a montreacute une
perte quasi-totale de lrsquoactiviteacute de Vp16PDF lorsque celle-ci eacutetait dialyseacutee contre un tampon
contenant une faible concentration en nickel (Figure I-13B) indiquant que le maintien de
lrsquoactiviteacute enzymatique neacutecessite un minimum de 15 mM de NiCl2 dans le tampon de dialyse
Cette concentration eacutetant deacutejagrave trop importante pour la stabiliteacute des ribosomes utiliseacutes lors
drsquoexpeacuteriences ulteacuterieures nous avons deacutecideacute de ne pas tester drsquoautres concentrations en nickel
dans le tampon de dialyse Comme deacutecrit dans le chapitre II les tests drsquointeraction avec les
ribosomes ont donc eacuteteacute reacutealiseacutes avec la forme peu active de Vp16PDF purifieacutee avec des
tampons faiblement concentreacutes en nickel (5 mM) comme deacutecrit preacuteceacutedemment (voir section
C1 et C2) Par ailleurs les tests drsquoactiviteacute ont reacuteveacuteleacute une diminution de lrsquoactiviteacute enzymatique
au-delagrave de 3 mM de substrat fMAS pheacutenomegravene connu pour ecirctre une inhibition par excegraves de
substrat propre aux PDFs 229 Ce pheacutenomegravene nrsquoavait pas eacuteteacute observeacute jusqursquoagrave maintenant (jrsquoai
au contraire montreacute une vitesse initiale de reacuteaction supeacuterieure en utilisant 6 mM de fMAS
compareacute agrave 4 mM voir Figure I-11A) probablement parce que lrsquoactiviteacute enzymatique nrsquoeacutetait
pas optimiseacutee en raison de conditions de tampons non adapteacutees (mesures reacutealiseacutees sur des
bacteacuteries lyseacutees dans un tampon agrave pH 55)
Chapitre I
79
Figure I-13 Activiteacute de Vp16PDF apregraves dialyse dans des tampons contenant de faibles concentrations en
nickel Des aliquotes de culture bacteacuterienne ayant surexprimeacute Vp16PDF ont eacuteteacute resuspendus dans du tampon
MES-KOH 50 mM pH 40 80 mM NiCl2 puis dialyseacutes contre des tampons contenant des concentrations en
NiCl2 plus faibles (2 agrave 15 mM) A) Les eacutechantillons dialyseacutes ont eacuteteacute analyseacutes sur gel drsquoeacutelectrophoregravese en
conditions deacutenaturantes coloreacute au bleu de Coomassie B) Les vitesses initiales de reacuteaction ont eacuteteacute mesureacutees sur
les eacutechantillons dialyseacutes ainsi obtenus pour des concentrations croissantes de substrat fMAS En bleu la vitesse
initiale mesureacutee pour la proteacuteine Vp16PDF non dialyseacutee en jaune violet et bleu les proteacuteines dialyseacutees contres
des tampons contenant respectivement 5 10 ou 15 mM de NiCl2
E ndash Purification et caracteacuterisation enzymatique drsquoune forme active de Vp16PDF
Par la suite jrsquoai proceacutedeacute agrave une nouvelle purification de Vp16PDF en utilisant les
conditions de tampon permettant le maintien de lrsquoactiviteacute ce qui mrsquoa permis de deacuteterminer
preacuteciseacutement ses constantes catalytiques
E1 ndash Purification de Vp16PDF dans des tampons fortement concentreacutes en
nickel
Vp16PDF a eacuteteacute surexprimeacutee en bacteacuteries et les cellules ont eacuteteacute lyseacutees dans le tampon
optimiseacute 50 mM MES-KOH pH 40 80 mM NiCl2 La proteacuteine eacutetant globalement chargeacutee
positivement dans ce tampon jrsquoai pu proceacuteder agrave une eacutetape de chromatographie en utilisant une
colonne eacutechangeuse de cations (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) A lrsquoissue de cette eacutetape la pureteacute
de Vp16PDF srsquoest aveacutereacutee supeacuterieure agrave 90 (Figure I-14)
Gracircce agrave lrsquooptimisation du tampon de lyse des bacteacuteries il est donc possible en une seule
eacutetape chromatographique drsquoobtenir la proteacuteine Vp16PDF sous forme pure et active avec un bon
rendement de purification (12 mg de proteacuteine pour 2 litres de culture bacteacuterienne)
Chapitre I
80
Figure I-14 Analyse de la pureteacute de Vp16PDF
apregraves purification dans des conditions de bas
pH (40) et forte concentration en nickel (80
mM) Gel SDS-PAGE 14 coloreacute au bleu de
Coomassie
E2 ndashLa caracteacuterisation de lrsquoactiviteacute deacuteformylase in vitro de la proteacuteine Vp16PDF
purifieacutee avec le nouveau protocole reacutevegravele une proteacuteine tregraves active partageant
des constantes catalytiques comparables aux autres PDFs actives
Les constantes enzymatiques de Vp16PDF purifieacutee via le protocole optimiseacute ont eacuteteacute
deacutetermineacutees avec le test drsquoactiviteacute coupleacute agrave la FDH (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) en utilisant le
substrat Fo-Met-Ala-Ser (fMAS) comme preacuteceacutedemment Les vitesses initiales de reacuteaction
obtenues en faisant varier la concentration en substrat ont pu ecirctre traiteacutees selon lrsquoeacutequation de
Michaeumllis-Menten (Figure I-15A)
La modification des conditions de purification a permis drsquoobtenir une enzyme ayant une
vitesse de catalyse nettement ameacutelioreacutee par rapport au premier protocole utiliseacute (kcat = 20 plusmn 2 s-
1 contre 3 s-1) (Tableau I-1) Lrsquoefficaciteacute catalytique deacutetermineacutee par le rapport entre la vitesse
catalytique (kcat) et la constante de Michaeumllis (Km) est eacutegalement fortement ameacutelioreacutee (8478 M-
1s-1 contre 915 M-1s-1 obtenue initialement avec la forme purifieacutee en condition pH55 et 5 mM
de nickel) et est comparable agrave celle drsquoautres deacuteformylases actives connues comme Ni-
AtPDF1B ou Ni-TtPDF (Tableau I-I) De plus Vp16PDF possegravede une affiniteacute pour le substrat
fMAS qui est dans lrsquoordre de grandeur de celui observeacute pour les peptides deacuteformylases actives
(Km = 23 plusmn 03 mM)
Drsquoapregraves les donneacutees obtenues et compareacutees agrave celles issues de la litteacuterature il semble
que Vp16PDF soit une deacuteformylase pleinement active une fois purifieacutee dans les nouvelles
conditions que jrsquoai eacutetablies
Chapitre I
81
Figure I-15 Vitesse initiale de deacuteformylation de Ni-Vp16PDF Les vitesses initiales de reacuteaction pour chaque
concentration de substrat sont repreacutesenteacutees selon les repreacutesentations de Michaeumllis et Menten (A) et Lineweaver
et Burke (B) Lrsquoactiviteacute deformylase a eacuteteacute mesureacutee en preacutesence de concentrations croissantes de fMAS et 675
nM drsquoenzyme
E3 ndash Vp16PDF est sensible agrave lrsquoinhibiteur naturel des PDFs lrsquoactinonine
Lrsquoactinonine est un inhibiteur peptidomimeacutetique naturel des PDFs 200 dont le mode
drsquoaction est connu 201235 Crsquoest un inhibiteur compeacutetitif 200201 qui se fixe aux PDFs selon un
meacutecanisme agrave deux eacutetapes (Figure I-16) Au cours de la premiegravere eacutetape lrsquoactinonine se fixe
rapidement agrave lrsquoenzyme avec une constante drsquoinhibition KI modeacutereacutee Le complexe EI ainsi formeacute
eacutevolue ensuite lentement vers un complexe EI de tregraves haute affiniteacute (KI ltlt KI) Ce complexe
final est qualifieacute de quasi-irreacuteversible car il possegravede une constante de dissociation tregraves faible
Le passage du complexe EI en complexe EI est vraisemblablement ducirc agrave un changement de
conformation de lrsquoenzyme en reacuteponse agrave la fixation de lrsquoactinonine (processus drsquoinduced-fit)
235237 Lrsquoactinonine eacutetant un inhibiteur universel des PDFs jrsquoai chercheacute agrave savoir si Vp16PDF y
est eacutegalement sensible et si oui agrave en deacuteterminer les constantes drsquoinhibition en comparant
notamment les valeurs KI et KI La mesure des constantes drsquoinhibition utilise le test drsquoactiviteacute
coupleacute agrave la FDH et le substrat fMAS et lrsquoactinonine est ajouteacutee agrave des concentrations variables
de maniegravere agrave obtenir des courbes dose-reacuteponse (voir Mateacuteriel et Meacutethodes)
Figure I-16 Mode drsquoaction de lrsquoactinonine (I) sur une PDF (E) selon un meacutecanisme de slow-tight binding
en deux eacutetapes
Chapitre I
82
Dans un premier temps jrsquoai deacutetermineacute la valeur drsquoIC50 correspondant agrave la concentration
drsquoactinonine neacutecessaire pour inhiber lrsquoactiviteacute PDF de moitieacute Pour cela jrsquoai preacute-incubeacute la
proteacuteine et lrsquoactinonine pendant 10 min agrave 37degC en utilisant des concentrations croissantes
drsquoactinonine puis deacuteclencheacute la reacuteaction enzymatique par lrsquoajout de substrat agrave une concentration
fixe (3 mM) Jrsquoai ainsi obtenu une IC50 de 51 plusmn 4 nM pour 100 nM de Vp16PDF (Figure I-17A)
Par ailleurs la preacute-incubation conduit agrave la formation drsquoun complexe final EI stable ce qui
permet le cas eacutecheacuteant de srsquoaffranchir de lrsquoeacutetape lente du meacutecanisme drsquoinhibition par slow-tight
binding permettant ainsi drsquoavoir accegraves agrave la valeur KI Dans ce travail jrsquoai deacutetermineacute une
constante drsquoinhibition apparente (KIapp) via la repreacutesentation du rapport vo vi (= vitesse initiale
de reacuteaction en absence drsquoactinonine vitesse initiale de reacuteaction en preacutesence drsquoactinonine) en
fonction de la concentration en actinonine qui conduit agrave une courbe dose-reacuteponse sous la forme
drsquoune droite (figure I-18B droite avec les carreacutes) dont le coefficient directeur est eacutegal agrave la valeur
1 KIapp Jrsquoai ainsi pu deacuteterminer une valeur KIapp eacutegale agrave 30 plusmn 3 nM
Par la suite jrsquoai reproduit lrsquoexpeacuterience en utilisant les mecircmes concentrations en
actinonine substrat et enzyme mais cette fois sans preacute-incubation du complexe
Vp16PDFactinonine Les cineacutetiques obtenues eacutetaient diffeacuterentes de celles observeacutees
preacuteceacutedemment avec deux phases clairement distinctes Les vitesses initiales de reacuteaction pour
la premiegravere phase ont eacuteteacute releveacutees et la droite vo vi en fonction de la concentration en actinonine
traceacutee (Figure I-17B droite avec les triangles) Jrsquoai ainsi pu deacuteterminer une valeur de KI eacutegale agrave
167 plusmn 10 nM (le coefficient directeur de la droite est eacutegal agrave 1 KI)
Les cineacutetiques drsquoinhibition ainsi que la comparaison des valeurs KI et KIapp (KIapp lt
KI) montrent clairement une diffeacuterence de comportement de Vp16PDF selon qursquoelle est preacute-
incubeacutee ou non avec lrsquoactinonine Cela est tout agrave fait coheacuterent avec un meacutecanisme drsquoinhibition
par slow-tight binding que lrsquoon retrouve pour la plupart des PDFs 201235238
Chapitre I
83
Figure I-17 Inhibition de Vp16PDF par lrsquoactinonine A) Mesure de lrsquoIC50 de lrsquoactinonine sur Vp16PDF
(100 nM) Lrsquoactiviteacute reacutesiduelle de lrsquoenzyme a eacuteteacute mesureacutee pour des concentrations croissantes drsquoactinonine en
preacutesence de 3 mM fMAS Lrsquoactiviteacute initiale hors preacutesence drsquoinhibiteur est consideacutereacutee comme eacutequivalente agrave
100 B) Repreacutesentation des vitesses initiales de reacuteaction mesureacutees en A sous la forme v0 vi = f(actinonine)
Le coefficient directeur de la droite ainsi obtenue permet de deacuteterminer le KI apparent Les carreacutes repreacutesentent
lrsquoexpeacuterience avec preacuteincubation du complexe enzymeinhibiteur et les triangles lrsquoexpeacuterience sans preacuteincubation
du complexe enzymeinhibiteur
E4 - Analyse de la speacutecificiteacute de substrat de Vp16PDF
Jusqursquoagrave preacutesent lrsquoensemble des proprieacuteteacutes enzymatiques de Vp16PDF a eacuteteacute deacutetermineacute
avec un seul tripeptide (fMAS) qui est le plus souvent utiliseacute au laboratoire car lrsquoun de ceux
qui permettent drsquoobtenir les meilleures efficaciteacutes catalytiques avec la PDF drsquoE coli 130229 Or
il nrsquoest pas exclu que Vp16PDF ait une speacutecificiteacute de substrat particuliegravere permettant de
favoriser la deacuteformylation de lrsquoune ou lrsquoautre des proteacuteines codeacutees par le geacutenome du phage
Vp16T ou au contraire de deacutefavoriser la deacuteformylation des proteacuteines de la bacteacuterie hocircte Une
telle observation serait un eacuteleacutement pour comprendre la preacutesence drsquoun gegravene codant une PDF
dans des geacutenomes de virus Il est agrave noter que la caracteacuterisation in vitro de lrsquoactiviteacute deacuteformylase
de la PDF du cyanophage Synechococcus S-SSM7 en utilisant diffeacuterents teacutetrapeptides formyleacutes
deacuteriveacutes de seacutequences de proteacuteines du phage a mis en eacutevidence une leacutegegravere diffeacuterence de
speacutecificiteacute de substrat de lrsquoenzyme par rapport agrave lrsquoenzyme de lrsquohocircte 225 Afin de deacuteterminer si
Vp16PDF pourrait deacuteformyler speacutecifiquement des proteacuteines codeacutees par son propre geacutenome
nous avons deacutefini des tripeptides dont la seacutequence est deacuteriveacutee des seacutequences N-terminales du
proteacuteome du phage Drsquoapregraves les donneacutees de seacutequenccedilage le geacutenome du phage Vp16T contient
64 ORFs (Figure I-18) 218 Une fonction a pu ecirctre attribueacutee pour seulement douze des proteacuteines
codeacutees par ces ORFs 218 mais aucune drsquoelle nrsquoa encore eacuteteacute confirmeacutee expeacuterimentalement
Chapitre I
84
Figure I-18 Carte geacutenomique du phage Vp16T Seules les ORFs codant pour des seacutequences proteacuteiques
supeacuterieures agrave 70 acides amineacutes sont repreacutesenteacutees Seules 12 ORFs codent pour des proteacuteines dont la seacutequence
est homologue agrave celle de proteacuteines dont la fonction est connue Drsquoapregraves Seguritan et al 2003 218
Apregraves analyse des seacutequences proteacuteiques codeacutees par les ORFs de Vp16T nous avons
choisi de tester les peptides MNE MAL MPA et MSN correspondant respectivement aux N-
terminaux des proteacuteines putatives ADN polymeacuterase proteacuteine de queue (laquo tail fiber protein raquo)
capside et heacutelicase De plus nous avons choisi de tester les peptides MAK MTT et MKL
correspondant agrave des seacutequences N-terminales repreacutesenteacutees plusieurs fois (3 fois maximum) dans
le geacutenome du phage (le peptide MNE est trouveacute deux fois dans les seacutequences N-terminales du
phage) Les efficaciteacutes catalytiques de Vp16PDF et EcPDF vis-agrave-vis de ces peptides ont eacuteteacute
deacutetermineacutees en utilisant le test drsquoactiviteacute coupleacute agrave la FDH les efficaciteacutes catalytiques obtenues
avec le peptide de reacutefeacuterence fMAS ont eacuteteacute fixeacutees arbitrairement comme eacutetant 100
Les peptides ont eacuteteacute solubiliseacutes dans de lrsquoeau (voir Mateacuteriels et Meacutethodes)
Malheureusement malgreacute de nombreux essais dont lrsquoajout de DMSO (voir Mateacuteriels et
Meacutethodes) les peptides fMNE et fMAL nrsquoont pas pu ecirctre solubiliseacutes et ils nrsquoont donc pas eacuteteacute
testeacutes De plus en raison de problegravemes expeacuterimentaux le peptide fMAK a pu ecirctre testeacute
uniquement avec EcPDF
Lrsquoefficaciteacute catalytique de Vp16PDF vis-agrave-vis des peptides fMKL et fMTT est
eacutequivalente agrave celle obtenue avec le fMAS tandis que celle pour les peptides fMPA et fMSN est
leacutegegraverement moins bonne (Tableau I-2) Neacuteanmoins bien qursquoune leacutegegravere speacutecificiteacute de substrat
semble ressortir de ces reacutesultats celle-ci nrsquoest pas significative car les mecircmes tendances ont eacuteteacute
obtenues avec la PDF drsquoE coli (Tableau I-2) Si ces reacutesultats ne reacutevegravelent pas pour lrsquoinstant une
activiteacute preacutefeacuterentielle de la PDF du phage pour ses propres proteacuteines il serait toutefois
neacutecessaire de tester drsquoautres tripeptides correspondant aux N-terminaux drsquoautres proteacuteines du
phage afin drsquoavoir une vision plus exhaustive et pouvoir deacuteterminer plus sucircrement si Vp16PDF
pourrait ou non favoriser la deacuteformylation des proteacuteines du phage
Chapitre I
85
Peptide
Vp16PDF EcPDF
Km
(mM)
kcat
(sec-1
)
kcat
Km
(sec-1
M-1
)
kcat
Km
()
Km
(mM)
kcat
(sec-1
)
kcat
Km
(sec-1
M-1
)
kcat
Km
()
fMAS 23 196 8478 100 249 57 22800 100
fMKL 29 274 9448 111 019 344 86000 377
fMPA 143 53 3711 437 51 82 16080 705
fMSN 12 274 2286 269 58 886 15355 673
fMTT 101 904 8950 105 14 701 49366 216
fMAK ND ND ND ND 38 1442 44808 205
Tableau I-2 Constantes enzymatiques de Vp16PDF et EcPDF pour diffeacuterents tripeptides formyleacutes Tableau
comparatif des constantes catalytiques mesureacutees pour diffeacuterents substrats entre EcPDF et Vp16PDF Efficaciteacute
catalytique pour le fMAS fixeacutee arbitrairement comme 100 drsquoactiviteacute
Les PDFs nrsquoayant pas de speacutecificiteacute de substrat elles reconnaissent virtuellement
nrsquoimporte quelle proteacuteine du moment que celle-ci deacutebute par une meacutethionine formyleacutee 229 ce
qui conduit agrave la deacuteformylation de la quasi-totaliteacute des proteacuteines en cours de synthegravese la
proportion allant jusqursquoagrave 95 chez les bacteacuteries 47140 De ce fait lrsquoensemble des vingt acides
amineacutes est repreacutesenteacute en N-terminal des proteacuteines notamment en deuxiegraveme position (voir
Figure I-19 sur laquelle les proteacuteomes des bacteacuteries E coli et V parahaemolyticus ont eacuteteacute pris
pour exemples) De maniegravere eacutetonnante la nature du deuxiegraveme acide amineacute dans les proteacuteines
codeacutees par Vp16T est un peu diffeacuterente Aucun reacutesidu Trp Cys Met ou Glu nrsquoest trouveacute en
deuxiegraveme position (Figure I-19) De plus le reacutesidu Ala est particuliegraverement abondant tandis
que le reacutesidu Ser est sous-repreacutesenteacute (Figure I-19) Dans une moindre mesure une Tyr est plus
freacutequemment retrouveacutee en deuxiegraveme position dans le proteacuteome de Vp16T compareacute aux deux
geacutenomes bacteacuteriens pris en exemple (Figure I-19) Cette tendance est partiellement retrouveacutee
dans le proteacuteome du cyanophage S-SSM7 les reacutesidus Trp et Cys ne sont jamais preacutesents en
deuxiegraveme position et il plutocirct rare drsquoavoir une His (Figure I-19) Ces particulariteacutes pourraient
conduire agrave une speacutecificiteacute de substrat inhabituelle Bien que les tests preacuteliminaires de speacutecificiteacute
de substrat ne lrsquoindiquent pas (Tableau I-2) des eacutetudes compleacutementaires seront neacutecessaires
Par ailleurs si le reacutesidu en deuxiegraveme position nrsquoa geacuteneacuteralement pas drsquoinfluence pour les
PDFs elle en a une pour les meacutethionines aminopeptidases (MetAPs) En effet il a eacuteteacute montreacute
qursquoune chaicircne lateacuterale peu encombrante en deuxiegraveme position (Gly Ala Pro Ser Cys voire
Thr et Val) permet aux MetAPs de cliver la Met initiale preacutealablement deacuteformyleacutee tandis
Chapitre I
86
qursquoune chaicircne lateacuterale encombrante ne permet pas le clivage 131 La nature du deuxiegraveme acide
amineacute eacutetant inhabituelle dans le proteacuteome du phage Vp16T nous nous sommes demandeacute quelle
sera la conseacutequence quant au clivage de la Met initiatrice des proteacuteines du phage lors de
lrsquoexpression de ces proteacuteines par la cellule hocircte (le geacutenome de Vp16T ne posseacutedant a priori pas
drsquoORF codant une MetAP putative lrsquoexcision de la Met initiatrice sera vraisemblablement
assureacutee par la MetAP de lrsquohocircte) Nous avons utiliseacute le logiciel TermiNator
(httpsbiowebi2bcparis-saclayfrterminator3) 188 qui permet de preacutedire pour un proteacuteome
donneacute la proportion de proteacuteines qui subissent la voie de la NME (crsquoest-agrave-dire perte de la
formyl-meacutethionine) Drsquoapregraves cette preacutediction 41 des proteacuteines du phage Vp16T devraient
perdre leur formyl-Met proportion tregraves similaire agrave celle preacutedite pour les proteacuteines des bacteacuteries
E coli et V parahaemolyticus ainsi que pour le cyanophage S-SSM7 (respectivement 39 36
et 41) La nature atypique des extreacutemiteacutes N-terminales des proteacuteines du phage Vp16T ne
devrait donc pas avoir drsquoeffet sur le clivage des Met N-ter hypothegravese qui reste toutefois agrave
valider expeacuterimentalement
Figure I-19 Freacutequence des amineacutes retrouveacutes en seconde position dans le proteacuteome drsquoE coli V
parahaemolyticus Vp16T et S-SSM7 Les freacutequences de chaque acide amineacute sont repreacutesenteacutees en bleu orange
gris et jaune pour les organismes E coli V parahaemolyticus Vp16T et S-SSM7 respectivement
Chapitre I
87
Conclusion Lrsquoeacutetude des seacutequences geacutenomiques issues de programmes de seacutequenccedilage reacutecents a
permis drsquoidentifier la preacutesence jusqursquoalors insoupccedilonneacutee de seacutequences homologues de peptides
deacuteformylases chez un certain nombre de virus et bacteacuteriophages Parmi ces seacutequences celle
provenant du phage Vp16T apparaicirct comme eacutetant lrsquoune des plus courtes identifieacutees agrave ce jour
Lrsquoanalyse des alignements de seacutequences avec de nombreuses peptides deacuteformylases indique
que cette enzyme est la plus proche du sous-type 1B comme celle drsquoE coli Neacuteanmoins cette
PDF est tronqueacutee en C-terminal et ne possegravede donc pas lrsquoheacutelice α caracteacuteristique des PDFs de
type 1B deacutecrite comme permettant lrsquointeraction avec le ribosome 91
Lrsquoeacutetude de sa structure et de sa stabiliteacute a permis de montrer que la proteacuteine a un
repliement classique pour une PDF de type 1B ainsi qursquoune stabiliteacute similaire aux autres
deacuteformylases connues Cette PDF est active in vivo ayant la capaciteacute de compleacutementer la
deacuteformylase endogegravene drsquoE coli De plus les expeacuterimentations in vitro indiquent que les
constantes catalytiques sont similaires agrave celles obtenues pour drsquoautres deacuteformylases actives et
aucune speacutecificiteacute de substrat nrsquoa pu ecirctre observeacutee Neacuteanmoins une particulariteacute reacuteside dans les
conditions de purification de lrsquoenzyme En effet afin de substituer son meacutetal naturel et de
conserver son activiteacute durant la purification Vp16PDF neacutecessite drsquoecirctre extraite et purifieacutee dans
un tampon acide (pH 40) avec une forte concentration en nickel (80 mM) Lrsquoeacutetude de son
inhibition par lrsquoactinonine puissant inhibiteur des PDFs reacutevegravele des constantes drsquoinhibition de
lrsquoordre de grandeur de celles observeacutees pour drsquoautres deacuteformylases
Nous pouvons ainsi conclure agrave lrsquoissue de ce chapitre que la seacutequence homologue des
PDFs identifieacutee chez le phage Vp16T code bien une peptide deacuteformylase de type 1B posseacutedant
des caracteacuteristiques de structure de stabiliteacute et drsquoactiviteacute communes agrave un grand nombre de
deacuteformylases connues Jrsquoai par la suite chercheacute agrave savoir si Vp16PDF est capable drsquointeragir avec
les ribosomes malgreacute lrsquoabsence de lrsquoheacutelice C-terminale caracteacuteristique des PDFs de type 1B
et si oui comment Les reacutesultats sont deacutecrits dans le chapitre suivant
Chapitre II
88
Chapitre II Caracteacuterisation biochimique
du complexe Vp16PDFribosome
Chapitre II
89
Chapitre II
90
Jrsquoai montreacute dans le Chapitre I que lrsquoORF 60 identifieacutee dans le geacutenome du bacteacuteriophage
Vp16T supposeacutee coder une PDF 218 code effectivement une proteacuteine ayant une activiteacute peptide
deacuteformylase in vitro et in vivo Jrsquoai eacutegalement montreacute que cette proteacuteine (Vp16PDF) est
globalement comparable aux autres PDFs connues si ce nrsquoest son extreacutemiteacute C-terminale
extrecircmement courte conduisant agrave lrsquoabsence de lrsquoheacutelice α C-terminale typique des PDFs de type
1B auxquelles elle est affilieacutee Or cette heacutelice permet vraisemblablement aux PDF1Bs
drsquointeragir avec les ribosomes bacteacuteriens au moins chez E coli 94 Nous nous sommes alors
demandeacute si Vp16PDF est capable drsquointeragir avec les ribosomes malgreacute lrsquoabsence drsquoheacutelice α C-
terminale et si oui comment Quelles sont les reacutegions de Vp16PDF et du ribosome impliqueacutees
dans lrsquointeraction Quelle est lrsquoaffiniteacute du complexe PDFribosome Quel est le rocircle exact de
lrsquoheacutelice α C-terminale de la PDF drsquoE coli Quel est le rocircle de la chaicircne polypeptidique en
cours de synthegravese dans la formation du complexe Jrsquoai tenteacute de reacutepondre agrave ces questions en
mettant en place toute une seacuterie drsquoexpeacuteriences baseacutees sur des approches biochimiques et
structurales
Les reacutesultats obtenus au cours de la caracteacuterisation biochimique et enzymatique de
Vp16PDF (voir Chapitre I) ont montreacute qursquoil est possible de preacuteserver une bonne activiteacute
deacuteformylase agrave condition de maintenir lrsquoenzyme dans un tampon contenant une tregraves forte
concentration en nickel (80 mM) Neacuteanmoins compte tenu de lrsquoinfluence des ions divalents sur
la structure du ribosome etou sur lrsquointeraction de ce dernier avec ses partenaires ainsi que les
problegravemes techniques qui peuvent ecirctre engendreacutes par la haute concentration de nickel jrsquoai
deacutecideacute de travailler avec la proteacuteine purifieacutee dans des tampons faiblement concentreacutes en nickel
(5 mM) pour eacuteviter toute sorte drsquointerfeacuterence avec le ribosome La totaliteacute des expeacuteriences
preacutesenteacutees dans ce chapitre a eacuteteacute reacutealiseacutee avec des ribosomes 70S drsquoE coli Pour les expeacuteriences
de pontage chimique jrsquoai utiliseacute des ribosomes que jrsquoai purifieacutes au laboratoire et pour les
expeacuteriences de seacutedimentation jrsquoai utiliseacute les ribosomes provenant drsquoun kit commercial (voir
Mateacuteriels et Meacutethodes)
A ndash Vp16PDF interagit avec les ribosomes bacteacuteriens malgreacute lrsquoabsence de lrsquoheacutelice
C-terminale typique des PDFs de type 1B
In vitro la PDF drsquoE coli (EcPDF) interagit avec les ribosomes bacteacuteriens et plus
particuliegraverement avec la grande sous-uniteacute selon une stœchiomeacutetrie 11 et avec une affiniteacute de
lrsquoordre de 2 microM (Kd = 25 plusmn 10 microM pour les 70S et Kd = 18 plusmn 09 microM pour les 50S selon
Bingel-Erlenmeyer et al 91 Kd ~ 15 microM pour les 70S selon Bornemann et al 132) EcPDF se
Chapitre II
91
positionne sur le ribosome agrave proximiteacute des proteacuteines bL17 bL32 et uL22 crsquoest-agrave-dire pregraves de
lrsquoextreacutemiteacute du tunnel de sortie (voir Figure i11 en Introduction) elle interagit directement avec
la proteacuteine uL22 ainsi que lrsquoARN ribosomal 23S via son heacutelice α C-terminale 91 Vp16PDF
eacutetant une PDF tregraves proche structuralement drsquoEcPDF (voir Chapitre I section C5) mais ne
posseacutedant pas lrsquoheacutelice C-terminale qui permet agrave EcPDF de se fixer au ribosome mon premier
objectif a donc eacuteteacute de deacuteterminer si Vp16PDF est capable drsquointeragir avec les ribosomes malgreacute
lrsquoabsence de cette heacutelice et si oui de deacuteterminer avec quelle affiniteacute Pour cela jrsquoai mis au point
un protocole inspireacute de la technique de seacutedimentation sur couche de sucrose utiliseacutee
preacuteceacutedemment par Sandikci et al 94 (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) Dans cette expeacuterience
lrsquoeacutechantillon contenant le complexe PDFribosome preacutealablement formeacute est deacuteposeacute agrave la surface
drsquoune solution de sucrose et soumis agrave ultracentrifugation (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) Les
ribosomes se retrouvent alors dans le culot et les proteacuteines solubles dans le surnageant Un
Western-blot suivi drsquoune immunodeacutetection en utilisant les anticorps anti-Vp16PDF que nous
avons produits (voir Chapitre I) est reacutealiseacute sur le culot afin de deacutetecter ou non la preacutesence de
Vp16PDF co-seacutedimenteacutee avec les ribosomes
Dans un premier temps jrsquoai voulu reproduire lrsquoapproche suivie par Sandikci et al 94 agrave
savoir utiliser une concentration fixe de ribosomes et des concentrations croissantes de
Vp16PDF Jrsquoai donc commenceacute par controcircler le comportement de Vp16PDF en absence de
ribosomes De maniegravere surprenante lrsquoanalyse par Western-blot a alors montreacute que la proteacuteine
seacutedimente malgreacute lrsquoabsence de ribosomes dans lrsquoeacutechantillon de faccedilon proportionnelle agrave la
quantiteacute de proteacuteine testeacutee (Figure II-1) Nous avons constateacute le mecircme comportement avec la
proteacuteine drsquoE coli Ce reacutesultat signifiait que lrsquoexpeacuterience ne pouvait pas ecirctre reacutealiseacutee en preacutesence
drsquoune concentration constante de ribosomes et drsquoune concentration variable de proteacuteine
Vp16PDF
Figure II-1 Seacutedimentation de Vp16PDF en
absence de ribosomes Des concentrations
croissantes de Vp16PDF (de 1 agrave 15 microM) ont eacuteteacute
deacuteposeacutees agrave la surface drsquoune couche de sucrose
puis les eacutechantillons ont eacuteteacute centrifugeacutes Les
culots ont alors eacuteteacute resuspendus puis analyseacutes
par Western-blot suivi drsquoune immunodeacutetection
en utilisant des anticorps anti-Vp16PDF
Chapitre II
92
Pour pouvoir mrsquoaffranchir de la capaciteacute de Vp16PDF agrave seacutedimenter seule jrsquoai donc
modifieacute le protocole en fixant la concentration de Vp16PDF (5 microM) et en augmentant
progressivement la concentration en ribosomes (de 02 microM agrave 2 microM) Dans ces conditions une
fraction constante de proteacuteine seacutedimentera indeacutependamment de la preacutesence de ribosomes (voir
ci-dessus) et lrsquoaugmentation de la quantiteacute de PDF seacutedimenteacutee en preacutesence de ribosomes sera
donc due agrave sa capaciteacute agrave interagir avec les ribosomes et non pas agrave lrsquoaugmentation de la quantiteacute
de deacuteformylase dans le meacutelange reacuteactionnel Comme attendu une leacutegegravere fraction de Vp16PDF
seacutedimente en absence de ribosomes et une quantiteacute plus importante de proteacuteine seacutedimente agrave
mesure que lrsquoon augmente la quantiteacute de ribosomes dans les eacutechantillons (Figure II-2) Ce
reacutesultat indique une interaction PDF70S qui semble speacutecifique et signifie donc que lrsquoabsence
drsquoheacutelice C-terminale chez Vp16PDF nrsquoempecircche pas la proteacuteine de se lier au ribosome
La quantiteacute de Vp16PDF co-seacutedimenteacutee avec les ribosomes peut ecirctre quantifieacutee agrave partir
du reacutesultat de Western-blot (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) permettant de repreacutesenter la quantiteacute
de proteacuteine co-seacutedimenteacutee en fonction de la concentration de ribosomes dans lrsquoeacutechantillon
(Figure II-2B) On remarque qursquoentre 02 microM et 15 microM de ribosome la quantiteacute de Vp16PDF
seacutedimenteacutee reste tregraves faible (bien que supeacuterieure agrave la quantiteacute seacutedimenteacutee en absence de
ribosomes voir Figure II-2A) alors que lorsque la concentration en ribosomes atteint 2 microM on
observe une forte augmentation de la seacutedimentation de Vp16PDF (FigureII-2) Lrsquoaffiniteacute
apparente est donc supeacuterieure ou eacutegale agrave 1-2 microM ce qui paraicirct comparables aux valeurs
mesureacutees pour le complexe EcPDFEc70S 91132 Aucun plateau correspondant agrave la quantiteacute
maximale de proteacuteine qui peut co-seacutedimenter nrsquoa pu ecirctre atteint et pour des raisons techniques
la quantiteacute de ribosomes testeacutee nrsquoa pas pu ecirctre augmenteacutee En effet pour pouvoir ensuite
comparer ces reacutesultats avec ceux obtenus avec des ribosomes ayant une chaine polypeptidique
preacutecise jai utiliseacute les ribosomes drsquoun kit commercial adapteacute pour la preacuteparation des ribosomes
bloqueacutes dont la concentration en ribosome est tregraves faible
Chapitre II
93
A
B
Figure II-2 Interaction de Vp16PDF avec les ribosomes 70S vides drsquoE coli A) Reacutesultat typique montrant
lrsquointeraction Vp16PDF70S qui a eacuteteacute mesureacutee par une expeacuterience de co-seacutedimentation sur couche de 20
sucrose et analyseacutee par gel SDS-PAGE 15 suivi drsquoun Western-blot en utilisant des anticorps anti-Vp16PDF
B) Quantification du signal de fluorescence et normalisation en quantiteacute seacutedimenteacutee de Vp16PDF () en
fonction de la concentration en ribosome (microM) La quantification provient de gels drsquoanalyses ou lrsquoon compare
sur le mecircme gel la seacutedimentation de Vp16PDF en preacutesence de ribosome posseacutedant plusieurs longueurs de
chaicircne peptidique Crsquoest la raison pour laquelle le point agrave 15 microM preacutesent sur la figure A (qui repreacutesente une
gamme de concentration de ribosome la plus large possible) ne figure pas sur la figure B
B ndash Lrsquoabsence de lrsquoheacutelice C-terminale chez Vp16PDF semble conduire agrave une
localisation au ribosome diffeacuterente de celle observeacutee avec EcPDF
Apregraves avoir montreacute que Vp16PDF interagit avec des ribosomes bacteacuteriens vides jrsquoai
chercheacute agrave savoir quelles proteacuteines ribosomales sont impliqueacutees dans lrsquointeraction Jrsquoai pour cela
proceacutedeacute agrave deux types drsquoapproches des expeacuteriences de pontage chimique coupleacutees agrave des
analyses par Western-blot et spectromeacutetrie de masse ainsi que des expeacuteriences de cristallisation
visant agrave deacuteterminer la structure du complexe Vp16PDFribosome par cristallographie des rayons
X
Chapitre II
94
B1 - Vp16PDF semble preacutesenter trois sites de fixation au ribosome
Le cross-linking ou pontage chimique est une technique qui utilise un agent pontant (ou
cross-linker) permettant de lier de maniegravere covalente deux partenaires par exemple des
proteacuteines impliqueacutes dans un complexe stable Le complexe proteacuteine-proteacuteine ainsi formeacute peut
alors ecirctre eacutetudieacute par diffeacuterentes approches dont la spectromeacutetrie de masse Dans le cadre de
lrsquoeacutetude des interactions PDFribosome cette technique a permis agrave Bingel-Erlenmeyer et al de
reacuteveacuteler une proximiteacute spatiale entre la PDF drsquoE coli et la proteacuteine ribosomale bL17 situeacutee agrave
proximiteacute de lrsquoextreacutemiteacute du tunnel de sortie 91 Jrsquoai voulu reproduire cette expeacuterience et
appliquer le protocole pour eacutetudier la formation du complexe Vp16PDFribosome
Afin de pouvoir comparer aiseacutement les reacutesultats obtenus avec EcPDF 91 jrsquoai choisi
drsquoutiliser comme deacutecrit lrsquoEDC (ou 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide
hydrochloride) comme agent pontant Cette moleacutecule possegravede deux extreacutemiteacutes reacuteactives Lrsquoune
reacuteagit avec le groupement carboxylate drsquoun aspartate ou glutamate pour produire un composeacute
agrave fonction amine reacuteactive mais qui est instable et donc sujet agrave lrsquohydrolyse Lrsquoautre extreacutemiteacute si
elle reacuteagit rapidement avec lrsquoamine primaire drsquoune lysine forme alors une liaison amide avec
lrsquoEDC LrsquoEDC a la particulariteacute drsquoecirctre un agent pontant de longueur nulle crsquoest-agrave-dire qursquoil
peut lier un aspartate ou glutamate avec une lysine qui sont tregraves proches spatialement Drsquoautre
part agrave lrsquoissue de la reacuteaction de pontage lrsquoEDC nrsquoexiste plus les deux chaicircnes lateacuterales eacutetant
lieacutees covalemment lrsquoune agrave lrsquoautre par une liaison amide Cela geacutenegravere donc des complexes
proteacuteiques dont la masse moleacuteculaire est la simple addition de la masse des proteacuteines lieacutees
moins une moleacutecule drsquoeau perdue lors de la formation de cette liaison amide
A lrsquoissue de la reacuteaction de pontage chimique une eacutetape drsquoultracentrifugation permet la
seacutedimentation des ribosomes seuls ou complexeacutes avec Vp16PDF ce qui permet drsquoeacuteliminer les
contaminants de faibles poids moleacuteculaires se trouvant dans le surnageant Une digestion agrave la
RNAse permet ensuite de deacutegrader lrsquoARN et de dissocier lrsquoensemble des ribosomes en
proteacuteines seules ou complexes covalents proteacuteine-proteacuteine Drsquoautre part nous avons utiliseacute dans
cette expeacuterience une proteacuteine Vp16PDF qui possegravede une eacutetiquette Strep-tag inseacutereacutee agrave son
extreacutemiteacute N-terminale ou une eacutetiquette 6xHis en C-terminal permettant une eacutetape de
purification partielle de la proteacuteine contenue dans le meacutelange reacuteactionnel Ainsi lrsquoeacutechantillon
final analyseacute ne contient en theacuteorie que la proteacuteine Vp16PDF (eacuteventuellement en complexe avec
elle-mecircme) en complexe covalent avec un ou plusieurs partenaires proteacuteiques ribosomaux le
cas eacutecheacuteant Les proteacuteines contenues dans lrsquoeacutechantillon sont seacutepareacutees par eacutelectrophoregravese sur gel
de polyacrylamide en conditions deacutenaturantes suivie par un transfert sur membrane et une
Chapitre II
95
immunodeacutetection en utilisant les anticorps anti-Vp16PDF Lrsquoexpeacuterience a eacutegalement eacuteteacute
reacutealiseacutee avec EcPDF
En preacutesence de ribosomes mais en absence drsquoEDC (Figure II-3 A et B) une bande
correspondant agrave EcPDF ou Vp16PDF est observeacutee confirmant la co-seacutedimentation de chacune
des deux proteacuteines avec les ribosomes En ajoutant de lrsquoEDC aux mecircmes eacutechantillons des
bandes de plus hauts poids moleacuteculaires apparaissent (Figure II-3A et B) que lrsquoon ne retrouve
pas lorsque lrsquoEDC est ajouteacute agrave de la PDF seule (Figure II-3-A et B) Cela indique la formation
de complexes impliquant lrsquoune ou lrsquoautre des deux PDFs ce qui suggegravere comme publieacute
preacuteceacutedemment 91 la formation de complexes covalents entre les PDFs et des proteacuteines
ribosomales
A B
Figure II-3 Analyse des produits de cross-linking entre la PDF et le ribosome 70S A) Analyse du produit de cross-
linking entre Strep-EcPDF et les ribosomes 70S migreacute sur gel SDS-PAGE 12 puis Western-blot avec anticorps anti-
EcPDF B) Analyse du produit de cross-linking entre His-Vp16PDF et les ribosomes 70S (panneau de gauche) et entre
Strep-Vp16PDF et les ribosomes 70S (panneau de droite) migreacute sur gel SDS-PAGE 14 puis Western-blot avec anticorps
anti-Vp16PDF Les asteacuterisques repreacutesentent les bandes proteacuteiques contenant la PDF drsquointeacuterecirct lieacutee agrave drsquoautre(s) proteacuteine(s)
Lrsquoeacutetiquette Strep se trouve en N-terminal et lrsquoeacutetiquette His en C-terminal
Une analyse des bandes de plus haut poids moleacuteculaire par spectromeacutetrie de masse a
effectivement reacuteveacuteleacute la preacutesence de proteacuteines ribosomales au sein de ces bandes de hauts poids
moleacuteculaires (Figure 4A et B) La proteacuteine bL17 a eacuteteacute identifieacutee dans les eacutechantillons obtenus
avec EcPDF confirmant les donneacutees de la litteacuterature 91 Les proteacuteines bL17 bL19 uL23 uL24
bL25 et bL32 ont eacuteteacute identifieacutees dans les eacutechantillons obtenus avec His-Vp16PDF (Figure II-
4A) et les proteacuteines uL22 uL23 uL24 bL25 uL29 uL30 bL31 et bL32 ont eacuteteacute identifieacutees
pour les eacutechantillons obtenus avec Strep-Vp16PDF (Figure II-4B)Ces proteacuteines sont toutes
pour la plupart situeacutees dans la reacutegion de lrsquoextreacutemiteacute du tunnel de sortie (Figure II-4C) ce qui
est coheacuterent avec ce que lrsquoon attend du mode de fixation de Vp16PDF sur le ribosome De plus
ces reacutesultats semble indiquer que nous aurions identifieacute un site de fixation de Vp16PDF
Chapitre II
96
commun avec EcPDF situeacute agrave proximiteacute du tunnel de sortie du peptide et impliquant la proteacuteine
bL17 mais eacutegalement deux autres sites potentiels de fixation de Vp16PDF eacutegalement situeacutes au
voisinage du tunnel de sortie (Figure II-4C)
A
B
C
Figure II-4 Analyse des produits de cross-linking entre Vp16PDF et les ribosomes 70S par spectromeacutetrie
de masse (NanoLC-MS LTQ-Orbitrap) A) Analyse du produit de cross-linking entre His-Vp16PDF et les
ribosomes 70S Le gel SDS-PAGE 14 est coloreacute au Sypro ruby (panneau de gauche)Les donneacutees de
spectromeacutetrie de masse sur les eacutechantillons du gel SDS-PAGE sont normaliseacutees (en bleu les proteacuteines retrouveacutees
dans le controcircle en rouge les proteacuteines retrouveacutees dans lrsquoeacutechantillon contenant Vp16PDF) B) Analyse du
produit de cross-linking entre Strep-Vp16PDF et les ribosomes 70S Le gel SDS-PAGE 14 est coloreacute au Sypro
ruby (panneau de gauche)Les donneacutees de spectromeacutetrie de masse sur les eacutechantillons du gel SDS-PAGE sont
normaliseacutees (en bleu les proteacuteines retrouveacutees dans le controcircle en rouge les proteacuteines retrouveacutees dans
lrsquoeacutechantillon contenant Vp16-PDF) Lrsquoeacutetiquette Strep se trouve en N-terminal et lrsquoeacutetiquette His en C-terminal
C) Repreacutesentation des sites putatifs de fixation de Vp16PDF et EcPDF au ribosome deacutetermineacutes par
spectromeacutetrie de masse Les cercles rouges repreacutesentent les sites de fixation identifieacutes pour Vp16PDF et le cercle
bleu pour EcPDF Lrsquoeacutetoile blanche indique la position de la sortie du tunnel du peptide
Chapitre II
97
B2 ndash Vers la structure cristalline drsquoun complexe Vp16PDF
ribosome
La reacutesolution de la structure tridimensionnelle de complexes PDFribosome par la
technique de cristallographie des rayons X permettrait drsquoidentifier et deacutecrire les interactions
entre les ribosomes et les PDFs agrave un niveau atomique Pour cela il est neacutecessaire de produire
des cristaux de complexe ribosomePDF Plutocirct que de chercher de nouvelles conditions de
cristallisation des ribosomes en complexe avec la PDF approche qui srsquoaveacuterait particuliegraverement
ardue nous avons choisi de partir de conditions de cristallisation de ribosomes bacteacuteriens
connues et largement utiliseacutees par diffeacuterents laboratoires Dans le cadre drsquoune collaboration
avec lrsquoeacutequipe de Marat Yusupov (IGBMC Strasbourg) nous avons donc choisi de travailler agrave
partir de conditions de cristallisation des ribosomes 70S de Thermus thermophilus qui ont
permis de reacutesoudre de nombreuses structures Jrsquoai donc purifieacute au laboratoire des ribosomes de
T thermophilus (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) et jrsquoai ensuite suivi deux approches la co-
cristallisation et le trempage La co-cristallisation consiste agrave former un complexe ribosomePDF
en solution puis ensuite agrave cristalliser ce complexe Avec cette approche des modifications du
protocole de cristallisation peuvent possiblement ecirctre neacutecessaires par rapport au protocole
utiliseacute pour la cristallisation des ribosomes seuls En effet le macrocomplexe ribosomePDF
eacutetant diffeacuterent du ribosome seul les paramegravetres permettant la cristallisation ainsi que
lrsquoagencement des moleacutecules au sein du cristal peuvent ecirctre diffeacuterents La technique de trempage
quant agrave elle consiste agrave former des cristaux de ribosomes seuls puis agrave ajouter la proteacuteine PDF
dans la goutte de cristallisation contenant les cristaux de ribosomes stables La PDF peut alors
peacuteneacutetrer dans les cristaux pour aller se fixer agrave son ou ses site(s) de liaison Cette approche
suppose que les canaux de solvant preacutesents dans les cristaux de ribosomes vides sont
suffisamment larges pour que la PDF puisse y diffuser De plus le ou les site(s) de fixation de
la PDF sur le ribosome doivent ecirctre accessibles crsquoest-agrave-dire non impliqueacutes dans des contacts
cristallins Nous avons donc analyseacute lrsquoempilement cristallin des cristaux de ribosomes 70S de
T thermophilus obtenus agrave partir des conditions de cristallisation que nous avons choisi drsquoutiliser
18239 Cela nous a montreacute que la zone situeacutee autour de lrsquoextreacutemiteacute du tunnel de sortie nrsquoest pas
impliqueacutee dans des contacts ce qui signifie qursquoelle est accessible agrave Vp16PDF
Les cristaux ont eacuteteacute produits agrave 24degC par la technique de diffusion de phase-vapeur en
gouttes assises avec une solution de cristallisation qui contient un meacutelange de deux PEG agrave
concentrations eacutegales du thiocyanate de potassium ainsi qursquoun tampon Tris 18239 (voir
Mateacuteriels et Meacutethodes) Par rapport agrave une purification de reacutefeacuterence donnant de nombreux beaux
Chapitre II
98
cristaux (ribosomes purifieacutes donneacutes par M Yusupov) la preacuteparation de ribosomes que jrsquoai
obtenue a permis lrsquoobtention de cristaux de ribosomes seuls preacutesentant sensiblement les critegraveres
attendus notamment en terme drsquoaspect et de taille (figure II-5A) Jrsquoai donc proceacutedeacute agrave des
expeacuteriences de co-cristallisation et trempage avec Vp16PDF mais eacutegalement les proteacuteines PDF
et MetAP drsquoE coli (EcPDF et EcMetAP) La co-cristallisation a produit des cristaux de taille
et drsquoaspect attendus (Figure II-5B) Cependant rien nrsquoindique la preacutesence de lrsquoune ou lrsquoautre
des proteacuteines au sein des cristaux Les expeacuteriences de trempage ont quant agrave elle donneacute des
cristaux dont lrsquoaspect nrsquoest pas alteacutereacute (Figure II-5C) indiquant soit la fixation de la proteacuteine sur
les moleacutecules de ribosomes cristalliseacutes sans affecter lrsquoempilement cristallin soit qursquoaucune
proteacuteine nrsquoest rentreacutee dans les cristaux
A
B
C
Figure II-5 Cristaux de ribosomes de T thermophilus A Cristaux de ribosomes seuls obtenus dans des
conditions de cristallisation connues 18239 B Cristaux obtenus par co-cristallisation avec un eacutechantillon
contenant des ribosomes et EcPDF (gauche) ou EcMetAP (milieu) ou Vp16PDF (droite) C Cristaux de
ribosomes apregraves trempage avec EcMetAP
Jrsquoai ensuite testeacute la diffraction des diffeacuterents types de ribosomes obtenus au synchrotron
SOLEIL (Gif-sur-Yvette) Jrsquoai pour cela proceacutedeacute agrave une eacutetape preacutealable de cryoprotection des
cristaux (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) selon le protocole utiliseacute par lrsquoeacutequipe de M Yusupov 239
Malheureusement les cristaux ont eacuteteacute fortement alteacutereacutes par ce traitement allant mecircme jusqursquoagrave
leur dissolution complegravete Jrsquoai malgreacute tout pu tester la diffraction des rayons X des cristaux qui
restaient et qui ne semblaient pas endommageacutes Les meilleurs cristaux ont diffracteacute jusqursquoagrave 10
Chapitre II
99
agrave 15Aring de reacutesolution ce qui est tregraves loin des 3Aring attendus 239 Etant donneacute la qualiteacute visuelle des
cristaux avant le protocole de cryoprotection nous avons alors supposeacute que crsquoeacutetait cette eacutetape
critique qui avait fortement alteacutereacute les cristaux Dans le but de tester cette hypothegravese nous avons
confieacute une de nos preacuteparations de ribosomes agrave Axel Innis (IECB Bordeaux) Dans ses mains
les ribosomes que nous avons produits ont donneacute des cristaux qui ont diffracteacute jusqursquoagrave 35Aring de
reacutesolution Crsquoest pourquoi afin drsquoaugmenter nos chances de reacutesoudre des structures de
complexes ribosome-proteacuteine de la NME nous avons deacutecideacute drsquoentamer une collaboration avec
lui en lui confiant leacutetude des interactions PDFribosome par cristallographie des rayons X
C ndash Rocircle de lrsquoheacutelice des PDFs de type 1B et des reacutesidus V135T136I137 C-terminaux
de Vp16PDF dans la formation du complexe PDF ribosome
Ayant montreacute que Vp16PDF est capable drsquointeragir avec le ribosome malgreacute lrsquoabsence
de lrsquoheacutelice supposeacutee meacutedier lrsquointeraction jrsquoai par la suite chercheacute agrave mieux comprendre le rocircle
joueacute par lrsquoextreacutemiteacute C-terminale des PDFs de type 1B dans la formation du complexe
PDFribosome Nous avons donc deacutecideacute de construire des proteacuteines chimeacuteriques agrave savoir une
PDF de bacteacuteriophage Vp16T agrave laquelle on ajoute une reacutegion C-terminale heacutelicale mimant une
PDF de type 1B classique et inversement une PDF drsquoE coli deacutepourvue de son extreacutemiteacute C-
terminale mimant Vp16PDF Jrsquoai alors testeacute lrsquoeffet des modifications apporteacutees agrave chacune des
deux PDFs par un test de compleacutementation fonctionnelle agrave 42degC identique agrave celui reacutealiseacute au
chapitre I Dans ce test les gegravenes codant les diffeacuterentes constructions chimeacuteriques sont inseacutereacutes
dans un plasmide pBAD inductible agrave lrsquoarabinose lequel est utiliseacute pour transformer la souche
PAL421Tr drsquoE coli dont le gegravene chromosomique codant la PDF endogegravene a eacuteteacute inactiveacute (voir
section B du Chapitre I et Mateacuteriels et Meacutethodes) Les bacteacuteries posseacutedant le plasmide codant
la proteacuteine drsquointeacuterecirct sont deacuteposeacutees sur milieu geacuteloseacute suppleacutementeacute en arabinose et incubeacutees agrave
42degC Dans ces conditions la deacuteformylase endogegravene nrsquoest pas exprimeacutee seule la proteacuteine
drsquointeacuterecirct est induite
Chapitre II
100
Dans un premier temps nous avons simplement souhaiteacute ajouter agrave Vp16PDF les deux
heacutelices C-terminales drsquoEcPDF (3 et 3) (Figure II-6 et II-7) Or le dernier reacutesidu de Vp16PDF
(I137) correspondant au premier reacutesidu de lrsquoheacutelice 310 3 drsquoEcPDF (F143) et voulant ecirctre sucircrs
que cette reacutegion se replierait bien sous forme drsquoune heacutelice 310 nous avons choisi de conserver
la seacutequence situeacutee en amont de cette heacutelice et avons donc substitueacute les trois derniers reacutesidus de
Vp16PDF par les trois reacutesidus eacutequivalents dans EcPDF soit le motif V135T136I137 muteacute par le
motif K135L136F137 Cette chimegravere appeleacutee Vp16PDF(KLF)heacutelice possegravede donc la seacutequence
correspondant aux deux heacutelices C-terminales complegravetes drsquoEcPDF mais ne contient pas la
seacutequence totale de Vp16PDF (Figure II-7A et B) De maniegravere surprenante cette chimegravere srsquoest
aveacutereacutee incapable de compleacutementer la souche E coli def conditionnelle dans des conditions non
permissives (Figure II-9A) Les controcircles eacutetant conformes aux reacutesultats attendus agrave savoir la
proteacuteine Vp16PDF sauvage qui compleacutemente agrave un niveau comparable agrave celui obtenu avec
EcPDF (Figure II-9A) ce reacutesultat suggeacuterait que cette chimegravere preacutesentait une capaciteacute de
deacuteformylation fortement diminueacutee in vivo
Nous avons donc deacutecideacute de construire une deuxiegraveme chimegravere ougrave nous avons cette fois
conserveacute les trois derniers reacutesidus VTI de Vp16PDF et ajouteacute la seacutequence C-terminale drsquoEcPDF
en respectant exactement lrsquoalignement de seacutequences (Figure II-6 et II-7A et B) Cette chimegravere
appeleacutee Vp16PDF(VTI)heacutelice possegravede alors la seacutequence complegravete de Vp16PDF additionneacutee en
C-terminal de la seacutequence drsquoEcPDF allant du reacutesidu M144 (situeacute au milieu de lrsquoheacutelice 3) au
Figure II-6 Alignement de seacutequences de plusieurs PDFs appartenant aux diffeacuterents types Les PDFs 1B sont
repreacutesenteacutees par celle du phage VP16T de V parahaemolyticus (Vp16PDF1B) drsquoE coli (EcPDF) de A thaliana
(AtPDF1B) et du phage S-SSM7 (S-SSM7PDF1B) Les PDFs du type 1A sont repreacutesenteacutees par celle drsquoA thaliana
(AtPDF1A) et de H sapiens (HsPDF1A) Les PDFs de type 2 sont repreacutesenteacutees par celles de B stearothermophilus
(BstPDF2) et S aureus (SaPDF2)
Vp16PDF
Chapitre II
101
reacutesidu terminal A169 Les expeacuteriences ont montreacute que cette chimegravere permettait la
compleacutementation de la souche PAL421Tr (Figure II-9A) ce qui signifiait que cette chimegravere
eacutetait capable comme Vp16PDF ou EcPDF sauvages de deacuteformyler des proteacuteines in vivo
Les reacutesultats totalement opposeacutes obtenus avec ces deux chimegraveres nous ont conduits agrave
regarder plus attentivement la seacutequence dans la reacutegion situeacutee autour de lrsquoheacutelice 3 drsquoEcPDF
En alignant plusieurs seacutequences et conformeacutement agrave ce que nous avions deacutejagrave noteacute au Chapitre I
(voir Figure I-1 et section A1) nous avons remarqueacute que les reacutesidus terminaux Thr et Ile de
Vp16PDF sont plutocirct inhabituels et qursquoils correspondent tregraves geacuteneacuteralement agrave des reacutesidus Leu
ou Met et Phe ou Tyr respectivement (Figure II-6)
Nous avons alors construit une derniegravere chimegravere appeleacutee Vp16PDF(VTF)heacutelice dans
laquelle nous avons remplaceacute le dernier reacutesidu I137 de Vp16PDF par la seacutequence C-terminale
drsquoEcPDF agrave partir du reacutesidu F143 (Figure II-7A et B) Cette chimegravere srsquoest montreacutee incapable de
deacuteformyler des proteacuteines in vivo (Figure II-9A) La seule diffeacuterence entre cette chimegravere et la
preacuteceacutedente qui est active (Vp16PDF(VTI)heacutelice) eacutetant le reacutesidu I137 de Vp16PDF substitueacute par
une Phe ce reacutesultat a mis en eacutevidence le rocircle crucial de ce reacutesidu I137 Cependant les tests
drsquoactiviteacute in vitro sur extraits bruts ainsi que les tests de compleacutementation in vivo ne nous
A B
Figure II-7 Structure du domaine C-terminal des versions chimeacuteriques de Vp16PDF A) Proteacuteines
chimeacuteriques destineacutees agrave lrsquoeacutetude de lrsquoimpact de lrsquoheacutelice α C-ter des PDF1B sur les proprieacuteteacutes de la proteacuteine
Vp16PDF La numeacuterotation des acides amineacutes correspond agrave la seacutequence drsquoEcPDF B) Zoom sur la superposition
des structures drsquoEcPDF et Vp16PDF au niveau du C-terminal En bleu structure du C-ter de Vp16PDF et les
reacutesidus C-terminaux associeacutes En marron structure du C-ter drsquoEcPDF et les reacutesidus C-terminaux associeacutes Les
trois structures preacutesentes agrave la droite correspondent aux C-ter des trois proteacuteines chimegraveres deacutecrites Les rectangles
correspondent aux trois reacutesidus de jonction entre la seacutequence de Vp16PDF et la seacutequence C-ter drsquoEcPDF
Chapitre II
102
permettent pas de deacuteterminer si ce reacutesidu est impliqueacute dans lrsquointeraction de lrsquoenzyme avec le
ribosome etou dans lrsquoactiviteacute catalytique Des tests drsquoactiviteacute sur les proteacuteines purifieacutees
permettraient drsquoeacutetablir les constantes catalytiques des diffeacuterentes chimegraveres et ainsi deacuteterminer
si le reacutesidu I137 possegravede un rocircle dans la catalyse enzymatique Des seacutedimentations en preacutesence
de ribosome deacutetermineront si ce reacutesidu est impliqueacute dans lrsquoaffiniteacute de lrsquoenzyme avec le
ribosome
En parallegravele des constructions de proteacuteines mutantes drsquoEcPDF ont eacutegalement eacuteteacute
reacutealiseacutees afin de mimer la structure de Vp16PDF Les reacutesultats preacuteceacutedents ayant mis en eacutevidence
un rocircle important des reacutesidus VTI chez Vp16PDF nous avons donc deacutecideacute dans un premier
temps drsquoobserver lrsquoinfluence de ces reacutesidus chez lrsquoenzyme EcPDF Ainsi nous avons construit
un mutant drsquoEcPDF au niveau du reacutesidu F143 substitueacute par le reacutesidu I137 de Vp16PDF appeleacute
EcPDF(KLI) Un second mutant a eacutegalement eacuteteacute construit en remplaccedilant les reacutesidus
K141L142F143 drsquoEcPDF par les reacutesidus V135T136I137 de Vp16PDF appeleacute EcPDF(VTI) (Figure II-
8) Ces deux mutants permettront de deacuteterminer lrsquoinfluence de ces reacutesidus dans lrsquoactiviteacute
catalytique etou lrsquointeraction avec le ribosome Dans un second temps nous avons choisi
drsquoeacutetudier la forme courte drsquoEcPDF pour deacuteterminer lrsquoinfluence de lrsquoheacutelice α dans lrsquointeraction
de lrsquoenzyme avec le ribosome
Figure II-8 Proteacuteines EcPDF mutantes destineacutees agrave lrsquoeacutetude du rocircle de lrsquoheacutelice α C-ter La numeacuterotation
des acides amineacutes est baseacutee sur la seacutequence drsquoEcPDF
Chapitre II
103
La construction de la forme courte drsquoEcPDF deacutepourvue de son extreacutemiteacute C-terminale
a reposeacute sur des donneacutees biochimiques reliant lrsquoactiviteacute de lrsquoenzyme agrave la longueur de lrsquoextreacutemiteacute
C-terminale 92 Si la deacuteleacutetion se fait apregraves le reacutesidu 145 (Figure II-8) la proteacuteine conserve 100
de son activiteacute alors que si lrsquoon tronque la proteacuteine apregraves le reacutesidu 143 lrsquoactiviteacute mesureacutee nrsquoest
que de 20 Les deacuteleacutetions du domaine C-terminal ont donc eacuteteacute faites apregraves le reacutesidu 143
drsquoEcPDF
Le mutant EcPDF(KLF)ΔC-ter possegravede la seacutequence EcPDFwt mais avec une deacuteleacutetion
du C-terminal agrave partir du reacutesidu 144 Le mutant EcPDF(KLI)ΔC-ter possegravede la seacutequence du
mutant EcPDF(KLI) (variant 1 agrave 143) mais avec deacuteleacutetion du domaine C-ter agrave partir du reacutesidu
144 Le mutant EcPDF(VTI)ΔC-ter possegravede la seacutequence du mutant EcPDF(VTI) mais avec
deacuteleacutetion du domaine C-ter agrave partir du reacutesidu 144 (Figure II-8) Ainsi ces mutants vont permettre
de comprendre le rocircle que peut avoir lrsquoheacutelice α dans lrsquoaffiniteacute et la localisation des proteacuteines au
ribosome ainsi que la fonction des reacutesidus V135T136I137 C-terminaux de Vp16PDF
Lrsquoexpeacuterience de compleacutementation fonctionnelle a eacuteteacute reacutealiseacutee avec les mutants drsquoEcPDF
chez qui jrsquoai testeacute les diffeacuterentes deacuteleacutetions de lrsquoextreacutemiteacute C-terminale deacutecrites ci-dessus (Figure
II-9B) De maniegravere surprenante lrsquoensemble des constructions srsquoest aveacutereacute capable de
compleacutementer la souche PAL421Tr ce qui signifie que la deacuteleacutetion des heacutelices C-terminales
drsquoEcPDF nrsquoaffecte pas la capaciteacute de deacuteformylation de lrsquoenzyme (Figure II-9B) De mecircme la
substitution des reacutesidus KLF par KLI et VTI qursquoils soient avant lrsquoheacutelice α C-terminale (dans
les constructions EcPDF(KLI) et EcPDF(VTI)) ou directement en C-terminal
(EcPDF(KLI)ΔC-ter et EcPDF(VTI)ΔC-ter) ne diminue pas la capaciteacute des cellules agrave
compleacutementer la PDF endogegravene (Figure II-9B) Les constructions eacutetant fonctionnelles nous
pouvons supposer que les proteacuteines sont solubles et correctement exprimeacutees Elles seront donc
purifieacutees et pourront servir drsquooutil pour observer lrsquointeraction et la localisation au ribosome des
PDFs mutantes Nous deacuteterminerons ainsi si lrsquoabsence de lrsquoheacutelice α C-terminale modifie la
capaciteacute drsquointeraction de lrsquoenzyme et le rocircle que peuvent avoir les reacutesidus VTI (preacutesents en C-
terminal de Vp16PDF) dans ces interactions
Chapitre II
104
Figure II-9 Deacuteformylation in vivo des versions chimegraveres de la proteacuteine Vp16PDF (ajout drsquoheacutelice α en C-
terminal) et des versions mutantes de la proteacuteine EcPDF (suppression de lrsquoheacutelice α en C-terminal) par un
test de compleacutementation fonctionnelle Des gouttes de dilutions successives de 10 en 10 preacuteleveacutees sur une culture
liquide pousseacutee une nuit agrave 30degC sont deacuteposeacutees sur milieu geacuteloseacute Les bacteacuteries de la souche PAL421Tr contiennent
le plasmide pMAK portant le gegravene codant EcPDF wt et sont transformeacutees avec un plasmide pBAD vide ou portant
les gegravenes codant pour les proteacuteines chimegraveres et mutantes A) Test de compleacutementation fonctionnelle reacutealiseacute sur les
proteacuteines Vp16PDF chimegraveres Les boicirctes contenant 05 de glucose sont incubeacutees une nuit agrave 30degC Les boicirctes
contenant de lrsquoarabinose sont incubeacutees une nuit agrave 42degC B) Test de compleacutementation fonctionnelle reacutealiseacute sur les
proteacuteines EcPDF mutantes Les boicirctes contenant 05 de glucose et celles contenant lrsquoarabinose sont incubeacutees une
nuit agrave 30degC Le milieu geacuteloseacute contient toujours 50microgmL drsquoampicilline
Afin de deacuteterminer si le deacutefaut de deacuteformylation observeacute in vivo avec la chimegravere
Vp16PDF(KLF)heacutelice pouvait avoir un lien avec une perte dactiviteacute enzymatique jai voulu
tester lactiviteacute deacuteformylase in vitro de cette chimegravere agrave comparer agrave celle des autres chimegraveres
qui elles compleacutementent Jrsquoai donc produit les diffeacuterentes chimegraveres en suivant le protocole
utiliseacute pour lrsquoexpression de la proteacuteine sauvage et sa purification sous forme active Des
aliquotes de cultures bacteacuteriennes ont alors eacuteteacute resuspendus dans un tampon 50 mM MES-KOH
pH40 contenant 80 mM de nickel tampon deacutetermineacute comme permettant le maintien de
lrsquoactiviteacute deacuteformylase de Vp16PDF (voir chapitre I) Il est agrave noter que les mutants drsquoEcPDF
eacutetant fonctionnels in vivo (Figure II-9B) je nrsquoai pas testeacute leur activiteacute in vitro
Chapitre II
105
Le niveau drsquoexpression et la solubiliteacute des chimegraveres se sont aveacutereacutes comparables si ce
nrsquoest supeacuterieur agrave ceux obtenus pour Vp16PDF sauvage (Figure II-10) et jrsquoai donc proceacutedeacute agrave
des mesures drsquoactiviteacute enzymatique des diffeacuterentes chimegraveres
Jrsquoai pour cela utiliseacute le test drsquoactiviteacute coupleacute qui mrsquoavait preacutealablement servi agrave
deacuteterminer les constantes cineacutetiques de la proteacuteine sauvage (voir Chapitre I) Avant de purifier
les proteacuteines recombinantes jrsquoai commenceacute par tester lrsquoactiviteacute enzymatique sur les fractions
solubles des aliquotes preacutepareacutes ci-dessus Ces premiers reacutesultats ont montreacute que les trois
chimegraveres ont une activiteacute deacuteformylase in vitro mesurable Neacuteanmoins la chimegravere
Vp16PDF(VTI)heacutelice semble leacutegegraverement plus active que Vp16PDF wt tandis que les chimegraveres
Vp16PDF(KLF)heacutelice et Vp16PDF(VTF) heacutelice ont une activiteacute leacutegegraverement infeacuterieure agrave celle
de Vp16PDF wt (Figure II-11) Ces reacutesultats preacuteliminaires devront ecirctre confirmeacutes en mesurant
preacuteciseacutement lrsquoactiviteacute enzymatique in vitro des proteacuteines purifieacutees (y compris en regardant la
speacutecificiteacute de substrat des diffeacuterentes chimegraveres) mais il apparaicirct deacutejagrave que les variations
drsquoactiviteacute semblent ecirctre correacuteleacutees avec les reacutesultats obtenus par lrsquoapproche de compleacutementation
notamment une baisse drsquoactiviteacute enzymatique associeacutee agrave une compleacutementation moins bonne
(Tableau II-1)
Figure II-10 Test drsquoexpression des proteacuteines Vp16PDF chimeacuteriques Analyse sur gel SDS-PAGE coloreacute au
bleu de Coomassie NI pour non-induit I-ins pour fraction insoluble drsquoeacutechantillon induit I-sol pour fraction
soluble drsquoeacutechantillon induit Les proteacuteines chimegraveres ont eacuteteacute produites selon le mecircme protocole que celui utiliseacute
pour la forme sauvage Les constructions ne possegravedent pas drsquoeacutetiquette
Chapitre II
106
Figure II- 11 Test drsquoactiviteacute deacuteformylase reacutealiseacute sur fractions solubles drsquoextraits bruts exprimant
Vp16PDF ou les proteacuteines chimeacuteriques Les activiteacutes de Vp16PDF Vp16PDF(KLF)heacutelice
Vp16PDF(VTI)heacutelice et Vp16PDF(VTF) heacutelice sont exprimeacutees par microg de proteacuteines totales dans lrsquoextrait brut
soluble
Constructions Compleacutementation fonctionnelle
agrave 42degC Activiteacute in vitro
Vp16PDF +++ +++
Vp16PDF(KLF)heacutelice - +
Vp16PDF(VTI)heacutelice +++ ++++
Vp16PDF(VTF)heacutelice - +
Tableau II-1 Bilan de lrsquoactiviteacute in vivo et in vitro des constructions de Vp16PDF sauvage et des diffeacuterentes
chimegraveres
Lrsquoensemble de ces reacutesultats indique que le simple ajout des heacutelices 310 et α C-terminales
drsquoEcPDF agrave la deacuteformylase de phage ne perturbe en rien son activiteacute En revanche ils mettent
en lumiegravere le rocircle crucial joueacute par le tout dernier reacutesidu Ile137 dans lrsquoactiviteacute de Vp16PDF Il
nrsquoest toutefois pas exclu que cet acide amineacute puisse eacutegalement jouer un rocircle dans la formation
du complexe Vp16PDFribosome ce qursquoil faudra deacuteterminer en testant la capaciteacute des
diffeacuterentes chimegraveres agrave former des complexes avec les ribosomes comme jrsquoai pu le faire avec
Vp16PDF sauvage
Chapitre II
107
D ndash Lrsquoaffiniteacute de Vp16PDF pour le ribosome semble ecirctre influenceacutee par la
longueur du polypeptide naissant
Apregraves avoir montreacute que la PDF drsquoE coli interagit avec des ribosomes vides 91 le groupe
de Bernd Bukau a montreacute que la proteacuteine est eacutegalement capable drsquointeragir avec des ribosomes
en cours de synthegravese plus preacuteciseacutement avec des ribosomes posseacutedant une chaicircne peptidique de
40 acides amineacutes fusionneacutee agrave une seacutequence drsquoarrecirct appeleacutee SecM 94 Toutefois la preacutesence de
cette chaicircne naissante ne modifie pas lrsquoaffiniteacute drsquoEcPDF pour le ribosome (Kd = 18 plusmn 09 microM)
ce qui suggegravere un rocircle passif du polypeptide naissant dans la formation du complexe
PDFribosome 9194 Cependant les expeacuteriences nrsquoayant eacuteteacute meneacutees qursquoavec une seule longueur
de polypeptide il serait neacutecessaire de tester drsquoautres longueurs de chaicircnes afin de deacuteterminer
clairement son rocircle
Au cours de ma thegravese jrsquoai montreacute que Vp16PDF semble avoir un comportement
diffeacuterent drsquoEcPDF vis-agrave-vis de lrsquointeraction avec le ribosome (voir parties preacuteceacutedentes) Nous
nous sommes donc demandeacute quelle pouvait ecirctre lrsquoinfluence de la chaicircne peptidique dans la
formation du complexe Vp16PDFribosome Pour cela jrsquoai produit des ribosomes bloqueacutes en
cours de traduction et regardeacute lrsquointeraction avec Vp16PDF
Les ribosomes bloqueacutes (ou RNC pour laquo ribosome nascent chain raquo) ont eacuteteacute produits en
utilisant comme matrice de deacutepart un ADN contenant une seacutequence particuliegravere en C-terminal
appeleacutee seacutequence drsquoarrecirct SecM permettant de bloquer le ribosome en cours de synthegravese Chez
E coli cette seacutequence fait naturellement partie drsquoun opeacuteron secM-secA et permet de reacuteguler
lrsquoexpression de la proteacuteine SecA via la proteacuteine SecM en reacuteponse au statut de la cellule 240
Dans des conditions cellulaires normales la seacutequence Shine-Dalgarno situeacutee en amont du gegravene
secA est masqueacutee dans une structure tige-boucle formeacutee par lrsquoARNm rendant impossible la
fixation directe de ribosomes sur cette seacutequence conduisant agrave la reacutepression de lrsquoexpression de
SecA (Figure II-12A) Il a eacuteteacute montreacute que lorsque le ribosome traduit lrsquoARNm de lrsquoopeacuteron
secM-secA il marque une pause en 3rsquo de la seacutequence codante de secM permettant la
deacutestructuration de la tige-boucle deacutemasquant ainsi la seacutequence Shine-Dalgarno ce qui permet
la traduction de la seacutequence codante de secA situeacutee en aval Ce processus conduit agrave un faible
niveau basal de proteacuteine SecA dans la cellule La reprise de la traduction de la seacutequence codante
de secM est induite par la prise en charge de lrsquoextreacutemiteacute N-terminale de la proteacuteine SecM en
cours de synthegravese par une particule SRP qui adresse le complexe ribosomeARNmSecM vers
la membrane plasmique (Figure II-12A) SecM peut alors traverser la membrane plasmique
gracircce au translocon SecYEG qui fonctionne de concert avec la proteacuteine SecA (Figure II-12A)
Chapitre II
108
par ce biais la proteacuteine SecA est syntheacutetiseacutee directement agrave proximiteacute de la membrane
plasmique ougrave elle exercera son rocircle Le ribosome se dissocie et la structure tige-boucle se
reforme (Figure II-12A) Dans des cas de deacuteficience en proteacuteines de seacutecreacutetion la pause du
ribosome se prolonge ce qui conduit agrave la surproduction de la proteacuteine SecA (Figure II-12B)
Figure II-12 Principe de fonctionnement de lrsquoopeacuteron secM-secA A) Reacutegulation de lrsquoexpression de SecA
en conditions normales Lrsquoopeacuteron contient la seacutequence codante de SecM suivi de la seacutequence codante de SecA
Les deux seacutequences sont seacutepareacutees par une structure tige-boucle de lrsquoARNm qui rend inaccessible la seacutequence
Shine-Dalgarno (SD) qui preacutecegravede le gegravene secA Une seacutequence drsquoarrecirct particuliegravere bloque le ribosome agrave la fin de
la seacutequence secM Cela permet de deacutestabiliser la structure tige-boucle de lrsquoARNm et permet ainsi agrave drsquoautres
ribosomes de venir traduire la seacutequence secA en se fixant directement agrave la seacutequence SD ainsi deacutemasqueacutee Lors
de la traduction de secM le complexe ribosomeARNmSecM est adresseacute agrave la membrane par une particule SRP
et le peptide naissant est pris en charge par le complexe SecA-SecYEG Lrsquointeraction avec ces autres facteurs
legraveve la pause du ribosome aboutissant agrave la terminaison de la traduction du gegravene secM suivi de la dissociation
du ribosome B) Reacutegulation SecM-deacutependante de lrsquoexpression de SecA dans des conditions deacuteficientes en
proteacuteines de la vie de seacutecreacutetion La pause au niveau de la seacutequence drsquoarrecirct dure plus longtemps permettant
drsquoaugmenter la quantiteacute de proteacuteine SecA syntheacutetiseacutee Figure reacutealiseacutee drsquoapregraves Nakatogawa et Ito 2004 240
Il a eacuteteacute montreacute que la pause du ribosome pendant la traduction de secM est induite par
une seacutequence proteacuteique de 17 acides amineacutes (F150XXXXWIXXXXGIRAGP166 Figure II-13A)
situeacutee dans la reacutegion C-terminale de la proteacuteine 241 Lorsque ce motif dit laquo seacutequence drsquoarrecirct raquo
traverse le tunnel de sortie du ribosome il est capable drsquoadopter une conformation compacte et
drsquointeragir avec les composants du tunnel de sortie au niveau drsquoune reacutegion appeleacutee point de
constriction (Figure i3 et II-13B) 23 Des interactions speacutecifiques avec les proteacuteines ribosomales
uL4 et uL22 ainsi que lrsquoARN 23S (Figure II-13B) modifient la conformation globale du
ribosome 25 qui fait alors une pause pendant la traduction Bien que des expeacuteriences biochimiques
Chapitre II
109
et des donneacutees de cryo-microscopie eacutelectronique aient conduit agrave lidentification de certains reacutesidus
impliqueacutes dans la reconnaissance de la seacutequence SecM la voie entiegravere dinteraction des reacutesidus qui
relient SecM au ribosome na pas encore eacuteteacute eacutetablie de faccedilon concluante Neacuteanmoins il semblerait
que ce soit lrsquoARNt-P166 qui reste bloqueacute dans le site A du PTC (laquo peptidyl transferase
center raquo) empecircchant sa translocation vers le site P et retardant ainsi lrsquoincorporation de la Pro166
apregraves la Gly165 du polypeptide en cours de synthegravese 24242243 Cette seacutequence drsquoarrecirct peut
fonctionner de faccedilon indeacutependante au reste de la seacutequence de SecM et peut donc ecirctre fusionneacutee
agrave nrsquoimporte quelle proteacuteine drsquointeacuterecirct 241 Drsquoautres motifs riches en seacutequences XPPX capables
drsquoinduire un blocage des ribosomes en cours de traduction plus au moins fort ont eacuteteacute identifieacutes
dans drsquoautres proteacuteines 244 Cela permet de produire des ribosomes bloqueacutes en cours de
traduction la longueur de la proteacuteine produite eacutetant modulable
Figure II-13 Seacutequence drsquoarrecirct SecM et interaction avec lrsquoARNr et les proteacuteines ribosomales A)
Seacutequence drsquoarrecirct SecM Les reacutesidus conserveacutes agrave travers les seacutequences SecM sont repreacutesenteacutes en couleur En
rouge les reacutesidus qui interagissent avec les proteacuteines ribosomales et en vert les reacutesidus qui interagissent avec
lrsquoARNr 23S B) Repreacutesentation drsquoune chaicircne naissante avec seacutequence SecM dans le tunnel de sortie du
peptide La seacutequence drsquoarrecirct situeacute en C-terminal de SecM se compacte en creacuteant des interactions avec le
ribosome Droite zoom sur les interactions proteacuteiques entre les reacutesidus de la seacutequence SecM et les proteacuteines
ribosomales uL4 et uL22 Figures drsquoapregraves Woolhead et al 2006 et Fedyakina et al 2011 23125
Chapitre II
110
Dans le but drsquoeacutetudier lrsquoinfluence du polypeptide naissant dans la formation du complexe
Vp16PDFribosome la seacutequence drsquoarrecirct SecM a eacuteteacute fusionneacutee en C-terminal de la proteacuteine -
galactosidase drsquoE coli Cette proteacuteine est substrat aussi bien de la PDF que de la MetAP et elle
ne possegravede pas de signal drsquoadressage pouvant ecirctre cliveacute le N-terminal est donc approprieacute pour
notre eacutetude De plus cette seacutequence possegravede plusieurs domaines lui confeacuterant ainsi la
possibiliteacute drsquoavoir des formes de repliements co-traductionnels intermeacutediaires Enfin toutes les
meacutethionines sauf la meacutethionine initiatrice ont eacuteteacute substitueacutees par mutageacutenegravese dirigeacutee la
seacutequence ne possegravede donc pas drsquoautres meacutethionines agrave part la meacutethionine initiatrice ce qui est
important pour deacuteterminer le ratio de ribosome bloqueacutes (voir Mateacuteriels et Meacutethodes)
Diffeacuterentes constructions ont eacuteteacute reacutealiseacutees et introduites dans un vecteur pET-22b(+)
compatible avec le systegraveme de traduction in vitro utiliseacute Ces constructions ont eacuteteacute penseacutees pour
geacuteneacuterer des RNC contenant des peptides naissants dont lrsquoextreacutemiteacute N-terminale reste confineacutee
agrave lrsquointeacuterieur du tunnel de sortie du ribosome ou eacutemerge agrave peine agrave la surface du ribosome ou
encore soit totalement agrave lrsquoexteacuterieur du ribosome Etant connu que la longueur moyenne du
tunnel de sortie du ribosome bacteacuterien est drsquoenviron 80-100Aring 1314 qui correspond agrave un peptide
naissant de 30 agrave 60 acides amineacutes (30 agrave 40 si le polypeptide adopte une conformation totalement
eacutetendue 40 agrave 60 srsquoil se replie sous forme drsquoheacutelice ) 15ndash17 et compte-tenu eacutegalement que la
seacutequence drsquoarrecirct SecM contient 17 reacutesidus des fragments N-terminaux de -galactosidase
contenant les 3 8 18 25 36 54 78 88 et 239 premiers reacutesidus ont eacuteteacute fusionneacutes agrave la seacutequence
drsquoarrecirct SecM Cela a donneacute les constructions noteacutees SecMX ougrave X comprend le fragment de la
β-galactosidase suivi de la seacutequence SecM soit SecM20 SecM25 SecM35 SecM42 SecM53
SecM71 SecM95 SecM105 et SecM256 (Figure II-14)
Figure II-14 Repreacutesentation scheacutematique de la seacutequence de la β-galactosidase et des diffeacuterentes
constructions disponibles Les constructions comprennent la seacutequence de la β-galactosidase et la seacutequence de
pause SecM
Chapitre II
111
Les ribosomes bloqueacutes en cours de traduction ont eacuteteacute produits en faisant de la traduction
in vitro agrave lrsquoaide drsquoun kit commercial Le plasmide pET-22b(+) contenant le gegravene codant lrsquoune
ou lrsquoautre des constructions SecMX est ajouteacute dans le kit qui contient tous les composants
neacutecessaires pour les eacutetapes de transcription et traduction (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) A lrsquoissue
de la reacuteaction les ribosomes bloqueacutes sont produits et peuvent ecirctre utiliseacutes directement Le
rendement de production des ribosomes bloqueacutes a eacuteteacute estimeacute au laboratoire en utilisant de la
meacutethionine marqueacutee agrave lrsquoisotope 35S (35S-Met) ce qui a montreacute des diffeacuterences importantes selon
les constructions obtention de 17 12 40 26 90 32 52 49 de RNC pour les
constructions SecM20 25 35 42 53 71 95 et 105 respectivement apregraves 150 min de reacuteaction
Jrsquoai choisi pour mes eacutetudes de commencer agrave travailler avec les constructions SecM35 (40) et
SecM53 (90)
Jrsquoai alors proceacutedeacute agrave des expeacuteriences de seacutedimentation in vitro afin de regarder lrsquoaffiniteacute
de Vp16PDF pour ces ribosomes en utilisant le mecircme protocole que preacuteceacutedemment (gamme
de concentrations de ribosomes croissantes et concentration constante drsquoenzyme voir section
A) Comme pour les expeacuteriences preacuteceacutedentes reacutealiseacutees avec des ribosomes vides les meacutelanges
reacuteactionnels contenant les ribosomes bloqueacutes et Vp16PDF ont eacuteteacute fractionneacutes par
ultracentrifugation sur coussin de sucrose 20 et le contenu des culots a eacuteteacute analyseacute par
Western-blot suivi drsquoune immunodeacutetection en utilisant des anticorps anti-Vp16PDF Comme
preacuteceacutedemment une leacutegegravere seacutedimentation de la proteacuteine en absence de ribosome a pu ecirctre
observeacutee (Figure II-15A et B) Les expeacuteriences reacutealiseacutees avec chacune des deux constructions
SecM35 et SecM53 ont montreacute une interaction entre Vp16PDF et les ribosomes bloqueacutes en
cours de traduction avec un signal bien plus fort pour SecM53 par rapport aux ribosomes vides
ou bloqueacutes avec la construction SecM35 (Figure II-15B) de faccedilon reproductible
Figure II-15 Interaction de Vp16PDF avec des ribosomes bloqueacutes SecM35 et SecM53 A) Test de
seacutedimentation entre Vp16PDF et 70S-SecM35 Gel repreacutesentatif des analyses sur gel SDS-PAGE puis Western-
blot avec des anticorps anti-Vp16PDF B) Test de seacutedimentation entre Vp16PDF et 70S-SecM53 Gel
repreacutesentatif des analyses sur gel SDS-PAGE puis Western-blot avec des anticorps anti-Vp16PDF
Chapitre II
112
La quantification des bandes obtenues par Western-blot permet de regarder la proportion
de proteacuteine seacutedimenteacutee en fonction de la concentration en ribosomes A partir des diffeacuterents
tests de seacutedimentations reacutealiseacutes jrsquoai alors normaliseacute les reacutesultats pour pouvoir comparer les
donneacutees obtenues Jrsquoai pour cela repreacutesenteacute la quantiteacute de Vp16PDF seacutedimenteacutee sous forme de
pourcentage en fonction de la concentration de ribosomes (Figure II-16) Les expeacuteriences de
seacutedimentation ont alors eacuteteacute reproduites avec comme teacutemoin constant 5microM de Vp16PDF
seacutedimenteacutee en preacutesence de 2microM de ribosome et lrsquoensemble des valeurs de fluorescence de
chacune des bandes a ensuite eacuteteacute exprimeacute en pourcentage agrave partir de cette reacutefeacuterence 100
En comparant la proportion de Vp16PDF qui seacutedimente selon laquo lrsquoeacutetat raquo du ribosome
utiliseacute nous observons que le profil de seacutedimentation de Vp16PDF est le mecircme selon qursquoelle
co-seacutedimente en preacutesence de ribosome 70S vides ou de ribosomes 70S-SecM35 (Figure II-16)
Crsquoest agrave partir de 15 microM de ribosome que lrsquoon observe une augmentation significative de la
seacutedimentation Neacuteanmoins ne pouvant exceacuteder 2 microM de ribosome dans ce test les reacutesultats ne
nous permettent pas de visualiser un plateau maximum de seacutedimentation de PDF et le Kd ne
peut donc pas ecirctre deacutetermineacute On peut toutefois estimer une affiniteacute apparente avec un Kd
supeacuterieur ou eacutegal agrave 2 microM
Les reacutesultats concernant la co-seacutedimentation de Vp16PDF avec les ribosomes 70S-
SecM53 sont quant agrave eux significativement diffeacuterents En effet la quantification du signal de
Vp16PDF indique qursquoen preacutesence de ces ribosomes une quantiteacute importante de PDF seacutedimente
quantiteacute supeacuterieure agrave celle observeacutee lors de la seacutedimentation avec les autres constructions de
ribosomes (Figure II-16) Nous pouvons observer qursquoen preacutesence de 05 microM de ribosome la
quantiteacute maximale de PDF seacutedimente puisqursquoen augmentant la gamme de concentration de
ribosome jusqursquoagrave 2 microM la quantiteacute de Vp16PDF seacutedimenteacutee reste la mecircme Le plateau eacutetant
apparemment atteint le Kd est drsquoenviron 025 microM
Chapitre II
113
Figure II-16 Comparaison de la seacutedimentation de Vp16PDF en fonction de diffeacuterentes constructions de
ribosomes Seacutedimentation de Vp16PDF selon qursquoelle est incubeacutee en preacutesence de 70S vides de 70S-SecM35 ou
de 70S-SecM53 Les reacutesultats sont exprimeacutes en pourcentage de signal de Vp16PDF On considegravere comme 100
le signal correspondant agrave la seacutedimentation de Vp16PDF en preacutesence de 2microM de 70S-SecM53
Conclusion
Je me suis inteacuteresseacute dans ce chapitre agrave la capaciteacute de Vp16PDF agrave interagir avec les
ribosomes et jrsquoai amorceacute la caracteacuterisation de cette interaction (affiniteacute proteacuteines ribosomales
et motifs de Vp16PDF impliqueacutes) Jrsquoai pu montrer que Vp16PDF interagit avec les ribosomes
vides malgreacute lrsquoabsence drsquoheacutelice en C-ter ducirc agrave une extreacutemiteacute C-terminale tregraves courte avec une
affiniteacute dans la gamme du micromolaire Cette donneacutee suggegravere que lrsquoheacutelice α C-ter des PDFs
de type 1B nrsquoest pas le seul deacuteterminant permettant aux PDFs drsquointeragir avec le ribosome et
permet de proposer que les autres types de deacuteformylases (types 1A 2 et 3) peuvent eacutegalement
interagir avec le ribosome Les donneacutees issues des expeacuteriences de pontage chimique et
drsquoanalyse en spectromeacutetrie de masse mrsquoont eacutegalement permis drsquoobserver que Vp16PDF pourrait
posseacuteder plusieurs sites de fixation au ribosome localiseacutes agrave proximiteacute du tunnel de sortie du
peptide Lrsquoeacutetude de lrsquointeraction des proteacuteines chimegraveres et mutants drsquoEcPDF nous permettra de
savoir si lrsquoheacutelice α (ou les reacutesidus charniegravere VTI de Vp16PDF) jouent un rocircle dans cette
localisation
Enfin nous avons constateacute que lrsquoaffiniteacute de Vp16PDF semblait plus importante pour le
ribosome lorsque celui-ci avait syntheacutetiseacute une chaicircne peptidique de 53 acides amineacutes Ces
donneacutees suggegraverent donc que lrsquoaffiniteacute de Vp16PDF pour le ribosome est fortement influenceacutee
par la longueur de la chaicircne naissante qui devient un eacuteleacutement cleacute pour le recrutement de
Chapitre II
114
Vp16PDF au ribosome Ainsi ces donneacutees nous laissent supposer que la proteacuteine Vp16PDF
nrsquoest peut-ecirctre pas preacutesente sur le ribosome degraves le deacutebut de la traduction mais qursquoelle intervient
lorsque la chaicircne eacutemerge du tunnel de sortie du peptide Lrsquoeacutetude de lrsquointeraction de Vp16PDF
avec drsquoautres formes de ribosomes bloqueacutes en cours de traduction nous permettra de deacuteterminer
le stade de la traduction le plus favorable agrave lrsquointervention de cette enzyme
Chapitre II
115
Chapitre III
116
Chapitre III Caracteacuterisation de
lrsquoexpression de Vp16PDF chez E coli
Chapitre III
117
Chapitre III
118
Dans les chapitres preacuteceacutedents jrsquoai pu montrer que Vp16PDF est capable de
compleacutementer une souche bacteacuterienne (PAL421Tr) deacuteficiente pour le gegravene def endogegravene agrave des
tempeacuteratures non permissives (42degC) confirmant une activiteacute deacuteformylase in vivo de cette
proteacuteine Neacuteanmoins nous nous sommes aperccedilus que lrsquoincubation des mecircmes boicirctes agrave 30degC
induit une inhibition de la croissance bacteacuterienne Ces reacutesultats inattendus jamais observeacutes avec
aucune autre PDF nous ont conduits agrave reacutealiser une caracteacuterisation plus approfondie de cet effet
inhibiteur associeacute agrave lrsquoexpression de Vp16PDF dans plusieurs souches bacteacuteriennes
A ndash La surexpression de Vp16PDF dans E coli inhibe la croissance
bacteacuterienne agrave basse tempeacuterature
A1 ndash Lrsquoexpression de Vp16PDF inhibe la croissance bacteacuterienne Comme observeacute preacuteceacutedemment dans les tests de compleacutementation de la souche
PAL421Tr (voir Figure I-3 du Chapitre I) agrave 30degC et en preacutesence de glucose seule EcPDF dont
le gegravene est contenu dans le plasmide pMAK est exprimeacutee et toutes les bacteacuteries poussent de la
mecircme faccedilon (Figure III-1A) De mecircme agrave 42degC et en preacutesence drsquoarabinose seules les bacteacuteries
exprimant une PDF fonctionnelle porteacutee par le plasmide pBAD inductible agrave lrsquoarabinose peuvent
pousser confirmant que Vp16PDF assure pleinement une activiteacute peptide deacuteformylase in vivo
(Figure III-1B) Pourtant nous avons constateacute une inhibition de croissance de la souche
PAL421Tr quand des boicirctes identiques avaient eacuteteacute incubeacutees agrave 30degC au lieu de 42degC Cette
inhibition augmente avec la concentration drsquoarabinose et se manifeste deacutejagrave agrave des concentrations
tregraves faibles (Figure III-1C)
Afin de mieux comprendre cet effet inhibiteur les bacteacuteries PAL421Tr ont ensuite eacuteteacute
cultiveacutees en milieu liquide contenant de lrsquoarabinose et incubeacutees agrave 30degC Le suivi de la
croissance bacteacuterienne au cours du temps a montreacute une inhibition significative apregraves 2h de
culture suivi drsquoun arrecirct quasi-total de la croissance agrave 7h de culture uniquement en preacutesence de
Vp16PDF (Figure III-1D courbe rouge agrave comparer au controcircle (courbe noire) dans lequel les
bacteacuteries expriment uniquement EcPDF codeacutee agrave la fois par les plasmides pBAD et pMAK)
Lrsquoensemble de ces reacutesultats indique une inhibition de la croissance bacteacuterienne induite
par lrsquoexpression de Vp16PDF
Chapitre III
119
A
B
C
D
Figure III-1 Croissance bacteacuterienne agrave 30degC et 42degC lors de lrsquoexpression de Vp16PDF dans la souche PAL421Tr Des
gouttes de dilutions successives de 10 en 10 preacuteleveacutees sur une culture liquide pousseacutee une nuit agrave 30degC sont deacuteposeacutees sur milieu
geacuteloseacute Les bacteacuteries de la souche PAL421Tr contiennent le plasmide pMAK portant le gegravene codant EcPDF wt et sont
transformeacutees avec un plasmide pBAD vide ou portant les gegravenes codant EcPDF ou Vp16PDF wt A) Croissance sur milieu solide
agrave 30degC avec ampicilline et 05 de glucose pour inhiber lrsquoexpression de la proteacuteine codeacutee par le pBAD Seule EcPDF codeacutee
par le pMAK est exprimeacutee Les boicirctes sont incubeacutees 20h Ce controcircle permet de veacuterifier que la mecircme quantiteacute de cellules est
deacuteposeacutee pour chacun des eacutechantillons B) Croissance sur milieu solide agrave 42degC avec ampicilline et une concentration croissante
drsquoarabinose afin drsquoinduire lrsquoexpression du gegravene porteacute par le plasmide pBAD Les boicirctes sont incubeacutees 20h C) Croissance sur
milieu solide agrave 30degC avec ampicilline et des concentrations croissante drsquoarabinose pour lrsquoexpression de la proteacuteine codeacutee par le
pBAD Les boicirctes sont incubeacutees 20h D) Croissance bacteacuterienne en milieu liquide agrave 30degC Utilisation de milieu LB avec 1
drsquoarabinose pour lrsquoexpression de la proteacuteine codeacutee par le pBAD (indiqueacute sur les courbes) Les cellules expriment toutes EcPDF
codeacutee par le pMAK
Chapitre III
120
A2 ndash Lrsquoinhibition de la croissance bacteacuterienne nrsquoest pas due agrave une
compeacutetition entre Vp16PDF et EcPDF mais deacutepend de la tempeacuterature
Suite aux reacutesultats preacuteceacutedents et afin de deacuteterminer si lrsquoeffet inhibiteur de la croissance
observeacute chez les bacteacuteries exprimant Vp16PDF serait ducirc agrave la co-expression avec EcPDF jrsquoai
reacutealiseacute un nouveau test de compleacutementation fonctionnelle en utilisant cette fois une souche de
bacteacuteries PAL421Tr ayant perdu le plasmide pMAK705 contenant le gegravene codant EcPDF apregraves
plusieurs cycles de repiquage des cellules agrave 42degC (souche appeleacutee PAL421TrΔpMAK) Par
conseacutequent ces cellules nrsquoexpriment pas EcPDF mais uniquement Vp16PDF codeacutee par le
plasmide pBAD quelle que soit la tempeacuterature drsquoincubation degraves lors que de lrsquoarabinose est
preacutesent dans le milieu de culture Lrsquoexpeacuterience a montreacute une inhibition tregraves forte de la
croissance bacteacuterienne agrave 30degC de mecircme intensiteacute que celle observeacutee lorsque les deux proteacuteines
EcPDF et Vp16PDF sont exprimeacutees simultaneacutement (Figure III-2A panneau de droite deux
lignes du bas) Ces reacutesultats signifient que lrsquoeffet inhibiteur sur la croissance nrsquoest pas ducirc agrave une
eacuteventuelle compeacutetition entre les deux deacuteformylases mais uniquement agrave lrsquoexpression de
Vp16PDF Par ailleurs cet effet est deacutependant de la tempeacuterature puisqursquoil est eacutegalement observeacute
agrave 25degC (Figure III-2A panneau de gauche) mais pas agrave 37 ou 42degC (Figure III-2B)
Chapitre III
121
A3 ndash Lrsquoinhibition de croissance est indeacutependante du fond geacuteneacutetique des
bacteacuteries
Afin de veacuterifier si lrsquoinhibition de croissance provoqueacutee par Vp16PDF ne deacutepend pas du
fond geacuteneacutetique de la souche bacteacuterienne utiliseacutee nous avons choisi drsquoeacutetudier la croissance
drsquoautres souches drsquoE coli Les tests preacuteceacutedents ayant montreacute qursquoil nrsquoy avait pas de compeacutetition
entre EcPDF et Vp16PDF il nrsquoeacutetait donc pas neacutecessaire drsquoutiliser des souches dont le gegravene de
deacuteformylase endogegravene a eacuteteacute deacuteleacuteteacute et lrsquoexpeacuterience a donc simplement consisteacute agrave transformer
de nouvelles souches bacteacuteriennes (MG1655 W3110 MC4100 et JM101Tr voir Mateacuteriels et
Meacutethodes tableau MM-1) avec le plasmide pBAD contenant le gegravene codant Vp16PDF Les
bacteacuteries ont alors eacuteteacute cultiveacutees agrave 30degC en utilisant un milieu LB contenant diffeacuterentes
concentrations drsquoarabinose Comme observeacute dans la souche PAL421Tr lrsquoexpression de la
A
B
Figure III-2 Test de croissance de bacteacuteries E coli sur milieu solide exprimant soit Vp16PDF et EcPDF
simultaneacutement soit uniquement Vp16PDF agrave diffeacuterentes tempeacuteratures et en preacutesence drsquoarabinose A) A
25degC et 30degC la souche PAL421Tr exprime le gegravene EcPDF porteacute par le pMAK705-EcPDF La souche
PAL421TrΔpMAK (derniegravere ligne pour chacune des boicirctes) ne possegravede plus le pMAK705-EcPDF elle
nrsquoexprime donc pas EcPDF mais uniquement Vp16PDF porteacute par le pBAD induit avec les 2 drsquoarabinose B)
A 37degC et 42degC le plasmide pMAK705-EcPDF (thermosensible) nrsquoest plus preacutesent dans les cellules Le gegravene
porteacute par le pBAD est toujours induit par lrsquoarabinose preacutesent dans le milieu (2) La souche PAL421TrΔpMAK
(derniegravere ligne pour chacune des boicirctes) ne possegravede plus le pMAK705-EcPDF elle nrsquoexprime donc pas EcPDF
mais uniquement Vp16PDF porteacute par le pBAD
Chapitre III
122
proteacuteine Vp16PDF induit une inhibition de la croissance bacteacuterienne de chacune des souches
testeacutees effet drsquoautant plus marqueacute que la concentration en arabinose est forte (Figure III-3A)
Lrsquoeffet inhibiteur est lagrave encore deacutependant de la tempeacuterature puisqursquoil nrsquoest pas observeacute agrave 37degC
(Figure III-3B) De mecircme lrsquoinhibition de croissance provoqueacutee par lrsquoexpression de Vp16PDF
a pu ecirctre observeacutee sur des cultures en milieu liquide pour les deux souches MG1655 et JM101Tr
(Figure III-3C)
A
B
C
Figure III-3 Effet de lrsquoexpression de Vp16PDF sur la croissance cellulaire de diffeacuterentes souches drsquoE coli
sauvages A) Effet de lrsquoexpression de Vp16PDF agrave 30degC chez diffeacuterentes souches drsquoE coli MG1655 W3110 Jm101Tr
et MC4100 Les bacteacuteries sont cultiveacutees sur des milieux de culture solides (LB agar) avec ampicilline et diffeacuterentes
concentration drsquoarabinose (02 et 1) B) La mecircme expeacuterience a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave 37degC avec les souches MG1655 W3110
Jm101Tr C) Cineacutetique de croissance des souches MG1655 et Jm101Tr en milieu LB liquide avec 2 drsquoarabinose Effet
de lrsquoexpression de Vp16PDF agrave 30degC chez diffeacuterentes souches E coli MG1655 et Jm101Tr en milieu liquide (LB) avec
ampicilline et 1 drsquoarabinose
Chapitre III
123
A4 ndash Lrsquoinhibition de la croissance bacteacuterienne induite par
lrsquoexpression de Vp16PDF neacutecessiteacute une forme active de
lrsquoenzyme
Lrsquoensemble des reacutesultats preacuteceacutedents montre que Vp16PDF provoque un ralentissement
significatif de la croissance bacteacuterienne et ce agrave basse tempeacuterature De plus lrsquoinhibition est
indeacutependante de la souche bacteacuterienne utiliseacutee et nrsquoest pas la conseacutequence drsquoune compeacutetition
avec la PDF naturellement exprimeacutee par la bacteacuterie Je me suis alors demandeacute si lrsquoinhibition
observeacutee pouvait avoir un lien avec lrsquoactiviteacute enzymatique peptide deacuteformylase de Vp16PDF
Jrsquoai pour cela effectueacute des tests de compleacutementation en utilisant deux mutants catalytiques de
Vp16PDF E128A et Q47K Jrsquoai choisi de muter les reacutesidus E128 et Q47 car les reacutesidus
eacutequivalents chez EcPDF (E133 et Q50) sont impliqueacutes dans lrsquoaffiniteacute pour le substrat et dans le
meacutecanisme catalytique de deacuteformylation130180190 (voir Introduction Figure i22) En effet le
mutant E133A drsquoEcPDF est inactif in vivo (il ne compleacutemente pas agrave 42degC) et in vitro (Km =
0011 mM vs 62 mM pour la wt activiteacute relative kcat Km infeacuterieure agrave 05 de lrsquoactiviteacute obtenue
avec EcPDF sauvage) 130 de mecircme que le mutant Q50A drsquoEcPDF dont les paramegravetres
cineacutetiques indiquent clairement une perte drsquoefficaciteacute catalytique mais dont lrsquoaffiniteacute pour le
substrat est inalteacutereacutee 130 Afin de veacuterifier que les mutations E128A et Q47K introduites dans
Vp16PDF provoquent bien une inactivation de la proteacuteine le test de compleacutementation
fonctionnelle a drsquoabord eacuteteacute effectueacute agrave 42degC Comme attendu par homologie avec EcPDF
chacune des deux mutations inactive la fonction peptide deacuteformylase de Vp16PDF lrsquoempecircchant
de compleacutementer les bacteacuteries PAL421Tr (Figure III-4 agrave 42degC) En revanche lorsque le test est
reacutealiseacute agrave 30degC les bacteacuteries posseacutedant les versions muteacutees de Vp16PDF ont une croissance
normale et eacutequivalente agrave celle des bacteacuteries exprimant EcPDF sauvage (aucun effet inhibiteur
nrsquoest observeacute voir Figure III-4 agrave 30degC) Cela signifie que lrsquoeffet inhibiteur de Vp16PDF sur la
croissance des bacteacuteries est lieacute agrave lrsquoactiviteacute enzymatique de la proteacuteine crsquoest-agrave-dire agrave sa fonction
de deacuteformylation des proteacuteines drsquoE coli en cours de synthegravese
Chapitre III
124
Figure III-4 Influence de lrsquoactiviteacute deformylase de Vp16PDF sur la croissance des bacteacuteries PAL421Tr
A 42degC seule la deacuteformylase codeacutee par le pBAD est exprimeacutee A 30degC les cellules expriment la deacuteformylase
codeacutee par le pBAD ainsi que la deacuteformylase endogegravene drsquoE coli codeacutee par le pMAK705
A5 Lrsquoisoleucine terminale de Vp16PDF joue un rocircle crucial dans lrsquoeffet
inhibiteur exerceacute par lrsquoexpression de la proteacuteine
Etant donneacute qursquoune des diffeacuterences majeures entre Vp16PDF et EcPDF reacuteside agrave lrsquoextreacutemiteacute
C-terminale de ces deux proteacuteines nous avons deacutecideacute drsquoeacutevaluer la possibiliteacute que cette reacutegion
(incluant lrsquoheacutelice Cter) ait un impact sur lrsquoeffet inhibiteur de la proteacuteine Vp16PDF agrave des
tempeacuteratures infeacuterieures agrave 30degC Ainsi dans le but drsquoidentifier les deacuteterminants responsables
de lrsquoeffet inhibiteur de Vp16PDF nous avons drsquoabord analyseacute lrsquoeffet agrave 30degC des versions
chimeacuteriques de Vp16PDF qui possegravedent agrave leur extreacutemiteacute C-terminale diffeacuterents fragments issus
de lrsquoheacutelice α C-terminale drsquoEcPDF (chimegraveres preacuteceacutedemment utiliseacutees pour les tests de
compleacutementation fonctionnelle voir chapitre II section C1 et Figure II-7)
Comme attendu Vp16PDF wt inhibe la croissance bacteacuterienne agrave 30degC (Figure III-5)
Au contraire la chimegravere Vp16PDF(KLF)heacutelice ne provoque pas drsquoinhibition de croissance
(Figure III-5) Or jrsquoai montreacute que cette chimegravere est tregraves peu active in vivo (voir Chapitre II
Figure II-10A) ce qui signifie qursquoelle nrsquoest pas capable drsquoexercer pleinement son activiteacute
deacuteformylase Cela peut ecirctre ducirc agrave un deacutefaut drsquoactiviteacute enzymatique etou une incapaciteacute de se
lier au ribosome hypothegraveses qui seront testeacutees en purifiant la proteacuteine recombinante Les
cellules exprimant la chimegravere Vp16PDF(VTI)heacutelice ne montrent pas non plus drsquoinhibition de
croissance en preacutesence drsquoarabinose agrave 02 et une leacutegegravere inhibition pour des concentrations en
arabinose plus eacuteleveacutees comparable agrave celle observeacutee avec Vp16PDF(KLF)heacutelice (Figure III-5)
Cependant drsquoapregraves les tests preacuteliminaires drsquoactiviteacute et de compleacutementation fonctionnelle cette
proteacuteine est tregraves active (voir Chapitre II Figure II-10A) Il semble donc que lrsquoajout de lrsquoheacutelice
α en C-terminal sans modification des trois derniers reacutesidus VTI de la proteacuteine supprime lrsquoeffet
Chapitre III
125
inhibiteur de croissance provoqueacute par Vp16PDF Enfin les cellules exprimant
Vp16PDF(VTF)heacutelice ont une croissance inhibeacutee le pheacutenotype nrsquoeacutetant pas drastique mais
intermeacutediaire entre celui observeacute pour Vp16PDF wt et les deux autres chimegraveres (Figure III-5)
Lrsquoinhibition est drsquoautant plus forte que la concentration en arabinose augmente et donc la
quantiteacute de proteacuteine chimegravere exprimeacutee (Figure III-5)
Figure III-5 Test de croissance de bacteacuteries exprimant les proteacuteines peptides deacuteformylases chimegraveres sur
milieu solide agrave 30degC Les boicirctes sont suppleacutementeacutees soit en glucose (pour ne pas exprimer le gegravene du pBAD)
soit avec diffeacuterentes concentrations drsquoarabinose (pour exprimer le gegravene du pBAD) Elles sont incubeacutees 24h agrave
30degC La souche utiliseacutee est Jm101Tr
Drsquoapregraves mes reacutesultats la preacutesence de lrsquoheacutelice 3 drsquoEcPDF agrave lrsquoextreacutemiteacute C-terminale de
Vp16PDF constitue un eacuteleacutement essentiel dans lrsquoeffet inhibiteur de la proteacuteine Vp16PDF En
effet la preacutesence de lrsquoheacutelice 3 drsquoEcPDF agrave lrsquoextreacutemiteacute C-terminale de Vp16PDF nrsquoaltegravere pas
lrsquoactiviteacute deacuteformylase in vivo et in vitro mais supprime de faccedilon drastique lrsquoeffet inhibiteur sur
la croissance bacteacuterienne agrave 30degC
Lrsquoeffet inhibiteur est eacutegalement aboli avec les chimegraveres Vp16PDF(KLF)heacutelice et
Vp16PDF(VTF)heacutelice Neacuteanmoins lrsquoabsence de compleacutementation fonctionnelle in vivo et la
faible activiteacute in vitro observeacutees avec ces deux derniegraveres chimegraveres nous laissent suggeacuterer que
lrsquoabsence drsquoinhibition agrave 30degC est relieacutee agrave une baisse drsquoactiviteacute deacuteformylase des deux chimegraveres
reproduisant la situation deacutejagrave observeacutee avec les mutants E128A et Q47K Si crsquoest le cas les
trois derniers reacutesidus V135T136I137 de Vp16PDF seraient des eacuteleacutements deacuteterminants pour
lrsquoactiviteacute enzymatique de la proteacuteine En effet si nos donneacutees enzymatiques sont confirmeacutees
cela impliquera que la substitution des reacutesidus VTI en reacutesidus KLF diminue fortement lrsquoactiviteacute
et la compleacutementation agrave 42degC mais nrsquoinhibe pas la croissance bacteacuterienne (comparer les
chimegraveres Vp16PDF(KLF)heacutelice et Vp16PDF(VTI)heacutelice Tableau III-1) Par ailleurs la simple
substitution de lrsquoI137 en Phe suffit agrave diminuer fortement lrsquoactiviteacute (comparer les chimegraveres
Vp16PDF(VTF)heacutelice et Vp16PDF(VTI)heacutelice Tableau III-1)
Chapitre III
126
Cependant la preacutesence de la seacutequence VTI et lrsquoabsence de lrsquoheacutelice 3 sont des
conditions neacutecessaires mais pas suffisantes pour transposer lrsquoeffet inhibiteur agrave toute autre PDFs
En effet les versions chimeacuteriques drsquoEcPDF construites pour mimer Vp16PDF (Chapitre II
Figure II-9) ne provoquent aucune inhibition de croissance Ainsi bien que les diffeacuterents
chimegraveres soient fonctionnellement actives (Chapitre II) ni la deacuteleacutetion des heacutelices 3 et 3
drsquoEcPDF ni la mutation des reacutesidus KLF en VTI ne provoquent une inhibition de croissance
(Figure III-6)
Construction Compleacutementation
fonctionnelle (42degC) Activiteacute in vitro Croissance agrave 30degC
Vp16PDF +++ +++ ---
Vp16PDF(KLF)heacutelice + + +++
Vp16PDF(VTI)heacutelice +++ +++ +++
Vp16PDF(VTF)heacutelice - + +
Tableau III-1 Tableau reacutecapitulatif de lrsquoactiviteacute peptide deacuteformylase de Vp16PDF et de ses chimegraveres
Lrsquoensemble combineacute de ces reacutesultats met en lumiegravere le lien entre les diffeacuterentes
particulariteacutes structurales de Vp16PDF et les conseacutequences de son expression dans une bacteacuterie
agrave des tempeacuteratures infeacuterieures agrave 30degC En particulier lrsquoextreacutemiteacute C-terminale tregraves courte est
directement responsable de lrsquoinhibition de la croissance bacteacuterienne par la proteacuteine Vp16PDF
vraisemblablement via un mode de fixation au ribosome diffeacuterent de celui de la proteacuteine drsquoE
coli En effet lrsquoajout agrave lrsquoextreacutemiteacute C-terminale de Vp16PDF de lrsquoheacutelice 3 drsquoEcPDF nrsquoaltegravere
Figure III-6 Test de croissance agrave 30degC des bacteacuteries PAL421Tr transformeacutees avec des versions muteacutees
drsquoEcPDF au niveau de la reacutegion C-terminale Les gouttes de cultures de dilutions successives au dixiegraveme
sont deacuteposeacutees sur boicircte LB agar suppleacutementeacutee avec 1 drsquoarabinose pour lrsquoexpression des proteacuteines
Lrsquoincubation des boicirctes est faite agrave 30degC durant 17h
Chapitre III
127
pas lrsquoactiviteacute deacuteformylase de la proteacuteine mais suffit agrave restaurer la croissance bacteacuterienne
Neacuteanmoins drsquoautres facteurs speacutecifiques de la proteacuteine Vp16PDF non encore identifieacutes
semblent ecirctre neacutecessaires pour pouvoir reproduire lrsquoeffet inhibiteur dans drsquoautres PDFs
B ndash La surexpression de Vp16PDF dans E coli perturbe lrsquointeacutegriteacute de lrsquoenveloppe
bacteacuterienne
B1 ndash Lrsquoexpression de Vp16PDF altegravere la structure de lrsquoenveloppe
bacteacuterienne
Apregraves avoir observeacute les cineacutetiques de croissance des bacteacuteries exprimant Vp16PDF et
remarqueacute une mort cellulaire preacutecoce agrave 30degC (voir ci-dessus) nous avons deacutecideacute drsquoobserver
lrsquoapparence des cellules afin de voir srsquoil eacutetait possible de deacuteceler des particulariteacutes
pheacutenotypiques permettant de nous eacuteclairer sur les conseacutequences physiologiques de lrsquoexpression
de Vp16PDF Ainsi des bacteacuteries de la souche JM101Tr ont eacuteteacute transformeacutees avec le plasmide
pBAD contenant le gegravene codant EcPDF ou Vp16PDF et mises en culture liquide agrave 30degC en
preacutesence drsquoarabinose Des aliquotes ont alors eacuteteacute preacuteleveacutes agrave 5h et agrave 24h de culture (Figure III-
1D) et traiteacutes avec du iodure de propidium (IP) un agent intercalant utiliseacute comme marqueur
de la viabiliteacute cellulaire En effet agrave cause de sa lipophobie eacuteleveacutee lrsquoIP ne peut peacuteneacutetrer dans les
cellules viables posseacutedant une bonne inteacutegriteacute membranaire Lrsquoobservation des eacutechantillons au
microscope photonique a montreacute que les cellules exprimant Vp16PDF sont moins nombreuses
que celles exprimant EcPDF et qursquoune forte proportion semble lyseacutee (Figure III-5A)
conduisant agrave une forte mortaliteacute cellulaire (Figure III-5B) De plus lrsquoobservation des mecircmes
eacutechantillons (apregraves 5h de culture) en microscopie eacutelectronique agrave transmission a montreacute que les
bacteacuteries exprimant Vp16PDF ont un aspect anormal deacuteformeacute notamment au niveau de
lrsquoenveloppe bacteacuterienne (Figure III-5C panneaux de gauche) En effet les trois structures de
lrsquoenveloppe bacteacuterienne (membrane externe peacuteriplasme et membrane interne) sont bien
visibles et diffeacuterencieacutees dans les cellules controcircles mais sont confondues dans les cellules
exprimant la proteacuteine Vp16PDF (Figure III-5C panneaux de droite)
Chapitre III
128
B2 ndash Lrsquoexpression de Vp16PDF accroicirct la sensibiliteacute agrave lrsquoaction bacteacuteriolytique de
deacutetergents et antibiotiques
Les bacteacuteries ayant une enveloppe alteacutereacutee peuvent preacutesenter des pheacutenotypes de
sensibiliteacute accrue agrave diffeacuterentes moleacutecules comme les deacutetergents et les antibiotiques Afin de
confirmer lrsquoalteacuteration de lrsquoenveloppe de la bacteacuterie E coli induite par Vp16PDF nous avons
donc choisi de tester lrsquoeffet drsquoun deacutetergent (SDS) et drsquoun antibiotique (vancomycine) sur la
croissance des bacteacuteries JM101Tr exprimant la proteacuteine Le SDS est un deacutetergent anionique
puissant qui a un effet deacutenaturant sur les membranes 245 via la deacutenaturation des proteacuteines
membranaires hydrophobes Toutefois agrave basse concentration la croissance de bacteacuteries
sauvages nrsquoest que peu affecteacutee par le SDS au contraire des bacteacuteries dont la paroi est alteacutereacutee
La vancomycine est un antibiotique qui inhibe la synthegravese du peptidoglycane des bacteacuteries agrave
A
B
C
Figure III-5 Taux de mortaliteacute et aspect des cellules bacteacuteriennes (Jm101Tr) exprimant soit EcPDF soit
Vp16PDF agrave 30degC en milieu liquide LB avec 2 drsquoarabinose A) Observation des cellules bacteacuteriennes au
microscope photonique exprimant EcPDF ou Vp16PDF apregraves 5h et 24h de culture B) Taux de mortaliteacute des
cellules apregraves 5h et 24h de culture C) Observation au microscope eacutelectronique agrave transmission des cellules apregraves
5h de culture A 30degC les cellules expriment toutes EcPDF codeacutee par le pMAK En preacutesence drsquoarabinose les
cellules expriment eacutegalement le gegravene EcPDF ou Vp16PDF porteacute par le pBAD
Chapitre III
129
Gram positif Elle nrsquoa aucun effet sur les bacteacuteries agrave Gram neacutegatif dont le peptidoglycane est
plus fin et preacutesent dans lrsquoespace peacuteriplasmique elle est en outre trop grosse pour passer agrave travers
les porines de la membrane externe des bacteacuteries agrave Gram neacutegatif
Des tests sur milieu geacuteloseacute suppleacutementeacute en arabinose et SDS ou vancomycine ont eacuteteacute
effectueacutes Les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees agrave 30degC et 37degC Comme attendu en absence de SDS
ou vancomycine toutes les bacteacuteries poussent normalement agrave 37degC indeacutependamment du gegravene
porteacute par le pBAD car aucune inhibition induite par Vp16PDF wt nrsquoest observeacutee agrave cette
tempeacuterature sur milieu solide (Figure III-6 panneaux de gauche) En revanche en preacutesence de
SDS ou de vancomycine faiblement concentreacutes la croissance des bacteacuteries exprimant la forme
active de Vp16PDF est inhibeacutee alors que les bacteacuteries exprimant EcPDF ou les formes inactives
de Vp16PDF (mutants E128A et Q47K voir Figure III-4) ne sont pas affecteacutees (Figure III-6)
Cela signifie que lrsquoexpression de Vp16PDF wt induit un pheacutenotype de sensibiliteacute au SDS ou agrave
la vancomycine ce qui confirme que lrsquointeacutegriteacute de la membrane externe est alteacutereacutee suite agrave
lrsquoexpression de cette proteacuteine Notons eacutegalement que seule la forme active de Vp16PDF induit
ce deacutefaut de croissance indiquant encore une fois que le pheacutenotype est lieacute agrave lrsquoactiviteacute
enzymatique de la proteacuteine Les mecircmes effets mais plus intenses ont eacuteteacute obtenus agrave 30degC
(donneacutees non montreacutees) Ainsi lrsquoeffet de la vancomycine pourrait indiquer une alteacuteration de la
structure des porines de la membrane externe des bacteacuteries lui permettant alors de peacuteneacutetrer
dans lrsquoespace peacuteriplasmique et ainsi deacutegrader le peptidoglycane conduisant agrave lrsquoeacuteclatement des
bacteacuteries par choc osmotique
Figure III-6 Effet drsquoun deacutetergent et drsquoun antibiotique sur la croissance de bacteacuteries Jm101Tr qui
expriment Vp16PDF A) Effet du SDS sur la croissance des bacteacuteries JM101Tr exprimant Vp16PDF (induction
de la proteacuteine avec 02 arabinose agrave 37degC) B) Effet de la vancomycine sur la croissance des bacteacuteries JM101tr
exprimant Vp16PDF (induction de la proteacuteine avec 02 arabinose agrave 37degC)
Chapitre III
130
C ndashLrsquoexpression de Vp16PDF interfegravere avec le repliement de novo des proteacuteines
Lrsquoexpression de la proteacuteine Vp16PDF mime les pheacutenotypes observeacutes dans les cellules
bacteacuteriennes qui ont perdu la chaperonne Trigger Factor (TF) En effet le mutant tig manifeste
aussi un deacutefaut de croissance agrave 30degC 246 Le fait qursquoaucun pheacutenotype ne soit visible agrave des
tempeacuteratures plus eacuteleveacutees dans le mutant tig a eacuteteacute expliqueacute par lrsquoexpression induite en reacuteponse
agrave des stress notamment thermiques drsquoautres laquo heat shock proteins raquo (Hsp) qui ne rendent plus
le TF essentiel 246 De plus le mutant tig manifeste eacutegalement une susceptibiliteacute accrue au
SDS et agrave la vancomycine due agrave une diminution des proteacuteines OMPs (laquo Outer Membrane
Proteins raquo) 105247 En effet le TF a eacuteteacute montreacute comme jouant un rocircle crucial dans la biogenegravese
des OMPs Cela nous a ameneacutes agrave suggeacuterer que lrsquoexpression de Vp16PDF pourrait provoquer
des deacutefauts dans la biogenegravese des OMPs y compris les porines Notons eacutegalement que le
pheacutenotype induit par lexpression de Vp16PDF a aussi eacuteteacute observeacute pour des mutants drsquoE coli
dans les gegravenes Sec qui constituent les principaux processus de transport des proteacuteines de la
membrane dans les bacteacuteries 248249 De maniegravere inteacuteressante nous avons constateacute que les
cellules exprimant Vp16PDF eacutetaient sensibles aux inhibiteurs de SecA (Figure III-7) et la
proteacuteine induit la formation dagreacutegats intracellulaires (voir paragraphe suivant) suggeacuterant que
Vp16PDF pourrait eacutegalement interfeacuterer avec la translocation des proteacuteines via la voie Sec
Figure III-7 Croissance bacteacuterienne en preacutesence de NaN3 Lrsquoazide de sodium est un inhibiteur de la voie
Sec Souche Jm101Tr induction des proteacuteines avec arabinose croissance agrave 37degC
Chez les bacteacuteries le repliement de la majoriteacute des proteacuteines nouvellement syntheacutetiseacutees
est assureacute par le trigger factor (TF) et une proportion non neacutegligeable de proteacuteines (~30)
neacutecessite ensuite lrsquointervention drsquoautres chaperons moleacuteculaires (DnaKDnaJ etou
GroELGroES) (Figure III-8A) Ces voies ne sont pas indeacutependantes mais au contraire
eacutetroitement lieacutees avec lrsquoexistence drsquoautres voies connecteacutees incluant la voie SecASecB (Figure
III-8B) Ainsi une bacteacuterie deacuteficiente en lrsquoun ou lrsquoautre de ces facteurs met en place des voies
de contournement afin de pouvoir assurer malgreacute tout le repliement des proteacuteines naissantes 246
Chapitre III
131
Figure III-8 Les diffeacuterentes voies meacutetaboliques impliqueacutees dans le repliement et lrsquoadressage des
proteacuteines chez la bacteacuterie A) Facteurs impliqueacutes dans le repliement des proteacuteines Le TF est la premiegravere
enzyme agrave intervenir ensuite le systegraveme GroESEL etou le systegraveme des Hsp70 DnaKJ permettent le repliement
des proteacuteines de novo ou en condition de stress Drsquoapregraves Pechmann et al 2013 250 B) Rocircles des diffeacuterentes
voies de chaperons moleacuteculaires dans le repliement et lrsquoadressage des proteacuteines La synthegravese de proteacuteines de
novo (au centre) la voie cytosolique (agrave droite) la voie Sec (en bas) la voie TAT (en haut) et lrsquoadressage agrave la
membrane via un peptide signal en C-ter (agrave gauche) Les abreacuteviations pour les chaperons sont Trigger factor
(TF) DnaKDnaJDnaE (KJE) GroESGroEL (ESL) Sec A (A) SecB (B) et les proteacuteines de maturation redox
(REMPs) IM signifie membrane interne Une flegraveche verte indique une implication prouveacutee une flegraveche noire
remplie indique une interaction deacutemontreacutee et une flegraveche en pointilleacutee une interaction possible Drsquoapregraves Castanieacute-
Cornet et al 2014 246
A la lumiegravere de toutes ces donneacutees nous avons eacutemis lrsquohypothegravese que Vp16PDF pourrait
perturber le repliement etou lrsquoadressage co-traductionnel des proteacuteines agrave la membrane ce qui
est coheacuterent avec les expeacuteriences de pontage chimique entre Vp16PDF et le ribosome qui ont
montreacute que cette deacuteformylase atypique pourrait interagir avec le ribosome agrave proximiteacute du
tunnel de sortie du peptide (Chapitre II Figure II-4) au niveau des zones drsquointeraction du TF
(proteacuteines ribosomales uL23 uL24 et uL29) et de SecA (proteacuteines ribosomales uL22 uL23 et
uL24 Jrsquoai ainsi chercheacute agrave comprendre le possible dialogue entre Vp16PDF TF SecA et
drsquoautres possibles facteurs co-traductionnelles impliqueacutes dans le repliement et translocation des
chaicircnes naissantes
Chapitre III
132
Nous avons alors choisi drsquoeacutetudier lrsquoinfluence de Vp16PDF dans plusieurs contextes mutants
Nous avons choisi des mutants de chaperons moleacuteculaires fournis par lrsquoeacutequipe de Pierre
Genevaux en lrsquooccurrence un mutant KO dans le gegravene codant pour le chaperon Trigger Factor
(mutant Δtig) un mutant KO dans le gegravene codant pour la proteacuteine drsquoadressage SecB (mutant
ΔsecB) et un double mutant KO dans les gegravenes TF et SecB (mutant ΔtigΔsecB) (voir les
caracteacuteristiques de ces souches toutes deacuteriveacutees de la souche sauvage MG1655 dans le chapitre
Mateacuteriels et Meacutethodes) Ces mutants sont viables car le repliement des proteacuteines en cours de
synthegravese est assureacute par diffeacuterents facteurs plus ou moins interchangeables et les bacteacuteries
peuvent donc srsquoadapter sans trop de deacutesordres meacutetaboliques 246 Jrsquoai utiliseacute ces souches
mutantes pour exprimer Vp16PDF (gegravene codant porteacute par le plasmide pBAD) en preacutesence
drsquoarabinose Jrsquoai alors regardeacute lrsquoeffet de lrsquoexpression de Vp16PDF sur la croissance des souches
mutantes ainsi que lrsquoaccumulation drsquoagreacutegats dans ces contextes mutants (voir paragraphe
suivant)
Lrsquoexpeacuterience a confirmeacute que lrsquoexpression de Vp16PDF provoque lrsquoinhibition de la
croissance bacteacuterienne de la souche MG1655 sauvage (Figure III-9A panneau laquo wt raquo) comme
cela avait deacutejagrave eacuteteacute observeacute (voir Figure III-1 et III-3) De maniegravere inteacuteressante nous avons
observeacute que la deacuteleacutetion du gegravene codant TF (Δtig) ou SecB (ΔsecB) a consideacuterablement aggraveacute
la toxiciteacute exerceacutee par lrsquoexpression de Vp16PDF lrsquoinhibition ayant eacuteteacute observeacutee sur milieu
solide (Figure III-9A) et en cultures liquides (Figure III-9B) En revanche lrsquoeffet inhibiteur sur
milieu solide est nettement moins prononceacute chez le double mutant ΔtigΔsecB (Figure III-9A)
et inexistant dans les conditions expeacuterimentales testeacutees en culture liquide (Figure III-9B) De
plus la surexpression de TF ou SecB dans les souches ΔsecB et Δtig respectivement supprime
lrsquoeffet inhibiteur de Vp16PDF (Figure III-9C)
Chapitre III
133
Ces reacutesultats suggegraverent que lexpression de Vp16 PDF interfegravere preacutefeacuterentiellement avec
la voie SecBTF Le fait que le double mutant ΔtigΔsecB deacutemontreacute preacuteceacutedemment comme
adressant les preacute-proteacuteines via un mode de translocation co-traductionnelle plus speacutecifique et
indeacutependante de SecB 105248251 est moins sensible agrave lrsquoexpression de Vp16PDF que les deux
simples mutants suggegravere encore plus que Vp16PDF interfegravere en effet avec la voie Sec
A
B
C
Figure III-9 Caracteacuterisation preacuteliminaire in vivo de lrsquoeffet bacteacutericide induit par Vp16PDF A) Test de
croissance sur milieu solide de la souche MG1655 Des gouttes de culture bacteacuterienne avec dilutions successives
au dixiegraveme sont deacuteposeacutees sur boicirctes LB agar suppleacutementeacutees avec 035 drsquoarabinose pour lrsquoexpression des
gegravenes preacutesents dans le pBAD B) Test de croissance en milieu liquide de la souche MG1655 Culture en milieu
LB suppleacutementeacute avec 2 drsquoarabinose incubeacutee agrave 28degC En bleu bacteacuteries avec plasmide vide en orange
bacteacuteries exprimant EcPDF en gris bacteacuteries exprimant Vp16PDF C) Utilisation de la souche MG1655
transformeacutee avec un plasmide pBAD inductible agrave lrsquoarabinose permettant lrsquoexpression de EcPDF ou Vp16PDF
et avec un plasmide p29SEN inductible agrave lrsquoIPTG permettant lrsquoexpression de EcTF ou EcSecB
Chapitre III
134
D ndash Lrsquoexpression de Vp16PDF dans E coli conduit agrave lrsquoaccumulation drsquoagreacutegats
Des travaux anteacuterieurs ont montreacute que des mutations dans le gegravene codant SecB induisent
lrsquoaccumulation de proteacuteines de la voie de seacutecreacutetion dans des agreacutegats cytosoliques 248252 Dans
le but de mieux comprendre les dommages causeacutes par Vp16PDF jrsquoai donc deacutecideacute drsquoanalyser
lrsquoagreacutegation des proteacuteines en reacuteponse agrave son expression
Des bacteacuteries E coli W3110 transformeacutees avec le plasmide pBAD contenant le gegravene codant
EcPDF ou Vp16PDF ont eacuteteacute mises en culture liquide dans un milieu suppleacutementeacute en arabinose
et incubeacutees agrave 30degC (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) Dans ces conditions lrsquoexpression de lrsquoune ou
lrsquoautre des deux PDFs est induite et la croissance bacteacuterienne inhibeacutee en reacuteponse agrave lrsquoexpression
de Vp16PDF (voir Figure III-1B et C) Drsquoautre part les cultures ont eacuteteacute arrecircteacutees agrave une DO600
eacutegale agrave 1 crsquoest-agrave-dire avant que lrsquoinhibition de croissance ne soit visible (voir Figure III-1D)
puis les agreacutegats proteacuteiques extraits (voir Mateacuteriels et Meacutethodes) Lrsquoanalyse des surnageants de
lyse ou des fractions insolubles a montreacute des profils eacutelectrophoreacutetiques eacutequivalents pour des
bacteacuteries ayant exprimeacute EcPDF ou Vp16PDF similaires agrave celui obtenu avec des bacteacuteries
nrsquoayant surexprimeacute aucune proteacuteine (Figure III-10) Cela indique que lrsquoaccumulation des
proteacuteines solubles ou insolubles nrsquoest pas drastiquement affecteacutee En revanche lrsquoanalyse des
profils eacutelectrophoreacutetiques correspondant aux agreacutegats proteacuteiques a reacuteveacuteleacute que les bacteacuteries
exprimant Vp16PDF montrent un pattern de ces agreacutegats diffeacuterent de celui surexprimant EcPDF
ou le plasmide vide (Figure III-10)
Figure III-10 Analyse du profil eacutelectrophoreacutetique des fractions solubles insolubles et des agreacutegats
obtenus agrave partir de cellules exprimant Vp16PDF agrave 30degC Analyse sur gel SDS-PAGE 14 La souche utiliseacutee
est W3110 mise en culture jusqursquoagrave une DO600 = 1 en preacutesence drsquoarabinose 2 pour exprimer le gegravene preacutesent
dans le pBAD
Chapitre III
135
Les mecircmes reacutesultats ont eacuteteacute obtenus avec la souche MG1655 (Figure III-11A et B) Une
analyse quantitative du gel (voir Mateacuteriels amp Meacutethodes) a ensuite eacuteteacute reacutealiseacutee pour affiner ces
observations Lrsquoapparition drsquoun plus grand nombre de pics a confirmeacute la preacutesence de
nombreuses proteacuteines potentiellement nouvelles agreacutegeacutees en reacuteponse agrave lrsquoexpression de
ltVp16PDF (Figure III-11C panneau du bas agrave comparer aux panneaux du haut et du milieu)
Par ailleurs lrsquoaccumulation drsquoagreacutegats semble toucher des proteacuteines de tous poids moleacuteculaires
avec toutefois une accumulation sensiblement plus marqueacutee pour des tailles infeacuterieures agrave 40
kDa environ Enfin les cellules exprimant EcPDF contiennent comme celles nrsquoexprimant
aucune PDF des proteacuteines agreacutegeacutees dont la grande majoriteacute des bandes proteacuteiques ne deacutepasse
pas une intensiteacute supeacuterieure agrave 7500 ua (Figure III-11C) Seuls trois pics de proteacuteines deacutepassent
cette valeur pour atteindre une intensiteacute comprise entre 30000 et 45000 ua Les cellules ayant
exprimeacute Vp16PDF preacutesentent quant agrave elles des bandes proteacuteiques dont lrsquointensiteacute est supeacuterieure
agrave 7500 ua atteignant pour un grand nombre drsquoentre elles une valeur supeacuterieure agrave 15000 ua
(Figure III-11C)
Figure III-11 Analyse sur gel SDS-PAGE coloreacute au Sypro du contenu des agreacutegats de cellules MG1655
exprimant EcPDF ou Vp16PDF cultiveacutees en milieu liquide agrave 30degC avec 2 drsquoarabinose A) Profil
eacutelectrophoreacutetique des eacutechantillons du surnageant de lyse Un mecircme volume drsquoeacutechantillon est deacuteposeacute dans
chaque puits (expeacuterience permettant de veacuterifier que lrsquoon va extraire les agreacutegats agrave partir drsquoune mecircme quantiteacute
de cellules) B) Profil eacutelectrophoreacutetique des eacutechantillons drsquoagreacutegats C) Quantification des bandes proteacuteiques
observeacutees sur le gel SDS-PAGE 14 des agreacutegats Les bandes bleu et rouge servent de repegraveres la bande bleue
correspond agrave une intensiteacute de 7500 ua et la bande rouge agrave une intensiteacute de 20000 ua
Chapitre III
136
Jrsquoai par la suite analyseacute les agreacutegats produits en reacuteponse agrave lrsquoexpression de Vp16PDF
dans chacune des souches mutants MG1655 testeacutees preacuteceacutedemment (ie Δtig ΔsecB et
ΔtigΔsecB) En absence de toute expression de PDF (bacteacuteries transformeacutees avec le plasmide
pBAD vide) nous avons confirmeacute que les bacteacuteries secB contiennent naturellement plus
drsquoagreacutegats proteacuteiques que les bacteacuteries MG1655 wt (Figure III-12 voir les gels ainsi que leur
quantification) ce qui est la conseacutequence directe de la mutation Au contraire les bacteacuteries Δtig
montrent un profil eacutelectrophoreacutetique drsquoagreacutegats relativement similaire agrave celui observeacute dans les
cellules sauvages (Figure III-12) Nos reacutesultats montrent eacutegalement que la surexpression de
Vp16PDF augmente consideacuterablement lrsquoaccumulation drsquoagreacutegats de proteacuteines dans le mutant
ΔsecB par rapport agrave la souche de type sauvage refleacutetant peut-ecirctre la synergie in vivo deacutecrite ci-
dessus Enfin lrsquoaccumulation drsquoagreacutegats est nettement moindre dans le mutant ΔtigΔsecB et
comparable agrave celle observeacutee dans les cellules exprimant le plasmide vide ou la PDF drsquoE coli
(voir Figure III-12) en accord avec la suppression de lrsquoeffet toxique de lrsquoexpression de
Vp16PDF dans cette souche ΔtigΔsecB
Les reacutesultats obtenus jusqursquoici ne nous permettent pas de deacuteterminer la nature des
proteacuteines preacutesentes dans les agreacutegats Une analyse par spectromeacutetrie de masse devrait nous
permettre drsquoidentifier preacuteciseacutement les proteacuteines agreacutegeacutees et de deacuteterminer si les deacutefauts de
synthegravese proteacuteique touchent toutes les proteacuteines ou seulement certaines espegraveces proteacuteiques
comme des proteacuteines membranaires ce que lrsquoon peut supposer Jrsquoai preacutepareacute les eacutechantillons sur
les agreacutegats provenant de la souche sauvage en vue de reacutealiser prochainement lrsquoanalyse par
spectromeacutetrie de masse
Conclusion Dans ce chapitre jrsquoai montreacute que lrsquoexpression de Vp16PDF provoque agrave basse
tempeacuterature (le 30degC) une inhibition de la croissance cellulaire Les cellules ont un taux de
mortaliteacute supeacuterieur agrave celui des controcircles et montrent une alteacuteration de la paroi De plus les
cellules accumulent une plus grande quantiteacute de proteacuteines dans les agreacutegats Lrsquoensemble des
eacutetudes reacutealiseacutees incluant aussi les mutants des proteacuteines TF et SecB nous suggegraverent que
lrsquoexpression de la proteacuteine active Vp16PDF interfegravere preacutefeacuterentiellement avec la voie engageant
SecB et TF Enfin il apparaicirct que si lrsquoon ajoute lrsquoheacutelice α C-terminale drsquoEcPDF agrave Vp16PDF
le pheacutenotype drsquoinhibition de croissance agrave 30degC nrsquoest plus observable
Chapitre III
137
Chapitre III
138
Figure III-12 Analyse sur gel SDS-PAGE 14 coloreacute au Sypro du contenu des agreacutegats extraits de cellules MG1655 sauvage et mutantes exprimant EcPDF ou
Vp16PDF cultiveacutees en milieu liquide agrave 30degC avec 2 drsquoarabinose Les souches mutantes Δtig ΔsecB et ΔtigΔsecB sont deacuteriveacutees de la souche MG1655 wt Le profil
eacutelectrophoreacutetique des eacutechantillons drsquoagreacutegats est repreacutesenteacute agrave gauche la quantification des bandes proteacuteiques observeacutees sur le gel SDS-PAGE des agreacutegats agrave droite Les
bandes bleu et rouge servent de repegraveres la bande bleue correspond agrave une intensiteacute de 7500 au et la bande rouge agrave une intensiteacute de 20000 au
139
Discussion
140
Discussion
Discussion
141
Discussion
142
Lrsquoexistence des peptide deacuteformylases (PDFs) a eacuteteacute prouveacutee dans les anneacutees 1960 par la
mise en eacutevidence de la reacuteaction de deacuteformylation de la meacutethionine initiatrice chez les bacteacuteries
186 mais ce nrsquoest que dans les anneacutees 1990 que ces enzymes ont pu ecirctre purifieacutees et caracteacuteriseacutees
229 Jusqursquoau deacutebut des anneacutees 2000 il eacutetait admis que seules les bacteacuteries posseacutedaient des
peptides deacuteformylases mais il a ensuite eacuteteacute deacutemontreacute qursquoelles eacutetaient eacutegalement preacutesentes dans
les organites (chloroplastes et mitochondries) des cellules eucaryotes 225 Leur caractegravere
essentiel a alors eacuteteacute deacutemontreacute chez tous ces organismes procaryotes et eucaryotes 177 Depuis
les programmes massifs de seacutequenccedilage qui ont eacutemergeacute au cours de la derniegravere deacutecennie ont
reacuteveacuteleacute la preacutesence jusque-lagrave insoupccedilonneacutee de gegravenes codant potentiellement des PDFs chez un
grand nombre de virus et plus particuliegraverement des virus marins 218219 Ces nouvelles donneacutees
semblent confirmer le caractegravere universel de la deacuteformylation mais soulegravevent de nombreuses
questions quant au(x) rocircle(s) joueacute(s) par les PDFs virales si elles sont exprimeacutees et
fonctionnelles dans les cycles de reacuteplication virale Ainsi la compreacutehension de la nature et de
la fonction de ces PDFs neacutecessite leur caracteacuterisation
Au deacutebut de ma thegravese les PDFs pouvaient ecirctre classeacutees en trois grandes familles appeleacutes
types 1 2 et 3 avec deux sous-types 1B et 1A Les premiegraveres seacutequences de PDFs virales
identifieacutees ont eacuteteacute compareacutees aux PDFs connues jusqursquoalors indiquant leur appartenance au
type 1 et plus particuliegraverement au type 1B dont le repreacutesentant est la PDF drsquoE coli 218219 Les
PDFs codeacutees par les bacteacuteriophages Vp16T et Vp16C 218 semblaient alors particuliegraverement
proches de la PDF drsquoE coli au contraire des PDFs codeacutees par drsquoautres virus marins qui faisaient
partie drsquoune autre sous-branche du type 1B (voir Figure I1B du Chapitre I) 219 En parallegravele
une analyse phylogeacuteneacutetique reacutealiseacutee par un autre laboratoire 225 a toutefois proposeacute que les PDFs
des bacteacuteriophages Vp16T et Vp16C nrsquoappartiendraient pas agrave la mecircme sous-classe que les autres
PDFs virales et ne seraient mecircme pas apparenteacutees aux PDFs de type 1B (voir Figure 3B de
Frank et al 2003) 225 Ainsi eacutetant donneacutee la difficulteacute agrave classer les nouvelles seacutequences de PDFs
virales par rapport aux seacutequences des PDFs connues jusqursquoalors et bien caracteacuteriseacutees et gracircce
au nombre croissant de seacutequences de PDFs deacutecouvertes et disponibles agrave ce jour nous avons
deacutecideacute de construire un nouvel arbre phylogeacuteneacutetique plus preacutecis Nous avons pour cela utiliseacute
263 seacutequences de PDFs seacutelectionneacutees pour repreacutesenter la diversiteacute des seacutequences de PDFs et
comprenant eacutegalement les seacutequences virales nouvellement deacutecouvertes Les seacutequences ont eacuteteacute
Discussion
143
extraite de geacutenomes complegravetement seacutequenceacutes ou de geacutenomes pour lesquels le seacutequenccedilage eacutetait
presque complet Les seacutequences ont eacuteteacute aligneacutees avec Clustal X 253 et larbre a eacuteteacute construit avec
PHYLIP De maniegravere inteacuteressante une nouvelle classification a pu ecirctre eacutetablie comprenant
trois sous-classes de PDF1 (types 1A 1B et 1C) une classe 2 une classe 3 et une nouvelle
classe 4 (Figure D-1) Les PDFs de type 1A contiennent des seacutequences provenant de bacteacuteries
de plantes drsquoanimaux et de champignons Les PDFs de type 2 contiennent uniquement des
seacutequences provenant de bacteacuteries et champignons On retrouve les PDFs drsquoamibes drsquoarcheacutees
de kinetoplastes et de bacteacuteries dans le groupe des PDFs de type 3 De plus cette analyse classe
les PDFs drsquoarcheacutees dans un nouveau sous-groupe appeleacute type 1C Enfin dans ce nouvel arbre
phylogeacuteneacutetique les PDFs identifieacutees dans les geacutenomes des bacteacuteriophages Vp16T et Vp16C se
retrouvent comme la plupart des autres PDFs virales dans la sous-classe de type 1B En
revanche les seacutequences reconstruites des PDFs virales dorigine marine appartiendraient agrave une
branche plus eacuteloigneacutee constituant une nouvelle classe de PDFs appeleacutee type 4 et incluant par
ailleurs les PDFs de certain Apicomplexes (Figure D-1)
Devant la difficulteacute agrave classer les PDFs virales identifieacutees au cours des derniegraveres anneacutees
il est apparu neacutecessaire de caracteacuteriser ces enzymes afin drsquoen comprendre leurs speacutecificiteacutes
Cette caracteacuterisation eacutetait drsquoautant plus importante que lrsquoanalyse de lrsquoensemble des PDFs
virales a montreacute des seacutequences dont lrsquoextreacutemiteacute C-terminale est tregraves courte tronqueacutee quelques
reacutesidus apregraves le motif conserveacute 3 (voir Figure I1A du Chapitre I) Cette observation est tregraves
surprenante car il a eacuteteacute proposeacute que crsquoest justement cette reacutegion de la PDF drsquoE coli qui serait
en interaction directe avec le ribosome au cours du processus de deacuteformylation des proteacuteines
en cours de synthegravese in cellulo 91 Nous avons donc deacutecideacute de caracteacuteriser la PDF virale du
bacteacuteriophage Vp16T qui nous est apparu comme la PDF active ayant la seacutequence la plus courte
connue agrave ce jour Entre-temps au cours de ma thegravese la caracteacuterisation de la PDF du cyanophage
S-SMM7 a eacuteteacute publieacutee 225 La reacutesolution de sa structure a confirmeacute son affiliation au type 1B
avec un cœur globulaire deacutepourvu de lrsquoheacutelice C-terminale typique de la PDF drsquoE coli en
raison de sa seacutequence tronqueacutee en C-terminal et sa caracteacuterisation enzymatique a par ailleurs
montreacute une proteacuteine ayant une activiteacute deacuteformylase tregraves faible
Discussion
144
Figure D-1 Arbre phylogeacuteneacutetique des peptides deacuteformylases Lrsquoarbre a eacuteteacute reacutealiseacute agrave partir de 263
seacutequences Lrsquoalignement a eacuteteacute fait avec Clustal X et lrsquoarbre phylogeacuteneacutetique construit avec PHYLIP Le sous-
groupe 1B comprend des PDFs provenant de bacteacuteries de plantes de champignons drsquoalgues drsquoapicomplexes
de bacteacuteriophages (en rouge) et drsquoamibes Le sous-groupe 1C ne comprend que des PDFs drsquoarcheacutees Le sous-
groupe 1A contient des PDFs de bacteacuteries drsquoanimaux de plantes et de champignons Le groupe des PDFs de
type 2 comprend les enzymes de bacteacuteries et de champignons Le groupe de PDFs de type 3 comprend les
bacteacuteries les amibes les kineacutetoplastes et les archeacutees Le groupe de type 4 contient des deacuteformylases de
bacteacuteriophages (en rouge) et drsquoapicomplexes
Discussion
145
Durant ma thegravese jrsquoai montreacute que le gegravene homologue de peptide deacuteformylase identifieacute
chez le phage Vp16T code bien pour une enzyme agrave activiteacute deacuteformylase et jrsquoai donc chercheacute agrave
purifier cette enzyme pour proceacuteder agrave sa caracteacuterisation Or il est connu que la purification de
PDFs pleinement actives est souvent difficile car la Cys conserveacutee du motif II qui participe au
meacutecanisme enzymatique est tregraves sujette agrave lrsquooxydation via lrsquooxydation du meacutetal catalytique
192193 La preacuteservation de lrsquoactiviteacute est toutefois possible en forccedilant lrsquoincorporation dans le site
actif du cation divalent adeacutequat au moment de la lyse des bacteacuteries qui servent agrave la surexpression
de la proteacuteine recombinante mais rien ne permet a priori de preacutevoir quelles seront les meilleures
conditions de purification 194195229 Trouver les conditions ideacuteales de purification drsquoune
nouvelle PDF permettant de disposer drsquoune enzyme pleinement active peut donc ecirctre difficile
La mise au point des conditions de purification ideacuteales pour le maintien de lrsquoactiviteacute
enzymatique de Vp16PDF srsquoest aveacutereacutee particuliegraverement ardue et la composition des tampons
retenue est tout agrave fait inhabituelle
Pour commencer jrsquoai montreacute qursquoil eacutetait neacutecessaire drsquoutiliser une tregraves forte concentration
de nickel (80 mM) pour disposer drsquoune enzyme pleinement active Nous avons eacutegalement
constateacute que la stabiliteacute de la proteacuteine semblait deacutependre de la preacutesence drsquoions nickel dans le
milieu Ce comportement est inhabituel et neacutecessitera drsquoinvestiguer le rocircle de ce meacutetal pour
mieux comprendre la fonction de lrsquoenzyme On sait toutefois que lorsque les PDFs sont
purifieacutees sans ajout artificiel de meacutetal elles contiennent le plus souvent du Fe2+ celui-ci eacutetant
vraisemblablement le meacutetal naturellement preacutesent au sein du site actif de la plupart des PDFs
in cellulo 190193 Rien ne nous permet actuellement de savoir quel serait le meacutetal naturellement
preacutesent chez Vp16PDF Cependant le Fe2+ nrsquoeacutetant preacutesent qursquoen tregraves faible quantiteacute dans les
oceacuteans nous pouvons supposer que les deacuteformylases infectant des micro-organismes marins
nrsquoutilisent pas cet ion pour le meacutecanisme de catalyse
Jrsquoai eacutegalement montreacute qursquoil fallait purifier la proteacuteine recombinante dans un tampon de
bas pH (40) pour preacuteserver lrsquoactiviteacute enzymatique De plus lagrave encore la stabiliteacute de la proteacuteine
semble influenceacutee par le pH du milieu environnant Ce comportement est probablement lieacute au
point isoeacutelectrique particulier de la proteacuteine qui est relativement eacuteleveacute par rapport agrave celui de la
plupart des PDFs connues (70 contre 45-50) Ce pI eacuteleveacute est du agrave un nombre anormalement
bas de reacutesidus chargeacutes neacutegativement ce qui conduit agrave une reacutepartition des charges en surface
atypique En effet la reacutesolution de la structure de Vp16PDF a montreacute que sa surface est
globalement moins chargeacutee que drsquoordinaire en particulier autour du site de fixation du ligand
Discussion
146
Cette particulariteacute structurale ne trouve pas drsquoexplication agrave ce jour mais pourrait entrer en jeu
lors de lrsquointeraction avec le ribosome
Gracircce agrave la mise au point de tampons adapteacutes speacutecifiquement agrave la purification de la
proteacuteine Vp16PDF jrsquoai alors pu passer drsquoune forme faiblement active agrave une forme dont
lrsquoactiviteacute est tout agrave fait comparable agrave celle obtenue avec drsquoautres PDFs connues (kcat = 20 plusmn 2 s-
1 Km = 23 plusmn 03 mM kcat Km = 8478 M-1s-1 voir Chapitre I) Les donneacutees drsquoactiviteacute in vivo
et in vitro indiquent donc que la peptide deacuteformylase codeacutee par le bacteacuteriophage Vp16T est tregraves
probablement exprimeacutee lors de lrsquoinfection de lrsquohocircte et assure une fonction de deacuteformylation
dans la cellule Dans ce cas quels sont ses substrats A-t-elle une preacutefeacuterence pour les proteacuteines
codeacutees par le bacteacuteriophage est-elle capable de deacuteformyler les proteacuteines de lrsquohocircte Est-elle
capable drsquointeragir avec le ribosome Si oui agit-elle de concert ou au contraire en compeacutetition
avec la PDF de lrsquohocircte Quel est le rocircle drsquoune PDF virale dans le cycle drsquoinfection
Les travaux publieacutes en 2013 par Frank et al suggegraverent que la PDF codeacutee par le
cyanophage S-SSM7 deacuteformylerait preacutefeacuterentiellement les proteacuteines de lrsquohocircte S elongatus
impliqueacutees dans la photosynthegravese 225 La proteacuteine chloroplastique D1 serait particuliegraverement
substrat de la PDF du cyanophage La PDF codeacutee par le bacteacuteriophage contribuerait alors agrave
maintenir un environnement cellulaire favorable pour mener agrave bien sa reacuteplication En effet la
litteacuterature commence agrave documenter de faccedilon plus importante le rocircle des AMGs chez les virus
(auxiliary metabolic genes) dont la fonction est drsquooptimiser le meacutetabolisme de la cellule hocircte
pendant lrsquoinfection 254 Lrsquoexistence de proteacuteines de photosystegraveme codeacutees par les virus marins
est drsquoailleurs un bon exemple de cette strateacutegie adopteacutee par les phages 220255256 Mais la fonction
des AMGs ne semble pas concerner uniquement le meacutecanisme de photosynthegravese des cellules
hocirctes mais pourrait posseacuteder une grande varieacuteteacute de fonction comme le meacutetabolisme du carbone
257 la synthegravese des acides nucleacuteiques 258 ou la toleacuterance aux stress 259 Par la suite jrsquoai donc
tout naturellement chercheacute agrave deacuteterminer si lrsquoenzyme de phage avait des speacutecificiteacutes de substrat
dirigeacutees vers ses propres proteacuteines ou vers celles de son hocircte Jrsquoai pour cela reacutealiseacute des tests
drsquoactiviteacute avec diffeacuterents peptides formyleacutes correspondant au N-terminal des principales
proteacuteines codeacutees par le phage 218 Cette approche nrsquoa pas montreacute de speacutecificiteacute de substrat
particuliegravere de Vp16PDF (voir Chapitre I) ce qui semble indiquer que cette enzyme nrsquoa pas
pour fonction de deacuteformyler preacutefeacuterentiellement les proteacuteines du phage En parallegravele lrsquoanalyse
en spectromeacutetrie de masse sur le proteacuteome N-terminal drsquoE coli exprimant Vp16PDF nrsquoa pas
non plus montreacute de diffeacuterence de speacutecificiteacute de lrsquoenzyme du bacteacuteriophage Neacuteanmoins il est
Discussion
147
possible que Vp16PDF ait une speacutecificiteacute de substrat dirigeacutee vers drsquoautres proteacuteines codeacutees par
son geacutenome ce que nous nrsquoavons pas encore testeacute
La reacutesolution de la structure de Vp16PDF a montreacute que la proteacuteine adopte un repliement
global classique et qursquoen raison de sa seacutequence tronqueacutee en C-terminal elle est deacutepourvue de
lrsquoheacutelice C-terminale typique des PDFs de type 1B comme EcPDF Or la litteacuterature indique
qursquoEcPDF interagit avec le ribosome gracircce agrave son heacutelice α en C-terminal 91 Il nous est donc
apparu crucial de deacuteterminer si une PDF active deacutepourvue drsquoheacutelice α C-terminale avait la
capaciteacute drsquointeragir avec le ribosome Jrsquoai alors reacutealiseacute des eacutetudes drsquointeraction entre Vp16PDF
et les ribosomes drsquoE coli De faccedilon surprenante Vp16PDF interagit bien avec les ribosomes
70S avec une affiniteacute de lrsquoordre du micromolaire ce qui est comparable agrave ce qui avait eacuteteacute publieacute
avec EcPDF 91132 (voir Chapitre II) Cela signifie que contrairement agrave ce qui a pu ecirctre proposeacute
jusqursquoalors lrsquoheacutelice α des PDFs nrsquoest pas lrsquounique deacuteterminant permettant aux peptides
deacuteformylases drsquointeragir avec le ribosome et remet donc en question la theacuteorie actuellement
admise 9194126132 Cela permet eacutegalement drsquoextrapoler que les autres types de PDFs (1A et 2)
dont lrsquoextreacutemiteacute C-terminale adopte un repliement diffeacuterent 4793 peuvent eacutegalement interagir
avec le ribosome selon des meacutecanismes moleacuteculaires qui restent agrave investiguer Les travaux
meneacutes pendant ma thegravese ne nous ont pas permis de deacuteterminer preacuteciseacutement quels reacutesidus de
Vp16PDF sont impliqueacutes lors de la formation du complexe mais jrsquoai malgreacute tout pu montrer
que la reacutegion C-terminale de la proteacuteine et plus particuliegraverement ses deux derniers reacutesidus
jouent un rocircle cleacute dans la fonction de la proteacuteine Lrsquoeacutetude plus approfondie des chimegraveres que
jrsquoai construit permettra alors de mieux comprendre comment une PDF sans heacutelice C-terminale
parvient agrave se lier au ribosome
Jrsquoai en parallegravele chercheacute agrave identifier les proteacuteines ribosomales impliqueacutees dans
lrsquointeraction avec Vp16PDF Il en est ressorti que Vp16PDF viendrait se fixer au niveau de la
proteacuteine ribosomale uL22 tout comme EcPDF 91 Cependant nos donneacutees indiquent qursquoelle
pourrait eacutegalement cibler deux autres sites de fixation lrsquoun au niveau des proteacuteines ribosomales
uL29uL24uL23 et lrsquoautre au niveau des proteacuteines uL25uL30 Ce reacutesultat bien qursquoil doive
ecirctre confirmeacute en utilisant les proteacuteines chimeacuteriques est tregraves inteacuteressant dans la mesure ougrave il
indique que crsquoest probablement lrsquoabsence drsquoheacutelice α chez la peptide deacuteformylase qui entraicircne
une relocalisation de lrsquoenzyme Nous ne savons pas ce qui motive cette PDF agrave interagir
preacutefeacuterentiellement sur lrsquoun ou lrsquoautre des sites ou si deux particules pourraient se fixer
simultaneacutement sur le ribosome comme ce qui semble ecirctre le cas pour la proteacuteine drsquoadressage
SecA 124
Discussion
148
Nous avons eacutegalement voulu nous inteacuteresser au rocircle joueacute par le peptide naissant Pour
cela jai preacutepareacute des ribosomes bloqueacutes en cours de traduction en utilisant la proteacuteine β-
galactosidase agrave laquelle nous avons fusionneacute une seacutequence drsquoarrecirct SecM agrave son extreacutemiteacute C-
terminale Les reacutesultats sont preacuteliminaires mais montrent clairement une diffeacuterence drsquoaffiniteacute
de Vp16PDF selon la longueur de la chaicircne polypeptidique en cours de synthegravese Lrsquoaffiniteacute
semble en effet meilleure lorsque le peptide naissant eacutemerge du tunnel de sortie du ribosome
compareacute agrave des ribosomes vides ou dont le peptide naissant est encore confineacute dans le tunnel de
sortie Ce reacutesultat est en accord avec une eacutetude preacuteceacutedente qui montrait une affiniteacute eacutequivalente
pour un ribosome vide ou contenant un tregraves court peptide 94 Lrsquoaffiniteacute la plus importante a eacuteteacute
obtenue avec un peptide naissant contenant au total 53 reacutesidus drsquoacides amineacutes ce qui est
coheacuterent avec la distance de 13Aring mesureacutee entre lrsquoextreacutemiteacute du tunnel de sortie et le
positionnement putatif du site actif drsquoEcPDF lorsque celle-ci est fixeacutee au ribosome 91
Cependant ces reacutesultats ont eacuteteacute obtenus avec Vp16PDF qui ne contient pas lrsquoheacutelice C-terminale
drsquoEcPDF et qui semble se positionner diffeacuteremment La mecircme approche devra donc ecirctre
appliqueacutee avec EcPDF
Les peptides deacuteformylases ayant une affiniteacute tregraves faible pour le ribosome (de lrsquoordre du
micromolaire Kd = 25 plusmn 10 microM selon Bingel-Erlenmeyer et al 91 Kd ~ 15 microM selon
Bornemann et al 132 et une affiniteacute apparente de lrsquoordre de 1 agrave 2 microM selon notre eacutetude sur
Vp16PDF voir Chapitre II) et eacutetant moins abondantes dans la cellule que les ribosomes
(environ 1300 PDFs par cellule 194 contre environ 50000 ribosomes) il apparaicirct peu probable
que lrsquoenzyme se fixe sur le ribosome et laquo attende raquo que le peptide eacutemerge De plus eacutetant donneacute
que la plupart des facteurs qui agissent sur le peptide naissant degraves sa sortie du ribosome
interviennent au niveau drsquoune plateforme commune drsquointeraction situeacutee agrave proximiteacute du tunnel
de sortie du peptide (incluant les proteacuteines ribosomales bL17 bL22 bL32 uL24 uL29 et uL23)
22126 tout semble indiquer que le peptide naissant sert de signal pour favoriser lrsquointervention de
la PDF Cette hypothegravese peut ecirctre soutenue par le fait qursquoil a eacuteteacute suggeacutereacute que le peptide en cours
de synthegravese sert de signal pour le recrutement du TF 107108 et de la SRP 22138 Cependant il est
encore difficile de savoir si la PDF peut se lier au ribosome de faccedilon simultaneacute avec le TF 94132
Notons qursquoune compeacutetition semble exister entre la PDF et la MetAP Ces donneacutees confortent
ainsi lrsquohypothegravese drsquoune intervention seacutequentielle de plusieurs facteurs des modifications co-
traductionnelles du N-terminal et donc de la peptide deacuteformylase motiveacutee possiblement par la
taille et la nature du peptide naissant
Discussion
149
Concernant les autres types de ribosomes aucune donneacutee nrsquoest actuellement disponible
Les ribosomes chloroplastiques bien qursquoils possegravedent des proteacuteines speacutecifiques preacutesentent les
mecircmes proteacuteines faisant partie de la plateforme commune drsquointeraction des ribosomes
bacteacuteriens 7 Les chloroplastes contiennent des PDFs de type 1B dont la structure preacutesente une
extreacutemiteacute C-terminale sous forme drsquoheacutelice et nous pouvons donc raisonnablement supposer
que le meacutecanisme drsquointeraction est le mecircme que celui deacutecrit chez les procaryotes 91 Quant agrave la
reacutegulation du meacutecanisme de deacuteformylation au niveau du ribosome mitochondrial il est probable
que le meacutecanisme soit diffeacuterent En effet bien que certaines proteacuteines ribosomales universelles
et appartenant agrave la plateforme commune drsquointeraction soient preacutesentes des proteacuteines
mitochondriales speacutecifiques y sont eacutegalement preacutesentes Ainsi nous ne pouvons pas preacutedire la
localisation de la PDF1B dans cet environnement De plus les mitochondries contiennent
eacutegalement des PDF1A dont le domaine C-terminal nrsquoest pas structureacute en heacutelice et dont
nous ne connaissons pas le mode drsquointeraction Enfin il a eacuteteacute suggeacutereacute que le ribosome
mitochondrial posseacutedait un second tunnel de sortie du peptide 8ndash11 Dans ce contexte il est
difficile drsquoimaginer le deacuteroulement de la reacutegulation des modifications co-traductionnelles des
proteacuteines qui eacutemergent au niveau de ce second tunnel
Enfin nous ne savons pas non plus pourquoi certains organismes possegravedent deux types
diffeacuterents de peptides deacuteformylases Une premiegravere hypothegravese se dirige sur leur capaciteacute agrave fixer
des ions meacutetalliques diffeacuterents 183185 Des conditions de stresses pouvant modifier
lrsquohomeacuteostasie dans la cellule et ainsi la disponibiliteacute de certains types drsquoions il est probable
que les organismes qui possegravedent plusieurs types de PDF peuvent continuer agrave controcircler la
deacuteformylation de leur proteacuteome mecircme lorsque les conditions meacutetaboliques changent La
seconde hypothegravese pourrait se diriger vers leur capaciteacute agrave interagir avec le ribosome lorsque
celles-ci possegravedent des structures diffeacuterentes du domaine C-terminal Nous pouvons noter la
preacutesence de peptides deacuteformylases chez les archeacutees qui ne possegravedent pas de meacutethionines
formyleacutees 224 Dans ce cas nous ne connaissons pas le rocircle de ces PDFs putatives
De maniegravere tregraves inteacuteressante jrsquoai montreacute que la PDF du bacteacuteriophage Vp16T provoque
lorsqursquoelle est exprimeacutee agrave des tempeacuteratures infeacuterieures ou eacutegales agrave 30degC un pheacutenotype
drsquoinhibition de la croissance bacteacuterienne et drsquoaccumulation de proteacuteines sous forme drsquoagreacutegats
Notons que les proteacuteines chimegraveres que jrsquoai construit posseacutedant la seacutequence de Vp16PDF
additionneacutee de lrsquoheacutelice α C-terminale drsquoEcPDF ne montrent pas de pheacutenotype drsquoinhibition de
Discussion
150
croissance (voir chapitre III) Cela suggegravere donc que le pheacutenomegravene drsquoinhibition est directement
lieacute agrave lrsquoabsence drsquoheacutelice α chez Vp16PDF Il nrsquoest toutefois pas exclu que les deux derniers
reacutesidus de la proteacuteine puissent jouer un rocircle dans le pheacutenomegravene drsquoinhibition point qui sera
investiguer en eacutetudiant lrsquoaccumulation drsquoagreacutegats lorsque les bacteacuteries expriment non pas
Vp16PDF mais ses chimegraveres
Nous avons eacutegalement montreacute que les cellules exprimant Vp16PDF agrave 30degC preacutesentent
une alteacuteration inattendue de lrsquoenveloppe bacteacuterienne Ce pheacutenotype a eacuteteacute confirmeacute en cultivant
les cellules sur des milieux astringents contenant un antibiotique la vancomycine ou un
deacutetergent le SDS Les cellules exprimant Vp16PDF preacutesentent un pheacutenotype de sensibiliteacute
accrue au SDS et la vancomycine montrant une inhibition de croissance reflet drsquoune
permeacuteabiliteacute de lrsquoenveloppe bacteacuterienne plus importante
Les conseacutequences physiologiques de lrsquoexpression de la PDF du bacteacuteriophage
ressemblent tregraves fortement a ce qui est observeacute chez des mutants des voies drsquoadressage des
proteacuteines membranaires comme SecB 252260 et TF 105261 Etant donneacute que Vp16PDF semble se
fixer au ribosome agrave proximiteacute de lrsquoextreacutemiteacute du tunnel de sortie du peptide naissant nous
supposons que cette proteacuteine pourrait bloquer une ou plusieurs voies de repliement ou
drsquoadressage du peptide en cours de synthegravese aboutissant agrave des proteacuteines qui srsquoagregravegent agrave cause
de leurs deacutefauts de repliement etou drsquoadressage Nos donneacutees indiquant que le pheacutenotype
drsquoinhibition de croissance provoqueacute par Vp16PDF agrave 30degC nrsquoest que peu ou pas observable dans
un contexte double mutant ΔtigΔsecB alors qursquoil est intensifieacute dans un contexte simple mutant
Δtig ou ΔsecB supportent lrsquohypothegravese du lien entre Vp16PDF et la voie TFSecB Dans ce
contexte double mutant drsquoautres voies drsquoadressage des proteacuteines doivent ecirctre mise en place
voies dans lesquelles Vp16PDF nrsquointervient pas Cela peut ecirctre ducirc au fait que les proteacuteines
concerneacutees sont prises en charge de faccedilon post-traductionnelle ou bien parce que les facteurs
impliqueacutes dans un contexte ougrave la voie TFSecB ne fonctionne pas ne possegravedent pas les mecircmes
zones drsquointeraction sur le ribosome et nrsquoentrent donc pas en compeacutetition avec Vp16PDF Les
diffeacuterentes voies drsquoadressage des proteacuteines sont complexes composeacutees drsquoun grand nombre de
facteurs dont plusieurs peuvent ecirctre interchangeables Les donneacutees sont nombreuses mais il
reste pourtant encore beaucoup agrave deacutecouvrir tant ce meacutecanisme semble complexe et finement
reacuteguleacute
Discussion
151
Les phages sont incapables de se reproduire par leurs propres moyens et deacutependent
donc de lrsquohocircte pour se multiplier Lrsquoeacutetape la plus critique est la reacuteplication de leur mateacuteriel
geacuteneacutetique qui neacutecessite drsquoutiliser et de mobiliser la machinerie de traduction cellulaire A
lrsquoissue de ce processus de reacuteplication du geacutenome ainsi qursquoagrave lrsquoassemblage de la particule virale
les phages provoquent le plus souvent la lyse de la cellule hocircte ce qui permet la libeacuteration des
particules virales en vue de leur propagation La phase lytique intervient au moment adeacutequat
du cycle de reacuteplication virale ce qui permet au phage drsquoutiliser suffisamment longtemps le
meacutetabolisme de lrsquohocircte 262 Lrsquoenveloppe bacteacuterienne eacutetant une barriegravere difficile agrave franchir lrsquoune
des strateacutegies principales utiliseacutees par les phages pour laquo sortir raquo de la cellule est la
permeacuteabilisation de cette enveloppe Un certain nombre de phages utilisent alors un couple de
deux proteacuteines appeleacutees endolysines et holines 262263 Ces proteacuteines sont codeacutees par le geacutenome
du phage Les holines permettent de permeacuteabiliser la membrane plasmique en y creacuteant des
pores Les endolysines ont alors la possibiliteacute drsquoatteindre le peptidoglycane afin de le deacutegrader
Lrsquoenveloppe bacteacuterienne est aussitocirct fragiliseacutee ce qui provoque la lyse bacteacuterienne et la
libeacuteration des particules virales
Le cycle lytique du phage Vp16T nrsquoest pas deacutecrit mais son geacutenome ne semble pas
contenir de gegravenes codant des endolysines ou holines 218 au contraire drsquoautres phages infectant
la bacteacuterie Vibrio parahaemolyticus 264 En revanche nous avons observeacute que la peptide
deacuteformylase codeacutee par Vp16T interfegravere avec la voie de repliement et drsquoadressage TFSec
provoque lrsquoaccumulation de proteacuteines sous forme drsquoagreacutegats et deacutestabilise lrsquoenveloppe
bacteacuterienne aboutissant pour finir agrave la lyse des cellules Par ailleurs la sensibiliteacute des bacteacuteries
agrave lantibiotique vancomycine suggegravere une fragilisation de la membrane externe en reacuteponse agrave
lexpression de Vp16PDF (voir Chapitre III) Sachant que les mutants de la voie TF preacutesentent
un deacutefaut de synthegravese de proteacuteines membranaires notamment les porines OMPs 105246249 nous
pouvons poser lrsquohypothegravese que nous trouverons une accumulation plus importante dOMPs
dans les agreacutegats provoqueacutes par lrsquoexpression de Vp16PDF Nos reacutesultats semblent alors
indiquer que le phage Vp16T utiliserait un meacutecanisme tout agrave fait original de lyse alternatif agrave
celui des holinesendolysines induit par la PDF Cette enzyme pourrait alors jouer un double
rocircle Celui drsquoassurer un taux de deacuteformylation optimal dans la cellule beacuteneacutefique pour le bon
deacuteroulement de la traduction des proteacuteines de lrsquohocircte comme celui de ses propres proteacuteines
mais eacutegalement celui de fragiliser lrsquoenveloppe bacteacuterienne en perturbant une voie de repliement
et drsquoadressage des proteacuteines membranaires afin de pouvoir libeacuterer les particules virales lors de
la phase lytique
Discussion
152
Enfin comme deacutecrit dans lrsquointroduction les peptides deacuteformylases sont des cibles
theacuterapeutiques inteacuteressantes 130197199 De nos jours les inhibiteurs sont dirigeacutes vers le site actif
de lrsquoenzyme Lrsquoapprofondissement des connaissances quant au mode drsquointeraction de ces
enzymes avec le ribosome pourrait permettre la synthegravese de nouveaux inhibiteurs dirigeacutes non
pas vers le site actif mais vers le(s) domaine(s) drsquointeraction avec le ribosome Depuis
maintenant presque un siegravecle la theacuterapie phagique est utiliseacutee pour lutter contre les infections
bacteacuteriennes 265 Lrsquoeacutetude et la compreacutehension des meacutecanismes drsquoinfection des phages est donc
drsquoune grande importance drsquoun point de vue theacuterapeutique Ainsi toute deacutecouverte de fonction
enzymatique jusqursquoalors insoupccedilonneacutee chez les phages pourrait ecirctre importante pour
lrsquoutilisation de ce type de theacuterapie
Discussion
153
Mateacuteriels et Meacutethodes
154
Mateacuteriels et Meacutethodes
Mateacuteriels et Meacutethodes
155
Discussion
156
A-Techniques de biologie moleacuteculaire
A1-Souches bacteacuteriennes
Les souches drsquoE coli utiliseacutees pour la biologie moleacuteculaire sont reacutepertorieacutees dans le Tableau
MM-1
Tableau MM-1 Souches drsquoE coli utiliseacutees pour la biologie moleacuteculaire
A2 ndash Protocole
1) Ensemble des constructions plasmidiques
Le gegravene de 417 pb codant la proteacuteine Vp16PDF wt a eacuteteacute syntheacutetiseacute par lrsquoentreprise
GeneArt et cloneacute dans un vecteur pBADMyc-HisA (Invitrogen) en utilisant les sites de
restriction BspHI et PstI (lrsquoutilisation de ces sites de restriction exclut lrsquoeacutetiquette 6xHis
contenue dans le plasmide) LrsquoORF60 preacutesente dans le geacutenome du bacteacuteriophage Vp16T eacutetant
tregraves riche en GC 218 la seacutequence nucleacuteotidique codant Vp16PDF a eacuteteacute conccedilue avec optimisation
de codons pour une expression optimale en systegraveme bacteacuterien (voir la seacutequence nucleacuteotidique
et proteacuteique de Vp16PDF wt dans le Tableau MM-2) Le plasmide a eacuteteacute introduit dans la souche
drsquoE coli K12 (dam+ et dcm+) pour ecirctre amplifieacute puis a eacuteteacute purifieacute Le plasmide lyophiliseacute (5microg)
nous a ensuite eacuteteacute envoyeacute lequel a alors eacuteteacute resuspendu dans 50 microL drsquoeau milliQ
Le gegravene de 495 pb codant la chimegravere Vp16PDF(KLF)heacutelice a eacutegalement eacuteteacute syntheacutetiseacute
par lrsquoentreprise GeneArt eacutegalement avec optimisation de codons Le gegravene contient la seacutequence
codante drsquoEcPDF (K141LFMDYLSPLKQQRIRQKVEKLDRLKARA169) fusionneacutee en C-
terminal du gegravene codant Vp16PDF (apregraves le 134egraveme reacutesidu voir Tableau MM-2) il a eacuteteacute cloneacute
dans le vecteur pBADMyc-HisA avec les sites de restriction NcoI et XhoI (lrsquoutilisation de ces
sites de restriction exclut lrsquoeacutetiquette 6xHis contenue dans le plasmide)
Les gegravenes de 495 pb codant les chimegraveres Vp16PDF(VTI)heacutelice et Vp16PDF(VTF)heacutelice
ont eacuteteacute obtenus par mutageacutenegravese dirigeacutee (voir la proceacutedure paragraphe 2) agrave partir du gegravene codant
Vp16PDF(KLF)heacutelice preacutesent dans le plasmide pBADMyc-HisA de faccedilon agrave remplacer les
reacutesidus K132L133F134 par V132T133I134 ou V132T133F134 respectivement
Souche Geacutenotype Source
DH5 fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80 lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1
endA1 thi-1 hsdR17 Invitrogen
Tg1 K-12 supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rK-mK
-) Lucigen
NEB Turbo F proA+B+ lacIq ∆lacZM15 fhuA2 ∆(lac-proAB) glnV galK16 galE15 R(zgb-210Tn10)TetS endA1 thi-1 ∆(hsdS-mcrB)5
Novagen
Mateacuteriels et Meacutethodes
157
Les mutants drsquoEcPDF ont eacutegalement eacuteteacute obtenus par mutageacutenegravese dirigeacutee notons que la
version sauvage drsquoEcPDF est eacutegalement nommeacutee EcPDF(KLF) pour mettre lrsquoaccent sur les
reacutesidus qui sont muteacutes par la suite EcPDF(KLI) et EcPDF(VTI) ont eacuteteacute produits par la
substitution des reacutesidus K141L142F143 drsquoEcPDF par K141L142I143 ou V141T142I143
respectivementLes versions tronqueacutees et muteacutees drsquoEcPDF EcPDF(KLF)ΔC-ter
EcPDF(KLI)ΔC-ter et EcPDF(VTI)ΔC-ter ont eacuteteacute construites respectivement agrave partir des gegravenes
codant EcPDF wt EcPDF(KLI) et EcPDF(VTI) dans lesquels un double codon stop a eacuteteacute inseacutereacute
apregraves le codon correspondant au 144egraveme acide amineacute
Le gegravene sauvage codant EcPDF eacutetait preacutesent initialement dans un plasmide pBADMyc-
HisA ainsi que dans un plasmide pET-22b(+) Toutes les mutations ont eacuteteacute effectueacutees agrave la fois
dans les gegravenes contenus dans le plasmide pBADMyc-HisA mais eacutegalement dans ceux contenus
dans le pET-22b(+)
Lrsquoensemble des constructions utiliseacutees au cours de ce travail est reacutepertorieacute dans les
tableaux MM-2 et MM-3
Mateacuteriels et Meacutethodes
147
Tableau MM-2 Seacutequences geacutenomiques et proteacuteiques de Vp16PDF dans ses versions wt et chimeacuteriques
Les reacutesidus muteacutes sont repreacutesenteacutes en rouge Lrsquoextreacutemiteacute C-terminale drsquoEcPDF qui est ajouteacutee agrave la seacutequence de Vp16PDF est repreacutesenteacutee en vert
Version de Vp16PDF Seacutequence geacutenomique Seacutequence proteacuteique
wt
ATGAAAATTCTGAAAGATGATGCACCGGAACTGCATGCAATTGCAGCCGAAGTTCCGCATGGTGAAGATGTTAAAGATCTGGTTCTGGA
TATGACCGCAGCAATGACCGCAGCCGGTGGTATTGGTCTGGCAGGTAATCAGGTTGGTGTTCTGAAACGTATTATTGTTCTGCGTTGCC
CGACCTTTAAAGGTTGTGTTATTAATCCGATTATTACCCGTCATACCGATGGTCATGTTTATAGTCCGGAAGGTTGTCTGAGCTATCCG
GGTAAAACCGTTGCAAAAAAACGTCGTAATAAAGTTGTGGTGGAAGGCTATGATATGGATTGGCAGCCGATTACCATTGCAGCAAAAGG
TCTGACCGCATTTTGTCTGCAACATGAAATTGATCATCTGAATGGCGTGACCATTTAATAA
MKILKDDAPE LHAIAAEVPH
GEDVKDLVLD MTAAMTAAGG
IGLAGNQVGV LKRIIVLRCP
TFKGCVINPI ITRHTDGHVY
SPEGCLSYPG KTVAKKRRNK
VVVEGYDMDW QPITIAAKGL
TAFCLQHEID HLNGVTI
Vp16PDF(KLF)heacutelice
ATGAAAATCCTGCATGATGATGCACCGGAACTGCATGCCATTGCAGCCGAAGTTCCGCATGGTGAAGATGTTAAAGATCTGGTTCTGGA
TATGACCGCAGCAATGACAGCAGCCGGTGGTATTGGTCTGGCAGGTAATCAGGTTGGTGTTCTGAAACGTATTATTGTTCTGCGTTGTC
CGACATTTAAAGGCTGTGTTATTAACCCGATTATCACCCGTCATACCGATGGTCATGTTTATAGTCCGGAAGGTTGTCTGAGCTATCCG
GGTAAAACCGTTGCAAAAAAACGTCGTAATAAAGTGGTGGTGGAAGGCTATGATATGGATTGGCAGCCGATTACCATTGCCGCAAAAGG
TCTGACCGCATTTTGTCTGCAGCATGAAATTGATCATCTGAACGGCGTAACGATAATGGATTATCTGAGTCCGCTGAAACAGCAGCGTA
TTCGTCAGAAAGTTGAAAAACTGGATCGTCTGAAAGCACGTGCCTAATAA
MKILKDDAPE LHAIAAEVPH
GEDVKDLVLD MTAAMTAAGG
IGLAGNQVGV LKRIIVLRCP
TFKGCVINPI ITRHTDGHVY
SPEGCLSYPG KTVAKKRRNK
VVVEGYDMDW QPITIAAKGL
TAFCLQHEID HLNGKLFMDY
LSPLKQQRIR QKVEKLDRLK
ARA
Vp16PDF(VTI)heacutelice
ATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGGAACTGCATGCCATTGCAGCCGAAGTTCCGCATgGTGAAGATGTTAAAGATCTGGTTCTGGA
TATGACCGCAGCAATGACAGCAGCCGGTGGTATTGGTCTGGCAGGTAATCAGGTTGGTGTTCTGAAACGTATTATTGTTCTGCGTTGTC
CGACATTTAAAGGCTGTGTTATTAACCCGATTATCACCCGTCATACCGATGGTCATGTTTATAGTCCGGAAGGTTGTCTGAGCTATCCG
GGTAAAACCGTTGCAAAAAAACGTCGTAATAAAGTGGTGGTGGAAGGCTATGATATGGATTGGCAGCCGATTACCATTGCCGCAAAAGG
TCTGACCGCATTTTGTCTGCAGCATGAAATTGATCATCTGAACGGCGTAACGATAATGGATTATCTGAGTCCGCTGAAACAGCAGCGTA
TTCGTCAGAAAGTTGAAAAACTGGATCGTCTGAAAGCACGTGCCTAATAA
MKILKDDAPE LHAIAAEVPH
GEDVKDLVLD MTAAMTAAGG
IGLAGNQVGV LKRIIVLRCP
TFKGCVINPI ITRHTDGHVY
SPEGCLSYPG KTVAKKRRNK
VVVEGYDMDW QPITIAAKGL
TAFCLQHEID HLNGVTIMDY
LSPLKQQRIR QKVEKLDRLK
ARA
Vp16PDF(VTF)heacutelice
ATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGGAACTGCATGCCATTGCAGCCGAAGTTCCGCATGGTGAAGATGTTAAAGATCTGGTTCTGGA
TATGACCGCAGCAATGACAGCAGCCGgtGGTATTGGTCTGGCAGGTAATCAGGTTGGTGTTCTGAAACGTATTATTGTTCTGCGTTGTC
CGACATTTAAAGGCTGTGTTATTAACCCGATTATCACCCGTCATACCGATGGTCATGTTTATAGTCCGGAAGGTTGTCTGAGCTATCCG
GGTAAAACCGTTGCAAAAAAACGTCGTAATAAAGTGGTGGTGGAAGGCTATGATATGGATTGGCAGCCGATTACCATTGCCGCAAAAGG
TCTGACCGCATTTTGTCTGCAGCATGAAATTGATCATCTGAACGGCGTAACGTTCATGGATTATCTGAGTCCGCTGAAACAGCAGCGTA
TTCGTCAGAAAGTTGAAAAACTGGATCGTCTGAAAGCACGTGCCTAA
MKILKDDAPE LHAIAAEVPH
GEDVKDLVLD MTAAMTAAGG
IGLAGNQVGV LKRIIVLRCP
TFKGCVINPI ITRHTDGHVY
SPEGCLSYPG KTVAKKRRNK
VVVEGYDMDW QPITIAAKGL
TAFCLQHEID HLNGVTFMDY
LSPLKQQRIR QKVEKLDRLK
ARA
Mateacuteriels et Meacutethodes
148
Tableau MM-3 Seacutequences geacutenomiques et proteacuteiques drsquoEcPDF dans ses versions wt et mutantes
Version de EcPDF Seacutequences geacutenomiques Seacutequences proteacuteiques
wt
(proteacuteine eacutegalement
appeleacutee EcPDF(KLF)
ATGTCAGTTTTGCAAGTGTTACATATTCCGGACGAGCGGCTTCGCAAAGTTGCTAAACCGGTAGAAGAAGTGAATGC
AGAAATTCAGCGTATCGTCGATGATATGTTCGAGACGATGTACGCAGAAGAAGGTATTGGCCTGGCGGCAACCCAGG
TTGATATCCATCAACGTATCATTGTTATTGATGTTTCGGAAAACCGTGACGAACGGCTAGTGTTAATCAATCCAGAG
CTTTTAGAAAAAAGCGGCGAAACAGGCATTGAAGAAGGTTGCCTGTCGATCCCTGAACAACGTGCTTTAGTGCCGCG
CGCAGAGAAAGTTAAAATTCGCGCCCTTGACCGCGACGGTAAACCATTTGAACTGGAAGCAGACGGTCTGTTAGCCA
TCTGTATTCAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCAAACTGTTTATGGATTATCTGTCACCGCTGAAACAACAACGT
ATTCGTCAGAAAGTTGAAAAACTGGATCGTCTGAAAGCCCGGGCTTAA
MSVLQVLHIP DERLRKVAKP
VEEVNAEIQR IVDDMFETMY
AEEGIGLAAT QVDIHQRIIV
IDVSENRDER LVLINPELLE
KSGETGIEEG CLSIPEQRAL
VPRAEKVKIR ALDRDGKPFE
LEADGLLAIC IQHEMDHLVG
KLFMDYLSPL KQQRIRQKVE
KLDRLKARA
EcPDF(KLI)
ATGTCAGTTTTGCAAGTGTTACATATTCCGGACGAGCGGCTTCGCAAAGTTGCTAAACCGGTAGAAGAAGTGAATGC
AGAAATTCAGCGTATCGTCGATGATATGTTCGAGACGATGTACGCAGAAGAAGGTATTGGCCTGGCGGCAACCCAGG
TTGATATCCATCAACGTATCATTGTTATTGATGTTTCGGAAAACCGTGACGAACGGCTAGTGTTAATCAATCCAGAG
CTTTTAGAAAAAAGCGGCGAAACAGGCATTGAAGAAGGTTGCCTGTCGATCCCTGAACAACGTGCTTTAGTGCCGCG
CGCAGAGAAAGTTAAAATTCGCGCCCTTGACCGCGACGGTAAACCATTTGAACTGGAAGCAGACGGTCTGTTAGCCA
TCTGTATTCAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCAAACTGATTATGGATTATCTGTCACCGCTGAAACAACAACGT
ATTCGTCAGAAAGTTGAAAAACTGGATCGTCTGAAAGCCCGGGCTTAA
MSVLQVLHIP DERLRKVAKP
VEEVNAEIQR IVDDMFETMY
AEEGIGLAAT QVDIHQRIIV
IDVSENRDER LVLINPELLE
KSGETGIEEG CLSIPEQRAL
VPRAEKVKIR ALDRDGKPFE
LEADGLLAIC IQHEMDHLVG
KLIMDYLSPL KQQRIRQKVE
KLDRLKARA
EcPDF(VTI)
ATGTCAGTTTTGCAAGTGTTACATATTCCGGACGAGCGGCTTCGCAAAGTTGCTAAACCGGTAGAAGAAGTGAATGC
AGAAATTCAGCGTATCGTCGATGATATGTTCGAGACGATGTACGCAGAAGAAGGTATTGGCCTgGCGGCAACCCAGG
ttGATATCCATCAACGTATCATTGTTATTGATGTTTCGGAAAACCGTGACGAACGGCTAGTGTTAATCAATCCAGAG
CTTTTAGAAAAAAGCGGCGAAACAGGCATTGAAGAAGGTTGCCTGTCGATCCCTGAACAACGTGCTTTAGTGCCGCG
CGCAGAGAAAGTTAAAATTCGCGCCCTTGACCGCGACGGTAAACCATTTGAACTGGAAGCAGACGGTCTGTTAGCCA
TCTGTATTCAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCGTGACCATTATGGATTATCTGTCACCGCTGAAACAACAACGT
ATTCGTCAGAAAGTTGAAAAACTGGATCGTCTGAAAGCCCGGGCTTAA
MSVLQVLHIP DERLRKVAKP
VEEVNAEIQR IVDDMFETMY
AEEGIGLAAT QVDIHQRIIV
IDVSENRDER LVLINPELLE
KSGETGIEEG CLSIPEQRAL
VPRAEKVKIR ALDRDGKPFE
LEADGLLAIC IQHEMDHLVG
VTIMDYLSPL KQQRIRQKVE
KLDRLKARA
Mateacuteriels et Meacutethodes
149
Les acides amineacutes muteacutes par rapport agrave la version sauvage sont repreacutesenteacutes en rouge La seacutequence proteacuteique correspondant agrave la seacutequence sauvage drsquoEcPDF est repreacutesenteacutee en
vert
EcPDF(KLF)ΔC-ter
ATGGCAGTTTTGCAAGTGTTACATATTCCGGACGAGCGGCTTCGCAAAGTTGCTAAACCGGTAGAAGAAGTGAATGCA
GAAATTCAGCGTATCGTCGATGATATGTTCGAGACGATGTACGCAGAAGAAGGTATTGGCCTGGCGGCAACCCAGGTT
GATATCCATCAACGTATCATTGTTATTGATGTTTCGGAAAACCGTGACGAACGGCTAGTGTTAATCAATCCAGAGCTT
TTAGAAAAAAGCGGCGAAACAGGCATTGAAGAAGGTTGCCTGTCGATCCCTGAACAACGTGCTTTAGTGCCGCGCGCA
GAGAAAGTTAAAATTCGCGCCCTTGACCGCGACGGTAAACCATTTGAACTGGAAGCAGACGGTCTGTTAGCCATCTGT
ATTCAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCAAACTGTTTTAATAA
MAVLQVLHIP DERLRKVAKP
VEEVNAEIQR IVDDMFETMY
AEEGIGLAAT QVDIHQRIIV
IDVSENRDER LVLINPELLE
KSGETGIEEG CLSIPEQRAL
VPRAEKVKIR ALDRDGKPFE
LEADGLLAIC IQHEMDHLVG
KLF
EcPDF(KLI)ΔC-ter
ATGGCAGTTTTGCAAGTGTTACATATTCCGGACGAGCGGCTTCGCAAAGTTGCTAAACCGGTAGAAGAAGTGAATGCA
GAAATTCAGCGTATCGTCGATGATATGTTCGAGACGATGTACGCAGAAGAAGGTATTGGCCTGGCGGCAACCCAGGTT
GATATCCATCAACGTATCATTGTTATAAGCGGCGAAACAGGCATTGAAGAAGGTTGCCTGTCGATCCCTGAACAACGT
GCTTTAGTGCCGCGCGCAGAGAAAGTTAAAATTCGCGCCCTTGACCGCGACGGTAAACCATTTGAACTGGAAGCAGAC
GGTCTGTTAGCCATCTGTATTCAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCAAACTGATTTAATAA
MAVLQVLHIP DERLRKVAKP
VEEVNAEIQR IVDDMFETMY
AEEGIGLAAT QVDIHQRIIV
IDVSENRDER LVLINPELLE
KSGETGIEEG CLSIPEQRAL
VPRAEKVKIR ALDRDGKPFE
LEADGLLAIC IQHEMDHLVG
KLI
EcPDF(VTI)ΔC-ter
ATGGCAGTTTTGCAAGTGTTACATATTCCGGACGAGCGGCTTCGCAAAGTTGCTAAACCGGTAGAAGAAGTGAATGCA
GAAATTCAGCGTATCGTCGATGATATGTTCGAGACGATGTACGCAGAAGAAGGTATTGGCCTGGCGGCAACCCAGGTT
GATATCCATCAACGTATCATTGTTATTGATGTTTCGGAAAACCGTGACGAACGGCTAGTGTTAATCAATCCAGAGCTT
TTAGAAAAAAGCGGCGAAACAGGCATTGAAGAAGGTTGCCTGTCGATCCCTGAACAACGTGCTTTAGTGCCGCGCGCA
GAGAAAGTTAAAATTCGCGCCCTTGACCGCGACGGTAAACCATTTGAACTGGAAGCAGACGGTCTGTTAGCCATCTGT
ATTCAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCGTGACCATTTAATAA
MAVLQVLHIP DERLRKVAKP
VEEVNAEIQR IVDDMFETMY
AEEGIGLAAT QVDIHQRIIV
IDVSENRDER LVLINPELLE
KSGETGIEEG CLSIPEQRAL
VPRAEKVKIR ALDRDGKPFE
LEADGLLAIC IQHEMDHLVG
VTI
Mateacuteriels et Meacutethodes
150
2) Mutageacutenegravese dirigeacutee
La mutagenegravese dirigeacutee est utiliseacutee pour substituer deacuteleacuteter ou ajouter un petit nombre
drsquoacides amineacutes Pour cela nous avons utiliseacute le kit QuickChange Mutagenesis site-directed de
Stratagene Les amorces ont eacuteteacute conccedilues avec le serveur PrimerX
(httpwwwbioinformaticsorgprimerxcgi-binprotein_1cgi) dont les paramegravetres par deacutefaut
ont eacuteteacute modifieacutes le pourcentage de GC doit ecirctre compris entre 30 agrave 60 la longueur de 25
agrave 70 pb le Tm de la reacutegion apparieacutee compris entre 50 et 55degC et il est eacutegalement preacutefeacuterable que
lrsquooligonucleacuteotide se termine par un nucleacuteotide G ou C (ce qui eacutevite des appariements non
speacutecifiques) La tempeacuterature de deacuteshybridation des brins doit-ecirctre comprise entre 75 et 85degC
On preacutepare le mix reacuteactionnel suivant 5 microL de laquo 10X reaction buffer raquo auquel on ajoute 25 ng
drsquoADN 15 pmoles de chacun des oligonucleacuteotides (voir Tableaux MM-4 et MM-5) 02 mM
de dNTP mix (Agilent) et H2O pour compleacuteter agrave 49 microL On ajoute alors 1 μL de PfuUltra HF
DNA polymerase (concentration initiale 25 Uμl Agilent) Une premiegravere incubation de 1 min
agrave 95degC est reacutealiseacutee suivie du programme PCR suivant 45 sec agrave 95degC pour deacutesapparier les brins
drsquoADN puis 1 min agrave 55degC pour hybrider les amorces sur lrsquoADN et enfin 9 min agrave 72degC pour
permettre agrave la polymeacuterase de reacutepliquer le plasmide 18 cycles de PCR sont neacutecessaires pour
obtenir le mateacuteriel final A la fin des 18 cycles une derniegravere incubation de 10 min agrave 72degC est
reacutealiseacutee On ajoute ensuite 1microL de lrsquoenzyme DpnI (Thermofisher Scientific) qui permet de
digeacuterer les brins matrices meacutethyleacutes qui nrsquoont pas incorporeacute les mutations Lrsquoincubation se fait
durant 2h agrave 37degC Les plasmides sont alors utiliseacutes pour transformer la souche bacteacuterienne NEB
turbo Les clones obtenus sont mis en preacuteculture afin de reacutealiser une extraction plasmidique et
un seacutequenccedilage des plasmides par lrsquoentreprise GATC Biotech
Tableau MM-4 Couples drsquoamorccediles utiliseacutes pour la mutation des reacutesidus V132T133I134 de Vp16PDF avec
heacutelice
Constructions Seacutequences des amorces
Vp16PDF(VTI)heacutelice CTGAACGGCGTAACGATAATGGATTATCTGAGTCCGCTG
CAGCGGACTCAGATAATCCATTATCGTTACGCCGTTCAG
Vp16PDF(VTF)heacutelice CTGAACGGCGTAACGTTTATGGATTATCTGAGTCCGCTG
CAGCGGACTCAGATAATCCATAAACGTTACGCCGTTCAG
Les seacutequences des amorces (ThermoFisher Scientific) dans les sens laquo forward raquo puis laquo reverse raquo sont preacutesenteacutees
de 5rsquo en 3rsquo Les nucleacuteotides correspondant aux acides amineacutes muteacutes sont repreacutesenteacutes en rouge
Mateacuteriels et Meacutethodes
151
Tableau MM-5 Couples drsquoamorccediles utiliseacutes pour la mutation des reacutesidus 141 agrave 143 drsquoEcPDF wt
Constructions Seacutequences des amorces
EcPDF(KLI) CACCTGGTCGGCAAACTGATTATGGATTATCTGTCACC GGTGACAGATAATCCATAATCAGTTTGCCGACCAGGTG
EcPDF(VTI) CACCTGGTCGGCGTCACCATC ATGGATTATCTGTCACC CAGCGGTGACAGATAATCCTAGATGGTGACGCCGACCAGG
EcPDF(KLF)ΔC-ter CCTGGTCGGCAAACTGTTTTAGGATTATCTGTCACCGCTG
CAGCGGTGACAGATAATCCTAAAACAGTTTGCCGACCAGG
EcPDF(KLI)ΔC-ter GATGGATCACCTGGTCGGCAAACTGATCTAGGATTATCTGTCACCGCTGAAACAAC
GTTGTTTCAGCGGTGACAGATAATCCTAGATCAGTTTGCCGACCAGGTGATCCATC
EcPDF(VTI)ΔC-ter
CAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCGTCACCATCTAGGATTATCTGTCACCGCT
GAAACAAC
GTTGTTTCAGCGGTGACAGATAATCCTAGATGGTGACGCCGACCAGGTGATCCATCTCATGCTG
Les seacutequences des amorces (ThermoFisher Scientific) dans les sens laquo forward raquo puis laquo reverse raquo sont preacutesenteacutees
de 5rsquo en 3rsquo Les nucleacuteotides correspondant aux acides amineacutes muteacutes sont repreacutesenteacutes en rouge
3) Sous-clonage des gegravenes des chimegraveres de Vp16PDF preacutesentes
dans le plasmide pBAD vers le vecteur pET-16b Les gegravenes des proteacuteines chimeacuteriques eacutetaient initialement preacutesents dans un plasmide
pBAD utiliseacute pour reacutealiser les tests de compleacutementation fonctionnelle (voir plus loin)
Cependant afin de pouvoir surexprimer les proteacuteines et les purifier il a eacuteteacute neacutecessaire de sous-
cloner ces gegravenes dans un plasmide drsquoexpression permettant drsquoobtenir des quantiteacutes plus
importantes de proteacuteines Les gegravenes ont donc eacuteteacute sous-cloneacutes dans le vecteur pET-16b
(Novagen carte du plasmide en annexe)
Le meacutelange reacuteactionnel pour lrsquoamplification par PCR est le suivant 3 ng de plasmide 50
pmoles de chacun des oligonucleacuteotides (voir Tableau MM-6) 1 mM de dNTP (Agilent) 5 microL
de tampon de reacuteaction 10X 1 microL de Pfu DNA polymerase (Agilent 25 uniteacutesmicroL) dans 50 microL
final Le programme PCR se compose drsquoune eacutetape de deacutenaturation agrave 95degC durant 1 min puis 1
min drsquohybridation agrave 55degC et une eacutetape de synthegravese agrave 72degC durant 2 min On reacutealise 30 cycles
de deacutenaturationhybridationpolymeacuterisation et agrave la fin des cycles une derniegravere incubation de
10 min agrave 72degC est reacutealiseacutee Les amorces utiliseacutees pour amplifier les gegravenes (voir Tableau MM-
6) insegraverent des sites BspHI et XhoI aux extreacutemiteacutes 5rsquo et 3rsquo respectivement On purifie les
produits de PCR avec un kit speacutecifique (QIAquick PCR purification kit de Qiagen) Une fois
purifieacutes les produits de PCR sont alors digeacutereacutes par les enzymes BspHI et XhoI durant 20 min
agrave 37degC Le plasmide vide pET-16b est digeacutereacute avec lrsquoenzyme XhoI ainsi qursquoavec lrsquoenzyme NcoI
qui geacutenegravere des extreacutemiteacutes compatibles avec celles geacuteneacutereacutees par BspHI Pour la ligation nous
Mateacuteriels et Meacutethodes
152
avons utiliseacute 300 ng de pET-16b digeacutereacute 220 ng de produit de PCR purifieacute et digeacutereacute 2 microL de
T4 DNA ligase (Invitrogen 1 uniteacutemicroL) et 2 microL de tampon 10X dans un volume finale de 20
microL Les eacutechantillons sont incubeacutes agrave 22degC durant 4h Suite agrave la ligation le produit de reacuteaction
est transformeacute dans des bacteacuteries thermocompeacutetentes DH5α (voir protocole de transformation)
Les clones obtenus sont alors cribleacutes par PCR Pour cela nous reacutealisons pour chaque colonie
une reacuteaction de 25 microL final comprenant 15 microL de tampon 10X 02 mM de dNTP 2 mM
MgCl2 1 microL drsquoamorce T7 promoteur et T7 terminateur agrave4 pmolmicroL et 01 microL de Taq
Polymerase (Eurobio Taq 05U ) Le mix est tout drsquoabord preacutepareacute dans un volume final de 15
microL En parallegravele une colonie du clone agrave cribler est piqueacutee avec une pointe et meacutelangeacutee dans 10
microL drsquoeau (on repique eacutegalement ce clone sur boicircte LB agar contenant 25 microgmL drsquoampicilline
que lrsquoon incube la journeacutee agrave 37degC) On ajoute ensuite les 10 microL contenant la colonie dilueacutee dans
le mix PCR de 15 microL pour obtenir un volume finale de reacuteaction de 25 microL On utilise ensuite le
programme PCR suivant pour amplifier le plasmide preacutesent dans la colonie 3 min agrave 94degC pour
deacutesapparier les brins drsquoADN puis des cycles comprenant 30 sec agrave 94degC 30 sec agrave 52degC pour
hybrider les amorces sur lrsquoADN et enfin 3 min agrave 72degC pour permettre agrave la polymeacuterase de
reacutepliquer le plasmide Il faut reacutealiser 30 cycles de PCR pour obtenir le mateacuteriel final A la fin
des 30 cycles une derniegravere incubation de 10 min agrave 72degC est reacutealiseacutee Le produit de PCR est
alors analyseacute sur gel drsquoagarose 1 Les clones positif sont alors mis en preacuteculture dans 5 mL
de milieu LB liquide avec 25 microgmL drsquoampicilline et incubeacutes la nuit agrave 37degC On reacutealise le
lendemain une extraction des plasmides (voir extraction de plasmide avec le kit miniprep) Les
ADN purifieacutes sont alors envoyeacutes agrave lrsquoentreprise GATC Biotech pour ecirctre seacutequenceacutes
Tableau MM-6 Couples drsquoamorces permettant le transfert des gegravenes codant les chimegraveres de
Vp16PDF du plasmide pBADMyc-HisA vers le vecteur pET-16b
Constructions Seacutequences
Vp16PDF(KLF)heacutelice TACGACTCATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGG
ACCTGTCTCGAGTTATTAGGCACGTGCTTTCAGACG
Vp16PDF(VTI)heacutelice TACGACTCATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGG
ACCTGTCTCGAGTTATTAGGCACGTGCTTTCAGACG
Vp16PDF(VTF)heacutelice TACGACTCATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGG
ACCTGTCTCGAGTTATTAGGCACGTGCTTTCAGACG
Les seacutequences des amorces dans les sens laquo forward raquo puis laquo reverse raquo sont preacutesenteacutees de 5rsquo en 3rsquo Les sites de
restriction sont souligneacutes Les codons drsquoinitiation et de terminaison sont indiqueacutes respectivement en rouge et vert
Mateacuteriels et Meacutethodes
153
4) Preacuteparation des cellules thermocompeacutetentes
Les bacteacuteries thermocompeacutetentes ont eacuteteacute preacutepareacutees selon la meacutethode drsquoInoue
Tampon et milieu
Milieu SOB 2 bactotryptone 05 extrait de levures 10 mM NaCl 25 mM KCl 25 mM
MgCl2 10 mM MgSO4 pH64 Le milieu est autoclaveacute
Tampon TB 10 mM Pipes 55 mM MnCl2 15 mM CaCl2 250 mM KCl pH 67 Le tampon
est filtreacute et non autoclaveacute
Protocole
On reacutealise une preacuteculture de la souche souhaiteacutee (voir tableau MM-1) dans 7 mL de
milieu LB contenant les antibiotiques approprieacutes le cas eacutecheacuteant La preacuteculture est alors incubeacutee
la nuit agrave 37degC sous agitation (200 rpm) Ensuite on ensemence les cultures dans du milieu SOB
avec 250 microL de preacuteculture et lrsquoantibiotique si neacutecessaire La culture est reacutealiseacutee agrave 18degC sous
agitation (170 rpm) Lorsque la DO600 est voisine de 06 la culture est mise 10 min dans la
glace On centrifuge alors la culture agrave 2500 g 10 min agrave 4degC La re-suspension du culot se fait
de maniegravere douce dans 80 mL de TB froid On laisse reposer 10 min dans la glace On centrifuge
de nouveau lrsquoeacutechantillon agrave 2500 g 10 min agrave 4degC On resuspend cette fois le culot dans 20 mL
de TB froid On ajoute du DMSO agrave 7 final On laisse reposer 10 min dans la glace On reacutealise
des aliquotes de 200 microL que lrsquoon plonge dans lrsquoazote liquide Les bacteacuteries thermocompeacutetentes
sont ensuite stockeacutees agrave -80degC
Pour les souches MG1655 wt et mutantes (Tableau MM-8) le protocole de preacuteparation
des cellules thermocompeacutetentes est le suivant On reacutealise une culture de 30 mL de milieu LB
avec 300 microL de 1M MgSO4 50 microgmL drsquoampicilline et 300 microL de preacuteculture (incubeacutee la nuit agrave
37degC) La culture est incubeacutee 2h agrave 37degC (DO600 environ eacutegale agrave 04) On centrifuge la culture
durant 5 min agrave 5000 rpm agrave 4degC puis on resuspend le culot dans 10 mL de 01 M CaCl2 froid
puis on laisse reposer 20 min dans la glaceOn centrifuge alors la solution bacteacuterienne agrave 6000
rpm agrave 4degC durant 5 min puis on reprend le culot dans 1 mL de 01 M CaCl2 contenant 15 de
glyceacuterol On aliquote ensuite 100 microL par tube
Mateacuteriels et Meacutethodes
154
Test de compeacutetence des cellules
Pour effectuer un test de compeacutetence on reacutealise une transformation avec le plasmide de controcircle
pUC19 posseacutedant un gegravene de reacutesistance agrave lrsquoampicilline et on eacutetale les bacteacuteries transformeacutees
sur boicircte LB agar + 50 microgmL drsquoampicilline
On compte les colonies et on utilise la formule suivante
Lrsquoefficaciteacute (CFU) correspond au nombre de clones obtenus par microg de plasmide transformeacute
FD correspond au facteur de dilution si on reacutealise des dilutions
5) Transformation bacteacuterienne par choc thermique
Les transformations bacteacuteriennes par choc thermique ont eacuteteacute reacutealiseacutees avec des bacteacuteries
thermocompeacutetentes Pour cela on utilise 50 microL de bacteacuteries thermocompeacutetentes deacutecongeleacutees
lentement dans la glace dans lesquelles on ajoute environ 100 ng de plasmide On laisse reposer
quelques minutes dans la glace puis on place le meacutelange durant 2 min agrave 42degC Suite au choc
thermique les tubes sont replaceacutes dans la glace durant 5 min On ajoute alors 1 mL de milieu
LB et on incube les tubes durant 1h agrave 37degC avec agitation permettant ainsi aux bacteacuteries de se
reacutegeacuteneacuterer Le meacutelange de transformation est ensuite dilueacute au dixiegraveme et au centiegraveme puis
deacuteposeacute sur des boicirctes de Peacutetri contenant du milieu LB agar auxquelles on a preacutealablement
ajouteacute le ou les antibiotiques correspondant agrave la reacutesistance du plasmide (100 microgmL
drsquoampicilline etou 34 microgmL de chlorampheacutenicol) Les boicirctes sont ensuite incubeacutees durant la
nuit agrave 37degC
6) Extraction drsquoADN plasmidique (minipreps)
Les plasmides reacutepliqueacutes dans les bacteacuteries DH5α ont eacuteteacute extraits et purifieacutes avec le kit
QIAprep Spin Miniprep High-Yield de Qiagen Pour cela une colonie bacteacuterienne
preacutealablement transformeacutee avec le plasmide drsquointeacuterecirct est inoculeacutee dans 5 mL de milieu LB
contenant lrsquoantibiotique approprieacute et incubeacutee durant 12 agrave 16h agrave 37degC La preacuteculture est ensuite
Mateacuteriels et Meacutethodes
155
centrifugeacutee 15 min agrave 4400 rpm Le surnageant est eacutevacueacute et le culot est resuspendu dans 250
microL de tampon P1 (50 mM Tris-HCl pH 80 plus de 5 min dans le tampon de lyse On ajoute
ensuite 350 microL de tampon de neutralisation N3 (42 M Gu-HCl 09 M aceacutetate de potassium
pH48) et on meacutelange tout de suite lrsquoeacutechantillon par inversion afin de preacutecipiter lrsquoADN
geacutenomique Une centrifugation de 10 min agrave 13000 rpm (4degC) permet de culoter lrsquoADN
geacutenomique et de reacutecupeacuterer le surnageant contenant le mateacuteriel plasmidique qui est alors deacuteposeacute
sur une colonne QIAprep spin Une centrifugation agrave 13000 rpm est faite durant 1 min agrave
tempeacuterature ambiante On ajoute 750 microL de tampon PE (10mM Tris-HCl pH75 80 eacutethanol)
et lrsquoon refait la mecircme centrifugation que preacuteceacutedemment (la centrifugation peut ecirctre reacutepeacuteteacutee
encore une fois afin drsquoeacuteliminer les restes de tampon) Enfin on place la colonne dans un tube
Eppendorf on ajoute 30 microL drsquoeau milliQ et on laisse reposer 1 min agrave tempeacuterature ambiante
Une derniegravere centrifugation agrave 13000 rpm est reacutealiseacutee et permet drsquoeacuteluer lrsquoADN plasmidique Une
mesure de la concentration est reacutealiseacutee au Nanodrop puis les plasmides sont stockeacutes agrave -20degC
7) Seacutequenccedilage
Les seacutequenccedilages ont eacuteteacute reacutealiseacutes par lrsquoentreprise GATC Biotech agrave partir de 20 microL de
plasmide agrave une concentration comprise entre 50 ngmicroL et 80 ngmicroL Dans le cas des
constructions disponibles dans le pET-16b les oligonucleacuteotides utiliseacutes pour le seacutequenccedilage
sont les primers de GATC correspondant au T7 promoteur Dans le cas des constructions
disponibles dans le pBADMyc-HisA les oligonucleacuteotides utiliseacutes pour le seacutequenccedilage sont les
primers de GATC correspondant au pBAD promoteur
B-Techniques de biochimie
B1 Purification des proteacuteines Vp16PDF et chimegraveres
Les diffeacuterentes proteacuteines drsquointeacuterecirct ont eacuteteacute exprimeacutees sous forme recombinante dans E
coli en utilisant les souches reacutepertorieacutees dans le tableau MM-7
Tableau MM-7
Souche Geacutenotype Source
PAL421Tr galK rpsL fmsΔ1 recA56 srl-300 Tn10 Meinnel et al
1994 226
Rosetta2(DE3)pLysS F- ompT hsdSB(rB
- mB-) gal dcm (DE3)
pLysSRARE2 (CamR) Novagen
Mateacuteriels et Meacutethodes
156
1) Test drsquoexpression et de solubiliteacute
Apregraves transformation de bacteacuteries Rosetta2(DE3)pLysS avec un plasmide pET contenant la
proteacuteine drsquointeacuterecirct (vecteur pET-22b pour les mutants drsquoEcPDF ou pET-16b pour les chimegraveres
de Vp16PDF voir plus haut) un clone est mis en preacuteculture dans 5 mL de milieu LB
suppleacutementeacute avec 50 microgmL drsquoampicilline et 34 microgmL de chlorampheacutenicol La preacuteculture est
incubeacutee la nuit agrave 37degC sous agitation Le lendemain on ensemence 100 mL de milieu 2YT avec
2 mL de preacuteculture suppleacutementeacute en ampicilline 50 microgmL et chlorampheacutenicol 34 microgmL La
culture est incubeacutee agrave 37degC sous agitation agrave 180 rpm jusqursquoagrave lrsquoobtention drsquoune densiteacute optique
agrave 600nm (DO600) de 06-08 Lrsquoexpression de la proteacuteine drsquointeacuterecirct est alors induite par lrsquoajout
drsquoIPTG agrave une concentration finale de 05 mM et la culture est poursuivie 4-5h agrave 37degC sous
agitation Par la suite les diffeacuterents preacutelegravevements sont dilueacutes afin que chaque eacutechantillon ait la
mecircme absorbance agrave 600nm (crsquoest-agrave-dire la mecircme quantiteacute de bacteacuteries dans chaque eacutechantillon)
et centrifugeacutes pendant 15 min agrave 4400 rpm (4degC) Les culots bacteacuteriens sont alors resuspendus
dans 15 mL de tampon de lyse(tampon 50 mM MES-KOH agrave pH7555 ou 4 suivant la proteacuteine
drsquointeacuterecirct et contenant diffeacuterentes concentrations en NiCl2 - 5 mM 20 mM ou 80 mM) puis
transfeacutereacutes dans un tube Eppendorf de 2 mL afin drsquoecirctre lyseacutes par sonication (3 seacuteries de 20
pulsations par eacutechantillon agrave 50 de la puissance maximale avec 1 min de repos dans la glace
entre chaque seacuterie de pulsations) Lrsquoextrait brut soniqueacute est alors seacutepareacute en deux aliquotes de
750 microL Lrsquoun des aliquotes est analyseacute sur gel SDS-PAGE 14 (apregraves lrsquoavoir centrifugeacute 20
min agrave 8000 rpm pour eacuteliminer les deacutebris cellulaires) afin drsquoobserver lrsquoexpression globale de la
proteacuteine Lrsquoautre aliquote va ecirctre traiteacute de faccedilon agrave seacuteparer les proteacuteines solubles et insolubles
Pour cela une centrifugation agrave 14000 rpm durant 20 min est reacutealiseacutee (4degC) Le surnageant
correspond agrave la fraction soluble et le culot agrave la fraction insoluble Ce culot est resuspendu dans
20 microL de tampon de lyse et les deux fractions soluble et insoluble sont analyseacutees sur gel SDS-
PAGE 14
2) Purification de Vp16PDF (forme peu active)
Des bacteacuteries PAL421Tr thermocompeacutetentes sont transformeacutees par choc thermique avec le
plasmide pBADMyc-His A contenant le gegravene codant Vp16PDF wt Les bacteacuteries transformeacutees
sont eacutetaleacutees sur boicircte LB agar contenant 100 microgmL drsquoampicilline et incubeacutees environ 24h agrave
37degC Des preacutecultures de 20 mL contenant 50 microgmL drsquoampicilline sont inoculeacutees agrave partir drsquoun
clone et incubeacutees durant la nuit agrave 37degC Par la suite 2 L de milieu LB contenant 50 microgmL
drsquoampicilline et 02 drsquoarabinose (pour lrsquoinduction de la proteacuteine) sont inoculeacutes avec la
preacuteculture La culture est reacutealiseacutee en utilisant 10 erlens de 2 L contenant chacun 200 mL de
Mateacuteriels et Meacutethodes
157
culture et est incubeacutee agrave 37degC sous agitation agrave 180 rpm durant 7h jusqursquoagrave obtention drsquoune
DO600 = 20 On centrifuge ensuite la solution bacteacuterienne 20 min agrave 8000 rpm et 4degC (rotor JA-
10 centrifugeuse Beckman Coulter) On resuspend ensuite le culot dans 40 mL de tampon de
lyse 50 mM MES-KOH pH 55 5 mM NiCl2 Si besoin le culot resuspendu peut ecirctre conserveacute
agrave -80degC
La solution bacteacuterienne est lyseacutee par un casseur de cellules (Microfluidizer) en reacutealisant 2
passages successifs agrave 15000 Psi puis centrifugeacutee 30 min agrave 15000 rpm (4degC) afin drsquoeacuteliminer les
deacutebris cellulaires Le surnageant est filtreacute avec une seringue eacutequipeacutee drsquoun filtre 045 microm afin de
srsquoassurer qursquoaucun deacutebris susceptible de boucher les conduits de lrsquoAKTA durant la purification
ne soit encore preacutesent
La purification se fait par chromatographie eacutechangeuse de cations en utilisant 23 mL de
reacutesine SP-Sepharose Fast Flow packeacutee dans une colonne (GE Healthcare life science) La
colonne est eacutequilibreacutee avec le mecircme tampon que celui utiliseacute pour la lyse que lrsquoon nomme
tampon A (50 mM MES-KOH pH55 5 mM NiCl2) Une fois lrsquoeacutechantillon injecteacute lrsquoeacutelution agrave
4degC se fait avec un tampon 50 mM MES-KOH pH55 5 mM NiCl2 1M KCl (que lrsquoon nomme
tampon B) Pour cela une premiegravere eacutetape drsquoeacutelution est reacutealiseacutee en passant 6 volumes de colonne
avec 15 de tampon B Une autre eacutetape consiste ensuite agrave reacutealiser un gradient de 15 agrave 60
de tampon B durant 8 volumes de colonnes agrave 2 mLmin Des fractions de 4 mL sont reacutecolteacutees
et analyseacutees sur gel SDS-PAGE 14 puis on reacutecupegravere celles qui contiennent Vp16PDF (environ
35 mL) Il faut ensuite concentrer les proteacuteines avec les uniteacutes drsquoultrafiltration AmiconUltra 3
kDa-15mL (Merck Millipore) en les centrifugeant agrave 4000g jusquagrave obtention drsquoenviron 11 mL
Une centrifugation 10 min agrave 15000 rpm agrave 4degC permet drsquoeacuteliminer les proteacuteines preacutecipiteacutees Cet
eacutechantillon est alors injecteacute sur une colonne Superdex 75 Prepgrade de 120 mL (GE Healthcare)
Lrsquoeacutelution de lrsquoeacutechantillon est reacutealiseacutee avec 15 volumes de colonne de tampon A agrave 15 mLmin
Les fractions sont analyseacutees sur gel SDS-PAGE 15 et lrsquoensemble des fractions drsquointeacuterecirct sont
rassembleacutees (environ 15 agrave 20 mL total) Un second passage de lrsquoeacutechantillon est reacutealiseacute sur la
colonne Superdex 75 Prepgrade (dans les mecircmes conditions que preacuteceacutedemment) afin
drsquoaugmenter le degreacute de pureteacute de la proteacuteine Apregraves analyse des fractions sur gel SDS-PAGE
14 les fractions drsquointeacuterecirct sont rassembleacutees et concentreacutees avec les tubes Amicon Ultra 3kDa-
15 mL agrave 4000g agrave 4degC jusqursquoagrave obtention drsquoenviron 500 microL Lrsquoeacutechantillon est alors centrifugeacute
10 min agrave 15000 rpm agrave 4degC afin drsquoeacuteliminer les proteacuteines preacutecipiteacutees Un dosage de Bradford
permet alors de mesurer la concentration de la proteacuteine On reacutealise ensuite des aliquotes et la
proteacuteine est conserveacutee agrave -80degC La proteacuteine purifieacutee est finalement dialyseacutee la nuit agrave 4degC contre
Mateacuteriels et Meacutethodes
158
- 1 L de tampon 50 mM MES-KOH pH55 5 mM NiCl2 50 glyceacuterol La proteacuteine est alors
stockeacutee agrave -20degC et sera utiliseacutee pour des tests drsquoactiviteacute
- 1 L de tampon 50 mM MES-KOH pH55 5 mM NiCl2 La proteacuteine est alors stockeacutee agrave -80degC
et sera utiliseacutee pour des tests drsquointeraction
Remarque Il est impeacuteratif drsquoutiliser de la verrerie en plastique et non en pyrex pendant
toutes les eacutetapes de purification afin drsquoeacuteviter tout relargage de meacutetaux qui pourraient se fixer
au site actif de lrsquoenzyme agrave la place du nickel 194
3) Purification de Vp16PDF (forme pleinement active)
Des bacteacuteries Rosetta2(DE3)pLysS thermocompeacutetentes sont transformeacutees par choc
thermique avec le plasmide pET16bVp16PDF Les bacteacuteries transformeacutees sont eacutetaleacutees sur boicircte
LB agar contenant 100 microgmL drsquoampicilline et 34 microgmL de chlorampheacutenicol et incubeacutees
environ 24h agrave 37degC Des preacutecultures de 20 mL de milieu LB contenant 50 microgmL drsquoampicilline
et 34 microgmL de chlorampheacutenicol sont inoculeacutees agrave partir drsquoun clone et incubeacutees durant la nuit agrave
37degC Par la suite 2 L de milieu 2YT contenant 50 microgmL drsquoampicilline et 34 microgmL de
chlorampheacutenicol sont inoculeacutes avec la preacuteculture de faccedilon agrave avoir DO600 = 02 La culture est
reacutealiseacutee en utilisant 10 erlens de 2 L contenant chacun 200 mL de culture et est incubeacutee agrave 37degC
sous agitation agrave 150 rpm Lrsquoexpression de la proteacuteine est induite lorsque les bacteacuteries atteignent
une DO600 = 05-06 avec lrsquoajout de 05 mM IPTG On laisse pousser les bacteacuteries 3h agrave 37degC et
150 rpm puis on centrifuge la solution bacteacuterienne 20 min agrave 8000 rpm et 4degC (rotor JA-10
centrifugeuse Beckman Coulter) On resuspend ensuite le culot dans 40 mL de tampon de lyse
50 mM MES-KOH pH 40 80 mM NiCl2 Si besoin le culot resuspendu peut ecirctre conserveacute agrave
-80degC
La solution bacteacuterienne est lyseacutee par un casseur de cellules (Microfluidizer) en reacutealisant 2
passages successifs agrave 15000 Psi puis centrifugeacutee 30 min agrave 15000 rpm (4degC) afin drsquoeacuteliminer les
deacutebris cellulaires Le surnageant est filtreacute avec une seringue eacutequipeacutee drsquoun filtre 045 microm afin de
srsquoassurer qursquoaucun deacutebris susceptible de boucher les conduits de lrsquoAKTA durant la purification
ne soit encore preacutesent
Le protocole permettant de purifier Vp16PDF sous forme active consiste agrave utiliser des
tampons de lyse et de purification agrave pH4 et avec 80 mM de NiCl2 Ainsi le tampon de lyse est
le suivant MES-KOH 50 mM pH4 80 mM de NiCl2 Lrsquoeacutetape de purification sur colonne SP
Sepharose Fast Flow (GE Healthcare life science) est reacutealiseacutee selon le mecircme protocole que celui
Mateacuteriels et Meacutethodes
159
utiliseacute pour la forme inactive mais en preacutesence de tampons de composition diffeacuterente La
colonne est eacutequilibreacutee avec le tampon de lyse et lrsquoeacutelution se fait avec le tampon 50 mM MES-
KOH pH4 80 mM NiCl2 1 M KCl Les fractions drsquoeacutelution sont analyseacutees sur gel SDS-PAGE
14 et celles contenant la proteacuteine sont rassembleacutees Lrsquoeacutechantillon peut alors ecirctre concentreacute
jusqursquoagrave environ 5 mL avec les tubes Amicon Ultra 3 kDa-15 mL agrave 4000g agrave 4degC Lrsquoeacutechantillon
est alors centrifugeacute 10min agrave 15000 rpm agrave 4degC afin drsquoeacuteliminer les proteacuteines preacutecipiteacutees
La proteacuteine purifieacutee est finalement dialyseacutee la nuit agrave 4degC contre
- 1 L de tampon 50 mM MES-KOH pH40 80 mM NiCl2 50 glyceacuterol La proteacuteine est alors
stockeacutee agrave -20degC et sera utiliseacutee pour des tests drsquoactiviteacute
4) Dosage des proteacuteines par la meacutethode de Bradford
On reacutealise tout drsquoabord une gamme eacutetalon avec de la proteacuteine BSA (solution stock 1
mg mL) Dans des cuves de spectrophotomegravetre on ajoute 200 microL de reacuteactif de Bradford
(BioRad) des quantiteacutes de BSA allant 1 microg agrave 10 microg et on complegravete avec de lrsquoeau jusqursquoagrave un
volume final de 1 mL (ajouter du NiCl2 dans la gamme si la proteacuteine agrave doser en contient) On
meacutelange bien lrsquoeacutechantillon et on laisse incuber 15 min agrave tempeacuterature ambiante On reacutealise en
parallegravele de la gamme eacutetalon de BSA une gamme de la proteacuteine agrave doser Pour cela dans un
volume de 1 mL on ajoute diffeacuterents volumes de proteacuteines 200 microL de reacuteactif de Bradford et
on complegravete avec de lrsquoeau Apregraves avoir meacutelangeacute on laisse incuber les eacutechantillons 15 min agrave
tempeacuterature ambiante On reacutealise alors une mesure de lrsquoabsorbance agrave 595 nm de chacun des
eacutechantillons de la gamme eacutetalon ce qui permet de tracer la droite qui relie lrsquoabsorbance en
fonction de la concentration de proteacuteine contenue dans lrsquoeacutechantillon On reacutealise les mecircmes
mesures drsquoabsorbance avec les eacutechantillons dont la concentration de proteacuteine est inconnue et
on reporte les valeurs sur la courbe de la gamme eacutetalon On peut alors deacuteterminer la
concentration en proteacuteine de lrsquoeacutechantillon
5) Electrophoregravese en conditions deacutenaturantes
Lrsquoeacutelectrophoregravese en conditions deacutenaturantes (SDS-PAGE) est reacutealiseacutee agrave partir du protocole
de Laemmli 266 Le gel drsquoeacutelectrophoregravese se compose drsquoun gel de concentration (36
drsquoacrylamide) et drsquoun gel de seacuteparation (entre 10 et 15 drsquoacrylamide selon la taille des
proteacuteines que lrsquoon souhaite observer) et contenant 01 de SDS Les gels de concentration et
de seacuteparation sont preacutepareacutes avec le systegraveme Mini-PROTEAN de Biorad Une quantiteacute
deacutetermineacutee de proteacuteines est meacutelangeacutee avec du tampon de charge (2X 100mM Tris-HCl 4
SDS 20 glyceacuterol 8 β-mercaptoeacutethanol 01 bleu de bromopheacutenol pH 68) et chauffeacutee
Mateacuteriels et Meacutethodes
160
durant 5 min agrave 95degC Les eacutechantillons agrave analyser sont deacuteposeacutes dans les puits du mini-gel ainsi
qursquoun marqueur de poids moleacuteculaire (PageRuler Prestained Protein Ladder 26616 de Thermo
Scientific) La migration srsquoeffectue dans un tampon Tris-Glycine-SDS pH83 (25 mM Tris-
HCl 01 SDS 192 mM Glycine) et se deacuteroule sous une tension de 100V jusqursquoagrave ce que les
proteacuteines passent le gel de concentration puis 200V pour le gel de seacuteparation jusqursquoagrave la sortie
du front de migration du gel
Pour reacutealiser les gels SDS-PAGE il faut utiliser un beacutecher pour preacuteparer la solution pour le
gel de seacuteparation (14 acrylamide 0378 M Tris-HCl pH 88 01 SDS 014 APS 01
TEMED) (volume final de 5 mL) On commence par ajouter le tampon Tris puis lrsquoacrylamide
le SDS lrsquoAPS et lrsquoeau Ajouter agrave la fin le TEMED qui va acceacuteleacuterer la reacuteaction de
polymeacuterisation On meacutelange agrave la pipette et on deacutepose doucement la solution entre les deux vitres
du Mini-PROTEAN System de Biorad On ajoute doucement 200 microL drsquoisopropanol apregraves avoir
deacuteposeacute le gel de seacuteparation afin drsquoaplanir le niveau et drsquoeacuteliminer les eacuteventuelles bulles Il faut
ensuite attendre une heure que le gel polymeacuterise Ensuite on penche le systegraveme de faccedilon agrave
eacutevacuer lrsquoisopropanol et on essuie les reacutesidus avec du papier propre On preacutepare alors dans un
beacutecher la solution pour le gel de concentration (36 acrylamide 012 M Tris-HCl pH 68
01 SDS 02 APS 01 TEMED) (volume final 5 mL) Tout comme le gel de seacuteparation
on ajoute le TEMED uniquement agrave la fin On deacutepose alors la solution entre les vitres au-dessus
du gel de seacuteparation preacutealablement polymeacuteriseacute jusqursquoagrave la limite supeacuterieure des vitres On
deacutepose alors le peigne contenant les puits entre les deux vitres Il faut ecirctre preacutecautionneux afin
de ne pas inseacuterer de bulles dans le gel
6) Western-blot suivi drsquoune immunodeacutetection
Preacuteparation des anticorps
Les anticorps anti-Vp16PDF ou anti-EcPDF ont eacuteteacute produits agrave partir de lapins agrave lrsquoanimalerie
de lrsquoINAF au CNRS de Gif-sur-Yvette
Pour chaque seacuterie drsquoanticorps 500 microL de proteacuteine agrave 1 mgmL additionneacutes de 500 microL
drsquoadjuvant de Freund ont eacuteteacute injecteacutes agrave deux lapins en parallegravele agrave J0 J14 J28 et J43 (adjuvant
complet pour la premiegravere injection incomplet pour les injections suivantes) Des preacutelegravevements
sanguins ont eacuteteacute reacutealiseacutes dans lrsquoartegravere meacutediane agrave J0 et J37 pour les anticorps anti-Vp16PDF et
J0 J36 et J64 pour les anticorps anti-EcPDF Un dernier preacutelegravevement intracardiaque a eacuteteacute
effectueacute agrave J58 pour les anticorps anti-Vp16PDF et J81 pour les anticorps anti-EcPDF
Mateacuteriels et Meacutethodes
161
Pour chaque preacutelegravevement il faut reacutecupeacuterer le seacuterum contenant les anticorps Pour cela il
faut casser 2-3 pipettes Pasteur en verre agrave lrsquointeacuterieur de chacun des tubes de preacutelegravevement et les
incuber 1h agrave 37degC dans une eacutetuve On centrifuge alors lrsquoeacutechantillon durant 20 min agrave 2000 rpm
agrave tempeacuterature ambiante et on reacutecupegravere la partie supeacuterieure du seacuterum ainsi obtenue Des aliquotes
de 500 microL sont stockeacutes agrave -80degC
Preacutecipitation des anticorps au sulfate drsquoammonium
On deacutecongegravele lentement (dans de la glace) les anticorps stockeacutes agrave -80degC (durant environ
3h) Pour 1 mL drsquoeacutechantillon on centrifuge 30 min agrave 14000 g On reacutecupegravere le surnageant et on
le preacutecipite avec 40 drsquoammonium sulfate (243 mg) pendant 1h agrave 4degC On centrifuge de
nouveau 1h agrave 14000 g et on resuspend ensuite le culot avec 1 mL de tampon phosphate (Na2Na)
20 mM pH 72 On effectue une dialyse toute la nuit contre 500 mL de ce mecircme tampon On
deacutetermine alors la concentration en anticorps (une DO280 de 135 correspond agrave une
concentration en IgG de 1 mgmL)
Produits utiliseacutes pour le Western-blot
Tampon de transfert 192 mM Glycine 25 mM Tris-base 005 SDS 20 Methanol
PBS 5X 750 M NaCl 80 mM Na2HPO4 20 mM NaH2PO4
Tween20 (Sigma P-7949)
Lait en poudre (GE Healthcare)
Membrane PVDF (GE Healthcare)
Anticorps primaires dilueacutes dans un tampon PBS-Tween20 03-lait 025
Anticorps anti-EcTF dilution 1 15000
Anticorps anti-EcMetAP (lapin 361) dilution 15000-10000
Anticorps anti-EcPDF (lapin 363) dilution 110000
Anticorps anti-Vp16PDF (lapin 342) dilution 1 5000-10000
Anticorps secondaires dilueacutes dans un tampon PBS-Tween20 03-lait 025
Goat anti-rabbit IgG-Cy5 dilution 1 1000 (Amersham)
Protocole
Le principe du Western-blot est drsquoidentifier une proteacuteine drsquointeacuterecirct agrave lrsquoaide drsquoanticorps
primaires dirigeacutes speacutecifiquement contre cette proteacuteine Un anticorps secondaire auquel est
greffeacutee une sonde fluorescente dirigeacute contre lrsquoanticorps primaire permet alors de deacutetecter la
proteacuteine par fluorescence
Mateacuteriels et Meacutethodes
162
Les eacutechantillons sont deacuteposeacutes sur gel SDS-PAGE agrave 15 drsquoacrylamide (voir eacutelectrophoregravese
en conditions deacutenaturantes) La migration se fait agrave 100V dans un tampon Tris-Glycine-SDS
Le gel est alors reacutecupeacutereacute et rinceacute dans du tampon de transfert apregraves eacutelimination du stacking (gel
de concentration) Le sandwich permettant le transfert des proteacuteines depuis le gel vers la
membrane est reacutealiseacute en appliquant le gel contre un morceau de membrane PVDF
preacutealablement activeacutee dans du meacutethanol le tout entre plusieurs feuilles de papier Whatman
Lrsquoensemble est placeacute dans une cassette laquelle est placeacutee dans la cuve remplie de tampon de
transfert Un courant constant de 30V est appliqueacute durant la nuit en chambre froide Le transfert
effectif des proteacuteines sur la membrane est aiseacutement veacuterifiable gracircce agrave lrsquoutilisation de marqueurs
de poids moleacuteculaires coloreacutes (ThermoFisher Prestained protein ladder 26616)
La membrane est ensuite reacutecupeacutereacutee et laveacutee rapidement agrave lrsquoeau puis avec du tampon PBS
1X La saturation de la membrane permettant drsquoeacuteviter la fixation aspeacutecifique des anticorps est
effectueacutee pendant 5h agrave 4degC dans un tampon PBS Tween20 03 et 5 drsquoagent bloquant
(Amersham ECL blocking agent) La membrane est ensuite laveacutee avec du tampon PBS 1X
Tween20 03 durant 30 min agrave 4degC puis incubeacutee la nuit agrave 4degC en preacutesence drsquoanticorps primaire
dilueacute dans du tampon PBS 1X Tween20 03 agent bloquant 025 La membrane est laveacutee
5 fois 10 min avec du tampon PBS 1X Tween20 03 agent bloquant 025 avant drsquoincuber
agrave lrsquoobscuriteacute durant 3h en preacutesence des anticorps secondaires (Ig-Cy5-Anti rabbit Amersham
dilueacute 1000 fois) La membrane est alors laveacutee 3 fois avec du tampon PBS 1X Tween20 03
lait 025 puis 2 fois 10 min dans du tampon PBS1X Tween20 03 et enfin une derniegravere
fois dans du PBS 1X Apregraves seacutechage la fluorescence de la membrane peut ecirctre reacuteveacuteleacutee Nous
utilisons au laboratoire lrsquoappareil PharosFX Molecular Imager de BIO-RAD pour la reacuteveacutelation
Nous utilisons le logiciel Quantity One en mode laquo basic raquo pour quantifier le signal de
fluorescence Avec lrsquooption laquo rect tool raquo nous traccedilons un cadre autour des bandes agrave quantifier
ainsi qursquoun cadre ne contenant aucune bande afin drsquoobtenir le signal de bruit de fond Le signal
de fluorescence agrave lrsquointeacuterieur de chaque cadre est alors quantifieacute Les valeurs ainsi obtenues sont
rentreacutees dans le logiciel Excel afin de reacutealiser un traitement des donneacutees
B2 Mesure de lrsquoactiviteacute peptide deformylase
Lrsquoactiviteacute des enzymes PDF est mesureacutee par un test cineacutetique spectrophotomeacutetrique 231 La
reacuteaction catalyseacutee par lrsquoenzyme PDF est coupleacutee agrave la reacuteaction catalyseacutee par lrsquoenzyme formate
deacuteshydrogeacutenase (FDH) selon les deux reacuteactions suivantes
Mateacuteriels et Meacutethodes
163
ougrave N-formyl-Met-X (ou fMX) est un peptide syntheacutetique de longueur variable et posseacutedant une
meacutethionine initiatrice formyleacutee NAD+ est le produit de la reacuteaction de deacuteformylation (la
nicotinamide adeacutenine dinucleacuteotide sous forme oxydeacutee) et le NADH sous forme reacuteduite (produit
de la reacuteaction de la formate deacutehydrogenase) Le peptide couramment utiliseacute au laboratoire est
le N-formyl-Met-Ala-Ser ou fMAS
La quantiteacute de peptide deacuteformyleacute est proportionnelle agrave la quantiteacute de NADH formeacute avec
une stoechiomeacutetrie 11 La mesure de lrsquoabsorbance du NADH agrave 340 nm au cours du temps
permet donc de mesurer directement le taux de deacuteformylation de la meacutethionine et donc lrsquoactiviteacute
de lrsquoenzyme A340 = ἐNADH-340nm x [PDF] x l ougrave ἐ est le coefficient drsquoextinction molaire du NADH
(ἐNADH-340nm = 6220 mol-1Lcm-1 ou M-1cm-1) et l la longueur du trajet optique de la cuve (1
cm) Ainsi cette eacutequation permet le calcul theacuteorique de la variation drsquoabsorbance observable
pour une concentration en substrat donneacutee Une gamme de concentration en fMAS allant de 0
mM agrave 10 mM est ainsi reacutealiseacutee afin de mesurer la vitesse initiale de reacuteaction (vi) de Vp16PDF
en fonction de la concentration en substrat (vi = A340min-1) La courbe vi = f([fMAS]) est alors
traceacutee gracircce au module Kinetics de SigmaPlot selon lrsquoeacutequation de Michaeumllis-Menten etou
Lineweaver-Burke Cela permet de deacuteterminer les constantes Vmax (A340min) et Km (mM) Le
kcat est ensuite calculeacute selon lrsquoeacutequation kcat = Vmax ([PDF] x 60 x ἐNADH-340nm)
1) Mateacuteriel et solutions
Les mesures sont reacutealiseacutees dans des cuves en quartz de 200 microL preacutealablement nettoyeacutees
avec de lrsquoacide sulfochromique La longueur du trajet optique est de 1 cm Le
spectrophotomegravetre Ultraspec2100Pro (GE Healthcare) utiliseacute possegravede un portoir de 6 cuves agrave
effet Peltier ainsi qursquoune uniteacute de controcircle de la tempeacuterature Le spectrophotomegravetre est controcircleacute
par le logiciel SWIFT II
Les solutions stocks utiliseacutees pour le meacutelange reacuteactionnel sont 1M Hepes-KOH pH 75
10 mgmL BSA (pour limiter la fixation aspeacutecifique de lrsquoenzyme sur les parois de la cuve)
NAD+ 32 mM (Roche) 180 UmL FDH (Sigma ref F8649-250UN) 200 mM fMAS (Bachem
ref H-6210 250 mg) 10 mM NiCl2 Toutes les solutions sont preacutepareacutees dans de lrsquoeau
Mateacuteriels et Meacutethodes
164
Lrsquoenzyme Vp16PDF est conserveacutee agrave -20degC dans un tampon 50 mM MES-KOH pH4 80
mM NiCl2 50 glyceacuterol Une dilution intermeacutediaire de la PDF agrave 2-5 microM dans un tampon 50
mM MES-KOH pH4 80 mM NiCl2 est preacutepareacutee extemporaneacutement et conserveacutee dans la glace
pour la journeacutee Lrsquoenzyme conserveacutee dans le tampon 50 mM MES pH55 et 5 mM NiCl2 a
eacutegalement eacuteteacute testeacutee apregraves avoir reacutealiseacute une dilution intermeacutediaire agrave 2-5 microM
2) Protocole
Chaque meacutelange reacuteactionnel de 200 microL est preacutepareacute dans un tube Eppendorf contenant
HEPES-KOH 50 mM pH 75 NiCl2 1 mM NAD+ 12 mM FDH 45 UmL Vp16PDF 100 nM
(pour les tests reacutealiseacutes avec les extraits brut 10 microL de fraction soluble agrave 05 microgmicrol sont ajouteacutes)
Le meacutelange reacuteactionnel est ensuite transvaseacute dans une cuve laquelle est inseacutereacutee dans le
spectrophotomegravetre preacutealablement chauffeacute agrave 37degC 6 conditions expeacuterimentales peuvent ecirctre
testeacutees en mecircme temps gracircce au portoir de cuves contenant 6 emplacements La reacuteaction est
deacuteclencheacutee par lrsquoajout du substrat fMAS apregraves 2 min drsquoincubation dans le spectrophotomegravetre
(le tripeptide est remplaceacute par de lrsquoeau pour le blanc) et lrsquoabsorbance agrave 340 nm est mesureacutee
pendant 10 min agrave 37degC Une gamme de concentration en fMAS allant de 0 mM agrave 10 mM est
reacutealiseacutee afin de mesurer la vitesse initiale de reacuteaction (vi) de Vp16PDF en fonction de la
concentration en substrat La courbe vi = f([fMAS]) est alors traceacutee selon lrsquoeacutequation de
Michaeumllis-Menten etou Lineweaver-Burke On deacutetermine ainsi les constantes Vmax (mmolmin)
et Km (mM) Le kcat est ensuite calculeacute selon lrsquoeacutequation kcat = Vmax ([PDF] x 60 x ἐNADH-340nm)
avec ἐNADH-340nm = 6220 mol-1L-1cm-1
3) Test drsquoinhibition de Vp16PDF en preacutesence drsquoactinonine
Lrsquoinhibition de Vp16PDF par lrsquoactinonine a eacuteteacute mesureacutee par le test drsquoactiviteacute deacutecrit ci-
dessus selon un protocole leacutegegraverement modifieacute les concentrations en PDF et substrat sont
constantes lrsquoactinonine (resuspendue dans de lrsquoeacutethanol 100) est ajouteacutee agrave des concentrations
variables et la reacuteaction enzymatique est deacuteclencheacutee par lrsquoajout du substrat Pour deacuteterminer les
valeurs drsquoIC50 et de KIapp Le meacutelange reacuteactionnel contenant Vp16PDF et lrsquoactinonine est
incubeacute 10 min agrave 37degC puis transfeacutereacute dans une cuve laquelle est alors inseacutereacutee dans le
spectrophotomegravetre maintenu agrave 37degC Apregraves 2 min drsquoincubation le substrat est ajouteacute et la
cineacutetique mesureacutee par la deacutetection de lrsquoabsorbance agrave 340 nm La gamme de concentration
drsquoactinonine testeacutee srsquoeacutetend de 0 agrave 800 nM
Pour deacuteterminer la valeur du KIon utilise le mecircme protocole que le test drsquoactiviteacute deacutecrit
preacuteceacutedemment mais lrsquoactinonine est ajouteacutee au meacutelange reacuteactionnel Aucune preacuteincubation du
Mateacuteriels et Meacutethodes
165
complexe enzymeinhibiteur nrsquoa lieu Le meacutelange contient drsquoabord le substrat et lrsquoinhibiteur
lrsquoenzyme est ajouteacutee ensuite pour deacuteclencher la reacuteaction La gamme de concentration
drsquoactinonine testeacutee srsquoeacutetend de 0 agrave 800 nM
B3 Etudes sur les conseacutequences in vivo de lrsquoexpression de Vp16PDF
1) Souches
Les souches drsquoE coli utiliseacutees dans cette partie sont reacutepertorieacutees dans le Tableau MM-8
Tableau MM-8 Souches utiliseacutees pour les tests de compleacutementation fonctionnelle test de croissance et
extraction drsquoagreacutegats
2) Compleacutementation fonctionnelle
Le principe de la compleacutementation fonctionnelle de Vp16PDF est drsquoutiliser une souche de
bacteacuterie E coli dont le gegravene def codant EcPDF a eacuteteacute deacuteleacuteteacute et de le remplacer par le gegravene codant
la deacuteformylase de Vp16T via un plasmide pBAD inductible agrave lrsquoarabinose afin drsquoobserver si
lrsquoenzyme exprimeacutee permet aux bacteacuteries de survivre et donc de restaurer la croissance La
souche de bacteacuterie utiliseacutee pour les expeacuteriences de compleacutementation est la souche PAL421Tr
dont le gegravene chromosomique de deacuteformylase est deacuteleacuteteacute et qui contient un plasmide pMAK-
705-EcPDF contenant le gegravene de deacuteformylase endogegravene Ce plasmide est thermosensible ce
qui permet de controcircler sa capaciteacute agrave se reacutepliquer en fonction de la tempeacuterature Cette souche
est alors transformeacuteeavec un plasmide pBADMyc-HisA contenant le gegravene codant la proteacuteine
drsquointeacuterecirct
Souche Geacutenotype Source
Compleacutementation fonctionnelle
PAL421Tr galK rpsL fmsΔ1 recA56 srl-300 Tn10 Meinnel et al
1994 226
Extraction des agreacutegats et tests de croissance
W3110 F- lambda- IN(rrnD-rrnE)1 rph-1 P Genevaux
MG1655 wild type K-12 strain F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1 P Genevaux
MG1655ΔsecB F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1 ΔSecB P Genevaux
MG1655Δtig F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1 Δtig P Genevaux
MG1655 ΔtigΔsecB F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1 ΔSecB Δtig P Genevaux
A1119 W3110 Delta proteacuteases Lon ClpP ClpQY P Genevaux
A722 W3110 wild type P Genevaux
Jm101Tr Facute traD36 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 Δ(lac-proAB)
glnV thi recA56 srl-300 Tn10
Hirel et al 1988 267
Mateacuteriels et Meacutethodes
166
Une culture liquide de 100 mL de bacteacuteries PAL421Tr transformeacutee avec lrsquoune ou lrsquoautre
des diffeacuterentes constructions contenues dans un plasmide pBADMyc-HisA est reacutealiseacutee en
milieu LB contenant de lrsquoampicilline agrave 25 microgmL et incubeacutee agrave 30degC jusqursquoagrave ce que la densiteacute
optique des cultures soit DO600 = 1 On preacutelegraveve alors 10 mL de chaque eacutechantillon dans un tube
Falcon (dans le cas ougrave de leacutegegraveres variations de densiteacute optique seraient observeacutees entre des
souches transformeacutees avec des constructions diffeacuterentes on dilue avec du milieu LB liquide les
cultures de faccedilon agrave ce qursquoelles possegravedent toutes exactement la mecircme DO600 dans les 10mL)
Les eacutechantillons sont alors centrifugeacutes agrave 4400 rpm durant 15 min agrave 4degC de faccedilon agrave obtenir un
culot Ce culot est alors resuspendu dans 1 mL de milieu LB liquide Pour chacune des souches
on reacutealise alors une seacuterie de dilutions successives au dixiegraveme sur une plaque 96 puits (Figure
MM-1) On deacutepose par la suite sur un milieu nutritif LB geacuteloseacute une goutte de 10 microL de
chacune des dilutions pour chacune des souches utiliseacutees afin de deacuteposer de moins en moins
de bacteacuteries au fil des dilutions (Figure MM1) Le deacutepocirct des gouttes se fait sur boicircte LB agar
suppleacutementeacute avec 05 de glucose (pour inhiber lrsquoexpression du pBAD) et en parallegravele sur
boicirctes suppleacutementeacutees avec des concentrations drsquoarabinose allant de 02 agrave 2 et cultiveacutees agrave
30degC ou 42degC (voir Figure MM-1)
Mateacuteriels et Meacutethodes
167
Figure MM-1 Expeacuterience de compleacutementation fonctionnelle A) Culture de bacteacuteries PAL421Tr
transformeacutees avec un plasmide pBAD contenant le gegravene de la PDF drsquointeacuterecirct B) Preacuteparation des dilutions de
culture C) Deacutepocirct des gouttes sur boicircte et incubation
Mateacuteriels et Meacutethodes
168
2) Effet de lrsquoexpression de Vp16PDF sur la croissance des bacteacuteries
Cette expeacuterience a pour objectif drsquoobserver si lrsquoexpression de la proteacuteine Vp16PDF modifie
la cineacutetique de croissance des bacteacuteries en fonction de la souche bacteacuterienne testeacutee et de la
tempeacuterature drsquoincubation utiliseacutee Pour cela diffeacuterentes souches de bacteacuteries drsquoexpression (voir
tableau MM-8) ont eacuteteacute transformeacutees (soit avec un plasmide pBAD vide soit avec le plasmide
pBADEcPDF soit avec le plasmide pBADVp16PDF) et eacutetaleacutees sur boicirctes LB agar avec 100
microgmL drsquoampicilline et incubeacutees durant la nuit agrave 37degC Des preacutecultures de 5mL de LB sont
inoculeacutees avec un clone et mises en incubation agrave 37degC durant la nuit sous agitation dans un
milieu LB avec ampicilline (pour chaque construction transformeacutee un clone est testeacute) Le
lendemain des fioles contenant 100 mL de milieu 2YT sont inoculeacutees avec 200 microL de
preacuteculture et cela pour chaque construction On ajoute le ou les antibiotiques approprieacutes ainsi
qursquoune concentration finale de 2 drsquoarabinose (permet lrsquoinduction de la proteacuteine exprimeacutee par
le pBAD) pour chaque culture Les cultures bacteacuteriennes sont alors mises agrave incuber agrave diffeacuterentes
tempeacuteratures (28degC 30degC 37degC ou 42degC) Une mesure de lrsquoabsorbance agrave 600 nm est reacutealiseacutee
toutes les heures afin de pouvoir tracer une cineacutetique de croissance bacteacuterienne
3) Extraction drsquoagreacutegats des cellules bacteacuteriennes
Les agreacutegats de proteacuteines ont eacuteteacute isoleacutes en utilisant la meacutethode de Tomoyasu 268
NB lrsquoensemble des eacutetapes de ce protocole doit ecirctre effectueacute dans un meacutelange deau froide et
de glace
Tampons neacutecessaires pour lrsquoextraction des agreacutegats
Tampon A 10 mM KH2PO4 pH65 (agrave partir drsquoun stock agrave 05 M) 1 mM EDTA 20 sucrose
2 mgmL de lysozyme La solution est preacutepareacutee le jour mecircme
Tampon B 10 mM KH2PO4 pH65 1 mM EDTA
Protocole drsquoextraction des agreacutegats agrave partir de diffeacuterentes souches de bacteacuteries
Les souches utiliseacutees sont preacutesenteacutees dans le tableau MM-8 (la souche Jm101Tr nrsquoa pas eacuteteacute
utilseacutee pour lrsquoextraction des agreacutegats mais seulement pour les tests de croissance) elles sont
toutes transformeacutees avec le plasmide pBAD ou pBADVp16PDF ou pBADEcPDF
Les bacteacuteries sont mises en preacuteculture dans 4 mL de milieu LB avec 05 de glucose durant
la nuit agrave 30degC sous agitation constante (180 rpm) Cette preacuteculture est utiliseacutee pour ensemencer
50 mL de milieu LB avec une DO600 initiale de 004 le milieu contenant de lrsquoampicilline (50
microgmL) et 2 arabinose La culture se fait agrave 30degC sous agitation constante (180 rpm) Lorsque
Mateacuteriels et Meacutethodes
169
la DO600 atteint 1 uniteacute drsquoabsorbance ou apregraves 6h la culture est mise 15-20 min dans un meacutelange
eauglace On preacutelegraveve ensuite la quantiteacute neacutecessaire de bacteacuteries pour avoir une DO600 eacutegale agrave
1 en suivant la formule suivante 1 DO600 x 16 = volume agrave preacutelever (mL)
Lrsquoeacutechantillon est centrifugeacute 15 min agrave 6000 g (4degC) dans des tubes Falcon de 50 mL On
eacutevacue le surnageant et on resuspend le culot dans 120 microL de tampon A puis on laisse reposer
30 min dans lrsquoeauglace Par la suite 1080 microL de tampon B sont ajouteacutes la solution est
meacutelangeacutee par retournement puis transfeacutereacutee dans un tube Eppendorf de 2 mL La solution de
bacteacuteries est alors deacuteposeacutee dans un beacutecher contenant un meacutelange glaceeau et lyseacutee par
sonication en reacutealisant deux cycles de 10 pulsations par eacutechantillon avec une minute de repos
entre chaque seacuterie de pulsation (en utilisant 50 de puissance avec lrsquoappareil Sonifier cell
disruptor 200 de Branson) Lrsquoeacutechantillon est soumis agrave deux sonications avec une minute de
repos dans la glace entre les deux sessions de pulsations La solution de lyse est ensuite
centrifugeacutee 15 min agrave 2000 g (4degC) Le surnageant est transfeacutereacute dans un autre tube Eppendorf
(un aliquote de 100 microL est preacuteleveacute afin de reacutealiser un dosage des proteacuteines (voir dosage par la
meacutethode de Bradford) et une analyse sur gel SDS-PAGE afin de veacuterifier que les diffeacuterents
eacutechantillons testeacutes contiennent la mecircme quantiteacute de proteacuteines Le surnageant est alors centrifugeacute
25 min agrave 14000g (4degC) le surnagent eacutelimineacute puis le culot est centrifugeacute encore 2 min pour
eacuteliminer le reste de surnagent Enfin le culot est congeleacute agrave -80degC pour la nuit
Le lendemain le culot est resuspendu dans 1 mL de tampon B puis soniqueacute suivant les
mecircmes conditions que pour la lyse Lrsquoeacutechantillon est alors centrifugeacute 25 min agrave 14000 g (4degC)
puis le culot est resuspendu dans 960 microL de tampon B La suspension est de nouveau soniqueacutee
suivant les conditions deacutecrites preacuteceacutedemment mais en utilisant cette fois deux sessions de 8
pulsations On ajoute 240 microL de solution NonidetP-40 10 puis on vortexe
Les tubes sont mis agrave centrifuger 35 min agrave 14000 g puis le culot est resuspendu dans 960 microL
de tampon B et soniqueacute deux fois avec 8 pulsations On ajoute agrave nouveau 240 microL de solution
NonidetP-40 agrave 10 puis on vortexe On centrifuge une derniegravere fois lrsquoeacutechantillon durant 35
min agrave 14000 g (4degC) Le culot est alors resuspendu dans 40 microL de tampon de charge 1X et
utiliseacute pour diffegraverent expeacuteriences En geacuteneacuteral 20 microL sont analyseacutes sur gel SDS-PAGE 15
avec coloration au bleu de Coomassie ou Sypro Ruby pour visualisation des proteacuteines globales
des agreacutegats Les eacutechantillons peuvent eacutegalement ecirctre analyseacutes par Western-blot afin de
visualiser speacutecifiquement la preacutesence de certaines proteacuteines Dans ce cas il faut eacutegalement
charger 20 microL par puits drsquoeacutechantillon sur un gel SDS-PAGE 15 On reacutealise ensuite le
Mateacuteriels et Meacutethodes
170
protocole du Western-blot (voir partie Western-blot) avec des anticorps dirigeacutes contre les
proteacuteines drsquointeacuterecirct
4) Preacuteparation des eacutechantillons drsquoagreacutegats proteacuteiques pour une
analyse en spectromeacutetrie de masse digestion trypsique
drsquoeacutechantillons issus drsquoun gel SDS-PAGE Lrsquoobjectif de cette expeacuterience est drsquoidentifier les espegraveces proteacuteiques preacutesentes dans un
eacutechantillon drsquoagreacutegats cellulaires Sur les 40 microL drsquoeacutechantillon obtenus apregraves extraction des
agreacutegats 20 microL sont analyseacutes sur gel SDS-PAGE 15 pour visualisation des proteacuteines globales
des agreacutegats et le gel est coloreacute avec du SYPRO Ruby (Thermofisher) Pour chaque eacutechantillon
deacuteposeacute sur gel le profil de migration est analyseacute et les bandes reacuteveacuteleacutees sont minutieusement
deacutecoupeacutees pour ensuite ecirctre traiteacutees pour une analyse en spectromeacutetrie de masse
La deacutecoupe des bandes se fait sur une plaque de reacuteveacutelation UV preacutealablement recouverte
de film plastique pour eacuteviter toute forme de contamination Il est neacutecessaire drsquoutiliser des tubes
Eppendorf preacutealablement traiteacutes agrave lrsquoaceacutetonitrile (afin de dissoudre les eacuteventuels contaminants)
pour reacutecupeacuterer les eacutechantillons Il est eacutegalement important de se munir de gants propres et drsquoune
charlotte pour eacuteviter les contaminations par la keacuteratine Pour chaque bande deacutecoupeacutee un scalpel
propre doit ecirctre utiliseacute
Solutions utiliseacutees
- Solution de bicarbonate drsquoammonium agrave 50 mM (solution AB) 198 g de bicarbonate
drsquoammonium 50 mL drsquoeau pour HPLC (ne pas utiliser drsquoeau MQ)
- Solution de DTT agrave 10 mM diluer le DTT (stock agrave 1 M masse moleacuteculaire = 15425
gmol) dans 1mL de solution de bicarbonate drsquoammonium agrave 50 mM
- Solution drsquoiodoaceacutetamide (55 mM) diluer lrsquoiodoaceacutetamide (stock agrave 100 mM) dans une
solution de bicarbonate drsquoammonium agrave 50 mM
- Solution de bicarbonate drsquoammonium avec 5 drsquoaceacutetonitrile diluer 50 microL
drsquoaceacutetonitrile pur dans 950 microL de bicarbonate drsquoammonium agrave 50 mM
- Solution de trypsine Trypsine PROMEGA (20 microg) dilueacute dans 400 microL de solution de
reacutehydratation PROMEGA (Ref V5280)
Protocole
Pour un eacutechantillon migreacute sur gel SDS-PAGE chaque bande proteacuteique est deacutecoupeacutee
Chacune des bandes est deacuteposeacutee dans un tube Eppendorf puis deacutecoupeacutee en cubes de 1-2mm x
1-2mm x 1mm agrave lrsquoaide drsquoune lame de scalpel On ajoute alors 20 agrave 100 microL drsquoaceacutetonitrile 100
Mateacuteriels et Meacutethodes
171
durant 10 min pour deacuteshydrater le gel puis on retire le liquide Srsquoen suit une eacutetape de reacuteduction
des eacutechantillons durant laquelle on ajoute 20 agrave 100 microL (suivant le volume de la bande
deacutecoupeacutee) de solution de bicarbonate drsquoammonium (50 mM) contenant 10 mM de DTT durant
1h agrave 37degC en agitant les tubes occasionnellement mais vigoureusement Le liquide est ensuite
eacutevacueacute On poursuit sur une eacutetape drsquoalkylation ougrave lrsquoon va ajouter une solution drsquoiodoaceacutetamide
(55 mM) en utilisant le mecircme volume que celui ajouteacute lors de lrsquoeacutetape de reacuteduction Puis les
eacutechantillons sont incubeacutes 30 agrave 60 min agrave lrsquoabri de la lumiegravere en prenant soin drsquoagiter
occasionnellement et eacutenergiquement On eacutevacue ensuite le liquide On recommence lrsquoeacutetape de
deacuteshydratation en ajoutant 20-100 microL de solution drsquoaceacutetonitrile durant 10 min puis on eacutevacue
le surnageant On peut alors reacutehydrater les eacutechantillons en les laissant reposer durant 20 min
dans 20-100 microL de solution AB suivi drsquoune nouvelle deacuteshydratation avec 20-100 microL
drsquoaceacutetonitrile 100 durant 10 min On eacutevacue ensuite le liquide Les morceaux de gel sont alors
laveacutes dans 50-200 microL de solution de bicarbonate drsquoammonium et le liquide est retireacute Les
eacutechantillons sont de nouveau deacuteshydrateacutes durant 10 min avec 50-200 microL drsquoaceacutetonitrile puis on
eacutevacue les reacutesidus drsquoaceacutetonitrile en placcedilant les eacutechantillons durant 30 min agrave 1h dans un
SpeedVac (cela permet drsquoeacutevacuer les reacutesidus drsquoaceacutetonitrile neacutefastes pour lrsquoeacutetape de digestion
agrave la trypsine) Les eacutechantillons sont ensuite digeacutereacutes avec 2 microL de solution de trypsine en laissant
le temps aux morceaux de gel de se reacutehydrater agrave 0degC
Lorsque les eacutechantillons ont absorbeacute la solution de trypsine on ajoute 10-100 microL de
solution de bicarbonate drsquoammonium contenant 5 drsquoaceacutetonitrile pour reacutehydrater
complegravetement les morceaux de gel Les tubes sont mis agrave incuber durant 15 min (on peut ajouter
plus de solution le but eacutetant que les morceaux de gel soient complegravetement reacutehydrateacutes en eacutevitant
drsquoavoir un surplus de surnageant) Lrsquoeacutetape de digestion se deacuteroule ensuite durant 1 agrave 2h agrave 37degC
dans un thermomixeur agrave 600 rpm A lrsquoissue de la digestion on ajoute 2-10 microL de solution 1
FA (acide formique) ou 01 TFA (acide trifluoroaceacutetique) dilueacute dans de lrsquoeau si lrsquoextraction
doit ecirctre faite le lendemain Sinon on passe directement agrave lrsquoeacutetape de premiegravere extraction qui
consiste agrave reacutecupeacuterer le surnageant et le transfeacuterer dans un nouveau tube auquel on ajoute 10-
50 microL drsquoune solution 1 FA On incube lrsquoeacutechantillon durant 20-30 min agrave tempeacuterature ambiante
en agitant occasionnellement On reacutealise ensuite la seconde extraction qui consiste agrave ajouter
10-50microL de solution 80 aceacutetonitrile 01 FA et on incube durant 20-30 min agrave tempeacuterature
ambiante en agitant occasionnellement et vigoureusement On reacutecupegravere alors le surnageant que
lrsquoon ajoute agrave la fraction preacuteceacutedente On garde les morceaux de gel jusqursquoagrave ce que les analyses
de spectromeacutetrie de masse aient eacuteteacute effectueacutees Les tubes contenant le surnageant sont mis dans
Mateacuteriels et Meacutethodes
172
un concentrateur SpeedVac afin drsquoeacutevaporer le liquide et seacutecher les eacutechantillons (pas de
chauffage requis) On ajoute alors 10 microL drsquoeau pour resuspendre le mateacuteriel et on replace les
tubes dans la centrifugeuse sous vide afin drsquoobtenir seulement 2 microL de liquide dans le tube
Pour finir on resuspend lrsquoeacutechantillon dans 10-50 microL de solvant A (5 aceacutetonitrile 01 FA)
B4 Etudes des interactions avec le ribosome
1) Preacuteparation de ribosomes 70S drsquoE coli
Mateacuteriel et Solutions
-Centrifuge Beckman rotor JA20
-Rotors rotor 70Ti ou 502Ti pour ultracentrifugeuse (Beckman Coulter ref 337922)
-Tubes pour lrsquoultracentrifugation en polycarbonate aluminium (ref 355618 Beckman) adapteacutes
aux rotors 70Ti (Beckman Coulter) et 502Ti
-La paillasse et les pipettes sont nettoyeacutees avec une solution anti-RNAse (Ambion 9780)
Composition des diffeacuterents tampons et milieu de culture
-Tous les tampons sont preacutepareacutes au plus tocirct quelques jours en avance filtreacutes sur des filtres de
022 μm et stockeacutes agrave 4degC
-7 SpectraPor Dialysis Membrane MWCO 8000 Wet in 01 sodium azide (no ref 734-0614
VWR)
-Ammonium chloride A9434-1KG (Sigma)
-Lysozyme 62970-5G-F (Sigma)
-Potassium chloride P9541-500G (Sigma)
-Sucrose molecular biology grade RNase-free S0389-1KG (Sigma)
-Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Cat No 11 873 580 001 (20
tablets) or Cat No 05 056 489 001 (3x20 tablets) (Roche)
-DNase I FPLC pure Product number 27-0514 (Amersham Biosciences)
-PBS 10X sterile Molecular biology biosolve CAT Ndeg 16232321
Composition apregraves dilution
-PBS 1X 10 mM sodium phosphate 18 mM potassium phosphate 137 mM sodium chloride
27 mM potassium chloride pH 74 (25degC) Filtreacute avec filtres de 022 μm
Mateacuteriels et Meacutethodes
173
Tableau MM-9 Composition des tampons RSP pour la purification des ribosomes 70S drsquoE coli
Tampons
RSP Tris-HCl MgCl2 NH4Cl KCl Sucrose Autre
RSP 25 mM 10 mM 50 mM --- --- 7 mM -mercaptoethanol
(ajouteacute agrave la derniegravere minute)
RSP-10 25 mM 10 mM 50 mM --- 10 1 mM pefabloc + 05 mgmL
lysozyme (Roche)
RSP-18 A 25 mM 10 mM 05 M --- 18
RSP-18 B 25 mM 10 mM 1 M --- 18
RSP-low Mg 50 mM 1 mM 30 mM 30 mM ---
RSP-20 50 mM 05 mM 30 mM 30 mM 20
RSP-30 50 mM 13 mM 30 mM 30 mM 30
Protocole de purification des ribosomes drsquoE coli
La souche de bacteacuteries E coli MRE600 (souche deacuteficiente en RNase voir 269) est utiliseacutee
pour cette purification Cette souche ne contenant pas de plasmide portant une reacutesistance agrave un
antibiotique il est tregraves important de prendre des preacutecautions lors de la culture afin de ne pas
avoir de contamination
La souche MRE600 (conserveacutee en glyceacuterol agrave -80degC) est mise en preacuteculture (7 mL) pendant
12h agrave 37degC et sous agitation constante (180 rpm) Cette preacuteculture est utiliseacutee pour ensemencer
32 L de milieu LB reacutepartis dans 4 erlens de 3L (1mL de preacuteculture agrave DO600 ~ 5-6 pour 800 mL
de milieu) qui sont ensuite mis sous agitation constante (180pm) agrave 37degC Lorsque la DO600
atteint 27 agrave 29 uniteacutes drsquoabsorbance (il est important de ne pas deacutepasser ces valeurs pour que
la culture soit en phase exponentielle) la culture est arrecircteacutee en mettant les erlens dans la glace
durant 20 min (run on) puis centrifugeacutee pendant 30 min agrave 6000 rpm agrave 4degC (JA10 Beckman)
entre 10 et 12 g de bacteacuteries sont ainsi reacutecolteacutees Les culots bacteacuteriens sont laveacutes deacutelicatement
avec ~7 volumes de PBS 1X froid pour 1g de cellules La resuspension se fait avec une pipette
de 10 mL en eacutevitant de faire des bulles Geacuteneacuteralement on ajoute 50 mL de tampon dans le
premier tube et apregraves resuspension on transfert dans le deuxiegraveme tube et ainsi de suite jusqursquoau
dernier tube Tous les tubes de maniegravere seacutequentielle sont enfin laveacutes avec le reste de tampon
que lrsquoon ajoute agrave la solution initiale Les bacteacuteries et les solutions doivent ecirctre maintenues
constamment dans la glace Les cellules resuspendues sont distribueacutees dans deux tubes Falcons
de 50 mL puis centrifugeacutees 10-20 min agrave 6000 rpm 4degC (rotor laquo swinging centrifuge raquo)
Le culot bacteacuterien est resuspendu dans la glace (en utilisant une tige de verre arrondie) dans
15 mL de tampon RSP-10 Pour faciliter la resuspension les cellules sont mises agrave agiter
Mateacuteriels et Meacutethodes
174
doucement dans une chambre froide jusqursquoagrave complegravete suspension La solution de bacteacuteries
(~25mL) est additionneacutee de tampon RSP-10 sucrose jusqursquoagrave un volume final de 50 mL
Deux meacutethodes de lyse ont eacuteteacute utiliseacutees La plupart des purifications de ribosomes ont eacuteteacute
obtenues par sonication des cellules mais lrsquoutilisation drsquoun laquo cell distruptor (voir ci-dessous) a
eacutegalement eacuteteacute essayeacutee
Sonication
La lyse est effectueacutee par Sonication (Branson Digital Sonifer) Pour 50 mL de cellules
resuspendues on utilise un beacutecher de 100 mL en plastique (nettoyeacute avec de lrsquoeacutethanol) et deacuteposeacute
dans un beacutecher en verre de 1 L contenant un meacutelange drsquoeau et de glace
Les conditions de sonication sont les suivantes
Temps 3rsquo
Tempeacuterature max 11degC
Amplitude 60
Pulsation 5rsquorsquo
Intervalle 30rsquorsquo
Tempeacuterature pulsation 7degC
Tempeacuterature sonde 3degC
Dans le cas ougrave nous avons utiliseacute le Sonicator (Sonifier cell disruptor 200 de Branson) dont
nous ne pouvons pas controcircler tous les paramegravetres la sonication a eacuteteacute effectueacutee par des
pulsations de 5 sec avec des intervalles de 55 sec pour un temps total de pulsation de 3 min
(donc 36 pulsations de 5 sec drsquointervalle avec des pauses de 55 sec)
- Lyse des cellules avec le Cell Distruptor
Dans les cas ougrave nous avons utiliseacute le Cell Distruptor nous avons effectueacute 8 passages de
lrsquoeacutechantillon dans le microfluidizer avec une pression de 20 kpsi (apregraves chaque passage on
reacutecupegravere lrsquoeacutechantillon puis on le reacuteinjecte dans la machine)
Lrsquoeacutechantillon est ensuite centrifugeacute dans deux tubes 30 min agrave 19000 rpm 4degC (Beckman
rotor JA20) pour eacuteliminer les membranes Le surnageant est collecteacute dans un tube de 50 mL
auquel on ajoute de la DNase agrave 1 mgmL final (moitieacute drsquoune petite spatule ne pas doser car tregraves
volatile) partageacute dans deux tubes froids drsquoultracentrifugeuse de 25 mL (no ref 355618
Mateacuteriels et Meacutethodes
175
Beckman ndash les tubes sont adapteacutes pour les rotors type 70 Ti et type 502 Ti) et centrifugeacute 3h30
agrave 50000 rpm 4degC (rotor 70 Ti)
- Lavage I
Les culots sont resuspendus sous agitation douce (ne pas essayer drsquoobtenir une solution
homogegravene) agrave 4degC pendant 30 min dans 20 mL de tampon RSP puis deacuteposeacutes au fond du tube
On ajoute ensuite au fond du tube une solution RSP-18 A (le tout est reacuteparti dans 2 tubes)
Plus preacuteciseacutement en utilisant une seringue agrave pointe plate contenant 13 mL de solution pour
eacuteviter des bulles et positionneacutee au fond du tube Les tubes sont eacutequilibreacutes avec du tampon RSP
+ 1mM Pefabloc et centrifugeacutes pendant 16h agrave 25000 rpm ou 4h agrave 45000 rpm 4degC (Optima 70
Ti) Le surnageant est eacutelimineacute ainsi que la couche marron proche du culot
- Lavage II
Les culots sont ensuite resuspendus sous agitation douce 30 min avec une tige de verre ou
la nuit (shaking platform agrave 100-150 rpm) agrave 4degC dans 10 mL de tampon RSP puis centrifugeacutes
20 min agrave 17000 rpm (4degC) cette eacutetape de centrifugation est reacutepeacuteteacutee 2-3 fois Dans un tube 10
mL de surnageant sont alors deacuteposeacutes suivi par 125 mL drsquoune solution RSP-18 sucrose
contenant 1M NH4Cl La mecircme proceacutedure que celle deacutecrit dans laquo lavage I raquo est utiliseacutee pour
charger Centrifuger 3h agrave 50000 rpm (ou 3h30 agrave 40 000 rpm) dans un rotor 70 Ti (Optima)
4degC
Les culots sont resupendus dans 10 mL de tampon RSP sous agitation douce (sans chercher agrave
obtenir une solution homogegravene) pendant 30 min ou la nuit agrave 4degC (shaker 150 rpm)
- Lavage III (facultatif)
Le surnageant est centrifugeacute 20 min agrave 18000 rpm (JA20 Beckman) puis on le deacutepose au
fond drsquoune solution RSP-18 B comme dans le lavage I Centrifuger a 40000 rpm 3h30 ou
24000 rpm la nuit agrave 4degC
Les culots sont resupendus 30 min (150 rmp) agrave 4degC dans 3 mL de tampon RSP low Mg (ne pas
essayer drsquoobtenir une solution homogegravene) On centrifuge alors agrave 18000 rpm 20 min (JA20
Beckman 4degC)
Le surnageant est ensuite deacuteposeacute sur une bicouche de sucrose (couche supeacuterieure composeacutee
de 125 mL de tampon RSP-20 couche infeacuterieure composeacutee de 5 mL de tampon RSP-30)
Le deacutepocirct de lrsquoeacutechantillon et des deux couches se fait dans lrsquoordre suivant 1) eacutechantillon 2)
tampon RSP-20 et 3) tampon RSP-30 Apregraves une centrifugation de 5h agrave 50000 rpm ou la
nuit agrave 28000 rpm (4degC) les culots sont repris deacutelicatement dans 3mL de tampon 50 mM Tris-
Mateacuteriels et Meacutethodes
176
HCl 50 mM NH4Cl 50 mM MgCl2 7 mM β-mercaptoethanol La resuspension se fait avec
une tige de verre et une agitation douce agrave 150 rpm la nuit agrave 4degC si besoin Enfin les ribosomes
resuspendus sont dialyseacutes la nuit agrave 4degC contre environ 100 mL de tampon contenant 50 de
glyceacuterol 50 mM Tris-HCl 10 mM NH4Cl 10 mM MgCl2 7mM β-mercaptoethanol ou 2 mM
DTT
La concentration de ribosomes purifieacutes est mesureacutee avant et apregraves la dialyse (apregraves dialyse
lrsquoeacutechantillon est dilueacute au moins 1000-1500 fois pour le dosage) par mesure drsquoabsorbance agrave 260
nm dans 1 mL en utilisant les donneacutees suivantes 15 uniteacutes drsquoabsorbance (A260) correspondent
agrave 1 mg de 70S 1 A260 correspond agrave 25 pmolmL de 70S
La concentration de ribosome typique est entre 10 et 20 microM
2) Preacuteparation de ribosomes 70S de Thermus thermophilus
Mateacuteriel et Solutions
Les tampons utiliseacutes pour la purification des ribosomes de T thermophilus (listeacutes ci-
dessous) sont preacutepareacutes le matin du premier jour
Lrsquoindice de reacutefraction de chacune des solutions est mesureacute avec un reacutefractomegravetre
ATAGO Abbe ce qui permet de veacuterifier que la composition des tampons est exactement la
mecircme drsquoune purification agrave une autre
Tampon A (500mL) 100mM NH4Cl Mg(CH3COO)2 105 mM 20 mM HEPES-KOH
pH75 05 mM EDTA 1 mM DTT 01 mM benzamidine ajouter un peu de PMSF dissout
dans 100 μL drsquoaceacutetone juste avant la lyse
Tampon B (200 mL) (Indice de reacutefraction 1394) 11 M Sucrose 05 M KCl 105
mM Mg(CH3COO)2 05 mM EDTA 20 mM HEPES-KOH pH 75 1mM DTT
Tampon C (15 L) (Indice de reacutefraction 1365) 15 M Ammonium sulfate 10 mM
Mg(CH3COO)2 400 mM KCl 20 mM HEPES-KOH pH 75 1mM DTT
Tampon D (1 L) (Indice de reacutefraction 1338) Mg(CH3COO)2 10 mM 400 mM KCl
20 mM HEPES-KOH pH75 20 mM DTT
Tampon E 5X (250mL) 250 mM KCl 50mM NH4Cl 5125mM MgAcetate 125 mM
EDTA 50 mM HEPES-KOH pH75 5 mM DTT
Solution agrave 5 de sucrose (300 mL) (Indice de reacutefraction 13413) 30 mL de sucrose
50 + 60 mL de tampon E 5X (60 mL) + 210 mL drsquoH2O
Mateacuteriels et Meacutethodes
177
Solution agrave 20 de sucrose (300 mL) (Indice de reacutefraction 13630) ) 120 mL de
sucrose 50 + 60 mL de tampon E 5X (60 mL) + 120 mL drsquoH2O
Tampon G (100mL) 10 mM Mg(CH3COO)2 50 mM KCl 10 mM NH4Cl 50 mM
HEPES-KOHpH75 1 mM DTT
Protocole de purification des ribosomes de T thermophilus
Les ribosomes de T thermophilus ont eacuteteacute purifieacutes selon le protocole utiliseacute dans lrsquoeacutequipe de
Marat Yusupov 239
Les bacteacuteries T thermophilus HB8 sont acheteacutees aupregraves du service Bioexpression amp
Fermentation Facility (University of Georgia Athens GA USA) qui reacutealise les cultures par
fermenteur (culture reacutealiseacutee agrave 70degC jusqursquoagrave DO600 = 2) puis nous fournit les cellules sous forme
drsquoun unique bloc de culot sec de 250g stockeacute dans un pot en plastique lequel est conserveacute tel
quel agrave -80degC
Environ 25g de bacteacuteries T thermophilus HB8 sont preacuteleveacutes du bloc de culot sec en utilisant
un tournevis et un marteau pour en deacutetacher des morceaux Les bacteacuteries sont alors deacutecongeleacutees
lentement durant 1 agrave 2 h agrave tempeacuterature ambiante dans du tampon A en utilisant 15 mL de
tampon par gramme de bacteacuteries Les bacteacuteries resuspendues sont transvaseacutees dans une
eacuteprouvette de 50 mL en les filtrant agrave travers de la gaze pour eacuteliminer les eacuteventuels morceaux de
plastique Le volume est ajusteacute agrave 90 mL avec du tampon A puis de la DNase est ajouteacutee (agrave
raison de 2 microL de DNase agrave 1 UmicroL par gramme de cellules) La lyse des bacteacuteries est effectueacutee
avec un disrupteur de cellules (Cell Disrupteur de Constant Systems LTD) par 3 passages
successifs agrave une pression de 15 kbar agrave 4degC
Les bacteacuteries lyseacutees sont centrifugeacutees 1 h agrave 13500 rpm (4degC) On complegravete ensuite agrave 160
mL avec du tampon A et lrsquoeacutechantillon est reacuteparti agrave la surface de 4 tubes (Nalgene ref 355622)
contenant chacun 25 mL de tampon B Les eacutechantillons sont centrifugeacutes agrave 45000 rpm durant 17
h agrave 4degC Les surnageants sont soigneusement eacutelimineacutes et chaque culot est laveacute deacutelicatement
avec 2 mL de tampon C Les culots sont alors resuspendus avec 4 mL de tampon C par tube
sous agitation leacutegegravere agrave 4degC en utilisant des barreaux aimanteacutes de 15 cm de longueur Les culots
resuspendus drsquoun volume total de 20-25 mL sont rassembleacutes et la quantiteacute de ribosomes est
estimeacutee en mesurant la DO260 drsquoun aliquote dilueacute 10 fois (1 mgmL de 70S donne une DO260 =
15) On fait ensuite une centrifugation de 10 min agrave 10000 rpm agrave 4degC dans un seul tube de 50
mL
Une chromatographie drsquointeractions hydrophobes est ensuite reacutealiseacutee agrave 4degC avec une
colonne contenant 200 mL de reacutesine Butyl-650S (Tosoh Bioscience) le deacutebit est de 6 mLmin
Mateacuteriels et Meacutethodes
178
pour chaque eacutetape Lrsquoeacutechantillon est injecteacute sur la colonne preacutealablement eacutequilibreacutee avec 2
volumes de colonnes (VC) de tampon C puis la colonne est laveacutee avec 2VC de tampon D agrave
50 Lrsquoeacutelution est reacutealiseacutee gracircce agrave un gradient inverse de sulfate drsquoammonium allant de 50
de tampon D agrave 100 de tampon D des fractions de 4 mL sont reacutecolteacutees agrave chaque eacutetape La
DO260 de chacune des fractions est mesureacutee par un spectrophotomegravetre Nanodrop en utilisant 5
microL non dilueacutes les valeurs sont reporteacutees sur une courbe laquo DO260 en fonction du numeacutero de
fraction raquo afin de seacutelectionner les fractions contenant les ribosomes 70S Les fractions dont la
DO260 est comprise entre DOmax et DOmax 2 correspondant aux ribosomes 70S sont
rassembleacutees (Figure MM-2A) cette eacutetape de chromatographie permet lrsquoeacutelimination de
nombreux contaminants notamment la proteacuteine S1 La DO260 de ce pool est mesureacutee (sans
dilution) permettant agrave nouveau drsquoestimer la quantiteacute de ribosomes Apregraves avoir compleacuteteacute le
volume agrave 120 mL avec du tampon E lrsquoeacutechantillon est centrifugeacute 16h agrave 45000 rpm agrave 4degC
Figure MM-2 A) Suivi du gradient inverse en sulfate drsquoammonium au cours de la chromatographie
drsquointeractions hydrophobes (absorbance agrave 260nm en fonction des fractions collecteacutees) B) Analyse de
lrsquoabsorbance agrave 260nm dans les diffeacuterentes fractions des gradients (seul le premier gradient est repreacutesenteacute) Pour
chacune des deux eacutetapes les fractions comprises entre les deux traits verticaux ont eacuteteacute rassembleacutees et soumises
agrave lrsquoeacutetape suivante du protocole de purification
Mateacuteriels et Meacutethodes
179
Les ribosomes sont ensuite purifieacutes sur des gradients de sucrose le protocole preacutevoit
normalement drsquoutiliser 12 gradients de sucrose reacutepartis dans deux ultracentrifugeuses mais
pour des raisons techniques nous nrsquoavons pu utiliser qursquoune seule seacuterie de 6 gradients Les
gradients de sucrose (20-5) sont preacutepareacutes durant lrsquoeacutetape de chromatographie il srsquoagit de
mettre 175 mL de solution agrave 5 de sucrose dans chaque tube puis drsquoajouter au fond du tube
en passant agrave travers la solution agrave 5 175 mL de solution agrave 20 de sucrose Les gradients sont
ensuite formeacutes avec un formeur de gradient puis conserveacutes en chambre froide durant la nuit
Les culots obtenus par ultracentrifugation sont rinceacutes avec du tampon E (1 mL par
culot) puis resuspendus lentement dans du tampon E agrave raison de 1 mL de tampon par culot (2h
sous agitation lente en chambre froide avec des barreaux aimanteacutes de 06-07 cm) Les culots
ainsi resuspendus sont rassembleacutes et la DO260 est mesureacutee (apregraves dilution 1500) A cette eacutetape
la concentration typique est de 35-45 mgmL et une perte de ribosomes de 25 agrave 30 est
observeacutee par rapport agrave lrsquoeacutetape preacuteceacutedente Les eacutechantillons sont alors deacutelicatement deacuteposeacutes agrave la
surface de chacun des gradients agrave raison de 7 agrave 8 mg de ribosomes par gradient Apregraves
centrifugation agrave 15400 rpm et agrave 4degC durant 17h avec un rotor SW28 les gradients sont
fractionneacutes du bas vers le haut agrave lrsquoaide drsquoune pompe peacuteristaltique par fractions de 1 mL (deacutebit
de 2 mLmin et agrave une tempeacuterature de 4degC) La DO260 de chacune des fractions issues du premier
gradient est mesureacutee et la courbe repreacutesentant la DO260 en fonction du numeacutero de la fraction est
traceacutee Les fractions correspondant au pic (Figure MM-2B) sont rassembleacutees (~30 mL) puis on
mesure le volume et la DO260 du pool avec un Nanodrop Ensuite on dilue le pool avec du
tampon E pour le reacutepartir dans 2 tubes la concentration mesureacutee au Nanodrop ne doit pas ecirctre
infeacuterieure agrave 06-1 mgmL Une centrifugation est effectueacutee durant 16h agrave 45000 rpm agrave 4degC avec
un rotor 70Ti On eacutevacue le surnageant et on rince les culots avec 1 mL de tampon G par tube
On eacutevacue le tampon puis on resuspend lentement les culots dans 250 μL de tampon G par
tube avec un barreau aimanteacute (06-07 cm) en chambre froide On deacutepose les culots resuspendus
dans un tube de 15 mL et on mesure le volume exact ainsi que la DO260 (perte typique de 10
mg) Si neacutecessaire on dilue lrsquoeacutechantillon avec le tampon G pour obtenir une concentration finale
de 23-25 mgmL dans un volume de 800 microL (environ 10 microM) Ce protocole permet drsquoobtenir
~50 mg de ribosome agrave partir de 25g de bacteacuteries Enfin on filtre la solution finale de ribosomes
sur des tubes Eppendorf eacutequipeacutes drsquoun filtre 022 μm par centrifugation agrave 4degC quelques minutes
agrave 10000 g
Enfin les eacutechantillons sont aliquoteacutes congeleacutes rapidement agrave lrsquoazote liquide et stockeacutes agrave
-80degC Une analyse de suivi de la purification peut ecirctre reacutealiseacutee sur gel SDS-PAGE agrave partir
drsquoaliquot preacuteleveacutes agrave chaque eacutetape de la purification (voir Figure MM-3)
Mateacuteriels et Meacutethodes
180
Figure MM-3 Analyse des diffeacuterentes eacutetapes de purification des ribosomes 70S de T thermophilus sur
gel SDS-PAGE 15 1 Surnageant de lyse 2 Culot resuspendu apregraves eacutetape du coussin de sucrose 3 Apregraves
eacutetape de centrifugation agrave 10000 rpm 4 Pool apregraves la chromatographie HIC 5 Culot apregraves lrsquoultracentrigation
sur la nuit 6 Pool apregraves eacutetape de centrifugation de lrsquoeacutechantillon sur gradient de sucrose 7 ribosomes purifieacutes
Mesure de lrsquoactiviteacute des ribosomes Lrsquoactiviteacute des ribosomes 70S est consideacutereacutee comme la capaciteacute agrave syntheacutetiser des chaicircnes
poly-pheacutenylalanines in vitro (on mesure ainsi lrsquoactiviteacute drsquoeacutelongation) On mesure
lrsquoincorporation de la pheacutenylalanine tritieacutee dans la chaicircne polypeptidique deacutependant de lrsquoARNm
syntheacutetique poly(U) en preacutesence de tous les eacuteleacutements neacutecessaires pour le processus
drsquoeacutelongation 270ndash274 et un excegraves de pheacutenylalanine froid
Tampons neacutecessaires pour le test drsquoactiviteacute
Tampon D (pour dilution des ribosomes 500μL) 40 mM Tris-HCl pH 75 7 mM
MgCl2 80 mM NH4Cl 1 mM DTT
Tampon C (tampon de reacuteaction 10X 500μL) 400 mM Tris-HCl pH 75 70 mM MgCl2
800 mM NH4Cl 5mM DTT 10mM ATP 5mM GTP phosphoenolpyruvate 10 mM PEP-K
(C3H4O6P-K)
Tampon B (340microL) 0041 μgmL PK 0147mgmL ARN Poly(U) 0453 μM EF-Ts
046 μM EF-G 071 μM EF-Tu preacutepareacute dans du tampon C 1X
Tampon A (meacutelange contenant les ARNt Phe 180μL) tARNPhe chargeacute 175 μgμL
ARNt totaux 0167 μgμL PK 138 μCimL 3H-Phe soit environ 31106 dpmmL 244 μM
Phe preacutepareacute dans du tampon C 1X
Mateacuteriels et Meacutethodes
181
Mesure drsquoactiviteacute des ribosomes drsquoE coli MRE600 et de T thermophilus HB8
On dilue les ribosomes purifieacutes comme deacutecrit preacuteceacutedemment dans du tampon D pour avoir
les trois concentrations suivantes 196 μM 098 μM et 049 μM que lrsquoon incube 1 min agrave
30degC On preacutepare le tampon A pour la reacuteaction de chargement des ARNt et on incube 30 min agrave
30degC On meacutelange 20 μL de tampon B avec 5μL de solution de ribosomes dilueacutes et on
preacutechauffe 10 min agrave 30degC La reacuteaction de synthegravese proteacuteique est deacutemarreacutee en ajoutant 10 μL de
tampon A au meacutelange tampon B et la solution de ribosomes preacutepareacutee preacuteceacutedemment On incube
les eacutechantillons 6 min agrave 30degC La reacuteaction est arrecircteacutee en mettant 28 μL du meacutelange reacuteactionnel
sur un filtre GFC puis on plonge immeacutediatement chaque filtre dans du TCA 10 froid durant
15 min (pour preacutecipiter lrsquoensemble des macromoleacutecules) Pour le lavage on deacutepose le filtre
dans du TCA 5 agrave eacutebullition durant 15 min pour eacuteliminer ARNt acides amineacutes chaicircnes
peptidiques infeacuterieures agrave 3 reacutesidus Apregraves cette eacutetape le filtre est laveacute par trempage durant 1
min dans du TCA 5 Enfin on lave les filtres deux fois 10 min dans une solution eacutethanoleacutether
(eacutelimine le TCA qui laquo quenche raquo le comptage) puis une derniegravere fois 10 min dans de lrsquoeacutether agrave
tempeacuterature ambiante Les filtres sont seacutecheacutes sous la sorbonne Pour deacuteterminer la radioactiviteacute
lieacutee aux filtres on deacutepose ces filtres dans 4 mL de solution de scintillation (ECOLITE(+) Liquid
scintillation cocktail de MP Biomedicals) on agite 30 min et les produits de la reacuteaction fixeacutes agrave
la membrane sont quantifieacutes par un compteur agrave scintillation Les reacutesultats obtenus sont analyseacutes
avec le tableur Excel et repreacutesenteacutes graphiquement par les picomoles de pheacutenylalanine
incorporeacutes en fonction de la concentration de ribosomes
Nous avons constateacute que les preacuteparations de reacutefeacuterences R1 et M1 preacutealablement reacutealiseacutees
au laboratoire sont actives alors que les preacuteparations M3 et T4 sont 37 fois moins actives Il
est probable qursquoun problegraveme survenu lors de la purification a abouti agrave une deacutestructuration des
ribosomes drsquoE coli dans la preacuteparation M3 Concernant le protocole de purification de T
thermophilus le protocole implique une eacutetape qui aboutit agrave la perte de proteacuteines ribosomales
notamment la proteacuteine S1 neacutecessaires pour lrsquoactiviteacute de traduction ayant pour conseacutequence
une quantiteacute de pheacutenylalanine incorporeacutee tregraves faible
Mateacuteriels et Meacutethodes
182
Figure MM-4 Test drsquoincorporation in vitro de la pheacutenylalanine tritieacutee en fonction de la concentration
en ribosomes 70S Les purifications R1 M1 et M3 sont des preacuteparations de ribosomes 70S drsquoE coli MRE600
La purification T4 est une preacuteparation de ribosomes 70S de T thermophilus Lrsquoactiviteacute drsquoeacutelongation est mesureacutee
de faccedilon comparative avec la preacuteparation de reacutefeacuterence R1
3) Production de ribosomes bloqueacutes en cours de traduction (laquo stalled
ribosomes raquo)
Principe
Lrsquoobjectif de ce protocole est la production de ribosomes bloqueacutes en cours de traduction
en controcirclant preacuteciseacutement la longueur de la chaicircne peptidique syntheacutetiseacutee Ainsi il est possible
drsquoobtenir des chaicircnes de longueurs variables dont lrsquoextreacutemiteacute est confineacutee agrave lrsquointeacuterieur du
tunnel de sortie du ribosome ou au contraire qui eacutemerge de ce tunnel Le protocole utilise les
proprieacuteteacutes de la seacutequence SecM (seacutequence F150XXXXWIXXXXGIRAGP166) naturellement
preacutesente dans des proteacuteines drsquoE coli destineacutees agrave ecirctre exporteacutees240 La seacutequence SecM contenue
dans la proteacuteine induit naturellement une pause du processus de traduction Les meacutecanismes
qui induisent une pause du ribosome avec la seacutequence SecM sont encore en cours
drsquoinvestigation 24 Cette seacutequence est couramment utiliseacutee pour produire des ribosomes bloqueacutes
en cours de traduction et qui ne se dissocient pas (aussi appeleacutes laquo stalled ribosomes raquo ou RNC
pour laquo ribosome nascent chain raquo)
Les ribosomes bloqueacutes en cours de traduction ont eacuteteacute produits avec le kit laquo PURExpress
in vitro Protein Synthesis Kit raquo de chez New England Biolabs Ce kit contient tous les
composants pour transcrire un gegravene drsquointeacuterecirct en ARNm (facteurs de transcription
nucleacuteotideshellip) ainsi que les composants neacutecessaires agrave la traduction de lrsquoARNm syntheacutetiseacute
Mateacuteriels et Meacutethodes
183
(ribosomes facteurs de traduction ARNt acides amineacuteshellip) La transcription ainsi que la
traduction se deacuteroulent dans le mecircme meacutelange reacuteactionnel
La composition exacte des solutions A et B nrsquoest pas preacuteciseacutee dans le kit mais drsquoapregraves le livre
Cell-free Protein Purification chapitre 2 du Dr Takuya Ueda les compositions sont
- Solution A 02 mM de chacun des 20 acides amineacutes 108 DO260mL E coli tRNA
mixtures 4 mM ATP 4 mM GTP 2 mM CTP 2 mM UTP 40 mM creatine phosphate 20
microgmL formyl donor 100 mM Hepes-KOH pH 76 200 mM potassium glutamate 26 mM
magnesium acetate 4 mM spermidine 2 mM DTT
- Solution B 690 microgmL alanyl-tRNA synthetase 20 microgmL arginyl-tRNA synthetase
220 microgmL asparaginyl-tRNA synthetase 80 microgmL aspartate-tRNA synthetase 12 microgmL
cysteinyl-tRNA synthetase 38 microgmL glutaminyl-tRNA synthetase 126 microgmL glutamyl-
tRNA synthetase 96 microgmL glycyl-tRNA synthetase 8 microgmL histidyl-tRNA synthetase 400
microgmL isoleucyl-tRNA synthetase 40 microgmL leucyl-tRNA synthetase 64 lysyl-
tRNAsynthetase 21 microgmL methionyl-tRNA synthetase 170 microgmL phenylalanyl-tRNA
synthetase 100 microgmL prolyl-tRNA synthetase 19 microgmL seryl-tRNA synthetase 63 microgmL
threonyl-tRNA synthetase 11 microgmL tryptophanyl-tRNA synthetase 6 gmL tyrosyl-tRNA
synthetase 18 microgmL valyl-tRNA synthetase 200 microgmL methionyl-tRNA formyltransferase
100 microgmL initiation factor 1 (IF1) 400 microgmL initiation factor 2 (IF2) 100 microgmL initiation
factor 3 (IF3) 500 microgmL elongation factor G (EF-G) 1000 microgmL elongation factor Tu (EF-
Tu) 500 microgmL elongation factor Ts (EF-Ts) 100 microgmL release factor 1 (RF1) 100 microgmL
release factor 3 (RF3) 100 microgmL ribosome recycling factor (RRF) T7 ARN polymerase
ribosomes 70S E coli souche A19 13 microM 275
Il est inteacuteressant de noter que la solution B contient une meacutethionyl-tRNA
formyltransfeacuterase et la solution A du donneur de formyle Cela permet lrsquoincorporation drsquoune
Met initiatrice sous forme formyleacutee Ainsi le complexe ribosome chaicircne peptidique se trouve
dans un eacutetat permettant le recrutement de la peptide deacuteformylase
Ne sachant pas si lrsquoenzyme EcPDF est preacutesente dans les solutions du kit jrsquoai reacutealiseacute un
Western-blot suivi drsquoune immunodeacutetection en utilisant les anticorps anti-EcPDF De mecircme jrsquoai
chercheacute agrave savoir si le kit contient le trigger factor EcTF Jrsquoai ainsi montreacute que le kit contient du
TF mais pas EcPDF (Figure MM-5)
Mateacuteriels et Meacutethodes
184
Figure MM-5 Analyse de la preacutesence
drsquoEcPDF et EcTF dans les solutions A et B
du kit de ribosome laquo PURExpress in vitro
Protein Synthesis Kit raquo de chez New
England Biolabs par Western-blot Deacutepocirct de
10 microL de solution A et 75 microL de solution B sur
gel SDS-PAGE 14 La partie haute de la
membrane a eacuteteacute incubeacutee avec des anticorps
anti-EcTF et la partie basse avec des anticorps
anti-EcPDF
Description de la seacutequence geacutenomique utiliseacutee
Nous avons choisi de fusionner la seacutequence drsquoarrecirct SecM en C-terminal de la proteacuteine -
galacosidase drsquoE coli Cependant le N-terminus MTM a eacuteteacute modifieacute en MSL afin de ne contenir
qursquoune seule meacutethionine ce qui sera important pour deacuteterminer le ratio de ribosomes bloqueacutes
De plus le reste de la seacutequence est eacutegalement optimiseacute de faccedilon agrave ne contenir qursquoune
meacutethionine la meacutethionine initiatrice Cela permet ainsi de pouvoir compter le ratio de
ribosomes bloqueacutes agrave lrsquoissue de la reacuteaction (en utilisant de la 35S-L-Methionine) La seacutequence
geacutenomique
(5rsquoTTCAGCACGCCCGTCTGGATAAGCCAGGCGCAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCG
TAG-3rsquo)
correspondant agrave la seacutequence drsquoarrecirct de SecM (FSTPVWISQAQGIRAGPP) inclut un codon
proline ainsi qursquoun codon stop en 3rsquo permettant drsquooptimiser le blocage du ribosome 276277 La
seacutequence drsquoarrecirct SecM optimiseacutee a eacuteteacute fusionneacutee en C-terminal de diffeacuterentes seacutequences de β-
galactosidase de longueurs variables Les constructions preacutesenteacutees dans le tableau MM-10
correspondent agrave des proteacuteines recombinantes de 20 25 35 42 53 71 95 105 et 256 acides
amineacutes au total Lrsquoensemble des constructions a eacuteteacute inseacutereacute dans le plasmide drsquoexpression pET-
22b(+)
Mateacuteriels et Meacutethodes
185
Tableau MM-10 Liste des seacutequences geacutenomiques et proteacuteiques des diffeacuterentes constructions β-gal-SecM disponibles
SecM20
ATGAGCCTGTTCAGCACGCCCGTCTGGATAAGCCAGGCGCAAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLFSTPVWISQAQGIRAGPP
SecM25
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGTTCAGCACGCCCGTCTGGATAAGCCAGGCGCAAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLFSTPVWISQAQGIRAGPP
SecM35
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGGCCGTCGTATTACAACGTCGTGACTGGGAATTCAGCACGCCCGTCTGGATAAGCCAGGCGCAAGGCATCC
GTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLAVVLQRRDWEFSTPVWISQAQGIRAGPP
SecM42
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGGCCGTCGTATTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCaattATTCAGCACGCCCGTCTGGATA
AGCCAGGCGCAAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLFSTPVWISQAQGIRAGPP
SecM53
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGGCCGTCGTATTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAATTGAATCGCCTTGCAGCACATC
CCCCTTTCGctagTTTCAGCACGCCCGTCTGGATAAGCCAGGCGCAAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASFSTPVWISQAQGIRAGPP
SecM71
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGGCCGTCGTATTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAATTGAATCGCCTTGCAGCACATC
CCCCTTTCGCTAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCAATCGCCCTTCCCAGCAGTTACGCAGCTTCAGCACGCCCGTCTGGATAAGCCA
GGCGCAAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTNRPSQQLRSFSTPVWISQAQGIRAGPP
Mateacuteriels et Meacutethodes
186
SecM95
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGGCCGTCGTATTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAATTGAATCG
CCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCTAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCAATCGCCCTTCCCAGCAGTTGCGCA
GCCTGAATGGTGAGTGGCAATTTGTCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTTCCGGAAAGCTGGCTGGAATGcgATTTCAGC
ACGCCCGTCTGGATAAGCCAGGCGCAAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTNRPSQQLRSLNGEWQFVWFPAPEAVPESWLECDFSTPVWISQAQGIRAGPP
SecM105
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGGCCGTCGTATTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAATTGAATCGCCTTGCAGCACATC
CCCCTTTCGCTAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCAATCGCCCTTCCCAGCAGTTGCGCAGCCTGAATGGTGAGTGGCAATTTGTCTG
GTTTCCGGCACCAGAAGCGGTTCCGGAAAGCTGGCTGGAATGCGATCTTCCTGACGCCGATACTGTCGTGgtacCCTTCAGCACGCCCGTCTGGAT
AAGCCAGGCGCAAGGCATCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTNRPSQQLRSLNGEWQFVWFPAPEAVPESWLECDLPDADTVVVPFSTPVWISQ
AQGIRAGPP
SecM256
ATGAGCCTGATTACAGATTCACTGGCCGTCGTATTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAATTGAATCGCCTTGCAGCACATC
CCCCTTTCGCTAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCAATCGCCCTTCCCAGCAGTTGCGCAGCCTGAATGGTGAGTGGCAATTTGTCTG
GTTTCCGGCACCAGAAGCGGTTCCGGAAAGCTGGCTGGAATGCGATCTTCCTGACGCCGATACTGTCGTGGTACCCTCAAACTGGCAGATGCAC
GGTTACGACGCGCCCATCTACACCAACGTGACATATCCCATTACGGTCAATCCGCCATTTGTTCCCACGGAGAATCCGACCGGTTGTTACTCGCT
CACATTTAACGTCGACGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTGAATTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTATGGCCAGGACAGTCGTTTGCTGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGG
TGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCACAAACCGAC
CACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCTCTTTAATGATGATTTTTCACGCGCGTTCAGCACGCCCGTCTGGATAAGCCAGGCGCAAGGCA
TCCGTGCTGGCCCTCCGCCGTAG
MSLITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTNRPSQQLRSLNGEWQFVWFPAPEAVPESWLECDLPDADTVVVPSNWQMHGY
DAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLLSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSD
GSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATLFNDDFSRAFSTPVWISQAQGIRAGPP
Les seacutequences souligneacutees correspondent agrave la seacutequence de SecM permettant le blocage du ribosome
Mateacuteriels et Meacutethodes
187
Le meacutelange reacuteactionnel pour obtenir 24 microM de ribosomes bloqueacutes dans 25 microL final est le
suivant dans un tube Eppendorf on deacutepose 10 microL de solution A puis 75 microL de solution B ainsi
que 05 microL drsquoinhibiteur de RNAse (RNAse inhibitor murine de New England Biolabs 40000
uniteacutesmL) et le plasmide pET-22bSecM agrave une concentration finale de 5 agrave 25 ngmicroL (voir
tableau MM-11) On complegravete agrave 25 microL avec de lrsquoeau milliQ Le mix est alors doucement agiteacute
puis mis agrave incuber dans un thermomixeur agrave 37degC durant 150 min (un bain-marie agrave 37degC peut
eacutegalement ecirctre utiliseacute) Il faut faire attention de ne jamais vortexer la solution ni produire de
bulles afin de ne pas entraicircner une dissociation des ribosomes A lrsquoissue de la reacuteaction les
ribosomes bloqueacutes en cours de traduction sont precircts agrave ecirctre utiliseacutes
Tableau MM-11 Concentration et temps drsquoincubation optimaux pour obtenir des ribosomes bloqueacutes
avec les constructions SecM25 SecM42 SecM53 SecM71 et SecM105
Constructions Concentration optimale de
plasmides Temps optimal drsquoincubation
SecM25 5 ngmicroL 120 min
SecM42 15 agrave 25 ngmicroL 120 min
SecM53 5 ngmicroL 150 min
SecM71 5 ngmicroL 120 min
SecM105 15 ngmicroL 120 min
Veacuterification du ratio de ribosomes bloqueacutes produits
Le rendement drsquoobtention de ribosomes bloqueacutes en cours de traduction est mesureacute en
preacuteparant les ribosomes selon le protocole deacutecrit ci-dessus et en utilisant de la meacutethionine
radioactive Les ribosomes ainsi produits sont isoleacutes sur une colonne Sephacryl S-300 et la
radioactiviteacute contenue dans le meacutelange est mesureacutee La -galactosidase utiliseacutee ne contenant
qursquoune seule Met (voir lrsquooptimisation de seacutequence deacutecrite ci-dessus) la quantiteacute de radioactiviteacute
incorporeacutee est directement lieacutee agrave la quantiteacute de ribosomes bloqueacutes
La reacuteaction de synthegravese est reacutealiseacutee selon le mecircme protocole que deacutecrit preacuteceacutedemment
en ajoutant 2 microL de meacutethionine marqueacutee (EasyTag methionine 35S-Met de Perkin Helmer
reacutefeacuterence NEG709A agrave 14 microgmL et 1025 mCimL) dans le meacutelange reacuteactionnel
Dans une reacuteaction de 25 microL nous avons 60 pmol de ribosomes (24 microM) Comme chaque
ribosome bloqueacute nrsquoincorpore qursquoune seule meacutethionine (en N-terminal) 100 de ribosomes
Mateacuteriels et Meacutethodes
188
bloqueacutes incorporent donc 60 pmol de meacutethionine marqueacutee Nous utilisons 5 microL de meacutelange
reacuteactionnel pour le comptage de radioactiviteacute soit 12 pmol de ribosomes marqueacutes au maximum
La gamme eacutetalon de meacutethionine marqueacutee srsquoeacutetend donc de part et drsquoautre de cette valeur La
gamme est reacutealiseacutee dans un tampon 50 mM Hepes-KOHpH75 10 mM Mg(Ac)2et 75 mM
KAc
On deacutepose 1 mL de reacutesine Sephacryl S-300 high resolution (GE Healthcare) sur une
colonne Mobicole classique (MoBiTec) apregraves avoir mis un filtre Une fois lrsquoincubation des
ribosomes termineacutee on deacutepose le meacutelange reacuteactionnel au centre de la colonne (max 50
microLcolonne) et on centrifuge lrsquoeacutechantillon 2 min agrave 05 rcf Le filtrat contient alors les ribosomes
bloqueacutes alors que la reacutesine retient les meacutethionines marqueacutees libres qui nrsquoont pas eacuteteacute
incorporeacutees durant la synthegravese peptidique
Pour le comptage nous deacuteposons 100 microL drsquoeau 5 microL de solution de ribosomes bloqueacutes et
5 mL de liquide de scintillation dans un tube de comptage On peut alors reacutealiser les mesures
On reacutealise eacutegalement une gamme de concentration de 35S-L-Methionine afin de deacutefinir le
nombre de coups compteacutes en fonction de la quantiteacute de meacutethionine marqueacutee preacutesente dans la
solution Ainsi le nombre de coups mesureacutes dans la solution de ribosomes bloqueacutes nous indique
la quantiteacute de meacutethionine preacutesente et donc la quantiteacute de ribosomes bloqueacutes ayant incorporeacute
une meacutethionine
Tampon utiliseacute pour la gamme 50 mM HEPES-KOHpH 75 10 mM Mg(Ac)2 75 mM KAc
Nous ajoutons ensuite la meacutethionine marqueacutee au tampon Pour les comptages de
radioactiviteacute du liquide de scintillation (ECOLITE(+) Liquid scintillation cocktail de MP
Biomedicals) est alors ajouteacute
Une fois la gamme effectueacutee on attend la fin de lrsquoincubation de la reacuteaction de synthegravese
des laquo stalled ribosomes raquo Le comptage de la radioactiviteacute de la gamme et des eacutechantillons est
effectueacute avec un compteur agrave scintillation
4) Test de seacutedimentation
Lrsquointeraction ribosomePDF a eacuteteacute mesureacutee gracircce agrave un test de seacutedimentation sur couche de
sucrose selon un protocole publieacute 94
La PDF drsquointeacuterecirct (5 microM) est incubeacutee en preacutesence de concentrations croissantes de ribosomes
bloqueacutes (de 02 microM agrave 2 microM) dans un meacutelange reacuteactionnel de 60 microL contenant du tampon
Mateacuteriels et Meacutethodes
189
drsquointeraction (50 mM HEPES-KOHpH75 100 mM NH4OAc 20 mM MgCl2 et 1 mM TCEP)
Un extrait cellulaire S150 (contenant lrsquoensemble des proteacuteines bacteacuteriennes solubles mais pas
les ribosomes voir ci-dessous) est ajouteacute de faccedilon agrave diminuer les interactions aspeacutecifiques de
la PDF avec le ribosome Le meacutelange reacuteactionnel est incubeacute 30 min dans la glace puis centrifugeacute
agrave 16100 g durant 10 min (4degC) afin drsquoeacuteliminer les eacuteventuelles proteacuteines preacutecipiteacutees Le
surnageant (60 microL) est alors deacutelicatement deacuteposeacute sur 120 microL de couche de sucrose 20 (50
mM HEPES-KOHpH75 100 mM NH4OAc 20 mM MgCl2 et 1 mM TCEP 20 sucrose)
dans des tubes pour rotor TLA 100 Les tubes sont alors centrifugeacutes agrave 245000 g durant 30 min
agrave 4degC (rotor TLA100) A lrsquoissue de la centrifugation un culot leacutegegraverement jaune est visible On
eacutelimine le surnageant et on lave le culot 2 fois agrave la pipette avec le tampon drsquointeraction en
faisant couler le tampon le long de la paroi du tube de faccedilon agrave ne pas perturber le culot Le
culot est ensuite resuspendu dans 20 microL de tampon de charge 1X et les eacutechantillons sont
analyseacutes par Western-blot
5) Pontage chimique
Preacuteparation de lrsquoextrait S150 ( drsquoapregraves 278ndash280)
Une culture de bacteacuteries E coli MRE600 est reacutealiseacutee dans 1 L de milieu de culture
contenant 56 g KH2PO4 289 g K2HPO4 10 g extrait de levure auquel on ajoute 1 de
glucose et 10 mg de thiamine apregraves autoclavage Elle est incubeacutee agrave 37degC sous agitation (200
rpm) jusqursquoagrave obtenir une DO600 = 08 On place alors rapidement la culture dans la glace pour
stopper la croissance cellulaire On centrifuge les cellules 20 min agrave 8000 g afin drsquoobtenir un
culot qui est alors laveacute deux fois avec un tampon TMP (10 mM Tris-acetatepH 80 15 mM
magneacutesium acetate 60 mM potassium acetate 1 mM DTT 75 microgmL pMSF) Pour 1 L de
culture on obtient un culot de environ 25 g que lrsquoon resuspend apregraves rinccedilage dans 10 mL de
tampon TMP (le volume final apregraves resuspension est donc environ 12 mL) La lyse des cellules
est reacutealiseacutee avec un sonicateur Branson en faisant 3 cycles de 1 min de pulsation avec 1min
de pause entre chaque pulsation On centrifuge alors lrsquoeacutechantillon agrave 30000 g (26000 rpm) dans
un rotor TLA 1003 agrave 4degC durant 30 min On reacutecupegravere le surnageant et on le centrifuge de
nouveau dans les mecircmes conditions On mesure la concentration de proteacuteines par la meacutethode
de Bradford et on ajuste la concentration agrave 15 mgmL avec le tampon TMP Le lysat est ensuite
dialyseacute contre 1L du tampon TMP agrave 4degC durant 3h On reacutealise alors de nouveau une
centrifugation agrave 150000 g (65000 rpm) avec le rotor TLA 1003 durant 24 min agrave 4degC Le
surnageant S150 est collecteacute aliquoteacute dans des tubes de 100 microL puis est rapidement congeleacute
dans de lrsquoazote liquide afin drsquoecirctre stockeacute agrave -80degC
Mateacuteriels et Meacutethodes
190
La centrifugeuse utiliseacutee est la Beckman TL-100 le rotor TLA 1003 et les tubes Ultra-Clear
tubes frac12 x 2 13 x 51 mm (reacutefeacuterence 344057 chez Beckman)
Tampon pour le protocole de pontage chimique
Cross-linking buffer 100 mM HEPES-KOH 100mM KCl 10 mM MgCl2 pH 76
Binding buffer 20 mM HEPES-KOH 100mM NH4OAc 20 mM MgCl2 1 mM TCEP pH
74
Quenching buffer 1 M NH4OAc 1M Tris-HCl pH 74
Dissociation buffer 20 mM HEPES-KOH 100 mM NH4OAc 03 mM MgCl2 pH 74
Strep-Tactin lysis buffer 20 mM HEPES-KOH 150 mM KCl pH 75
Protocole du pontage chimique
Le pontage chimique avec lrsquoEDC permet de lier covalemment deux proteacuteines dont les reacutesidus
aspartateglutamate et lysine se retrouvent proches dans lrsquoespace (Figure MM-6)
Figure MM-6 Reacuteaction de pontage chimique entre lrsquoEDC et les groupements carboxyle et amine
primaire de deux proteacuteines
On incube 5 microM de ribosome avec 25 microM de strep-PDF dans le laquo cross-linking buffer raquo
dans un volume total de 2375 microL On incube alors lrsquoeacutechantillon durant 30 min agrave 25degC On
ajoute ensuite de lrsquoEDC agrave une concentration finale de 50 mM de faccedilon agrave obtenir un volume
final de 25 microL On incube 30 min agrave 25degC On ajoute alors 275 microL de laquo quenching buffer raquo
Lrsquoeacutechantillon est ensuite dilueacute avec le laquo binding buffer raquo pour obtenir un volume final de 50
microL On ajoute alors 100 microL drsquoextrait S150 et on charge lrsquoeacutechantillon sur 2 mL drsquoune couche de
sucrose agrave 20 (reacutealiseacutee dans du laquo binding buffer raquo) On centrifuge lrsquoeacutechantillon dans un rotor
TLA55 agrave 55000 rpm durant 35 h agrave 4degC (ou 55000 rpm durant 25 h agrave 4degC dans un rotor TLA
Mateacuteriels et Meacutethodes
191
1003) Le culot est ensuite laveacute deux fois avec 300 microL de laquo dissociation buffer raquo froid Le culot
est alors resuspendu dans 20 microL de laquo dissociation buffer raquo Une mesure de la concentration de
ribosome est effectueacutee agrave 260 nm En parallegravele on eacutequilibre la reacutesine Strep-Tactin-Sepharose
avec 30 microL de laquo dissociation buffer raquo puis une fois eacutequilibreacutee on ajoute la reacutesine au culot de
ribosome resuspendu On ajoute alors de la Bovine pancratic RNase A (Roche) agrave une
concentration finale de 5 microgmL Lrsquoeacutechantillon est incubeacute la nuit agrave 4degC Le lendemain on
transfegravere lrsquoeacutechantillon (incluant la reacutesine) dans un tube laquo filter spin column (MoBiTec) raquo de 1
mL On centrifuge 30 s agrave 100 g agrave 4degC On reacutecupegravere les proteacuteines non accrocheacutees en lavant la
reacutesine 3 fois avec 100 microL de laquo Strep-Tactin lysis buffer raquo On eacutelue ensuite les proteacuteines
accrocheacutees agrave la colonne avec 25 microL de tampon de charge 1X et on incube lrsquoeacutechantillon agrave 95degC
durant 10 min On centrifuge ensuite durant 2 min agrave 16000 g afin de reacutecupeacuterer les proteacuteines
Les eacutechantillons sont alors precircts agrave ecirctre analyseacutes sur gel SDS-PAGE etou Western-blot
Figure MM-7 Principe du pontage chimique entre 70S E coli et Strep-Vp16PDF avec EDC
B5 Cristallisation de complexes 70Sfacteurs NME
Les ribosomes de T thermophilus ont eacuteteacute cristalliseacutes selon le protocole utiliseacute dans lrsquoeacutequipe de
Marat Yusupov 18239 par la technique de diffusion de vapeur en reacutealisant des gouttes assises
dans des boicirctes 24 puits
Les cristaux de ribosomes seuls sont obtenus en meacutelangeant 2 microL de ribosomes agrave 13 microM et 2
microL de solution de puits contenant 38 agrave 43 de PEG-20000 38 agrave 43 de PEG-550 MME
Mateacuteriels et Meacutethodes
192
100 mM de KSCN et 100 mM de Tris-aceacutetate pH7 Les reacuteservoirs contiennent 400 microL de
solution de cristallisation Lrsquoeacutechantillon de ribosomes contient 185 pmol drsquoARNtfMet
preacutealablement activeacute 2 min agrave 55degC ainsi que 28 mM final de DBC (deoxy big chap) Les
proteacuteines PDF ou MetAP ont eacuteteacute cocristalliseacutees avec les ribosomes en preacuteparant des
eacutechantillons contenant un excegraves molaire 6X de proteacuteine par rapport aux ribosomes Les boicirctes
sont incubeacutees agrave 24degC durant 2 agrave 3 semaines
Les cristaux obtenus sont soumis agrave un protocole de cryoprotection 24h avant les expeacuteriences
de diffraction des rayons X Pour cela la solution de cristallisation drsquoun puits est transvaseacutee
dans un tube ougrave lrsquoon ajoute du MgCl2 agrave une concentration finale de 10 mM 600 μL de 60
MPD sont ajouteacutes dans les puits ainsi videacutes et 10 μL de solution de cristallisation contenant
10mM de MgCl2 sont alors ajouteacutes dans chacune des gouttes de cristallisation Les boicirctes de
cristallisation ainsi preacutepareacutees sont mises agrave eacutequilibrer 24h agrave 24degC Une fois sur la ligne de
lumiegravere soit 24h apregraves le deacutebut du protocole de cryoprotection la solution des gouttes de
cristallisation est eacutechangeacutee par 3 ajouts successifs de 45 μL de solution de cryoprotection (ajout
de solution puis eacutelimination sans toucher aux cristaux 3 fois de suite) constitueacutee typiquement
de 45 PEG-20000 45 PEG-550 MME 01M KSCN pH70 10 mM MgAcetate 30
MPD Les cristaux sont alors monteacutes sur une boucle et congeleacutes directement dans le flux drsquoazote
sur la tecircte goniomeacutetrique
Les expeacuteriences de diffraction ont eacuteteacute reacutealiseacutees au synchrotron SOLEIL sur la ligne de
lumiegravere PROXIMA1
Mateacuteriels et Meacutethodes
193
Carte des vecteurs vides
pET-16b
Mateacuteriels et Meacutethodes
194
pBADMyc-HisA
Mateacuteriels et Meacutethodes
195
pET-22b
Mateacuteriels et Meacutethodes
196
Constructions en pET-16b
Mateacuteriels et Meacutethodes
197
Mateacuteriels et Meacutethodes
198
Mateacuteriels et Meacutethodes
199
Construction des chimegraveres en pBADMyc-HisA
Mateacuteriels et Meacutethodes
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Titre Caracteacuterisation structurale et fonctionnelle de la peptide deformylase du phage Vp16T
Mots cleacutes modification co-traductionnelle ribosome deacuteformylation NME enzymes phages
Reacutesumeacute Les proteacuteines en cours de synthegravese subissent des modifications tregraves preacutecoces de leur extreacutemiteacute
N-terminale degraves lors que celle-ci eacutemerge du tunnel de sortie du ribosome La premiegravere modification est
lrsquoexcision de la meacutethionine initiatrice assureacutee par une meacutethionine aminopeptidase (MetAP) preacuteceacutedeacutee
de sa deacuteformylation par une enzyme peptide deacuteformylase (PDF) chez les bacteacuteries et dans les
mitochondries et chloroplastes Ce processus est ubiquitaire et essentiel et a eacuteteacute deacutecrit dans tout le regravegne
du vivant Chez les bacteacuteries les PDFs de type 1B se fixeraient au ribosome agrave proximiteacute de lrsquoextreacutemiteacute
du tunnel de sortie du peptide naissant via son heacutelice α C-terminale Or des analyses meacutetageacutenomiques
reacutecentes ont reacuteveacuteleacute la preacutesence insoupccedilonneacutee de gegravenes codant des PDFs putatives chez des virus marins
De maniegravere inattendue toutes les PDF virales preacutesentent des seacutequences C-terminales tregraves courtes et
deacutepourvues de lrsquoheacutelice 3 Lrsquoidentification de ces PDFs atypiques soulegraveve alors de nouvelles questions
quant agrave leur possible interaction au ribosome et agrave leur fonction biologique Lrsquoobjectif de ma thegravese a donc
eacuteteacute de reacutealiser la caracteacuterisation complegravete et inteacutegreacutee de la peptide deacuteformylase du bacteacuteriophage Vp16T
dont la seacutequence est lrsquoune des plus courtes connues agrave ce jour Jrsquoai montreacute que le phage Vp16T code une
proteacuteine active in vivo et in vitro et qursquoelle peut se lier au ribosome malgreacute lrsquoabsence drsquoheacutelice α C-
terminale La caracteacuterisation structure-fonction de Vp16PDF a reacuteveacuteleacute des caracteacuteristiques uniques qui
pourraient alors expliquer sa fonction au cours de la reacuteplication du phage Ainsi jrsquoai montreacute que
lrsquoexpression de Vp16PDF chez E coli modifie la structure de lrsquoenveloppe induit lrsquoaccumulation
drsquoagreacutegats et finalement inhibe la croissance bacteacuterienne De plus lrsquoeacutetude de souches bacteacuteriennes
mutantes a montreacute que Vp16PDF interfegravere speacutecifiquement avec le repliement et lrsquoadressage de proteacuteines
membranaires Cette derniegravere fonction pourrait permettre de deacutestabiliser la membrane de lrsquohocircte et ainsi
favoriser la libeacuteration des particules virales
Title Structural and functional characterization of peptide deformylase from Vp16T phage
Keywords co-translational modification ribosome deacuteformylation NME enzymes phages
Abstract Being synthesized proteins undergo very early changes in their N-terminal end since it
emerges from the outlet channel of the ribosome The first modification is the excision of the initiator
methionine provided by a methionine aminopeptidase (MetAP) preceded by its deformylating enzyme
peptide deformylase (PDF) in bacteria and in mitochondria and chloroplasts This process is ubiquitous
and essential and has been described in the kingdom of life In bacteria Type 1B PDFs would bind to
the ribosome near the end of the outlet tunnel of the nascent peptide via its C-terminal helix But
recent metagenomic analyzes revealed the unexpected presence of genes encoding putative PDFs in
marine viruses Unexpectedly all viral PDF have very short C-terminal sequences and lacking the 3
helix The identification of these atypical PDFs then raises new questions about their possible interaction
with ribosome and their biological function The aim of my thesis was therefore to achieve the complete
and integrated characterization of peptide deformylase bacteriophage Vp16T the sequence is one of the
shortest known to date I showed that the phage Vp16T code an active protein in vivo and in vitro and
can bind to the ribosome despite the absence of the C-terminal helix The structure-function
characterization Vp16PDF revealed unique features that could then explain its function in the replication
of the phage Thus I have shown that expression in E coli Vp16PDF modifies the envelope structure
induces accumulation of aggregates and ultimately inhibits bacterial growth In addition the study of
mutant bacterial strains showed that Vp16PDF specifically interfere with the folding and addressing of
membrane proteins This latter function could help destabilize the membrane of the host and thereby
promote release of viral particles
